BR112017006620B1 - Vacina, métodos para a preparação de uma vacina e para reduzir infecção por reovírus aviário, composição, e, usos de material antigênico e de uma vacina - Google Patents
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Abstract
vacina, métodos para a preparação de uma vacina e para reduzir infecção por reovírus aviário, composição, e, usos de material antigênico e de uma vacina. é descrita uma vacina de amplo espectro contra reovírus aviário, que é efetiva na redução da infecção de reovírus aviário em uma ave alvo. a vacina compreende material antigênico derivado de reovírus aviário de dois grupos de genótipos: 1 e 4, como aqui definido. esta vacina é efetiva contra todos os reovírus aviários, homólogos ou heterólogos para a vacina, incluindo cepas virulentas provenientes de falha vacinal.
Description
[001] A presente invenção se refere ao campo de vacinas veterinárias, em particular, a vacinas para aves domésticas para reduzir infecção por reovírus aviário. Também, a métodos para a preparação de uma vacina como essa, e aos usos médicos de tais vacinas.
[002] Reovírus aviários são taxonomicamente classificados na espécie Avian Orthoreovirus que está dentro do gênero Orthoreovirus, e na família Reoviridae. A partícula do vírus é sem envelope, mas tem um capsídeo de proteína de casca dupla. Este capsídeo contém o genoma de RNA de fita dupla que existe de 10 segmentos. Os segmentos genômicos podem ser agrupados em três classes de tamanho: grande (L), médio (M) e pequeno (S); proteínas virais codificadas a partir desses segmentos são indicadas por referência a esses segmentos, respectivamente, como: lambda (X), mu (μ), ou sigma (o). Uma visão geral da estrutura de um reovírus aviário é dada em Benavente & Martinez-Costas (Virus Res., 2007, p. 105-119).
[003] Reovírus aviários são patógenos importantes que causam doença grave em pássaros, e dano econômico significante em operações de criação de aves domésticas comerciais; basicamente galinhas, mas também perus e outros tipos de pássaros podem ser afetados. Sérias doenças e mesmo mortalidade ocorrem principalmente em pássaros jovens, em virtude de uma resistência relacionada à idade a sintomas de reovírus aviário, e a infecção se desenvolve em pássaros de cerca de 4 semanas de idade. Os sintomas incluem, entre outros, doença entérica e respiratória, miocardite e hepatite. Mais típica é artrite viral, levando a tenossinovite (ou: artrite Reoviral) em juntas e tendões. A claudicação resultante causa dificuldades em andar até os silos de alimento. Alternativamente, doença entérica viral que leva a absorção deficiente previne uma conversão efetiva do alimento. Ambas as doenças são especialmente problemáticas para criações de crescimento rápido e do tipo mais pesado tais como frangos de corte (ave para alimento). Também, em combinação com diversos outros agentes de doença entérica viral e bacteriana, reovírus aviário é um fator na assim chamada ‘síndrome de nanismo e raquitismo’.
[004] Todos esses sintomas levam ao sofrimento do animal e a perdas econômicas por pesos de abate reduzidos e condenações por baixas qualidades das carcaças.
[005] A principal maneira de controlar infecção por reovírus aviário é por vacinação, tanto dos pintinhos diretamente em idade muito jovem, quanto por vacinação de reprodutores (galinhas mães que produzem ovos fertilizados para progênie) antes de seu período de postura de ovos, para reduzir a transmissão para o ovo, e para proteger os pintinhos indiretamente por meio de anticorpos maternalmente derivados.
[006] Reovírus aviário pode ser cultivado in vitro, e replicar bem, por exemplo, em embrião de células do fígado de galinha primárias. Replicação causa um efeito citopático típico (cpe) mostrando grandes sincícios celulares.
