KR100583259B1 - 조류 레오바이러스의 신규한 항원 부류 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가금에서 장의 질병 상태에 관련된 조류 레오바이러스의 새로운 항원 부류를 제공한다. 또한, 본 발명은 새로운 유형의 조류 레오바이러스에서 유발되는 이러한 질병 상태에 대한 가금의 보호용 백신을 제공한다.

Description

조류 레오바이러스의 신규한 항원 부류{NOVEL ANTIGENIC CLASS OF AVIAN REOVIRUSES}
도1A는 식용 닭에 각각 백신접종을 한 경우와 백신접종을 하지 않은 대조군을 생후 항원투여를 한 날에 따라 발바닥 병변이 보호되는 정도를 나타냈다.
도1B는 사망률, 질병률, 발바닥 병변에 기초하여 대조군에 비해 백신접종을 한 경우의 보호 정도를 나타냈다.
도2A는 생후 1일에 ERS로 경구 감염된 닭과 생후 1일에 ERS로 피하 감염된 닭을 대조군과 비교하여 닭의 나이에 따른 성장지체를 나타냈다.
도2B는 생후 8일에 RES로 경구 감염된 닭과 생후 8일에 RES로 피하 감염된 닭을 대조군과 비교하여 닭의 나이에 따른 성장지체를 나타냈다.
도3A는 백신접종후 시간이 지남에 따른 혈청학상의 반응을 이덱스-적정농도(log2)로 나타냈다.
도3B는 1회 백신접종 후 항원투여된 것 및 2회 백신접종 후 항원투여된 것을 각각의 대조군과 비교하여 항원투여 후 시간이 지남에 따른 발바닥 병변 정도를 나타냈다.
본 발명은 조류 레오바이러스(reovirus) 및 살아있는 약화된 형태 또는 불활성화된 형태의 조류 레오바이러스를 함유하는 백신에 관한 것이다.
지난 수십 년동안 상업적 식용 닭의 생산은 가축 사육에서의 높은 효율성을 특징으로 하는 산업으로 진보하였다. 그러나, 사육 상황의 효율을 증가시키려는 강한 경향은 일부 본질적인 어려움을 극복하지 않고는 달성될 수 없다. 높은 밀도의 폐쇄된 공간에 감금된 동물 집단에서 자주 발생하는 감염성 질병의 발병률 증가가 가장 현저하다. 가금(家禽)에서 가장 파괴적인 질병 중 상당수가 항생제와 같은 치료제에 의한 치료 또는 백신접종에 의해 통제되거나 제한되었다. 그러나 불행하게도 약물로 통제되지 않고 적당한 백신접종 프로그램이 없는 복잡한 병인의 수많은 질병이 여전히 존재한다.
1970년대 후반 이래로 가금(家禽) 산업은 장(腸)의 질병을 앓고 있는 식용 닭에서 이러한 복잡한 질병과 직면해 왔다. 장염을 포함하여 병든 닭에서 다양한 질병 상태를 야기하는 이러한 질병 중의 하나는 주요한 임상적 증상과 육안 관찰을 통해 흡수불량 증후군(MAS)으로 명명된다. 또 다르게는, 이 질병은 감염성 왜소성 발육부진증후군, 허약한 새 질병 또는 약한 뼈 질병으로 명명된다. 수많은 분류된 질병 상태가 MAS와 연관되어 있음에도 불구하고, 모든 경우에 성장부진과 깃털 성장지체가 관찰된다. 게다가, 많은 다양한 기타의 증후와 손상, 예를 들면 사망, 묽은 액상 배설 및/또는 소화되지 않은 먹이의 배설, 췌장 위축, 전위, 뼈 변화, 흉선과 포낭의 위축 등이 MAS와 관련되어 있다.
Kouwenhoven 등(Avian Pathology 17, 879-897, 1988)은 MAS를 하기 5개의 기준에 의해 정의했다. 즉
(i) 하루된 병아리의 감염후 3주까지 성장 장애
(ⅱ) 배설물 중에 황적색 점액의 분비
(ⅲ) 혈장 알카라인 포스파타아제(ALP)활성의 증가
(ⅳ) 혈장 카로티노이드 농도(PCC)의 감소
(ⅴ) 육안으로 식별가능 정도로 확장된 경골주변 골단의 성장판
식용 닭에서 성장지체는 생후 1주일 또는 그 이전까지 명백해진다. 무리 중 5내지 20%는 병에 걸리고 생후 4주에 이 새들의 크기는 축사내에서 정상적으로 성장하는 새의 절반 이하일 것이다. 병에 걸린 무리는 불량한 먹이 전환율을 갖고 장은 약해지고 소화되지 않은 먹이를 함유한다.
MAS의 병인(病因)을 전적으로 이해할 수는 없으나, 이 증후군의 병인은 소화관 및 연관된 기관에 대한 감염성 물질의 직접적인 작용일 가능성이 있다. 이것은 또한 묽은 액상의 배설물 및/또는 소화되지 않은 먹이의 계속적인 배설을 설명할 수 있다.
여기서 설명된 징후는 체중 증가의 감소, 불량한 먹이 전환율 및 병 걸린 무리의 시장성 감소를 포함하여 일반적인 기능장애를 유발한다. MAS의 결과로 가금 산업은 매년 막대한 경제적 손실을 입게 된다. 따라서, 가금 산업은 식용 닭에서 관찰된 하나 이상의 분류된 질병 상태를 예방할 수 있도록, MAS를 제어하는 방법을 필요로 한다.
레오바이러스는 가금에 널리 퍼져있다. 레오바이러스는 다리의 관절 교갑과 건(腱)판을 지탱하는 주된 무게에 영향을 미치는, 관절염 상태(바이러스성 관절염/건초염으로 명명됨)를 일으키는 물질로 밝혀졌다.
또한 일부 보고에 의하면 MAS와 연관된 질병 상태를 보이는 닭에서 레오바이러스가 분리되었다고 한다. 이 보고에서는 레오바이러스가 하나 이상의 MAS 관련 질병 상태와 병인학적 관계를 갖는 것으로 추측하고 있으나, MAS에 레오바이러스가 연루되어 있다는 확실한 증거는 제시하고 있지 않다.
Van der Heide 등(Avian Diseases 25, 847-856, 1981)에서 레오바이러스는 임상적 설사를 하는 식용 영계의 장에서 분리되었다. 이 레오바이러스 분리체는 건초염 및 대퇴부 헤드 골절의 병변 및 골다공증을 유발할 수 있으나, 이 분리체가 실험적으로 레오바이러스에 감염된 닭에서 설사를 항상 유발하지는 않았다.
Page 등(Avian Disease 26, 618-624, 1982)은 절름발이, 왜소증, 이상한 깃털 생성을 가진 무리에서 레오바이러스를 분리했다. 감염되기 쉬운 식용 닭에게 경구 접종은 몸무게 증가, 깃털 생성 및 다수의 기관에서 유발된 병변에 대해서는 확실한 효과를 나타내었으나, 설사 또는 젖은 배설물(wet litter)의 유발에 관한 것은 보고되지 않았다.
