ES2240005T3 - Nueva clase antigenica de reovirus aviar. - Google Patents
Nueva clase antigenica de reovirus aviar.Info
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Abstract
Es un objeto de la presente invención proporcionar el agente causal de una condición morbosa entérica de tipo SMA perteneciente a una nueva clase antigénica de reovirus aviares. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna que proporcione una protección efectiva en las aves de corral frente a la enfermedad causada por reovirus aviares de la nueva clase antigénica. Es otro objeto de la presente invención proporcionar una vacuna que proporcione una protección efectiva en aves de corral frente a una condición morbosa entérica que también se asocia al SMA. Se ha visto ahora que estos objetos pueden ser acometidos disponiendo de un reovirus aviar perteneciente a una clase antigénica de reovirus aviares, caracterizado por el hecho de que el reovirus aviar perteneciente a la clase antigénica es capaz de producir antisuero en un animal, cuyo antisuero causa una reducción de las placas formadas por el reovirus aviar ERS, una muestra del cual está depositada en la ECACC, Salisbury,UK, bajo el Nº de acceso 99011475, de al menos un 75% en un ensayo de reducción de placas. Se ha observado que dichos reovirus aviares no sólo exhiben propiedades antigénicas hasta ahora desconocidas (Ejemplo 1, Tablas 2 y 3), sino que se ha visto también que los reovirus aviares según la presente invención pueden inducir la secreción de heces demasiado líquidas y/o alimento maldigerido por un pollo broiler, o que, en algunos casos, pueden incluso conducir a la muerte. Por ello, se designa aquí al nuevo reovirus aviar como cepa entérica de reovirus (¿ERS¿).
Description
Nueva clase antigénica de reovirus aviar.
La presente invención se relaciona con un
reovirus aviar y con una vacuna que contiene un reovirus aviar en
una forma viva atenuada o inactivada.
La producción comercial de "broilers" se
desarrolló en las últimas décadas en una industria que se
caracteriza por su alta eficacia en la producción en confinamiento
de los animales. Sin embargo, la fuerte tendencia hacia el aumento
de la eficacia de la fase de producción no puede ser lograda sin
encontrar algunas dificultades inherentes. Lo más notable es la
mayor incidencia de enfermedades infecciosas que con frecuencia
aparece en poblaciones animales estrechamente confinados de alta
densidad. Muchas de las enfermedades más devastadoras de las aves de
corral han quedado limitadas o han sido controladas mediante
vacunación o por tratamiento con agentes terapéuticos, tales como
antibióticos. Desafortunadamente, sin embargo, aún hay una serie de
enfermedades de etiología compleja que no han sido controladas con
fármacos y para las que no se dispone de un programa de vacunación
adecuado.
Desde finales de los años 70, la industria aviar
se ha enfrentado a dichas enfermedades complejas en pollos que
sufren de problemas entéricos. Una de tales enfermedades, que da
lugar a una variedad de condiciones morbosas en pollos afectados,
incluyendo la enteritis, es denominada por el signo clínico
principal y la observación macroscópica: síndrome de malabsorción
(SMA). Alternativamente, esta enfermedad es denominada como síndrome
del desarrollo deficiente con enanismo infeccioso, enfermedad de
palidez de las aves o enfermedad de la fragilidad ósea. Aunque un
gran número de condiciones morbosas variadas están ligadas al SMA,
en todos los casos se observa un crecimiento pobre y un desarrollo
retardado de las plumas. Adicionalmente, se ha correlacionado una
gran variedad de otros signos y lesiones, tales como mortalidad,
secreción de heces demasiado líquidas y/o alimento mal digerido,
atrofia pancreática, proventriculitis, cambios óseos, atrofia del
timo y de la bursa, etc., con el SMA.
Kouwenhoven y col. (Avian Pathology 17,
879-892, 1988) definió el SMA mediante cinco
criterios, es decir:
- (i)
- alteración del crecimiento hasta las 3 semanas posteriores a la infección de pollos de un día de edad,
- (ii)
- excreción de deposiciones de mucoides a húmedas amarillo-anaranjadas,
- (iii)
- aumento de la actividad fosfatasa alcalina ("ALP") plasmática,
- (iv)
- menor concentración plasmática de carotenoides (CPC) y
- (v)
- placas de crecimiento epifisario de la tibia proximal macroscópicamente ensanchadas.
El retraso en el crecimiento de los pollos
resulta obvio hacia la semana de edad o antes. De un 5 a un 20% de
las aves de un grupo pueden estar afectadas y estas aves tendrán la
mitad del tamaño o menos con respecto a sus compañeras de corral
hacia las 4 semanas de edad. Los grupos afectados tienen bajas
conversiones de alimento y tienen el intestino pálido y con
contenido de alimento sin digerir.
Aunque la patogénesis del SMA no está muy bien
entendida, la patogénesis probable de este síndrome es la acción
directa de agente(s) infeccioso(s) sobre el tracto
digestivo y órganos asociados.
El síndrome aquí descrito da lugar a una falta
general de rendimiento, incluyendo aumentos menores de peso,
conversión pobre del alimento y reducida comerciabilidad de los
grupos afectados. Como resultado del SMA, la industria aviar sufre
pérdidas económicas importantes anuales. Por lo tanto, la industria
aviar necesita una forma de controlar el SMA, de tal forma que se
pueda prevenir una o más de las diversas condiciones de la
enfermedad observada en los pollos.
Los reovirus son ubicuos en las aves de corral a
nivel mundial. Se ha visto que los reovirus son el agente causal de
una condición artrítica que afecta a las principales cápsulas
articulares que soportan el peso y a las láminas tendinosas de las
extremidades, denominada artritis/tenosinovitis vírica.
En algunas publicaciones, también se aislaron
reovirus de pollos que exhibían condiciones de enfermedad asociadas
al SMA. En estas publicaciones, se especula que los reovirus tienen
una relación etiológica con una o más de las condiciones de la
enfermedad asociadas al SMA, pero no aportó en ellas ninguna prueba
firme de la implicación de los reovirus en el SMA.
En van der Heide y col. (Avian Diseases
25. 847-856, 1981), se aisló un reovirus de
los intestinos de pollos jóvenes con diarrea clínica. Aunque este
aislado reovírico era capaz de inducir lesiones de tenosinovitis y
fracturas de la cabeza del fémur y osteoporosis, este aislado no
inducía diarrea de forma consistente en pollos infectados
experimentalmente con el reovirus.
Page y col. (Avian Diseases 26,
618-624, 1982) aislaron reovirus de un grupo que
experimentaba cojera, desarrollo deficiente y desarrollo errático de
las plumas. Aunque la inoculación oral en pollos de tipo broiler
susceptibles producía un claro efecto sobre los aumentos de peso, el
desarrollo de las plumas y las lesiones inducidas en una serie de
órganos, no se describió la inducción de diarrea o de camas
húmedas.