[007] Vacinas contra reovírus aviário são normalmente vacinas de vírus total, que são do tipo vivo atenuado, ou do inativado. Exemplos de vacinas contra reovírus aviário comerciais (todas da MSD AH, Países Baixos) são: vacinas vivas: Nobilis® Reo 1133, ou Nobilis® Reo 2177; ou uma vacina adjuvantada inativada tal como Nobilis® Reo Inac (compreendendo cepas 1733 e 2408). As origens da cepa de vacina S1133 remontam ao início dos anos oitenta (Van der Heide et al., 1983, Avian Dis., vol. 27, p. 698-706), mas ela ainda está em uso nos dias de hoje.
[008] No regime de vacinação padrão recomendado, pássaros reprodutores são vacinados contra reovírus aviário pelo menos duas vezes: por uma vacinação primária (inicial) com vacina viva em idade muito jovem, e por uma vacinação secundária (reforço) com vacina inativada diversas semanas mais tarde. Dependendo da gravidade da pressão de infecção de campo, um outro reforço pode ser dado algumas semanas mais tarde, e pássaros reprodutores tipicamente recebem uma vacinação de reforço adicional em torno de 16 a 18 semanas de idade, isto é, 4 a 6 semanas antes do início de ação da postura. Na prática, a pressão de infecção por reovírus aviário no campo não é sempre alta, portanto, muitos produtores de aves domésticas se satisfazem dando apenas uma vacinação a pintinhos ou a reprodutores. Entretanto, no caso de um surto de infecção virulenta por reovírus aviário, os pintinhos de cria podem não ser suficientemente protegidos contra uma infecção de campo.
[009] Proteção imune contra reovírus aviário é obtida através de uma resposta imune humoral efetiva, contra diversas proteínas estruturais do vírus. Os principais imunógenos virais, entretanto, são as proteínas de capsídeo externas sigmaB e sigmaC; sigmaB (ou: oB) é a proteína principal, e sigmaC (oC) é a proteína de capsídeo externa secundária. SigmaC serve na anexação da partícula viral a uma célula hospedeira. Ela é codificada pela região 3’ do segmento do genoma S1, e tem cerca de 326 aminoácidos de tamanho. Observou-se que a proteína sigmaC é muito mais variável antigenicamente do que sigmaB (WO 2009/093251, e: Meanger et al., 1995, Avian Pathol., vol. 24, p. 121-134).
[010] A opinião geral no campo de vacinologia contra reovírus aviário foi que a vacinação efetiva contra reovírus aviário poderia apenas ser obtida por uma vacina homóloga, assim, contra os vírus de dentro do mesmo grupo sorotipo do antígeno de vacina (Wood et al., 1986, Comp. Pathol., vol. 86, p. 125-129). Por muitos anos, vacinas contra reovírus aviário foram, portanto, baseadas em antígenos de únicos grupos de sorotipos distintos. Programas de vacinação padrões foram direcionados ao sorotipo reovírus presente em um bando de pássaros local; vacinação repetida então forneceu imunidade sólida.
[011] Quando mais que um sorotipo de reovírus aviário foi prevalecente em uma área, essas vacinas puderam ser alternadas em vacinação inicial e de reforço, por exemplo, administrando uma vacinação inicial com a cepa de vacina ‘clássica’ de reovírus aviário, tais como S1133, 1733, 2177 ou 2408, e acompanhamento com uma vacina de reforço contra, por exemplo, uma cepa ERS. Por muitos anos, esses foram os principais tipos de reovírus aviário prevalecentes no campo.
[012] Como um vírus de RNA, reovírus aviário pode desenvolver mutações em seu genoma. Na prática, isto leva ao encontro ocasional de novas variantes no campo, que podem ser mais ou menos virulentas. Um problema a esse respeito, entretanto, é a dificuldade de uma diferenciação efetiva de reovírus aviários, já que testes sorológicos podem apresentar variabilidade nos resultados. Portanto, cepas de reovírus aviário costumavam ser identificadas testando neutralização de vírus usando soros policlonais em um ensaio de redução de placa, ou determinando um padrão de ligação específico usando um painel de anticorpos monoclonais, vide a caracterização da cepa 2177 (EP 687.728), e da cepa ERS (EP 1.024.189).