Hieronymus 등(Avian Disease 27, 246-254, 1983)은 MAS가 의심되는 닭의 장에서 레오바이러스 균주에 대해 보고하였으므로, 감염성 건초염을 제어하기 위한 백신 균주로서 보편적으로 사용되는 레오바이러스 균주 S1133와 이들 균주의 항원적 관계를 결정했다. 저자는, 레오바이러스가 임상적 MAS에 걸린 닭에서 분리되었 다는 사실에도 불구하고, 레오바이러스가 MAS의 발병물질이라는 것은 입증되지 않았음을 확신한다.
Eidson 등(Poultry Science 64, 2081-2086, 1985)은 건초염뿐 아니라 MAS 문제를 가지고 있는 식용 닭 무리 중에서 Hieronymus 등에 의해 분리된 C08균주에서 유래된 불활성화된 레오바이러스 백신의 효과를 연구하였다. 백신이 식용 닭 집단의 체중에 긍정적인 효과를 주었지만, 관찰된 먹이 전환율에는 차이가 없었다. 더구나, 장염과 관련된 질병 상태, 예를 들면 젖은 배설물에 대한 어떠한 백신의 효과도 보고되지 않았다.
Rosenberger 등(Avian Disease 33, 535-544, 1989)도 사육하는 상업적 식용 닭의 건 및 골수에서 몇몇 레오바이러스 균주를 분리하였다. 레오바이러스 균주로 접종된 닭은 임상적 질병에 대해 조사되었고, 설사 또는 젖은 배설물의 징후는 보고되지 않았다.
Kouwenhoven 등(Avian Pathology 17, 879-892)도 흡수장애 증후군에서 레오바이러스의 역할에 대해 조사하였다. 저자는 유사한 사례에서 분리된 레오바이러스로는 MAS를 다시 유발할 수 없었으므로 레오바이러스가 MAS의 주된 병인학적 물질이 아니라고 결론내렸다. 레오바이러스와 아데노바이러스를 포함한 감염성 물질은 흡수장애 증후군에서 일종의 자극제로 작용하리라고 추측된다.
그러나, 전술한 간행물과 더불어 많은 다른 바이러스가 MAS와 연관되어 있다. 이것은 로타바이러스, 파르보바이러스, 엔테로바이러스류의 바이러스, 토가바이러스류의 바이러스, 코로나바이러스류의 바이러스, 아데노바이러스 및 칼리시 바이러스를 포함한다. 또는 박테리아가 병인에 연루되어 있다는 것이 제안되었다. 또한, 선행기술에 따르면 MAS와 같은 부류의 증후군은 진균독(mycotoxin)에 기인하므로, 진균독 또는 기타 독소는 MAS 유발 물질로써 간과될 수 없다고 생각된다.
최근에 간행된 리뷰(World Poultry, 14, 57-58, 1998)에서 맥널티(McNulty)는 MAS에 대한 당해 기술의 상태를 요약하였다. 맥널티는 MAS에 대한 백신의 비유용성을 강조하였고, 바이러스 분리 뿐아니라 지금까지 보고된 부류에서 분리된 시료의 바이러스학적 및 미생물학적 시험은 MAS 유발 물질의 확인에 관하여 유용한 결과를 제공하지 못하고 있다고 언급하였다. 맥널티는 이 접근이 유용한 결과를 산출할 것 같지 않다고 생각했다. 대신, MAS에 걸린 생산지에서의 단속 조처가 MAS를 제어하는 가장 좋은 방법이라 생각된다.
따라서, 닭이 걸리는 특정 장의 질환, 예를 들면 묽은 액상 배설물 및/또는 소화되지 않은 먹이를 배설하는 MAS와 연관된 장의 질환에 대한 유효한 보호를 유도하는 백신의 필요성이 여전히 존재한다.
또한, 조류 레오바이러스는 상당한 항원적 이질성을 나타내며 조류 레오바이러스의 새로운 항원 부류의 출현은 가금에서 레오바이러스 백신의 사용과 중대한 관련성을 가질 수 있다.
본 발명자는 조류 레오바이러스의 새로운 항원 부류를 지금 확인하였다. 또한, 새로운 항원의 부류에 속하는 조류 레오바이러스는 MAS와 연관된 상기 질병 상태, 예를 들면 묽은 액상 배설물 및/또는 소화되지 않은 먹이의 배설 및 성장지체 를 유발할 수 있음을 보여준다.
따라서, 본 발명의 제 1목적은 조류 레오바이러스의 새로운 항원 부류에 속하는 MAS와 같은 장의 질병 상태의 유발 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2목적은 새로운 항원 부류의 조류 레오바이러스에 의해 야기되는 질병에 대항하여 가금을 유효하게 보호할 수 있는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 3목적은 MAS와 연관된 장의 질병 상태에 대항하여 가금을 유효하게 보호할 수 있는 백신을 제공하는 것이다.
이 목적들은, 항원 부류에 속하는 조류 레오바이러스가 동물에서 항혈청을 유도할 수 있고, 상기 동물의 항혈청은 플라크 감소 분석에서 조류 레오바이러스 ERS(상기 ERS의 시료는 기탁번호 제99011475호로 영국의 살리스버리에 소재하는 ECACC에 기탁됨)에 의해 형성되는 플라크를 75% 이상 감소시키는 것을 특징으로 하는 조류 레오바이러스의 항원 부류에 속하는 조류 레오바이러스를 제공함으로써 달성될 수 있다.
이러한 조류 레오바이러스는 지금까지 알려지지 않은 항원성(실시예1, 표2, 표3)을 나타낼 뿐 아니라, 본 발명의 조류 레오바이러스가 식용 닭에 의한 묽은 액상 배설물 및/또는 소화되지 않은 먹이의 배설을 유발할 수 있으며, 어떤 경우에는 심지어 사망에 이르게 할 수 있다는 것이 관찰되었다. 따라서, 본원에서는 새로운 조류 레오바이러스를 장의 레오바이러스 균주(ERS)로 명명한다.
식용 닭 무리에서 젖은 배설물의 배설은 또한 연구중인 MAS에 걸린 식용 닭 에서 일반적으로 관찰되는 질병 상태중의 하나다. 더구나, 이 임상적 질병 상태는 MAS에 걸린 식용 닭에서 가장 뚜렷한 임상적 징후, 즉 성장지체의 원인 중 하나이다. 예를 들면, 본 발명의 조류 레오바이러스는 경구적으로 레오바이러스에 감염된 식용 닭에서 젖은 배설물의 배설을 유발하는 것으로 보인다. 즉, 새의 배설강 주변부에 풀이겨진(pasting) 깃털을 관찰할 수 있다.
실시예 중의 실험은 또한 새로운 조류 레오바이러스의 경구적 감염이 대조군 닭에 비해 감염된 식용 닭에서 성장지체를 일으킨다는 것을 보여준다.
플라크 감소 분석은 (조류 레오)바이러스 분리체 사이의 항원 관계를 결정하기 위한 기술로 널리 사용되는 분석이다(참조 예 Nersessian 등, Am. J. Vet. Res. 50, 1475-1480, 1989). 더구나, 본 발명의 목적을 위해 플라크 감소 분석의 상세한 설명이 실시예1에 제공된다. 명백히, 플라크 감소 분석에 사용되는 항혈청은 적절한 품질이어야 한다. 이러한 항혈청의 제조 방법은 또한 실시예1에서 설명된다.