Hieronymus y col. (Avian Diseases 27,
246-254, 1983) describieron el aislamiento de varias
cepas de reovirus de los intestinos de pollos con sospecha de SMA y
determinaron la relación antigénica de estas cepas con la cepa
reovírica S1133, que es comúnmente usada como cepa vacunal para el
control de la tenosinovitis infecciosa. Los autores confirman que, a
pesar del hecho de que se aislaron los reovirus de pollos con SMA
clínico, aún había que probar que los reovirus eran el agente causal
del SMA.
Eidson y col. (Poultry Science 64,
2081-2086, 1985) investigaron el efecto de una
vacuna de reovirus inactivado, derivada de la cepa C08 aislada por
Hieronymus y col. en grupos de broilers que experimentaban problemas
con el SMA, así como tenosinovitis. Aunque la vacuna tenía un efecto
positivo sobre el peso corporal de la población de broilers, no
había diferencia en la conversión del alimento observada. Más aún,
no se describió ningún efecto de la vacuna sobre las condiciones de
la enfermedad asociadas a la enteritis, tales como camas
húmedas.
Rosenberg y col. (Avian Diseases 33,
535-544, 1989) también aislaron varias cepas de
reovirus de los tendones y de la médula ósea de pollos broiler
comerciales producidos en el campo. Aunque los pollos inoculados con
las cepas reovíricas fueron examinados en cuanto a enfermedad
clínica, no se describieron signos de diarrea o cama húmeda.
Kouwenhoven y col. (Avian Pathology 17,
879-892, 1988) también investigaron el papel del
reovirus en el síndrome de malabsorción. Estos autores no pudieron
reproducir el SMA con reovirus aislados de un caso de campo y
concluyeron que el reovirus no es el agente etiológico primario del
SMA. Se especula allí que pueden actuar agentes infecciosos,
incluyendo reovirus y adenovirus, como algún tipo de activación en
el síndrome de malabsorción.
Sin embargo, además de las publicaciones antes
mencionadas, muchos otros virus han sido asociados al SMA. Éstos
incluyen rotavirus, parvovirus, virus de tipo enterovirus, virus de
tipo togavirus, virus de tipo coronavirus, adenovirus y calicivirus.
Adicionalmente, también se sugirió que las bacterias estaban
implicadas en la etiología. También se han atribuido los síndromes
de campo de tipo SMA a micotoxinas en la técnica anterior y se
especula que las micotoxinas u otras toxinas no deberían ser
ignoradas como el agente causal del SMA.
En una revisión recientemente publicada (World
Poultry 14, 57-58, 1998), McNulty resumió el
estado de la técnica sobre el SMA. McNulty enfatizó la no
disponibilidad de una vacuna contra el SMA y dijo que los
aislamientos de virus, así como los exámenes virológicos y
microbiológicos de muestras aisladas del campo referidos hasta la
fecha, no han aportado datos útiles con respecto a la identificación
del/de los agente(s) causal(es) del SMA. McNulty
especuló que no es probable que esta aproximación dé resultados
útiles. En lugar de ello, se considera que las medidas de
tratamiento en los sitios de producción afectados por el SMA son la
mejor arma para controlar el SMA.
Por ello, se necesita aún una vacuna que induzca
una protección efectiva frente a ciertos problemas entéricos
experimentados por los pollos, tales como los problemas entéricos
asociados al SMA, que dan como resultado la secreción de heces
demasiado líquidas y/o alimento maldigerido.
Más aún, los reovirus aviares exhiben una
considerable heterogeneidad antigénica y el surgimiento de nuevas
clases antigénicas de reovirus aviares puede tener implicaciones
importantes para el uso de vacunas de reovirus en aves de
corral.
Los presentes inventores han identificado ahora
una nueva clase antigénica de reovirus aviares. Más aún, se
demuestra que los reovirus aviares pertenecientes a esta nueva clase
antigénica son capaces de inducir condiciones de enfermedad
pronunciadas que también se asocian al SMA, tales como la secreción
de heces demasiado líquidas y/o alimento maldigerido y retraso en el
crecimiento.
Por lo tanto, es un objeto de la presente
invención proporcionar el agente causal de una condición morbosa
entérica de tipo SMA perteneciente a una nueva clase antigénica de
reovirus aviares.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una vacuna que proporcione una protección efectiva en
las aves de corral frente a la enfermedad causada por reovirus
aviares de la nueva clase antigénica.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar una vacuna que proporcione una protección efectiva en
aves de corral frente a una condición morbosa entérica que también
se asocia al SMA.
Se ha visto ahora que estos objetos pueden ser
acometidos disponiendo de un reovirus aviar perteneciente a una
clase antigénica de reovirus aviares, caracterizado por el hecho de
que el reovirus aviar perteneciente a la clase antigénica es capaz
de producir antisuero en un animal, cuyo antisuero causa una
reducción de las placas formadas por el reovirus aviar ERS, una
muestra del cual está depositada en la ECACC, Salisbury, UK, bajo el
Nº de acceso 99011475, de al menos un 75% en un ensayo de reducción
de placas.
Se ha observado que dichos reovirus aviares no
sólo exhiben propiedades antigénicas hasta ahora desconocidas
(Ejemplo 1, Tablas 2 y 3), sino que se ha visto también que los
reovirus aviares según la presente invención pueden inducir la
secreción de heces demasiado líquidas y/o alimento maldigerido por
un pollo broiler, o que, en algunos casos, pueden incluso conducir a
la muerte. Por ello, se designa aquí al nuevo reovirus aviar como
cepa entérica de reovirus ("ERS").
La excreción de heces húmedas en grupos de
broilers es una de las condiciones de la enfermedad que también se
observa en broilers afectados por el SMA en el campo. Más aún, se
anticipa que esta condición de enfermedad clínica es una de las
causas del signo clínico más pronunciado en broilers afectados de
SMA, es decir, el del retraso en el crecimiento. En los ejemplos, se
muestra que un reovirus aviar según la invención induce la excreción
de heces líquidas por broilers infectados oralmente con el reovirus,
es decir, que era observable un recubrimiento pastoso alrededor de
la cloaca de las aves. Los experimentos de los ejemplos muestran
también que la infección oral del nuevo reovirus aviar también da
lugar a un retraso del crecimiento en los broilers infectados en
comparación con los pollos
control.
control.
