JPS5879929A - 日本脳炎・豚パルポ混合ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、日本脳炎ウィルスおよび豚パルボウイルス
感染に起因する豚の死流産を予防することを目的とする
日本脳炎・豚パルボ混合ワクチンに関するものである。

従来、わが国における豚のウィルス性異常産の主な原因
は、日本脳炎ウィルスの感染によるものと考えられ、予
防には主として生ワクチンが使用されてきたが、日本脳
炎ワクチンを注射した豚←、日本脳炎の非流行期にも豚
死流産の発生があることから、ｅの原因を追求し、日本
脳炎ウィルス以外に豚パルボウイルスも関与しているこ
とが明らかになった。

豚パルボウイルスは、１９６７年イギリスのカートライ
ト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ　）らによって繁殖障害を起
こした母豚費異常産子から分離されて以来、豚のウィル
ス性異常産の原因の一つとして注目され、現在、はとも
どの国で蔓延し、大きな被害を与えている。わが国では
１９７０年に豚死流産胎児の脳からはじめて豚パルボウ
イルスが分離され、その後の調査から、妊娠豚が感染す
ると死流産を起こし、わが国にもかなりの発生があるこ
とがわかり、日本脳炎番こつぐ豚生産」二の問題として
注目され、このウィルスｌこよる豚の死流産を予防する
ワクチンの開発も進められて、１９７６年から不活化ワ
クチンが実用化されはじめた。ｅの後、ワクチンの使用
量も年ごとに増加し、本病の予防について大きな関心が
寄せられている。

このように、豚のウィルス性異常産については、日本脳
炎ウィルスに加えて豚パルボウィルスの感染も考慮しな
ければならないことは明白であり、その予防には両ワク
チンの注射が必要である。また、日本脳炎の流行は夏か
ら秋にかけて起こるが、豚パルボウイルスの感染も同時
期に多発することが明らかであるので、日本脳炎生ワク
チンの注射とほぼ同時期に豚パルボ不活化ワクチンの注
射がなされてい乙。さらに、近年豚の飼育形態は多頭化
が進もでいるので、伝染病が発生すると、多数の豚に被
害を及ぼすことになり、（の結果、伝染病予防対策」二
予防ワクチンを豚に注射する必要が出てくる。しかし、
数多くの種類のワクチンを別１固に、多数の豚に注射す
ることは、きわめて多くの労力と経費とを要するため、
一部の種類のワクチンしか注射できないこともあって、
防疫上、大きな問題となっている。これらの解決策とし
て、同じような疾病を起こす原因となる２種以上のウィ
ルスまたは細菌に対しては、混合ワクチンの開発が望ま
れている。

このような見地から、日本脳炎ウィルスおよび豚パルボ
ウイルスに対する混合ワクチンの開発も切望されている
が、現在のところ、豚の日本脳炎の予防には、主として
生ワクチンが使用されており、現行の豚パルボ感染症ワ
クチンはホルマリン不活化ワクチンであるため、混合す
ると日本脳炎ウィルスが不活化されるために、両者を混
合することはできないのである。

なお、日本脳炎・豚パルボ混合ワクチンの試作例として
、豚胎児腎由来（ＥＳＫ）細胞で増殖した豚パルホウイ
ルス９０Ｈ８株を濃縮後、β−プロピオラクトンで不活
化し、弱毒日本脳炎生ウイルス液と混合した凍結乾燥ワ
クチンが公表されているが、β−プロピオラクトンには
発が５性の疑かあることから食品添加物として使用が禁
止されている化学物質であるため、食肉に供される豚に
注射することは好ましくなく、禁止されなければならな
い。

この発明は、このような現状に着目してなされたもので
あって、初代豚腎培養（ＳＫ）細胞で増殖した弱毒日本
脳炎ウィルスｍ株と、ＳＫ細胞で増殖した豚パルボウイ
ルスｇＯＨ８−５Ｋ株を物理的（たとえは熱もしくは紫
外線による）処理番こより不活化したウィルス液とを混
合し、凍結乾燥してなる日本脳炎・豚パルボ混合ワクチ
ンを提供するものである。以下にその詳細を述べる。