일반적으로, 살아있는 조류 레오바이러스에 대항하여 생성된 적절한 항혈청은, 생후 3내지 4주된 SPF 닭에 1마리당 102.0-109.0TCID50, 바람직하게는 1마리당 103.0-106.0TCID50의 감염 적정농도(titre)를 갖는 살아있는 바이러스 균주를 피하로 또는 근육내로 접종함으로써 제조될 수 있다. 혈액은 감염후 3 내지 4주, 바람직하게는 감염후 4주에 채취될 수 있다. 또한, 제 1 감염후 3 내지 4주에 닭은 제 1 감염에 사용된 것과 거의 동일한 용량으로 동일한 살아있는 바이러스 균주로 재감염될 수 있다. 혈액은 제 2 감염후 2내지 4주에 채취된다.
불활성화된 조류 레오바이러스 균주에 대항하여 생성된 적절한 항혈청은 3내지 4주된 SPF 닭에 불활성화된 바이러스 제제를 피하로 또는 근육내로 접종함으로써 얻어질 수 있다. 불활성화 전의 제제의 감염 적정농도는 동물 1마리당 107.0-1011.0 TCID50, 더 바람직하게는 동물 1마리당 108.0-1010.0 TCID50이다. 혈액은 접종후 3내지 4주, 바람직하게는 접종후 4주에 채취될 수 있다. 닭은 또한 제 1 접종후 3내지 6주에 동일한 불활성화된 바이러스 제제로 재접종될 수 있다. 혈액은 제 2 접종후 2내지 4주에 채취된다.
본 발명의 새로운 조류 레오바이러스를 확인함으로써 조류 레오바이러스의 새로운 항원 부류에 의한 감염에서 야기되는 질병 상태에 대항하여 가금을 효과적으로 보호할 수 있는 새로운 조류 레오바이러스 백신을 제조할 수 있다. 특히, 새로운 조류 레오바이러스는 묽은 액상 배설물 및/또는 소화되지 않은 먹이의 배설 및 성장지체와 같은 질병 상태에 대하여 가금을 효과적으로 보호할 수 있는 새로운 조류 레오바이러스 백신의 제조를 가능하게 한다. 이러한 질병 상태는 또한 MAS와 연관되어 있다.
본 발명의 조류 레오바이러스는 또한 현장(field)에서 분리될 수 있다. 분리 방법의 중요한 측면은 바이러스 분리를 위한 출발점으로 사용되는 표적 동물의 확인이다. 이 목적을 위해 사용되는 전형적인 식용 닭은 다음의 징후를 보인다: 묽은 액상 배설물 및/또는 성장지체를 야기하는 소화되지 않은 먹이의 배설.
결과적으로, 병에 걸린 닭에서 장을 분리한 후, 적당한 완충액 중에 장기를 균질화시킨다. 그 다음에 균질화된 조직을 원심분리하고, 상층액을 0.2㎛의 세공 크기를 가진 필터를 통해 여과한다. 여과액의 시료에 새로이 준비된 1차적 닭 세포, 바람직하게는 닭의 간 배세포[chicken embryo liver(CEL)]를 첨가한다. 그리고 항온처리 후 4내지 8일째에 세포병적 효과(cytopathic effect;CPE)의 여부를 알기 위해 단일층을 조사한다. CPE가 없으면, 제 1 단일층의 결빙/해빙된 현탁액을 새로이 제조한 CEL 세포에 첨가한다. 제1계대(passage) 또는 제2계대 후에 CPE가 관찰되면, 바이러스는 식용 닭에서 묽은 액상 배설물 및/또는 소화되지 않은 먹이의 배설을 유발하는 생체내 특성에 의해, 그리고 하기한 바와 같이 특이적 폴리클론- 및 모노클론의 항체를 사용하여 면역-형광법(IFT)이나 플라크 감소 분석에서 결정된 항원적 특성에 의해 추가로 특징지워진다.
본 발명의 조류 레오바이러스의 분리 방법에 대한 자세한 설명이 실시예1에 개시되어 있다.
본 조류 레오바이러스의 분리 방법에서 바람직한 출발 물질로서 장이 사용되지만, 조류 레오바이러스는 또한 병에 걸린 식용 닭의 간 또는 이런 식용 닭에 의해 배설되는 배설물로부터 분리될 수 있다. 기타 기관이 본 발명의 조류 레오바이러스의 분리를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다는 점이 제외되어서는 안된다.
특히, 본 발명은 플라크 감소 분석에서 전술한 조류 레오바이러스 및 조류 레오바이러스 ERS에 의해 형성된 플라크를 80%이상, 바람직하게는 90%이상 감소시킬 수 있는 조류 레오바이러스에 대해 유도된 항혈청을 제공한다. 상기 ERS의 시료는 영국의 살리스버리에 소재하는 ECACC에 기탁번호 제99011475로 기탁되어 있다.
본 발명의 보다 더 바람직한 구체예는 폴리클론 항혈청과 모노클론항체(Moab)에 의해 특이적인 면역학적 반응양상을 보여주는 조류 레오바이러스를 제공한다. 이 특이적 반응 양상은 지금까지 알려진 조류 레오바이러스에 의해 나타난 것과 다르다.
모노클론 항체는 감염 물질의 특성을 확인하고 동일하거나 유사한 미생물의 여러가지의 분리체 사이의 유사점과 차이점을 결정하는데 사용된다. Vakharia등의 문헌(Proceedings of the International Symposium on adenovirus and reovirus infection in poultry, Rauishholzhausen, Germany, 1996, 295-304)은 9개의 항-레오바이러스 Moab의 판넬에 대해 개시했으며, 이들 Moab와의 반응성에 대해 조류 레오바이러스 류의 분리체를 시험하였다. Moabs 판넬(panel)의 다른 양상의 반응성으로 인해, 반응성 양상과의 관계를 토대로 분리체를 분류할 수 있었다.
본 발명의 구체예에서 전술한 조류 레오바이러스는 (ⅰ) 조류 레오바이러스 분리체, 바람직하게는 기본형 레오바이러스 균주1133에 대항하여 생성된 폴리클론 항혈청과 IFT에서의 반응성, (ⅱ) Moabs INT 13-06,INT 14-11 및 15-01 INT와 IFT에서의 반응성 부재(시료는 각각 기탁번호 제99011472, 9911473과 99011474로 ECACC에 기탁됨)에 의해 추가로 특성화된다.
판넬-양상에 의해 정의되는 본 발명의 조류 레오바이러스는 실시예1과 표3에 입증된 바와 같이 새로운 항원 유형의 레오바이러스를 나타낸다. 표3에 나타난 많은 선행기술의 레오바이러스 균주가 MAS와 연관된 징후와 병변을 나타내는 식용 닭의 조직(장을 포함)에서 분리되었다는 사실에도 불구하고, 상기 정의된 새로운 항원 특성을 갖는 본 발명의 조류 레오바이러스는 선행기술에서 개시된 바 없다.
더욱 바람직한 본 발명의 조류 레오바이러스는 본 발명의 조류 레오바이러스에 대해 특징적인 조류 레오바이러스 ERS(분리체1)이며, 상기 시료는 기탁번호 제99011475호로 ECACC에 기탁되어 있다.