El ensayo de reducción de placas es un ensayo
ampliamente usado en la técnica para determinar la relación
antigénica entre aislados (reo)víricos (aviares) (véase, por
ejemplo, Nersessian y col., Am. J. Vet. Res. 50,
1475-1480, 1989). Más aún, para los fines de la
presente invención, se da una descripción detallada del ensayo de
reducción de placas en el Ejemplo 1. Obviamente, el antisuero que se
ha de usar en el ensayo de reducción de placas debe ser de una
calidad apropiada. Se describen también en el Ejemplo 1 métodos para
la preparación de dicho antisuero.
En general, se puede preparar un antisuero
apropiado producido frente a reovirus aviares vivos por inoculación
de pollos SPF de 3 a 4 semanas de edad por vía subcutánea o
intramuscular con una cepa de virus vivos que tiene un título
infeccioso de 10^{2,0}-10^{9,0}
DICT_{50}/animal, más preferiblemente de
10^{3,0}-10^{6,0} DICT_{50}/animal. Se puede
recoger sangre de 3 a 4 semanas después de la infección,
preferiblemente 4 semanas después de la infección. Los pollos pueden
ser también reinfectados con la misma cepa de virus vivo de 3 a 4
semanas después de la primera infección con aproximadamente la misma
dosis que la usada en la primera infección. Se recoge sangre entre 2
y 4 semanas después de la segunda infección.
Se puede obtener un antisuero apropiado producido
frente a cepas de reovirus aviares inactivados por inoculación de
pollos SPF de 3 a 4 semanas de edad por vía subcutánea o
intramuscular con la preparación de virus inactivado. El título
infeccioso de la preparación antes de la inactivación puede ser de
10^{7,0}-10^{11,0} DICT_{50}/animal, más
preferiblemente de 10^{8,0}-10^{10,0}
DICT_{50}/animal. Se puede recoger sangre de 3 a 4 semanas después
de la inoculación, preferiblemente 4 semanas después de la
inoculación. Los pollos pueden ser también reinoculados con la misma
preparación de virus inactivado de 3 a 6 semanas después de la
primera inoculación. Se recoge sangre entre 2 y 4 semanas después de
la segunda inoculación.
La identificación del nuevo reovirus aviar según
la invención permite la preparación de nuevas vacunas de reovirus
aviares que pueden proteger de manera efectiva a las aves frente a
las condiciones de la enfermedad resultantes de la infección por la
nueva clase antigénica de reovirus aviares. En particular, los
nuevos reovirus aviares permiten la preparación de nuevas vacunas de
reovirus aviares que pueden proteger de manera efectiva a las aves
frente a condiciones morbosas tales como la secreción de heces
demasiado líquidas y/o alimento maldigerido y el retraso en el
crecimiento. Dichas condiciones morbosas se asocian también al
SMA.
El reovirus aviar según la invención puede ser
también aislado del campo. Un aspecto importante del método de
aislamiento es la identificación del animal objeto que se ha de usar
como punto de partida para el aislamiento del virus. Un broiler
típico para uso con este fin muestra los siguientes signos: la
secreción de heces demasiado líquidas y/o alimento mal digerido, que
dan como resultado un retraso en el crecimiento.
A continuación, se aísla el intestino del pollo
afectado, seguido de homogeneización del órgano en un tampón
adecuado. Se centrifuga luego el tejido homogeneizado y se filtra el
sobrenadante a través de filtros con un tamaño de poro de 0,2
\mum. Se añade una muestra del filtrado a células de pollo
primarias recién preparadas, preferiblemente células de hígado de
embrión de pollo ("CEL"), y, a los 4-8 días de
incubación, se inspeccionan las monocapas en cuanto a la presencia
de un efecto citopático (ECP). Si no hay presencia de ECP, se añade
una suspensión congelada/descongelada de la primera monocapa a
células CEL recién preparadas. Si después del primer pase o del
segundo pase se observa un ECP, entonces se caracteriza además el
virus por sus propiedades in vivo en broilers para inducir la
secreción de heces demasiado líquidas y/o alimento maldigerido y por
sus propiedades antigénicas determinadas en el ensayo de reducción
de placas o en la técnica de inmunofluorescencia (TIF) usando
anticuerpos policlonales y monoclonales específicos según se
describe más adelante.
Se describe en el Ejemplo 1 un método más
detallado para el aislamiento de un reovirus aviar según la presente
invención.
Aunque se usan los intestinos en el proceso de
aislamiento del presente reovirus aviar como material de partida
preferido, también se puede aislar el reovirus aviar del hígado de
pollos broiler afectados o de las heces excretadas por dichos pollos
broilers. Tampoco habría que excluir que otros órganos puedan servir
como material de partida para el aislamiento del reovirus aviar
según la invención.
En particular, la presente invención proporciona
un reovirus aviar según se ha descrito anteriormente, siendo capaz
del antisuero inducida frente al reovirus aviar de causar una
reducción de las placas formadas por el reovirus aviar ERS, una
muestra del cual está depositada en la ECACC, Salisbury, UK, bajo el
Nº de acceso 99011475, de al menos un 80%, preferiblemente de al
menos un 90%, en un ensayo de reducción de placas.
En una realización incluso más preferida de la
invención, se proporciona un reovirus aviar que exhibe un patrón de
reacción inmunológica específico con un panel específico de
antisuero policlonal y anticuerpos monoclonales (mAb). Este patrón
de reacción específico es diferente del exhibido por los reovirus
aviares hasta ahora conocidos.
Los anticuerpos monoclonales son útiles para
identificar características de un agente infeccioso y para
determinar similitudes y diferencias entre diferentes aislados del
mismo microorganismo o de otro similar. Vakharia y col. (Proceedings
of the International Symposium on adenovirus and reovirus infections
in poultry, Rauischholzhausen, Alemania, 1996,
295-304) describieron un panel de 9 mAb
anti-reovirus y estudiaron aislados de campo de
reovirus aviares en cuanto a su reactividad con estos mAb.
Diferentes patrones de reactividad del panel de mAb permitieron la
clasificación de los aislados en base a su relación con el patrón de
reactividad.
En esta realización de la invención, se
proporciona un reovirus aviar según se ha descrito antes que se
caracteriza además por (i) su reactividad en la TIF con un antisuero
policlonal producido frente a un aislado de reovirus aviar,
preferiblemente frente a la cepa de reovirus prototípica 1133, y
(ii) la ausencia de reactividad en la TIF con los mAb INT
13-06, INT 14-11 y
15-01 INT (muestras de los cuales están depositadas
en la ECACC bajo el Nº de acceso 99011472, 99011473 y 99011474,
respectivamente).