まず、豚パルボウイルスは、農林水産省家畜衛生臥験場
から分与されたＱＱＨ５株（昭和４５年広島県下で豚の
死産胎児より分離され、ＥＳＫ細胞で継代し、クローニ
ングを５回行なった継代数１１代のもの）をＳＫ細胞で
３代継代し、継代ことに６０℃で３０分間加熱処理した
後、眼界希釈法で５回クローニングして得られた達人ウ
ィルスのない９ＱＨ８−８Ｋ株を使用しており、ＳＫ細
胞できわめて増殖性が良い株である。さらに、５０℃も
しくは４５℃の温度でＳＫ細胞で増殖させた豚パルボウ
イルスを長期間感作し、抗原性を保持した状態で不活化
することにより、濃縮等の手段を用いないで弱毒日本脳
炎生ウィルスとの混合を行なったものであるから、前記
の試作混合ワクチンとは製造方法においても本質的に異
なるものである。

つぎに、この発明を具体的に説明すれば、弱毒日本脳炎
ウィルスｍ株をＳＫ細胞に接種し、通常の温度（約３７
℃付近）で１８〜２４時間培養して、ウィルス増殖補助
に感染培養液を採取し、ｅの遠心上清を弱毒日本脳炎ウ
ィルス浮遊液とする。

一方、豚パルボウイルスｇ□）１ｓ−８Ｋ株をＳＫ細胞
に接種し、通常の培養温度（約３７℃付近）で７〜１４
日間培養してウィルス増殖補助に感染培養液を採取し、
（の遠心上清を熱感作することによりウィルスを不活化
したものを豚パルボ不活化ウィルス液をそれぞれ容量比
１：１ないし１；４の割合で混合し、この混合液と安定
剤（たとえば乳糖、蔗糖および精製水からなる）をそれ
ぞれ容量比３：１の割合で混合し、これを常法により凍
結乾燥することにより得られた日本脳炎・豚パルホの乾
燥混合ワクチンである。

この混合ワクチンをリン酸緩衝食塩液で溶解した俊、豚
または妊娠豚の皮下に注射しても、被注射動物は臨床上
何ら異常を示さず、かつ、日本脳炎および豚パルボウィ
ルスに対する抗体の上昇か認められ、さら番こ、強毒日
本脳炎ウィルス、または豚パルボウイルスの攻撃に対し
て抵抗することから、この混合ワクチンの安定性および
有効性が立証された。現在、野外において使用されてい
る日本脳炎生ワクチン単味および豚パルボウイルス感染
症不活化ワクチン単味と比較した場合、第１表に示すよ
うに、この発明のワクチンを４週間隔で２．　Ｏｍｌず
つ２回、または、２．０　ｍｌｌ初回注射後４問 ／８１：射することにより、それぞれの単味のワクチン
を注射したときと同様の効果を挙げることができ、同時
に日本脳炎および豚パルボウイルス感染による豚の異常
産の予防ができる利点を有して注射の省略化に大いに役
立って、この発明のワクチンはきわめて優れたものであ
ると言える。