본 발명의 조류 레오바이러스는 살아있거나, 생(生)약화되거나 또는 불활성화된 형태일 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 MAS가 관찰되는 장의 질병 상태와 같은 조류 레오바이러스 감염에서 야기되는 질병 상태에 대한 가금의 보호용 백신을 제공하는데, 본 발명의 조류 레오바이러스 및 약학적 허용 담체나 희석제를 포함한다.
본 발명의 조류 레오바이러스는 살아있는 약화된 또는 불활성화된 형태로서 백신 중에 포함될 수 있다. 만일 조류 레오바이러스가 살아있는 약화된 또는 불활성화된 형태라면, 상기에 전술한 MAS-연관된 질병 상태를 유도하는 조류 레오바이러스의 성질은 상당히 감소되거나 완전히 없어진다.
본 발명의 조류 레오바이러스의 약화는 예를 들면 Gouvea 등의 문헌(Virology 126, 240-247, 1983)에 개시된 것과 같이 상기 목적을 위한 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 간단히, 표적 동물에서 바이러스를 분리한 후에 바이러스 현탁액은 1차적 닭의 배 섬유아세포(CEFs)에 접종된다. 분리체가 CPE를 생성할 수 없으면, CPE가 관찰될 때까지 바이러스를 반복해서(예, 3-10번) 접종한다. CPE가 보이자마자 세포와 세포 배양액을 수집하고, 냉동 및 해빙시 켜, 원심분리로 맑게한 다음, 조류 레오바이러스 분리체를 함유하는 상층액을 분할하여 -20℃에서 저장한다. 이 과정을 반복하여(예, 10-100번) 바이러스를 더욱 약화시킬 수 있다.
본 발명의 백신은 예를 들면 시판용 살아있는 불활성화된 레오바이러스 백신에 흔히 사용되는 통상적인 방법에 따라 준비될 수 있다. 수의학적 백신 조성물의 제조는 특히 "Handbunch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin"(편집: Mays,A.등, Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Germany, 1984) 및 "Vaccines or Veterinary Applications"(편집: Peters,A.R.등, Butterworth-Heinemann Ltd,1993)에 설명되어 있다.
간단히, 감염되기 쉬운 기질에는 본 발명의 조류 레오바이러스를 살아있는 또는 살아있는 약화된 형태로 접종하고, 바이러스가 소정의 감염 적정농도 또는 항원 함량(질량)으로 복제될 때까지 증식시킨다. 그후에 물질을 보유한 레오바이러스를 수거하고 예방적 활성을 갖는 약학적 조성물로 제제화할 수 있다.
상기에서 정의된 조류 레오바이러스의 복제에 사용할 수 있는 모든 기질은, 조류 레오바이러스가 기질에 적응한 후 필요하다면, 본 발명에 따른 백신을 생성하는데 사용될 수 있다. 적당한 기질은 1차(조류) 세포 배양물[예를 들면, 닭 간의 배세포(CEL), 닭의 배 섬유아세포(CEF) 또는 닭의 신장세포(CK)], 포유동물 세포주[예를 들어, 베로(Vero) 세포주] 또는 BGN-70세포주, QT-35, QM-7 또는 LMH같은 조류 세포주를 포함한다. 대개, 세포의 접종 후에 바이러스를 3-10일 동안 증식시키고, 그 후 세포 배양 상층액을 수거하고, 필요한 경우 세포 잔해를 제거하기 위해 여과하거나 원심분리한다.
대안적으로, 본 발명의 조류 레오바이러스를 배(胚)화된 달걀에서 증식시킨 후, 통상적인 방법으로 조류 레오바이러스 물질을 수거할 수 있다.
살아있는 약화된 바이러스를 함유하는 본 발명의 백신은 동결건조된 형태나 (동결된) 현탁액의 형태로 제조되어 시판된다. 백신은 상기 조성물에 통상적으로 사용되는 희석제 또는 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 담체는 안정화제, 보존제 및 완충액을 포함한다. 적당한 안정화제는 예를 들어 SPGA, 탄화수소(예로, 소비톨, 만니톨, 전분, 자당, 덱스트란, 글루타메이트, 또는 글루코스), 단백질(예로, 건조된 우유혈청, 알부민 또는 카세인)또는 그것의 분해 산물이다. 적당한 완충액은 예를 들어 알칼리 금속 포스페이트이다. 적당한 보존제는 티메로살, 메티올레이트, 겐타마이신이다. 희석액은 물, 수성 완충액(예로 완충 염수), 알코올 및 폴리올(예로 글리세롤)이다.
필요한 경우, 본 발명의 살아있는 백신은 보조제를 함유할 수 있다. 보조적 활성을 가진 적당한 화합물과 조성물의 예는 불활성화된 백신의 제조를 위해 아래에 언급된 것과 동일하다.
본 발명의 살아있는 백신은 예를 들어 근육내, 피하내 주사에 의한 투여가 가능하지만, 살아있는 백신은 조류 레오바이러스 백신접종에 통상적으로 사용되는 저가의 대량 투여 기법에 의해 투여되는 것이 바람직하다. 이 기법은 음료수 및 분무 백신접종을 포함한다.
살아있는 백신의 투여를 위한 또 다른 방법은 난내(in ovo) 투여, 점안 투여 및 부리를 담그는 투여(beak dipping administration)를 포함한다.
더 바람직한 구체예로 본 발명은 MAS가 관찰되는 것과 같은 장의 질병 상태에 대하여 불활성화된 형태의 조류 레오바이러스를 포함하는 백신을 제공한다. 불활성화된 백신의 주된 장점은 높은 레벨의 보호 항체가 장기간 지속된다는 것이다. 이러한 성질로 인해,불활성화된 백신이 종축 백신접종에 특히 적합하게 된다.
증식 단계후 수거된 바이러스를 불활성화하는 목적은 바이러스의 재생성을 방지하는 것이다. 일반적으로, 이것은 화학적 또는 물리적 수단으로 수행될 수 있다. 화학적 불화성화는 예를 들어 효소, 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 에틸렌-이민 또는 그것의 유도체로 바이러스를 처리함으로써 수행될 수 있다. 필요한 경우, 불활성화된 화합물은 나중에 중화된다. 포름알데히드로 불활성화된 물질은 예를 들어 티오설페이트로 중화될 수 있다. 물리적 불활성화는 에너지가 충분한 방사능, 예를 들면 UV 광 또는
Figure 112000001696871-pat00001
-선을 바이러스에 조사함으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 필요한 경우, 처치후 pH 가 약 7의 값으로 조정될 수 있다.
불활성화된 조류 레오바이러스를 함유하는 백신은 예를 들면 이 목적에 적당한 전술한 약학적 허용 담체 또는 희석제를 하나 이상 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 불활성화된 백신은 보조적 활성을 갖는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 이 목적에 적당한 화합물이나 조성물은 알루미늄 히드록시드, -포스페이트, -옥시드, 또는 베이올 에프
Figure 112000001696871-pat00002
(Bayol F
Figure 112000001696871-pat00003
) ,마르콜 52
Figure 112000001696871-pat00004
(Marcol 52
Figure 112000001696871-pat00005
)와 같은 광유, 비타민 E 아세테이트와 같은 식물유 및 사포닌을 주성분으로 하는 수중유형 또는 유중수형 유제를 포함한다.
불활성화된 백신은 대개 비경구적으로, 즉 근육내 또는 피하내로 투여된다.