El reovirus aviar según la invención definido por
el patrón del panel representa un nuevo tipo antigénico de reovirus,
según se demuestra en el Ejemplo 1 y en la Tabla 3. A pesar del
hecho de que muchas de las cepas de reovirus de la técnica anterior
mostradas en la Tabla 3 son aisladas de tejidos de pollos broiler
(incluyendo los intestinos) que muestran signos y lesiones asociadas
al SMA, no se han descrito en la técnica anterior reovirus aviares
según la presente invención que tengan las nuevas propiedades
antigénicas antes definidas.
Un reovirus aviar incluso más preferido según la
presente invención es el reovirus aviar ERS (aislado 1), que es
característico de los reovirus aviares según la presente invención,
una muestra del cual está depositada en la ECACC bajo el Nº de
acceso 99011475.
El reovirus aviar según la invención puede estar
en forma viva, viva atenuada o inactivada.
La invención proporciona en otro aspecto una
vacuna para uso en la protección de las aves de corral frente a
condiciones morbosas resultantes de una infección por un reovirus
aviar, tales como las condiciones morbosas entéricas observadas con
el SMA, consistente en un reovirus aviar según la invención y un
soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable.
El reovirus aviar según la presente invención
puede ser incorporado a la vacuna como un virus vivo atenuado o
inactivado. La propiedad del reovirus aviar para inducir condiciones
morbosas asociadas al SMA según se ha descrito antes está
significativamente reducida o está completamente ausente si el
reovirus aviar está en forma viva atenuada o inactivada.
La atenuación de un reovirus aviar según la
invención puede ser conseguida por métodos bien conocidos en la
técnica para este fin, tal como describen Gouvea y col. (Virology
126, 240-247, 1983). Resumiendo, tras aislar
el virus de un animal objeto, se inocula una suspensión vírica en
fibroblastos primarios de embrión de pollo ("CEF"). Si el
aislado no es capaz de producir ECP, entonces se hacen repetidos
pases del virus (por ejemplo, 3-10 veces) hasta
observar un ECP. Tan pronto como es visible un ECP, se recogen las
células y los fluidos del cultivo celular, se congelan y se
descongelan, se aclaran por centrifugación y se hacen alícuotas del
sobrenadante que contiene el aislado del reovirus aviar y se
almacenan a -20ºC. Se puede repetir este proceso (por ejemplo,
10-100 veces) para atenuar aún más el virus.
Se puede preparar una vacuna según la invención
por métodos convencionales, tales como, por ejemplo, los comúnmente
usados para las vacunas de reovirus vivas e inactivadas
comercializadas. La preparación de composiciones vacunales
veterinarias está, entre otros, descrita en "Handbuch der
Schutzimpfungen in der Tiermedizin" (eds.: Mayr, A. y col.,
Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Alemania, 1984), y en
"Vaccines for Veterinary Applications" (ed.: Peters, A.R. y
col., Butterworth-Heinemann Ltd., 1993).
Resumiendo, se inocula un substrato susceptible
con un reovirus aviar según la invención en una forma viva o viva
atenuada y se propaga hasta que el virus se replica hasta un título
infeccioso o contenido de masa antigénica deseados, tras de lo cual
se recoge el material que contiene el reovirus y se formula en una
composición farmacéutica con actividad profiláctica.
Se puede usar cualquier substrato que sea capaz
de soportar la replicación de los reovirus aviares definidos
anteriormente, si es necesario tras adaptación de los reovirus
aviares a un substrato, para producir una vacuna según la presente
invención. Como substratos adecuados, se incluyen cultivos celulares
(aviares) primarios, tales como células de hígado de embrión de
pollo (CEL), fibroblastos de embrión de pollo (CEF) o células de
riñón de pollo (CK); líneas celulares de mamífero, tales como la
línea de células VERO o la línea de células BGM-70;
o líneas celulares aviares, tales como QT-35,
QM-7 o LMH. Normalmente, tras la inoculación de las
células, se propaga el virus durante 3-10 días,
después de los cuales se recoge el sobrenadante del cultivo y, si se
desea, se filtra o centrifuga para eliminar los restos
celulares.
Alternativamente, el reovirus aviar según la
invención puede propagarse en huevos de pollo embrionados, seguido
de recogida del material reovírico aviar por métodos rutinarios.
La vacuna según la invención que contiene el
virus vivo atenuado puede ser preparada y comercializada en forma de
suspensión (congelada) o en forma liofilizada. La vacuna contiene
adicionalmente un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable
habitualmente usado para tales composiciones. Como soportes, se
incluyen estabilizantes, conservantes y tampones. Son estabilizantes
adecuados, por ejemplo, SPGA, carbohidratos (tales como sorbitol,
manitol, almidón, sacarosa, dextrano, glutamato o glucosa),
proteínas (tales como suero de lecho desecado, albúmina o caseína) o
sus productos de degradación. Son tampones adecuados, por ejemplo,
los fosfatos de metales alcalinos. Son conservantes adecuados el
timerosal, el mertiolato y la gentamicina. Como diluyentes, se
incluyen agua, tampones acuosos (tales como solución salina
tamponada), alcoholes y polioles (tales como el glicerol).
Si se desea, las vacunas vivas según la invención
pueden contener un adyuvante. Son ejemplos de compuestos y
composiciones adecuadas con actividad adyuvante los mismos que los
mencionados a continuación para la preparación de vacunas
inactivadas.
Aunque es posible la administración por
inyección, por ejemplo intramuscular o subcutánea, de la vacuna viva
según la presente invención, la vacuna viva es preferiblemente
administrada por las técnicas baratas de aplicación en masa
comúnmente usadas para la vacunación frente a reovirus aviares.
Estas técnicas incluyen la vacunación en el agua de bebida y por
aspersión.
Como métodos alternativos para la administración
de la vacuna viva, se incluyen la administración in ovo, por
colirios y por inmersión del pico.
En una realización preferida, la presente
invención proporciona una vacuna frente a condiciones morbosas
entéricas, tales como las observadas con el SMA, que incluye el
reovirus aviar en una forma inactivada. La ventaja mayor de una
vacuna inactivada son los elevados niveles de anticuerpos
protectores de larga duración que pueden obtenerse. Esta propiedad
hace que dicha vacuna inactivada sea particularmente adecuada para
la vacunación de reproductores.
El fin de la inactivación de los virus recogidos
tras la etapa de propagación es eliminar la reproducción de los
virus. En general, se puede conseguir esto por medios químicos o
físicos. Se puede efectuar la inactivación química tratando los
virus, por ejemplo, con enzimas, formaldehído,
\beta-propiolactona, etilenimina o un derivado de
éstos. Si es necesario, el compuesto inactivador es neutralizado
después. El material inactivado con formaldehído puede ser, por
ejemplo, neutralizado con tiosulfato. Se puede llevar
preferiblemente a cabo la inactivación física sometiendo los virus a
radiación rica en energía, tal como luz UV o rayos \gamma. Si se
desea, después del tratamiento se puede ajustar el pH a un valor de
aproximadamente 7.