以下に実施例を示す。

健康な子豚の腎臓を無菌的に取り出し、腎臓皮質を細切
して０．２５％トリプシン液を作用させ、細胞を消化し
た後、これを毎分１０００回転の速度で遠心分離し、得
られた沈澱細胞を増殖用培養第１表 ＪＰＶ　　日本脳炎・豚パルポ混合ワクチンＪＶ　　　
弱毒日本脳炎生ワクチン ＰＶ　　豚パルボウイルス感染症不活化ワクチン液に０
．　３％になるように浮遊させ５リツトル容量の回転培
養瓶２本に各４００ｍ１ずつ分注し、ゴム栓をして３７
℃のふ卵器内で回転培養すると、４〜５１ヨで完全なシ
ートが形成される。これらに７、５ １（’ｌ　　ＴＣＩＩ）５ｏ／ｍｌ　　の弱毒日本脳炎
ウィルスｍ株を１本あたり４Ｑｍｌ接種し、３７℃で６
０分間吸着後、ウィルス増殖用培養液１０１００Ｏずつ
注加し、３７℃で１８〜２４時間培養し、細胞変性効果
（ＣＰＥ）の発現を確認した後、培養液を採取し、この
感染培養液を毎分３０００回転の速度で遠心分離し、（
の遠心上清を弱毒日本脳炎ウィルス液として一８０℃に
凍結保存した。また、前記と同様な方法で調整した豚腎
細胞浮遊液を５リツトル容量の回転培養瓶８本に各４０
０ｍ１ずつ分注し、ゴム栓をして３７℃のふ卵器内で回
転培養し、４〜５日で完全なシートを形成した後、１０
　　’ｒＣ　Ｉ　Ｄ５。

、／ｍ　ｌの豚パルボウイルス９ＱＩ（Ｓ−５Ｋ株を１
本あたり４Ｑｍｌ接種し、３７℃で６０分間吸着後ウィ
ルス増殖用培養液５　０　０　ｍｌずつ注加し、３７℃
で１０日間培養した後培養液を採取し、この感染培養液
を毎分３０００回転の速度で遠心分離し、ｅの遠心上清
（ウィルス感染価１０７°５〜８°２”ｒＣ　Ｉ　Ｉ）
　５。

／ｉｎｌ　、　Ｈ　Ａ価５１２〜１０２４倍）を４５℃
テ１０週間熱感作し不活化した。この豚パルボ不活化ウ
ィルス液４０００ｍ１と前記の一８０℃で凍結保存して
いた弱毒日本脳炎ウィルス液を融解したもの２０００ｍ
１と混合し、さらに乳糖２０％、ポリビニルピロリドン
に９０の０．　６　％を含む精製水を１２１℃で２０分
間高圧滅菌した安定剤溶液２０００ｍ１Ｊｚ混合し、そ
の８ｍｌ　　ずつを内容積３０ｍ１の滅菌バイアル９１
０本に分注し、これを常法に従って凍結乾燥し、真空下
で封栓して乾燥ワクチンを得た。

この乾燥ワクチンを、１７Ｑｍｇ　ノＮ．ａＣ＋　、６
．８ｍｇノＫＨ，，　ＰＯ４．　２Ｈ２０、１５，５ｍ
ｇ　ノＮａ，，ＨＰＯ４２ｒ−ｔ，，ｏ、１００ｍｇ　
の精製ゼラチン、０．４’ｍｇＯフェノールレッドを含
む滅菌精製水２０ｍ１　で溶解して、その２０ｍ１　を
豚の皮下に注射すると、日本脳炎および豚パルボウイル
スに対する免疫期間は６力月以上であり、このワクチン
の有効期間は２〜５℃の冷暗所に保存すれば１８力月間
であった。なお、このワクチンは１０ｒＣＩＤ５ｏ／ド
ースの東毒日本脳炎ウィルス感染価を有していた。なお
、この発明のワクチンについて、つぎのような安全性お
よび有効性の試験ならびに臨床試験を行な一〇だ。

すなわら、 （イ）安全性： 日本脳炎および豚パルボウイルスに対する抗体陰性の約
１カ月齢の子豚５頭の皮下にワクチンをそれぞれ２、Ｑ
ｍｌ　　ずつ注射し、注射時およびその後１４日間の元
気消失、発熱および体重減少等の現象の有無を臨床的に
観察したが、いずれの豚においても異常は全く認められ
なかった。東だ、注射後７日間毎日採血を行ない、血中
からの日本脳炎ウィルスおよび豚パルボウイルスの回収
を行なったが、いずれの豚からもウィルス血症は検出さ
れず安全であ゛つた。

