SU1328375A1 - Штамм ЕNтеRоVIRUS SUIS дл диагностики энтеровирусного гастроэнтерита свиней - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к ветеринарной вирусологии и представл ет собой штамм нового серотипа энтеро- вирусов свиней, используемый дл  диагностики энтеровирусного гастроэнтерита свиней. Целью изобретени   вл етс  штамм энтеровируса свиней, обладающий репродуктивной активностью, в культуре клеток почки поросенка, безвредный и ареактогенный дл  лабораторных животных. Штамм К-9 Enterovi- rus suis XI вызывает сероконверсию у кроликов, в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтрализующие антитела образуютс  в титре 1:256-. 1:512. Штамм не вызывает отклонений от физиологической нормы у интраве- нозно и интрамускул рно инокулирован- ных кроликов. О S (Л со N5 00 00 vj ел

Description

10

Изобретение относитс  к ветеринарной вирусологии и представл ет собой штамм нового серотипа энтерови- русов свиней, используемый дл  диагностики энтеровирусного гастроэнтерита свиней.

Цель изобретени  - штамм энтеро- вируса свиней, обладающий реп родук- тивной активностью в культуре клеток почки поросенка, безвредный и ареакто : генный дл  лабораторных животных,

Штамм депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов МСХ СССР под № 287/5, назван К-9 Enterovirus suis- -jg XI и имеет следующие признаки.

Морфологи , Сферическа  форма, типична  дл  энтеровирусов, имеет ико- саэдральную симметрию, размер вириона 26-28 нм,

.Антигенна  структура, В реакции перекрестной нейтрализации штамм серологически отличаетс  от референтных штаммов известных серотипов энтеровирусов свиней,

Биологические свойства. Штамм К-9 Enterovirus suis-XI обладает,репродуктивной активностью в культуре пер- вичнотрипсинизированных клеток почек эмбриона свиньи и перевиваемых клеток линии СПЭВ и накапливаетс  в них

20

25

30

до ТЦДср,/мл в течение 48 ч при 37 + 0,5°С, Обладает бл шкообразуюишми свойствами на первично-трипси- низированных клетках почек эмбриона свиньи и перевиваемых клетках линии, СПЭВ,, Образует однородные бл шки размером -1,5 мм.

Физико-химические свойства. Явл етс  РНК-содержащим, репродукци  вируса в культуре клеток не подавл етс  присутствием в поддерживающей среде 100 мкг/мл 5-бром-2-дезоксиурИ ина и 0,1-1,0 мкг/мл актиномицина Д, устойчив к воздействию хлороформа, эфира и трипсина, а также сред со начени ми рН 2,0-11,0. Понижает титы на 2-31g после прогревани 

ри 50°С в течение 60 миН в присутствии 1 М MgClj,

. 11ммуногенность, Вызывает серокон- у кроликов; в гипериммунных роличьих сыворотках вируснейтрали- антитела образуютс  в титре 1:256-1:512,

Безвредность, Не вызывает отклоений от физиологической нормы у нтравенозно и инт амускул рно иноку- ированных кроликов.

40

45

35

gQ

55

752

Пример 1, Использование штамма К-9 энтеровируса свиней в качестве антигена дл  обнаружени  и идентификации антител в сыворотках крови . больных и переболевших животных.

Обнаружение и идентификацию антител провод т В реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток. Дл  постановки РН готов т двукратные разведени  сывороток в объеме 0,5 мл и к каждому разведению сыворотки добавл ют по О,5 мл антигена с содерg

0

5

0

0

5

жанием вируса в 0,1 мл 100 ТЦДг,,, Ви5

УО рус-сывороточную смесь вьщерживают

один час.в термостате при 37°С, после чего смесь каждого разведени  по 0,2 мл внос т в 2-4 пробирки с монослоем культуры клеток, в которых предварительно ростова  среда заменена на 0,8 мл поддерживающей. Учет результатов титровани  антител провод т на 4 и 7 сут. Титром антител считают наибольшее разведение сыворотки , которое нейтрализует 100 вируса в-50% инокулированных вирус- сывороточной смесью в пробирках,

Результат считаетс  положительным при нарастании титра антител, в парных сыворотках в четыре и более раз или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50 и более пpo

центах сывороток крови однократно. обследованных животных, .

Пример 2, Обнаружение анти-х гена (вируса)в мазках-отпечатках из патологического, материала методом пр мой иммунофпуоресценции (ИФ), Дп  исследовани  методом иммунофпуоресценции на обезжиренных предметных стеклах готов т мазки-отпечатки из свежезамороженного материала. Препараты высушивают, фиксируют в aцeтoнej нанос т на них флуоресцирующий .иммуноглобулин , помещают во влажную камеру , затем промывают фосфатно-буфер- I

ным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе . Приготовленные препараты иссле- Q дуют люминесцентным микроскопом. Положительным результатом исследовани  считают специфическое  рко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на фоне мозговой ткани, котора  светитс  серовато-зеленоватым цветом.

Пример 3. Идентификаци  выделенного вируса в культуре клеток.

Типирование вируса провод т в реакции нейтрализации на культуре кле5

ток с помощью иммунной сыворотки к вирусу штамма К-9, вход щего в состав набора диагностикумов. Иммунна  сыворотка используетс  в дозе 20 нейтрализующих доз. Вирус дл  типирова- ни  используют в дозе 1000 ТЦЦ . Дл  типировани  0,5 мл вируса с содержанием его в 0,1 мл 1000 ТЦД смешивают с 0,5 мл иммунной СЫВОР.ОТКИ с

содержанием в 0,1 мл ее 20 нейтрализующих доз. После выдерживани  вирус- ,сывороточной смеси в течение 1,5 ч при 37°С по 0,2 мл ее внос т в четыре пробирки с культурой клеток, ростова  среда в которых предварительно заменена на 0,8 мл поддерживающей и став т в термостат на инкубацию при 37 С, Учет результатов провод т на 4 и 7 сут,

Результат типировани  считают по- ложительньм, если в 50% инокулирован- ных вирус-сывороточной смесью пробирок сыворотка нейтрализовала вирус (ЦПД не отмечено),

10

283754

Пример 4, Идентификаци  вируса в культуре клеток методом имму- нофлуоресценции,

Выращенную на покровных стеклах культуру клеток заражают выделенным вирусом и инкубируют в термостате до по влени  ЦПД, После наступлени  ЦПД стекла извлекают, промывают фосфат- но-буферным раствором, подсушивают.и фиксируют ацетоном. Затем на препараты нанос т фулоресцируюш ий иммуноглобулин к штамму К-9, выдерживают |30 мин при 37°С, обильно промывают

g фосфатно-буферным раствором ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают. Микроскопию провод т на люминесцентном микроскопе.

Claims (1)

1. Положительным результатом считают специфическое  рко-зеленое свечение цитоплазмы клеток в виде фокусов из 3-4 пораженных клетокi :Формула изобретени  ; Штамм Enterovirus suis 287/5

   25 () диагностики энтеровирус- ного гастроэнтерита свиней.

   20