Una vacuna que contenga el reovirus aviar
inactivado puede, por ejemplo, contener uno o más de los soportes o
diluyentes farmacéuticamente aceptables antes mencionados adecuados
para este fin.
Preferiblemente, una vacuna inactivada según la
invención contiene uno o más compuestos con actividad adyuvante.
Como compuestos o composiciones adecuadas para este fin, se incluyen
hidróxido, fosfato u óxido de aluminio; emulsiones de
aceite-en-agua o de
agua-en-aceite basadas, por ejemplo,
en un aceite mineral, tal como Bayol F® o Marcol 52®, o un aceite
vegetal, tal como acetato de vitamina E, y saponinas.
Las vacunas inactivadas son normalmente
administradas por vía parenteral, por ejemplo intramuscular o
subcutáneamente.
La vacuna según la invención consiste en una
dosificación efectiva del reovirus aviar como componente activo, es
decir, una cantidad de material reovírico aviar inmunizante que
inducirá inmunidad en las aves vacunadas o en su progenie frente a
la inoculación de un virus virulento. La inmunidad se define aquí
como la inducción de un nivel superior significativo de protección
en una población de aves tras la vacunación en comparación con un
grupo no vacunado.
Típicamente, la vacuna viva según la invención
puede ser administrada en una dosis de
10^{2}-10^{9} DICT_{50} por ave,
preferiblemente en una dosis de 10^{2}-10^{6}
DICT_{50}, y una vacuna inactivada puede contener el equivalente
antigénico de 10^{4}-10^{10} DICT_{50} por
ave.
Aunque se puede usar con efectividad la vacuna
reovírica aviar según la presente invención en pollos, también se
pueden vacunar con éxito otras aves de corral, tales como pavos,
gallinas de Guinea y codornices, con la vacuna. Los pollos incluyen
broilers, stock reproductivo y stock de ponedoras.
Como las condiciones morbosas entéricas, tales
como las observadas con el SMA, han sido descritas primariamente en
pollos broiler, la presente invención proporciona preferiblemente
una vacuna para uso en la protección de broilers frente a
condiciones morbosas entéricas, tales como las observadas con el
SMA.
La edad de los animales que reciben una vacuna
viva o inactivada según la invención es la misma que la de los
animales que reciben las vacunas reovíricas aviares vivas o
inactivadas actualmente comercializadas. Por ejemplo, se pueden
vacunar los broilers directamente desde un día de edad en adelante
con la vacuna viva atenuada según la invención. La vacunación del
stock parental, tal como los reproductores de broilers, puede ser
realizada con una vacuna viva atenuada o inactivada según la
invención o con combinaciones de ambas. Las ventajas de este tipo de
programa de inmunización incluyen la protección inmediata de la
progenie de un día de edad proporcionada por anticuerpos de
derivación materna transmitidos verticalmente a las aves jóvenes. Un
programa típico de vacunación de reproductores incluye la vacunación
de los reproductores a las 6 semanas de edad con una vacuna viva
atenuada, seguida de una vacunación entre las 14 y las 18 semanas de
edad con una vacuna inactivada. Alternativamente, la vacunación viva
puede ir seguida de dos vacunaciones con vacunas inactivadas en las
semanas 10-12 y 16-18 de
edad.
edad.
La invención también incluye vacunas de
combinación, que contienen, además del reovirus aviar según la
invención, uno o más componentes vacunales de otros patógenos
infecciosos para las aves. Con esos otros patógenos infecciosos para
las aves, también se quiere decir reovirus aviares que son
antigénicamente distintos de los reovirus aviares según la presente
invención y se incluyen las cepas de reovirus aviares asociadas a
tenosinovitis.
Preferiblemente, los componentes vacunales en la
vacuna de combinación son las formas vivas atenuadas o inactivadas
de los patógenos infecciosos para las aves de corral.
En particular, la presente invención proporciona
una vacuna de combinación en la que todos los componentes vacunales
están en forma inactivada.
Preferiblemente, la vacuna de combinación
consiste en una o más cepas vacunales (inactivadas) del virus de la
bronquitis infecciosa (IBV), del virus de la enfermedad de Newcastle
(NDV), del virus de la enfermedad bursal infecciosa (IBDV), del
adenovirus de las aves (FAV), del virus EDS y del virus de la
rinotraqueítis de los pavos
(TRTV).
(TRTV).
En el marco de la presente invención, se han
depositado los siguientes microorganismos y líneas celulares de
hibridomas en la European Collection of Animal Cell Cultures
(ECACC), Salisbury, UK, el 14 de Enero de 1999:
| Virus/hibridoma | Nº de acceso |
| Reovirus aviar ERS | 99011475 |
| INT 13-06 | 99011472 |
| INT 14-11 | 99011473 |
| 15-01 INT | 99011474 |
Se aislaron individualmente el intestino y/o el
hígado de pollos que habían tenido problemas digestivos y cama
húmeda que había dado como resultado un retraso en el crecimiento.
Se homogeneizaron los órganos individualmente en un homogeneizador
usando perlas de vidrio (2 mm) y PBS con antibióticos durante 20
min. a velocidad máxima. A continuación, se centrifugaron los
tejidos homogeneizados. Se centrifugó el homogenado de intestino a
4.000 rpm y se centrifugó el hígado a 1.200 rpm, ambos durante 15
minutos. A continuación, se filtraron los sobrenadantes prensando a
través de filtros con un tamaño de poro decreciente (5, 1,2, 0,45,
0,2 \mum). Se añadieron 100 \mul de suspensión que pasaba a
través del filtro de 0,2 \mum a células de hígado de embrión de
pollo (CEL) primarias recién preparadas presentes en matraces de
cultivo de tejidos. A los 4 a 8 días de la incubación, se
inspeccionaron las monocapas en cuanto a la presencia de un efecto
citopático (ECP). Si no había presencia de ECP, se congelaron las
monocapas a -20ºC y a las 24 h se descongelaron las monocapas. A
continuación, se añadió 1 ml de esta suspensión
congelada/descongelada a células CEL recién preparadas. Si no era
visible ningún efecto citopático después de 4-8
días, el cultivo fue considerado negativo para el crecimiento vírico
en células CEL. Si después del primer pase o del segundo pase se
observó ECP, entonces se siguió caracterizando el virus por el
ensayo de reducción de placas y la técnica de inmunofluorescencia
(TIF).