（ロ）有効性： 日本脳炎および豚パルボウイルスに対する抗体陰性の妊
娠豚５頭を用い、４頭をワクチン注射群とし、残り１頭
は無処置対照豚とした。ワクチン注射群のうら２頭はワ
クチン２．Ｑｍｌ　　を４週間隔で２回注射し、残り２
頭は初回にワクチン２．Ｑｍｌを皮下注射し、初回注射
後４週目に現在実用化されているホルマリン不活化豚パ
ルボワクチンを２．Ｑｍｌ　　皮下注射した。第２回ワ
クチン注射後、２週目にワクチン注射群および無処置対
照豚に１頭あたり１０　ｒＣＩＤ５ｏの古本株を皮下注
射により攻撃し、さらに日本脳炎ウィルスによる攻撃１
週後に１頭あたり１０　　ｒＣＩＤ５ｏの豚パルボウイ
ルスｇ０１（Ｓ株を経口投与して感染防御試験を行な・
つた。各回攻撃後７日間毎日採血してウィルス血症の発
現の有無を調べ、また−膜状態について分娩まで観察し
、産子の状況を調べた。（の結果を第２表（その１〜３
）＆こ示すが、ワクチン注射群はいずれも日本脳炎およ
び豚パルボウイルスに対する抗体の上昇が認められ、第
２回注射後（以下余白） 第　２　表　（その１） 第　２　表　（その２） 第２表（その３） ２週目に日本脳炎ウィルレス古本株で３週目番こ豚ノく
ルボウイルス９０Ｈ５株で攻撃した結果、臨床症状に異
常はなく、ウィルス血症も認められず、攻撃による両ウ
ィルスに対する抗体価の有意の上昇も認められなかった
。しかし、対照豚で（よ日本刀α炎および豚パルボウイ
ルス感染によるウィルス血症が認められ、両つィルスに
対する抗体価も著しい上昇が認められた。ついで、分娩
成績（こつし）で観察した結果、ワクチン注射豚はすべ
て正産であつたが、対照豚においては異常子の娩出が認
められ、異常子から豚パルボウイルスが回収された。

なお、対照豚の娩出した異常子からの日本脳炎ウィルス
の回収は陰性であった。このような感染防御試験の結果
から、日本脳炎および豚パルボのウィルス感染による豚
の死流産を予防するうえで、この発明のワクチンはきわ
めて有効であることが証明された。

（ハ）臨床試験： 野外における日本脳炎および豚ボルボウイルス感染によ
る豚の死流産を予防するためにこの発明のワクチンを応
用したときの安全性と有効性とを調べる目的で臨床試験
を行ない、同時にそれぞれ単味ワクチンとの比較も行な
った。供試ワクチンは日本脳炎・豚パルボ混合ワクチン
（ＪＰＶ）、弱毒日本脳炎生ワクチン（ＪＶ）および豚
パルボウイルス感染症不活化ワクチン（ＰＶ）で、それ
ぞれのワクチンの１回の注射量は２．０　ｍ　ｌで皮下
注射した。試験対黒豚はいずれも未経産の豚で、試験開
始時種付は後５０日以内のもの、または、１力月第　　
　３　　　表 以内に種付は予定の繁殖用雌豚を選定し、第３表に示す
ような試験群に分けた。試験の実施方法は、ワクチンの
安全性を調べる目的で各回注射後に一般状態を観察し、
また、各回注射時と第２回注射後４週目および分娩時に
採血し抗体価を測定した。

さらに分娩成績について調査し、対照と比較した。

試験結果は、第４表および第５表に示すが、ワクチンを
注射された妊娠豚はいずれも異常を示すことなく経過し
、ワクチンの安全性が確認された。

試験豚ではワクチン注射により両ウィルスに対する充分
な抗体応答を示した。すなわち、日本脳炎ウィルスに対
するＨ１抗体価は、第４表に示され第４表 ２　　　　００２７４　　０　　０　　　０１５　　１
０８■ ３　　　　０００００　　４　　９　　　２１５〉３４
２１　　　　９１０００　　０　　０　　　０１０　　
　１０．８２　　　０００６２　　１　　０　　　０１
０　　　Ｚｏ。