본 발명의 백신은 활성 성분으로서 조류 레오바이러스를 유효량, 즉 독성 바이러스에 의한 공격(항원 투여)에 대항하여 백신 접종된 새 또는 그들의 자손에서 면역을 유도할 조류 레오바이러스 물질을 면역화시키는 양으로 포함한다. 본원에서 면역은 백신접종되지 않은 군에 비해 백신접종후 새 집단에서 상당히 높은 레벨의 보호를 유도하는 것으로 정의된다.
통상적으로, 본 발명의 살아있는 백신은 새 1마리 당 102-109 TCID50 , 바람직하게는 102-106TCID50 의 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 불활성화된 백신은 새 1마리당 104-1010TCID50 과 등가의 항원을 포함한다.
본 발명의 조류 레오바이러스 백신은 닭에 효과적으로 사용될 수 있으나, 칠면조, 기니아 파울(guinea fowl) 및 메추라기와 같은 기타의 가금도 효과적으로 백신으로 접종될 수 있다. 닭은 식용 닭, 복제 가축, 및 알을 낳는 가축을 포함한다.
MAS가 관찰되는 것과 같은 장의 질병 상태가 식용 닭에서 주로 보고되었기 때문에, 본 발명은 바람직하게 MAS가 관찰되는 것과 같은 장의 질병 상태에 대항하여 식용 닭의 보호에 사용되는 백신을 제공한다.
본 발명에 따른 살아있는 또는 불활성화된 백신을 투여받은 동물의 나이는 현재 시판되는 살아있는- 또는 불활성화된 조류 레오바이러스 백신을 투여받은 동 물의 나이와 동일하다. 예를 들면, 식용 닭은 생후 1일부터, 본 발명의 살아있는 약화된 백신으로 직접 백신접종된다. 식용 닭의 종축과 같은 부모 가축의 백신접종은 본 발명의 살아있는 약화된 또는 불활성화된 백신, 또는 양자의 혼합으로 수행될 수 있다. 이런 유형의 면역주사 프로그램의 장점은 수직적으로 새끼에게 전달되는 모계 유래의 항체에 의해 제공된 생후 1일된 자손의 직접적인 보호를 포함한다. 전형적인 종축의 백신접종 프로그램은 생후 6주의 종축에게 살아있는 약화된 백신을 접종한 후 생후 14-18주에 불활성화된 백신을 접종하는 것을 포함한다. 대안적으로, 살아있는 백신을 접종한 후 생후 10-12주에 및 16-18주에 불활성화된 백신으로 2회접종할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조류 레오바이러스외에 가금에 감염되는 기타 병원균의 하나 이상의 백신 성분을 포함하는 백신 조합을 포함한다. 본 발명의 조류 레오바이러스와 항원적으로 구별되고 건초염과 연관된 조류 레오바이러스 균주를포함하는, 가금에 감염되는 이러한 다른 병원균을 가진 조류 레오바이러스를 의미한다.
바람직하게는 백신 조합에서 백신 성분은 가금에 감염되는 병원균의 살아있는 약화된 또는 불활성화된 형태이다.
특히, 본 발명은 백신 조합을 제공하며 이 백신 조합의 모든 백신 성분은 불활성화된 형태이다.
백신 조합은 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 뉴캐슬 질병 바이러스(NVD), 감염성 포낭 질병 바이러스(IBVD), 가금 아데노바이러스(FAV), EDS바이러스 및 칠 면조 비기관지염 바이러스(TRTV)의 하나 이상의 (불활성화된) 백신 균주를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 프레임워크에서, 뒤따르는 하기 미생물 및 하이브리도마 세포주는 1999년 1월 14일에 영국의 살리스버리에 소재하는 유럽 동물 세포 배양물 수집소(ECACC)에 기탁되었다:
바이러스/하이브리도마 기탁번호
조류 레오바이러스 ERS 99011475
INT 13-06 99011472
INT 14-11 99011473
15-01 INT 99011474
실시예
실시예1
새로운 조류 레오바이러스의 특징규명
A
새로운 조류 바이러스의 분리
장 및/또는 간은 각각 소화 문제 및 성장지체를 야기하는 젖은 배설물을 갖는 닭에서 분리되었다. 장기는 각각 항생제를 포함한 PBS 및 유리 진주(2mm)를 사용하여 균질기에서 최대 속도로 20분 동안 균질화시켰다. 그 다음에 균질화된 조직을 원심분리하였다. 장 균질물은 4000rpm에서, 간은 1200rpm에서 양쪽 모두 15분간 원심분리하였다. 다음에 상층액은 감소하는 세공 크기(5, 1.2, 0.45, 0.2-㎛)를 가진 필터로 가압 여과되었다. 0.2-㎛필터를 통과하는 현탁액의 100㎕를 조직 배양 플라스크에 존재하는 새로이 제조된 1차 닭 간의 배세포(CEL)에 첨가하였다. 단일층을 항온 처리한 후 4내지 8일째에 세포병적 효과(CPE)의 존재에 대해 검사하였다. CPE가 없으면 단일층을 -20℃에서 결빙시키고, 24시간 후에 단일층을 해빙시켰다. 다음에, 이 결빙/해빙된 현탁액 1㎖를 새로이 제조된 CEL 세포에 첨가하였다. CPE가 보이지 않으면 4-8일후에 배양물은 CEL세포 상에서 바이러스 성장에 대하여 음성인 것으로 생각되었다. 제1계대 또는 제2계대 후에 CPE가 관찰되는 경우, 바이러스는 플라크 감소 분석 및 면역-형광법(IFT)에 의해 추가로 특성화되었다.
B
플라크 감소 분석에 의한 새로운 조류 레오바이러스의 시험관내 특성규명
1. 기타 조류 레오바이러스 균주에 대항하는 항혈청의 생성
균주ERS(살아있음):
생후 3주된 SPF 닭 10마리에 1마리당 ERS균주(분리체-2) 105.8TCID50을 피하로 감염시켰다. 감염 후 3주에 혈액을 채취하고, 혈청을 분리하여 동물에게 다시 1마리당 105.6 TCID50으로 감염시켰다. 2회 감염후 2주에 혈액을 채취하고 혈청을 분리했다. 획득후, 모든 혈청을 56℃에서 30분간 가열하여 불활성화시키고, 소량으로 분할하여 -20℃에서 보관하였다.
균주2177(살아있음):
생후 4주된 SPF닭 15마리에 1마리당 104.2TCID50을 피하로 감염시켰다. 감염 후 4주에 혈액을 채취하고 혈청을 분리시켰다. 수득한 후, 모든 혈청을 56℃에서 30분간 가열 불활성화시키고, 소량으로 분할하여 -20℃에서 보관하였다.
균주1733 및 2408(불활성화됨):
생후 4주된 SPF 닭 12마리에 W/0형 유제를 보조제로 사용한 조류 레오바이러스 균주 1733 또는 2408 중의 하나를 근육내로 접종한다. 동물 투여량: 동물 1마리당 490 엘리사 단위; 동물1마리당 107.0-1010.0 TCID50의 불활성화전 감염 적정농도를 나타냄. 감염후 4주에 혈액을 채취하고 혈청을 분리시켰다. 수득한 후, 모든 혈청을 56 ℃에서 30분간 가열 불활성화시키고, 소량으로 분할하여 -20 ℃에서 보관하였다.