Se infectó subcutáneamente a 10 pollos SPF de 3
semanas de edad con 10^{5,8} DICT_{50}/animal de la cepa ERS
(aislado 2). A las 3 semanas de la infección, se recogió sangre y se
aisló el suero y se volvió a infectar a los animales con 10^{5,6}
DICT_{50}/animal. Dos semanas después de la segunda infección, se
recogió sangre y se aisló el suero. Tras la adquisición, todos los
sueros fueron inactivados por calor a 56ºC durante 30 min. y
almacenados en pequeñas alícuotas a
-20ºC.
-20ºC.
Se infectó subcutáneamente a 15 pollos SPF de 4
semanas de edad con 10^{4,2} DICT_{50}/animal. A las 4 semanas
de la infección, se recogió sangre y se aisló el suero. Después de
la adquisición, todos los sueros fueron inactivados por calor a 56ºC
durante 30 min. y almacenados en pequeñas alícuotas a -20ºC.
Se inoculó intramuscularmente a 12 pollos SPF de
4 semanas de edad con una de las cepas de reovirus aviar 1733 ó 2408
adyuvada con una emulsión de ag/ac. Dosis por animal: 490 Unidades
Elisa/animal, que representa un título de infectividad antes de la
inactivación de 10^{7,0}-10^{10,0}
DICT_{50}/animal. A las 4 semanas de la infección, se recogió
sangre y se aisló el suero. Después de la adquisición, todos los
sueros fueron inactivados por calor a 56ºC durante 30 min. y
almacenados en pequeñas alícuotas a -20ºC.
Se inoculó intramuscular o subcutáneamente a diez
pollos SPF de 3-4 semanas de edad con una de las
siguientes vacunas de reovirus aviares inactivadas comerciales:
ISBI, Fort Dodge; Kaketsuken e Intervet International BV. Tres
semanas después de la infección se recogió sangre y se aisló el
suero. Tras la adquisición, todos los sueros fueron inactivados por
calor a 56ºC durante 30 min. y almacenados en pequeñas alícuotas a
-20ºC.
Los sueros preparados anteriormente fueron usados
en la TIF y en el ensayo de reducción de placas.
Se lleva a cabo la TIF esencialmente como se
describe en el párrafo C siguiente. Resumiendo, se cultivaron
células Vero en placas de microtitulación de poliestireno de 96
pocillos hasta la confluencia. Se inocularon diferentes monocapas
con la cepa reovírica 1133. Se añadieron 100 \mul de suero de
pollo al primer pocillo de la placa. Se hicieron diluciones seriadas
de razón 3. Después de las etapas de incubación y lavado, las placas
reaccionaron con anti-pollo de cabra marcado con
isotiocianato fluorescente diluidos a 1:100. Se observó la presencia
de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia. Se determinó
el título (calidad del suero) por dilución a punto final. Ésta es la
dilución más alta de suero que aún es capaz de inducir una clara
señal de fluorescencia. En la Tabla 1, se muestran los resultados de
la TIF para los sueros usados en la prueba de reducción de
placas:
| Suero contra la cepa reovírica aviar | Dilución final (expresada en log_{2}) |
| 2177 | 2.025 (11,0) |
| ERS | 6.075 (12,6) |
| 1733 | 6.075 (12,6) |
| 2408 | 18.225 (14,2) |
| Arvax | 75 (6,2) |
| Nobilis Reo | 18.225 (14,2) |
| Tri Reo | 6.075 (11,6) |
TABLA 1
(continuación)
| Suero contra la cepa reovírica aviar | Dilución final (expresada en log_{2}) |
| Oilvax Reo | 18.225 (14,2) |
| Suero negativo | <3 (<1) |
| Nobilis Reo™ comercializado por Intervet International b.v. | |
| Arvax™ comercializado por ISBI. | |
| Tri Reo™ comercializado por Fort Dodge. | |
| Oilvax Reo™ comercializado por Kaketsuken. |
Se tendría que usar antisuero de una calidad
apropiada en el ensayo de reducción de placas para determinar la
relación antigénica entre reovirus aviares pertenecientes a la nueva
clase antigénica y para distinguir los nuevos reovirus aviares de
los reovirus aviares conocidos (todos salvo el antisuero Arvax
cumplían con la calidad requerida del antisuero). Se produjo
antisuero ERS contra el aislado ERS 1 vivo y el aislado ERS 2 vivo e
inactivado.
Se resuspendieron CEL recién preparadas en medio
de cultivo de tejidos suplementado con un 5% de suero de ternera
fetal y antibióticos a una concentración final de 1 x 10^{6}
células por mililitro. Se llenaron placas de cultivo de tejidos de
60 mm con 5 ml de suspensión celular y se incubaron a 37ºC durante
24 h.
Al día siguiente, se diluyó el virus que había de
ser investigado en tubos de plástico en medio con antibióticos. Se
prepararon diluciones de 10^{-1} a 10^{-7}. A continuación, se
mezclaron 200 \mul de cada dilución con 50 \mul del suero de
ensayo. Se incubó esta mezcla a 37ºC durante 1 h. Como control
negativo, se mezclaron 200 \mul de dilución vírica con 50 \mul
de medio.
Se desechó el medio que quedaba por encima de las
monocapas presentes en las placas de cultivo de tejidos de 60 mm. A
continuación, se añadieron 100 \mul de las diferentes mezclas de
virus (con o sin suero) sobre una monocapa confluente. Para cada
mezcla de virus, se infectaron al menos 2 monocapas (placas). Se
incubaron las monocapas infectadas durante 1 h a 37ºC. A
continuación, se cubrieron las monocapas infectadas con 5 ml de
solución de agar (que contenía medio, FCS y antibióticos;
concentración final de agar 3,0%, concentración final de FCS 2,5%).
Se incubaron las placas durante 4 días a 37ºC. A continuación, se
añadieron a cada placa de cultivo de tejidos 2 ml de solución de
rojo neutro (0,02%). Después de 4 h de incubación a 37ºC, se contó
el número de placas por placa. Sólo se contaron las placas de
cultivo de tejidos que contenían 150 placas o menos.
Se calcula la reducción de placas como sigue: se
establece el número de placas de un determinado virus a una
determinada dilución sin suero como el 100%. Se compara luego éste
con el número de placas a la misma dilución de virus, pero con
suero.
En la Tabla 2A, se dan los resultados de un
primer experimento con distintos virus y sueros estudiados. La Tabla
2B muestra el resultado de un segundo experimento con los virus y
sueros indicados. Se produjo el suero frente a la vacuna ERS
inactivada según se describió para las cepas 1733/2408 inactivadas,
excepto por la recogida de la sangre 5 semanas después de la
vacunación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| * % Reducción de placas. | |
| - Referencia. |
\vskip1.000000\baselineskip
| * % Reducción de placas. | |
| Nd = No determinado. |
Se preparó antisuero policlonal infectando
conejos (1-1,5 kg) con la cepa de reovirus aviar
1133 purificada. Las infecciones de refuerzo tuvieron lugar 28 y 84
días después de la primera infección. Se recogió la sangre y se
aisló el suero 14 días después de la última inyección.