■ ３　　　　００００１　　２　　４　　　３１０＞り１
２１　　　７１０２０　　０　　０　　　０１０　　　
１６．２２　　　００１４４　　１　　０　　　０１０
　　　９１゜２■ ３　　　０　０　０　０　０　　４　　３　　　３　１
０　　〉７２４．５１　　　５０００（１０００５１０ ２、第２回注射時 ３、第２回注射後４週目 ４、分娩後 ×頭数 第　　　５　　　表 ２００２５４４００１５１２５．７ ■ ３００００１４７３１５〉６３１ ４０００１４４２２１３〉３ｓ２ ２０００２４４００１０１８１．５ ３　　　　　　０００００　　　　３　　　　５　　　
　　２１０　　〉６７６４　　　　　　０００１０　　
　　２　　　　３　　　　　１　　　　８　　〉４１２
１　　　　　　７２０１０　　　　０　　　　０　　　
　　０１０　　　　１４．６２　　　　　　８１１００
　　　　０　　　　０　　　　　０１０　　　　１２゜
３■ ３　　　　　　６　　　０　　　１　　　０　　　０　
　　　１　　　　２　　　　　０　　　１０　　　〉３
７．２４　　　　　　２　　　０　　　０　　　０　　
　０　　　　１　　　　３　　　　　４　　　１０　　
〉４４６．７１　　　　　　５００００００　　　　　
０５１０２　　　　　　５００００００　　　　　０５
　　　　１０■ ３　　　　　　３００００　　　　０　　　　１　　　
　　１　　　　５　　　〉６９．２４　　　　　　１０
０００　　　　０　　　　０　　　　　３　　　　４　
　〉６３１でいるとおり、第１回目のワクチン注射によ
り明らかに上昇が認められ、■、■、■群とも抗体価（
ＧＭ）に有意差は認められず、日本脳炎生ワクチン単独
の場合（■群）と同様の有効性を示すものと考えられた
。一方、豚パルボウィルスに対するＨ　Ｉ抗体価は、第
５表に示されているとおり、第１回注射後４週目で４０
〜３２０倍を示し、第２回の追加注射の結果、抗体価は
さらに上昇し、１群とＨ群との間で抗体価（ＧＭ）に有
意差は認められず、混合ワクチンの有効性が示された。

対照豚および豚パルボ不活化ワクチン非注射群（ＩＶ群
）の抗体価の推移（第４表および第５表）から、試験開
始後１，５〜２力月の間に日本脳炎の、また２〜３力月
の間に豚パルボウイルスの流行のあったことが明らかと
なった。さらに、第６表に示す試験豚の分娩成績をみる
と、混合ワクチン４週間隔２回注射群（１群）と、混合
ワクチン注射後４迦目に豚パルボ不活化ワクチンを注射
した口群とがほぼ同等の成績で最も良く、ついで日本脳
炎中ワクチン２回注射群（■群）の順であり、これに対
して対照豚（■群）では明らかにこれらのライ第６表 注１）異常子内訳 注２）圧死は除外 ルスの流行に起因すると考えられる死流産が認められた
。

以上の安全性および有効性の試験ならびに臨床試験の成
績から、この発明の日本脳炎・豚パルボ混合ワクチンは
野外で使用しても充分安全であり、かつ、豚のウィルス
性異常産の原因である日本脳炎および豚パルボウイルス
の感染を予防するうえにきわめて有効であることがわか
った。