조류 레오바이러스 균류를 함유하는 불활성화된 시판용 백신:
생후 3-4주된 SPR 닭 10 마리에 다음의 시판되는 불활성화된 조류 레오 바이러스 백신 중의 하나를 근육이나 피하로 접종하였다: ISBI, 포트 도지(Fort Dodge); 카케트수켄(Kaketsuken) 및 인터베트 인터내셔널 BV(Intervet International BV). 감염후 3 주에 혈액을 채취하고 혈청을 분리시켰다. 수득한후, 모든 혈청을 56℃에서 30 분간 가열 불활성화시키고, 소량으로 분할하여 -20 ℃에서 보관하였다.
상기 제조된 혈청은 IFT와 플라크 감소 분석에서 사용되었다.
2. 면역형광 시험(IFT)
IFT는 하기 C에 기재된 것과 거의 동일하게 수행된다. 간단히, 베로(Vero)세포는 합류될 때까지 96-웰 폴리스티렌 미소 적정농도 플레이트에서 성장되었다. 다른 단일층에 레오바이러스 균주1133을 접종했다. 닭 혈청 100㎕을 플레이트의 첫번째 웰에 첨가했다. 연속적인 3배 희석을 수행하였다. 항온처리 및 세척 후에, 1:100으로 희석된 형광 이소티오시아네이트-표지된 염소-항-닭과 플레이트를 반응시켰다. 형광의 존재는 형광 현미경으로 관찰되었다. 적정농도(혈청의 질)는 종말점 희석에 의해 측정된다. 이것은 혈청을 최대로 희석한 것으로, 여전한 깨끗한 형광 신호를 유도할 수 있다. 플라크 감소 시험에 사용된 혈청에 대한 IFT의 결과를 표1에 제시하고 있다.
조류 레오바이러스 균주에 대한 혈청 최종 희석 농도(log2로 표시)
2177 2025(11.0)
ERS 6075(12.6)
1733 6075(12.6)
2408 18225(14.2)
아르박스(Arvax) 75(6.2)
노빌리스 레오(Nobilis Reo) 18225(14.2)
트리 레오(Tri Reo) 6075(11.6)
오일박스 레오(Oilvax Reo) 18225(14.2)
음성 혈청(Negative serum) <3(<1)
노빌리스 레오(Nobilis ReoTM) 인터베트 인터내셔널(Intervet international) b.v에서 시판
아르박스(ArvaxTN) ISBI에서 시판
트리 레오(Tri ReoTM ) 포트 도지에서 시판
오일박스 레오(Oilvax ReoTM) 카케트수켄에서 시판
3. 플라크 감소 분석
새로운 항원 부류에 속하는 조류 레오바이러스들 사이의 항원적 관계를 결정하고 알려진 조류 바이러스와 새로운 조류 바이러스를 구별하기 위해 적당한 재질의 항혈청을 플라크 감소 분석에 사용하여야 한다(아르박스(Arvax) 항혈청을 제외한 모두가 필요로 하는 품질의 항혈청임). ERS 항혈청은 살아있는 ERS 분리체 1 및 살아있으면서 불활성화된 ERS 분리체 2에 대하여 생성되었다.
새로이 제조된 CEL은 5% 태내 송아지 혈청과 항생제를 보충한 조직배양 배지 중에 밀리리터당 106세포수의 최종 농도로 재현탁되었다. 60-mm 조직 배양 접시를 5-㎖ 세포 현탁액으로 충전시키고 37 ℃에서 24시간 동안 항온처리하였다.
다음날, 조사할 바이러스를 항생제가 있는 배지에서 플라스틱 튜브로 희석시켰다. 10-1에서 10-7로의 희석액이 제조되었다. 이어서, 각 희석액 200㎕를 시험할 혈청의 50㎕와 혼합했다. 이 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 음성 대조군으로서 200㎕의 바이러스 희석액을 50 ㎕의 배지와 혼합했다.
60-㎚조직 배양 접시에 있는 단일막 상부의 배지를 폐기하였다. 이어서, 100㎕의 기타 바이러스 혼합액(혈청과 함께 또는 혈청없이)을 융합성 단일층 위에 첨가하였다. 각각 바이러스 혼합액에 대해 2개 이상의 단일층(접시)이 감염되었다. 감염된 단일층을 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이어서, 감염된 단일층은 5 ㎖의 한천(agar)-용액(배지, FCS, 항생제를 포함; 최종 한천농도 3.0%;최종 FCS 농도 2.5%)으로 덮었다. 접시를 37℃에서 4일동안 항온처리하였다. 이어서, 각 조직 배양 접시에 2-㎖의 중성 레드 용액(0.02%)을 첨가했다. 37℃에서 4시간동안 항온처 리한 후, 접시마다 플라크의 수를 세었다. 150개 이하의 플라크를 갖는 조직 배양 접시만 계수했다.
플라크 감소는 다음과 같이 계산된다: 혈청이 없는 특정 희석액에서 특정 바이러스의 플라크 수를 100%로 설정한다. 다음에, 이것을 혈청이 있는 동일한 바이러스 희석액에서의 플라크의 수와 비교한다.
다른 바이러스 및 시험 혈청을 사용한 첫번째 실험의 결과를 표 2a에 제시하고 있다. 표 2b는 바이러스 및 표지된 혈청을 사용한 두번째 실험의 결과를 보여준다. 백신 접종후 5주에 혈액을 채취한 것을 제외하고는, 불활성화된 1733/2408 균주에 대해 전술한 바와 같이 불활성화된 ERS 백신에 대한 혈청이 생성되었다.
바이러스 혈청
1733 2408 2177 ERS-2 노빌리스 레오 아르박스 트리 레오 오일박스 레오 음성
불활성 불활성 생존 생존 불활성 불활성 불화성 불활성 -
ERS-1 0* 0 0 89 -
ERS-2 0 0 0 91 0 0 0 0 -
ERS-3 0 100 -
1733 91 85 -
2408 91 87 -
2177 85 83 -
K255 91 85 98 -
*% 플라크 감소
-참조
바이러스 혈청
ERS-2 생존 ERS-1 생존 불활성화된 ERS 백신 1133 생존
ERS-2 95* 81 89 12
ERS-1 100 100 nd nd
*% 플라크 감소
nd:수행되지 않음
C. IFT를 사용한 새로운 조류 바이러스의 시험관내 특성 규명: 항혈청 판넬 반응 양상
폴리클론 항혈청은 토끼(1-1,5kg)를 정제된 조류 레오바이러스 균주1133로 감염시켜 제조하였다. 1회 감염후 28일 및 84일에 2회 예방 주사를 놓았다. 마지막 주사후 14일에 혈액을 채취하고 혈청을 분리하였다.