Se caracterizaron las diferentes cepas de
reovirus aviares con diferentes mAb. Se cultivaron células CEL
primarias en placas de microtitulación de poliestireno de 96
pocillos. Las células no infectadas sirvieron como controles.
Después de 2-4 días de incubación a 37ºC con un 5%
de CO_{2}, se fijaron las monocapas infectadas con etanol al 96%.
Se desechó el alcohol y se lavaron las placas con tampón de lavado y
se añadieron 100 \mul de diferentes sobrenadantes de cultivo de
células de hibridomas diluidos a 1:50 ó 1:200 en PBS ó 100 \mul de
suero policlonal de conejo (conejo 68A) diluido a 1:50 a cada
pocillo. Se incubaron las placas durante 60-90 min.
a 37ºC, se lavaron dos veces con tampón de lavado y reaccionaron con
suero anti-ratón de conejo marcado con isotiocianato
fluorescente y diluido a 1:100 ó con anti-conejo de
cabra marcado con isotiocianato y diluido a 1:100. Finalmente, se
lavaron las placas y se fijaron con una solución de glicerol/PBS
(1:1). Se observó la presencia de fluorescencia con un microscopio
fluorescente.
El panel de antisueros usado en este experimento
consistía en el siguiente antisuero policlonal y en los mAb
producidos frente a la cepa reovírica aviar prototípica 1133:
| Conejo 68A | Antisuero policlonal de conejo |
| mAb 154 | Vakharia y col., 1996 (antes mencionado) |
| mAb 14-67 | Intervet International B.V. |
| mAb INT 13-06 | ECACC Nº acceso 99011472. |
| mAb INT 14-11 | ECACC Nº acceso 99011473. |
| mAb 15-01 INT | ECACC Nº acceso 99011474. |
Se caracterizaron aún los aislados de reovirus
aviares obtenidos por el método antes descrito en cuanto a su
reactividad con este panel de antisueros. Los nuevos aislados
reovíricos tienen un patrón de reacción distinto con el panel de
anticuerpos poli- y monoclonales. Las cepas de reovirus aviares
hasta ahora conocidas (S-1133 a CO8) aisladas de
casos de campo de SMA y tenosinovitis no reaccionan según el nuevo
patrón (véase la Tabla 3).
| Nuevo patrón de reacción: | Positivo: | conejo policlonal 68A, 154, 14-67. |
| Negativo: | INT 13-06, INT 14-11, 15-01 INT. |
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ \begin{minipage}[t]{145mm} Enterovax ^{TM} y
Tensynovac ^{TM} son vacunas de reovirus aviares comercializadas
por Shering-Plough Animal Health and Intervet Inc.
\end{minipage} \cr}
Experimento
1
Se infectaron oralmente 30 pollos SPF de un día
de edad con el reovirus ERS (aislado 1) purificado por placa. A los
4, 7 y 10 días de la infección, se aislaron los hígados de 10
animales y se investigaron en cuanto a lesiones microscópicas.
Experimento
2
Se infectaron oralmente 30 broilers de un día de
edad con anticuerpos maternos contra reovirus con la cepa reovírica
ERS purificada por placa. A los 7 y a los 10 días de la infección,
se observó a los animales en cuanto a signos clínicos. Se prestó
especial atención a la cama húmeda.
Experimento
3
Se infectaron oralmente 30 broilers de un día de
edad con anticuerpos maternos contra reovirus con la cepa reovírica
ERS purificada por placa. Una, dos y cuatro semanas después de la
infección, se pesaron 10 animales por grupo para investigar el
retraso en el crecimiento.
Experimento
4
Se infectaron oral o subcutáneamente 15 broilers
de un día de edad con anticuerpos maternos contra reovirus por grupo
con la cepa reovírica ERS (aislado 2) purificada por placa a la edad
de 1 día o de 1 semana. Se dejaron sin infectar 15 animales de la
misma edad y procedencia y éstos sirvieron como control negativo. Se
pesó a los animales cada semana durante un período de 7 semanas para
investigar el retraso en el crecimiento.
Experimento
1
Los pollos SPF infectados de un día de edad que
fueron infectados oralmente con el reovirus mostraron vacuolización
multifocal de los hepatocitos y/o de las células de Kupffer 4 a 10
días después de la infección.
Experimento
2
Diez días después de la infección oral, los
broilers mostraron enteritis, que dio lugar a heces demasiado
líquidas observables como recubrimiento pastoso alrededor de la
cloaca de las aves, contrariamente al grupo control de broilers no
infectados de la misma edad y procedencia mantenidos en idénticas
condiciones.
Experimento
3
Los broilers infectados oralmente de un día de
edad tenían un peso de 121,9, 327,0 ó 913,1 g a la edad de 1, 2 ó 4
semanas. Por el contrario, los broilers no infectados de la misma
edad y procedencia albergados en idénticas condiciones pesaban
134,8, 337,6 ó 999,9 g a la edad de 1, 2 ó 4 semanas.
Experimento
4
En las figuras 2A y 2B, se representan los
resultados. A la edad de 7 semanas, los animales infectados cuando
tenían un día de edad por vía oral o subcutánea mostraron un retraso
en el crecimiento de aproximadamente un 34% en comparación con los
animales control no infectados. A las 7 semanas de edad, la
proporción de peso entre los animales control no infectados y los
animales infectados era de 2.469 g frente a 1.635 g.
A la edad de 7 semanas, los animales infectados a
edad de una semana por vía oral o subcutánea mostraron un retraso en
el crecimiento de aproximadamente un 25% en comparación con los
animales control no infectados. A las 7 semanas de edad, la
proporción de peso entre los animales control no infectados y los
animales infectados era de 2.469 g frente a 1.842 g.
En conclusión, la cepa reovírica ERS es capaz de
inducir retraso en el crecimiento.
Se prepararon células CEL primarias a una
concentración final de 1 x 10^{6} células/ml. Se cultivaron las
células en MEM de Eagle que contenía un 0,1% de antibióticos y un 5%
de suero de ternera fetal. A 25 ml de esta suspensión celular, se
añadieron 0,1 ml de aislado de reovirus ERS (aislado 1). Después de
incubar durante 5 días en una incubadora de alta humedad a 37ºC, era
claramente visible un ECP y se había destruido por completo la
monocapa. El título infeccioso de la suspensión de células
infectadas era de 4,2 log_{10} DICT_{50}/ml. Se inactivó el
reovirus añadiendo formaldehído a la suspensión de células
infectadas a una concentración final del 0,2%. Se incubó la
suspensión a 37ºC durante 48 h. A continuación, se neutralizó el
formaldehído mediante una cantidad equimolar de bisulfito de sodio.