特許出願人　　　株式会社　微生物化学研究所間　　代
理人　　　鎌　　　１）　　文　　　二手続補正書（自
発） 昭和５７年１　月１３日 １、事件の表示 昭和　５６年特許願第１７８５９９号−２、発明の名称 日本脳炎・豚パルボ混合ワクチン ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　　　　京都府宇治市槙島町２４．１６番地氏名悴
称）　　　株式会社微生物化学研究所４、代理人 ５゜ 昭和　　　　　年　　　　　月　　　　　日　　（発送
日）８、補正の内容　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ｌ゛・　・補　　正　　の　　内　　容 １．　明細書、第６頁、第１１行目、 「ウィルス液をそれぞれ」を「ウィルス液とする。前記
の弱毒日本脳炎ウィルス浮遊液と豚パルポ不活化ウィル
スを、それぞれ」と補正し表す。

２、同、第６頁、第１８行目、 「た後、豚ｔたは」を「だ後、子豚上たは」と補正し表
す。

３、同、第７頁、第３行目、 １安定性」を「安全性」と補正し表す。

４、同、第７頁、第１０行目、 「注射」を１皮）注射」と補正し表す。

５、　同、第８頁、第１表において、（参考資料１をご
参照下さい。） 山　ＪＶワクチンの使用方法の欄、最下行、「注射」を
皮下注射と補正します。

＋２１ＰＶワクチンの有効成分の欄、 「ホルマリン不活化豚パルボウィルス」ヲ１豚ハルホホ
ルマリン不活化ウィルス」吉補正しトす。

＋３１ＰＶワクチンの使用方法の欄、 ［注射」を「皮下注射」と補正します。

６　同、第１０頁、第９行目、 「溶液」を削除します。

７、　同、第１２頁、第３行目、 「注射」を「皮下注射」と補正します。

８、同、第１２頁、第５行目、 ［ホルマリン不活化豚パルボワクチン」を「豚パルボホ
ルマリン不活化ワクチン」と補正します。

９、同、第１４頁、第２表（ｅの３）におイで１（参考
資料２をご参照下さい。） 山　ウィルス検出の豚番号５の欄、最下行、「検出」を
「検出※」と補正し表す。

（２）第２表（ｆの３）の枠外下、 「×豚パルボウイルス検出」を加入し表す。

１０、　　同、第１５頁、第１０行目、「豚ボルボ」を
１豚パルボ」と補正します。

１１、　　同、第１５頁、第１９行目、「試験対黒豚」
を「試験対象豚」と補正します。

１２　　同、第１７頁、第４表において、（参考資料３
をご参照下さい。） 山　試験群■、測定の時期１、 （イ）Ｈ１抗体価２０の欄、 「２」を「１」と補正し表す。

（ロ）平均Ｈ１抗体価（、Ｇ　Ｍ　）の欄、ｒ１４．５
Ｊを［−１３，５」と補正します。

（２）試験群■、測定の時期２、Ｈ１抗体価３２０の欄
、 「０」を１２」と補正します。

（３）試験群■、測定の時期２、Ｈ１抗体価３２゜の欄
、 「１」を「２」と補正し表す。

１３、同、第１８頁、第５表においで、（参考資料４を
ご参照下さい。） １１）最上段のＨＩ抗体価の見出欄、 「６０」を１８０」と補正しトす。

（２）　　試験群■、測定の時期４、Ｈ１抗体価ン１２
８０　の欄、 ［−１」を「２」と補正します。

１４、　　同、第１９頁、第９〜１０行目、「対照豚」
を「対照豚（■群）」と補正します。

１５、　同、第１９頁、第１０行目、 「注射群（ＩＶＪを［注射群（ＩＩＩＪと補正します。

１６　　同、第２０頁、第６表において、（参考資料５
をご参照下さい。

山　■群の産子数総数の欄、 「８４」を１８２」と補正します。

（２）■群の産子数−腹平均の欄、 ｒ　１０．５　ｊをｒｌｏ、２５Ｊと補正します。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 初代豚腎培養（ＳＫ）細胞で増殖した弱毒日本脳炎ウィ
   ルスｍ株と、ＳＫ細胞で増殖した豚パルボウイルスｇ□
   Ｈ８−８Ｋ株を物理的処理により不活化したウィルス液
   とを混合し、安定剤を加え凍結乾燥してなる日本脳炎・
   豚パルボ混合ワクチン。