다른 조류 레오바이러스 균주는 다른 Moab로 특성이 규명되었다. 1차 CEL세포를 96-웰 폴리스티렌 미소 적정농도 플레이트에서 성장시켰다. 감염되지 않은 세포는 대조군으로 작용하였다. 5% C02로 37℃에서 2-4일 항온처리한 후 감염된 단일층을 저온의 96% 에탄올로 고정시켰다. 알코올을 버리고, 플레이트를 세정 완충액으로 세척하였다. 그리고, PBS에서 1:50이나 1:200으로 희석된 100㎕의 다른 하이브리도마 세포 배양 상층액 또는 1:50으로 희석된 토끼 폴리클론 혈청(토끼 68A)을 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 60-90분간 항온처리되고 세정 완충액으로 두번 세척하고 1:100으로 희석한 형광 이소티오시아네이트로-표지된 토끼-항마우스-또는 1:100으로 희석힌 이소티아네이트로-표지된 염소-항-토끼 혈청과 반 응시켰다. 이어서, 플레이트를 세척하고 글리세롤/PBS 용액(1:1)으로 고정했다. 형광의 존재는 형광 현미경으로 관찰되었다.
이 실험에 사용된 항혈청 판넬은 다음의 폴리클론 항혈청을 포함하며 Moab는 기본형 조류 레오바이러스 균주1133에 대하여 생성되었다.
토끼 68A 토끼 폴리클론 항혈청
Moab 154 바크하리아 등.1996(앞에)
Moab 14-67 인터베트 인터내셔널 B.V
Moab INT 13-06 ECACC 기탁번호 제99011472호
Moab INT 14-11 ECACC 기탁번호 제99011473호
Moab 15-01 INT ECACC 기탁번호 제99011474호
전술한 방법으로 얻어진 조류 레오바이러스 분리체는 이 항혈청 판넬과의 반응성에 의해 추가로 특성 규명되었다. 새로운 레오바이러스 분리체는 폴리- 및 모노클론 항체의 판넬과 특별한 반응 양상를 갖는다. MAS 및 건초염 부류의 사례에서 분리된 지금까지 알려진 조류 레오바이러스 균주(S-1133에서 C08까지)는 새로운 양상에 따라 반응하지 않는다(참조 표3).
새로운 반응 양상 양성: 폴리클론 토끼 68A, 154, 14-67
음성: INT 13-06, INT14-11, 15-01 INT
토끼68A 154 14-67 INT 14-11 INT13-06 15-01 INT
바이러스
S-1133 + + + + + +
1133 + + + + + +
2408 + + + + + +
UM 203 + + + + + +
WVU1675 올슨 + + + + + +
6261 + + + + +
엔테로박스TM + + + + + +
텐시노박TM + + + + + +
1733 + + + + + -
2177 + + + - - +
206691 + + + - - +
CO8 + + + - + +
ERS 분리체
ERS-1 + + + - - -
ERS-2 + + + - - -
ERS-3 + + + - - -
ERS-4 + + + - - -
ERS-5 + + + - - -
ERS-6 + + + - - -
ERS-7 + + + - - -
ERS-8 + + + - - -
ERS-9 + + + - - -
ERS-10 + + + - - -
ERS-11 + + + - - -
ERS-12 + + + - - -
ERS-13 + + + - - -
엔테로박스TM 및 텐시노박TM 은 쉐링-플라우(Schering-Plough) 동물 건강 및 인터베트 주식회사에서 시판되는 조류 레오바이러스 백신이다.
D
새로운 조류 레오바이러스의 생체내 특성 규명
정제된 조류 레오바이러스 ERS 플라크를 사용한 실험적 감염
실험1
생후 1일된 SPF-닭 30마리를 정제된 레오바이러스 ERS 플라크로 경구 감염시 켰다(분리체1). 감염후 4, 7 및 10일에 10마리 동물에서 간을 분리하고 현미경적 병변에 대해 조사하였다.
실험2
생후 1일된 레오바이러스에 대한 모계의 항체를 가진 30마리의 식용 닭을 정제된 레오바이러스 균주 ERS 플라크를 사용하여 경구로 감염시켰다. 감염 후 7, 10일에 동물의 임상적 증상을 관찰했다. 젖은 배설물에 특히 주의했다.
실험3
생후 1일된 레오바이러스에 대항하는 모계의 항체를 가진 식용 닭 30마리를 정제된 레오바이러스 균주 ERS 플라크를 사용하여 경구로 감염시켰다. 감염 후 1, 2, 4주에 군당 10마리 동물의 체중을 재고, 성장지체를 조사하였다.
실험4
생후 1일된 레오바이러스에 대한 모계의 항체를 가진 군당 15마리의 식용 닭을 정제된 레오바이러스 균주 ERS(분리체-2) 플라크를 사용하여 생후 1일 또는 1주에 경구로 또는 피하로 감염시켰다. 같은 나이와 기원의 동물 15마리는 감염되지 않았고, 음성 대조군으로 작용하였다. 성장지체를 조사하기 위해 동물은 7주동안 매주 동물의 체중을 측정했다.
결과
실험1
레오바이러스를 사용하여 경구로 감염시킨 생후 1일의 감염된 SPF-닭은 감염 후 4내지 10일에 간세포 및/또는 쿠퍼(Kupffer) 세포에서 다중병소의 공포(액포)를 형성했다.
실험2
경구 감염후 10일에 식용 닭은, 동일한 조건하에서 동일 나이 및 기원의 비감염된 식용 닭 대조군과는 대조적으로 새의 배설강 주위에 풀이겨진 깃털로 관찰할 수 있는 묽은 액상 배설물을 유발하는 장염을 나타내었다.
실험3
생후 1일된 경구로 감염된 식용 닭은 1, 2 또는 4주에 121.9, 327.0 또는 913.1g의 체중을 가졌다. 반대로, 동일 조건하에서 기른 같은 나이 및 기원의 비감염된 식용 닭은 1, 2 또는 4주에 134.8, 337.6, 999.9g의 체중을 갖는다.
실험4
결과는 도2A 및 2B에 나타낸다. 생후 7주가 되었을때, 경구 또는 피하의 경로를 통해 생후 1일에 감염된 동물은 비감염된 대조군 동물에 비해 약 34%의 성장지체를 나타낸다. 생후 7주에서 비감염된 대조군 동물 대 감염된 동물 사이의 체중의 비는 2469g 대 1635g이다.
생후 7주에, 생후 1주일에 구강 또는 피하의 경로를 통해 감염되지 않은 대조 동물에 비해 약 25%의 성장지체를 보였다. 생후 7주에, 감염되지 않은 대조군 동물 대 감염된 동물 사이의 체중 비는 2469g대 1842g이다.
결론적으로, 레오바이러스 균주 ERS는 성장지체를 유발할 수 있다.
실시예2
동물 백신 연구
A
불활성화된 조류 레오바이러스 백신의 준비
1차적 CEL 세포를 1×106세포/㎖의 최종 농도로 제조하였다. 세포는 0.1% 항생제 및 5% 태내 송아지 혈청을 함유하는 이글스(Eagles) MEM에서 배양되었다. 이 세포 현탁액의 25㎖에 0.1㎖의 레오바이러스 분리체 ERS(분리체 1)를 가했다. 5일동안 37℃의 고습도 배양기에서 항온처리한 후, CPE는 선명하게 보이고 단일층은 완전히 파괴되었다. 감염된 세포 현탁액의 감염성 적정농도는 4.2 log10 TCID50/㎖이다. 레오바이러스는 감염된 세포 현탁액에 포름알데히드를 0.2% 의 최종 농도로 첨가함으로써 불활성화되었다. 현탁액은 37℃에서 48시간 동안 항온처리되었다. 그후 포름알데히드를 균등한 몰 양의 아황산수소나트륨으로 중화시켰다. 불활성화된 레오바이러스는 기타의 불활성화된 레오바이러스 백신을 제조하기 위해 사용되었다. 불활성화된 레오바이러스 현탁액을 광유 상(phase)과 45:55의 비로 혼합했다(유중 수형 유제).