Se usó el reovirus inactivado para preparar diferentes vacunas de
reovirus inactivadas. Se mezcló la suspensión de reovirus inactivada
con una fase de aceite mineral en una proporción de 45:55 (emulsión
de ag/ac).
Se vacunaron animales SPF de 3-4
semanas de edad intramuscularmente con las vacunas reovíricas
inactivadas (0,5 ml/animal). A las 2, 4 y 6 semanas de la
vacunación, se investigó el suero en cuanto a la presencia de
anticuerpos frente a reovirus. A las seis semanas de la vacunación,
se inoculó a los animales a través de la almohadilla plantar. El
virus de inoculación usado era la cepa de reovirus homóloga patógena
(2,2 log DICT_{50}/animal). Se puntuó el grado de inflamación y
decoloración de la almohadilla plantar y de la tibia durante un
período de 2 semanas. Se consideró que un pollo estaba protegido
frente a la inoculación si el valor acumulativo de la inflamación de
la almohadilla plantar era menor que la media de la inflamación de
la almohadilla plantar de los controles inoculados no vacunados
menos dos desviaciones estándar.
En un estudio similar al bosquejado
anteriormente, se inoculó a los animales a las cinco semanas de edad
y se evaluó la protección frente a una grave inoculación por medio
de la mortalidad, la morbilidad y las lesiones de las almohadillas
plantares.
En las Figuras 1A y 2A, se representan los datos
de protección. Los pollos vacunados mostraron un valor acumulativo
de inflamación de la almohadilla plantar que está significativamente
reducido en comparación con el grupo control, lo que indica que los
pollos vacunados estaban protegidos frente a una grave inoculación
con reovirus. Los datos de protección basados en la mortalidad y la
morbilidad también demuestran una protección significativa frente a
una grave inoculación.
Se vacunaron animales SPF de 3-4
semanas de edad intramuscularmente con una vacuna de reovirus ERS
inactivado (aislado 2) similar a la descrita anteriormente y se
revacunaron a las 6 semanas de la primera vacunación. Animales no
vacunados de la misma edad y procedencia sirvieron como control. A
las 2, 4, 5 y 6 semanas de la primera vacunación y a las 2 semanas
de la segunda vacunación, se investigaron los sueros en cuanto a la
presencia de anticuerpos frente a reovirus con el Idexx ELISA. A las
6 semanas de la primera vacunación o a las 2 semanas de la segunda
vacunación, se inoculó a los animales a través de la almohadilla
plantar con la cepa reovírica patógena ERS. Se midió la puntuación
media de lesiones del grado de inflamación y decoloración de la
almohadilla plantar y de la tibia todos los días durante un período
de 14 días después de la inoculación.
La respuesta serológica inducida por la vacuna
reovírica ERS inactivada aumentó en las primeras 4 semanas tras la
vacunación y se niveló entre las 5 y 6 semanas después de la primera
vacunación. La segunda vacunación dio lugar a un aumento de
aproximadamente 10 log_{2} a 12 log_{2} 2 semanas después de la
segunda vacunación (figura 3A). En la figura 3B, se muestran los
datos de pollos vacunados y no vacunados que fueron inoculados 5
semanas después de la primera vacunación ó 2 semanas después de la
segunda vacunación. Todos los pollos vacunados mostraban una
reducción significativa de lesiones en la almohadilla plantar y en
la tibia en comparación con los pollos no vacunados. Todos los
pollos vacunados mostraban valores acumulativos de inflamación en la
almohadilla plantar menores que la media de la inflamación de la
almohadilla plantar de los controles inoculados y no vacunados menos
dos desviaciones estándar, lo que indica que todos los animales
estaban protegidos frente a una grave inoculación de REO. Se
observaron algunas hinchazones leves de las almohadillas plantares
en el grupo vacunado; sin embargo, estas lesiones eran de naturaleza
temporal. Más aún, las lesiones temporales de las almohadillas
plantares eran menores en los animales que fueron vacunados dos
veces en comparación con los animales que fueron vacunados una
vez.
Claims (10)
1. Un reovirus aviar, caracterizado por
ser un reovirus aviar ERS, una muestra del cual está depositada en
la ECACC bajo el Nº de acceso 99011475.
2. Un reovirus aviar perteneciente a una clase
antigénica de reovirus aviares, caracterizado por el hecho de
que:
- (i)
- el reovirus aviar es capaz de inducir antisuero en un animal, cuyo antisuero provoca una reducción de las placas formadas por el reovirus aviar ERS de la reivindicación 1 de al menos un 75% en un ensayo de reducción de placas, y
- (ii)
- el reovirus aviar reacciona positivamente con el antisuero policlonal de reovirus aviar, pero no con los anticuerpos monoclonales INT 13-06, INT 14-11 y 15-01 INT, muestras de los cuales están depositadas en la ECACC bajo el Nº de acceso 99011472, 99011473 y 99011474.
3. Un reovirus aviar según la reivindicación 2,
caracterizado por el hecho de que el antisuero inducido
frente al reovirus aviar es capaz de provocar una reducción de las
placas formadas por el reovirus aviar ERS de la reivindicación 1 de
al menos un 80%, preferiblemente de al menos un 90%, en un ensayo de
reducción de placas.
4. Una vacuna para uso en la protección de las
aves de corral frente a condiciones morbosas resultantes de una
infección por reovirus aviares, que consiste en un reovirus aviar
según las reivindicaciones 1-3 y un soporte o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
5. Una vacuna según la reivindicación 4,
caracterizada por estar el reovirus aviar en forma viva
atenuada.
6. Una vacuna según la reivindicación 4,
caracterizada por estar el reovirus aviar en forma
inactivada.
7. Una vacuna según las reivindicaciones
4-6, caracterizada por contener además la
vacuna un adyuvante.
8. Una vacuna según las reivindicaciones
4-7, caracterizada por incluir la vacuna
además uno o más componentes vacunales de otros patógenos
infecciosos para las aves de corral.
9. Un método para la preparación de reovirus
aviares definidos en las reivindicaciones 1-3,
consistente en las etapas de:
- a.
- inocular un substrato susceptible con el reovirus aviar definido en las reivindicaciones 1-3,
- b.
- propagar el reovirus aviar y
- c.
- recoger el material que contiene el reovirus aviar.
10. Un método para la preparación de una vacuna
para uso en la protección de las aves de corral frente a condiciones
morbosas resultantes de una infección por reovirus aviares,
consistente en combinar los reovirus recogidos obtenidos por el
método según la reivindicación 9, si se desea tras la inactivación
de los reovirus, con un soporte o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
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