백신접종
생후 3-4주된 SPF 동물은 불활성화된 레오바이러스 백신(동물 1마리당 0.5㎖)을 사용하여 백신접종되었다. 백신접종후 2, 4 및 6 주에 레오바이러스에 대한 항체의 존재를 알기 위해 혈청을 조사하였다. 백신접종 후 6주에 동물은 발바닥(footpad) 경로를 통해 항원투여(challenge)되었다. 항원투여에 사용된 바이러스는 병원적 상동성 레오바이러스 균주였다(동물 1마리당 2.2 log TCID50). 발바닥과 경골의 염증의 정도와 변색을 2주동안 기록하였다. 발바닥 염증 누적치가 감염되지 않은 항원투여된 대조군의 발바닥 염증의 평균에서 2개의 표준 편차를 뺀것보다 적으면 닭은 항원투여에 대해 보호되는 것으로 생각되었다.
전술한 것과 유사한 연구에서, 동물은 생후 5주에 항원투여되고 심한 항원투여에 대한 보호는 사망률, 질병률 및 발바닥 손상에 의해 평가되었다.
결과
보호 데이터는 도1A 및 1B에서 도시된다. 백신접종된 닭은 대조군에 비해 현저히 감소된 발바닥 염증 누적치를 보였는데, 이는 백신접종된 닭이 심한 레오바이러스 항원투여에 대해 보호된다는 것을 의미한다. 또한, 사망률과 질병률에 기초한 보호 데이터는 심한 항원투여에 대한 유의성 있는 보호를 나타낸다.
B.
백신접종
3-4주된 SPF 동물에 전술한 것과 유사한 불활성화된 ERS 레오바이러스 백신(분리체2)을 근육내로 접종하였고, 1회 접종 후 6주에 재접종하였다. 같은 나이와 기원의 백신접종되지 않은 동물이 대조군으로 작용한다. 1회 백신접종 후 2, 4, 5, 6주에, 그리고 2회 접종후 2주에 이덱스 엘리사(Idexx ELISA)를 사용하여 레오바이러스에 대항하는 항체의 존재 여부를 알기 위해 혈청을 조사하였다. 1회 접종후 6주 또는 2회 접종후 2주에 동물은 병원성 레오바이러스 균주 ERS로 발바닥 경로를 통해 항원투여되었다. 발바닥과 경골의 염증과 변색 정도의 평균 병변 점수는 항원투여 후 14일의 기간동안에 매일 측정되었다.
결과
불활성화된 레오바이러스 ERS 백신에 의해 유도된 혈청학상의 반응은 1회 백신접종후 4주에 증가되었고, 1회 백신접종후 5내지 6주사이에 안정화되었다. 2회 백신접종은 2회 백신접종 후 2주에 약 10 log2에서 12 log2 까지의 증가를 야기하였다(도3). 도3B에서 1회 백신접종 후 5주 또는 2회 백신접종후 2주에 항원투여된 백신접종된 또한 백신접종되지 않은 닭에 대한 데이터를 도시하고 있다. 백신접종된 모든 닭은 백신접종되지 않은 것에 비해 발바닥 및 경골 병변에 있어서 유의성있는 감소를 나타내었다. 백신접종된 모든 닭의 발바닥 염증 누적치가 백신접종되지 않고 항원투여된 대조군의 발바닥 염증의 평균에서 2 표준 편차를 뺀 것보다 적었는데, 이는 모든 동물이 심한 REO 항원투여에 대해 보호됨을 의미한다. 일부 완화된 발바닥 종창이 백신접종된 군에서 관찰으나, 이 병변은 일시적인 성질의 것이었다. 더구나, 일시적인 발바닥 병변은 1회 백신접종된 동물에 비해 2회 백신접종된 동물에서 적었다.
본 발명에서는 새로운 항원 부류의 조류 레오바이러스, 이를 포함하는 백신 및 이들의 제조 방법을 제공함으로써 MAS와 관련된 장의 질병 상태로부터 유효하게
가금을 보호할 수 있다.

Claims (12)

  1. 조류 레오바이러스(reovirus)의 항원 부류에 속하는 조류 레오바이러스로서, 상기 조류 레오바이러스는
    (i) 동물에서 항혈청을 유도할 수 있고, 상기 항혈청은 플라크 감소 분석에서 조류 레오바이러스 ERS에 의해 형성되는 플라크를 75%이상 감소시키며, 상기 조류 레오바이러스 ERS의 시료는 기탁번호 제99011475호로 ECACC에 기탁된 것 및
    (ii) 폴리클론 조류 레오바이러스 항혈청과 양성적으로 반응하나 모노클론 항체와는 반응하지 않고, 상기 항체의 시료는 기탁번호 제99011472, 99011473 및 99011474호로 ECACC에 기탁된 것
    인 항원 부류에 속하는 조류 레오바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    조류 레오바이러스에 대해 유도된 항혈청이 플라크 감소 분석에서 조류 레오바이러스 ERS에 의해 형성된 플라크를 80%이상, 바람직하게는 90%이상 감소시킬 수 있고, 상기 조류 레오바이러스 ERS의 시료는 기탁번호 제99011475호로 ECACC에 기탁된 것을 특징으로 하는 조류 레오바이러스.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조류 레오바이러스가 조류 레오바이러스 ERS이며, 상기 조류 레오바이러스 ERS의 시료는 기탁번호 제99011475호로 ECACC에 기탁된 것을 특징으로 하는 조류 레오바이러스.
  5. 제1항, 제2항 또는 제4항에 따른 조류 레오바이러스 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는, 조류 레오바이러스 감염으로부터 유발된 질병 상태에 대한 가금 보호용 백신.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조류 레오바이러스가 살아있는 약화된 형태임을 특징으로 하는 백신.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 조류 레오바이러스가 불활성화된 형태임을 특징으로 하는 백신.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 백신이 보조제(adjuvant)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 백신이 가금에 감염성이 있는 다른 병원균의 백신성분을 하나 이상 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신.
  10. 제1항, 제2항 또는 제4항에 정의된 조류 레오바이러스의 제조 방법으로서,
    a. 감염되기 쉬운 기질에 조류 레오바이러스를 접종하는 단계;
    b. 조류 레오바이러스를 증식시키는 단계; 및
    c. 조류 레오바이러스 함유 물질을 수거하는 단계
    를 포함하는 방법.
  11. 조류 레오바이러스 감염으로부터 유발된 질병 상태에 대한 가금 보호용 백신의 제조 방법으로서, 제10항의 방법에 의해 얻어진 수거된 레오바이러스를 약학적 허용 담체 또는 희석제와 결합시키는 단계를 포함하며, 필요한 경우 상기 단계를 상기 레오바이러스의 불활성화 이후에 수행함을 특징으로 하는 가금 보호용 백신의 제조 방법.
  12. 가금에서 조류 레오바이러스 감염으로부터 유발된 질병 상태를 제어하는 방법으로서, 제1항, 제2항 또는 제4항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는 방법.
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