[013] Alternativamente, cepas de reovírus aviário podem ser caracterizadas pelos principais sintomas de doença que o vírus induz, tais como: tenossinovite, absorção deficiente, ou sintomas neurológicos (por exemplo, uma cepa ERS que induz sintomas neurológicos como é descrito em EP 1.551.961). Entretanto, em virtude da heterogeneidade na patogenicidade, isso não é totalmente conclusivo.
[014] Mais recentemente, a classificação de reovírus aviários é feita com base em diagnósticos moleculares, comparando sequências de aminoácidos ou nucleotídeos virais. Observou-se que é particularmente útil a esse respeito a comparação da sequência de aminoácidos da proteína sigmaC, já que é a mais variável das proteínas do reovírus aviário: apresentando apenas 35 % de identidade de sequência de aminoácidos entre os isolados de ave menos relacionados (J. M. Day, 2009, Inf. Gen. & Evolution, vol. 9, p. 390-400).
[015] Diversos cientistas descreveram o agrupamento de isolados de reovírus aviário por análises filogenéticas com base na identidade de sequência de aminoácidos de suas proteínas sigmaC. Já que mais e mais sequências de proteína sigmaC de isolados de reovírus aviário se tornam disponíveis em bases de dados públicas, análises mais elaboradas se tornam possíveis. Por exemplo: Kant et al. (2003, Vet. Res., vol. 34, p. 203-212), descreveram uma divisão de reovírus aviários em 5 principais grupos de genótipos. Nenhuma correlação pôde ser encontrada entre grupos sorotipos e genótipos, ou entre grupos de doença e genótipos: todos os tipos de doença associada com reovírus aviário puderam resultar de infecção com um reovírus aviário de qualquer dos grupos de genótipos.
[016] Usando diferentes parâmetros, outros estudos filogenéticos com base em análises da proteína sigmaC descrevem um outro agrupamento: Liu et al. (2003, Virology, vol. 314, p. 336-349), definem 6 linhagens; e Lublin et al. (2011, vacina, vol. 29, p. 8683-8688), definem 4 grupos de genótipos.
[017] O sistema descrito por Kant et al. (nos 5 grupos de genótipos), parece receber suporte mais científico. Nessa classificação, as cepas de vacinas contra reovírus aviário ‘clássica’ todas caem no genótipo grupo 1 de Kant, enquanto a cepa ERS cai no genótipo grupo 5 de Kant.
[018] Lublin et al. (supra) estudaram vacinação contra os diferentes grupos de genótipos. Em linha com o consenso de que vacinas contra reovírus aviário principalmente protegem homologamente, eles observaram que uma vacina efetiva contra todos os diferentes genótipos de reovírus aviário teve de conter material antigênico de cada qual desses grupos de genótipos.
[019] Nos últimos anos, houve um pico no número de infecções provenientes de falha vacinal de reovírus aviário. Aproximadamente a partir de 2009 a 2013, diversos surtos de reovírus aviário ocorreram na Europa e nos USA, por meio dos quais bandos de galinhas mostraram sintomas de infecção grave por reovírus aviário com tenossinovite, absorção deficiente e mesmo mortalidade; isso apesar do fato de que as galinhas foram particularmente vacinadas com vacinas contra reovírus aviário comerciais. Isto demonstrou que novas cepas de reovírus aviário virulentas desenvolveram, e que as vacinas clássicas e tipo ERS poderiam nem sempre proteger efetivamente.
[020] Inúmeros surtos em 2011 a 2012 em duas regiões da França foram analisados por Troxler et al. (2013, Vet. Record, vol. 172, p. 556). Baseando na divisão descrita por Kant et al. (supra) de cepas de reovírus aviário por comparação de sequência de aminoácidos da proteína SigmaC em 5 grupos de genótipos, Troxler et al. classificaram as cepas de surto que eles isolaram provenientes da França como uma subclasse do genótipo grupo 1 de Kant.
[021] Em virtude de as vacinas atuais parecerem inefetivas contra essas cepas provenientes de falha vacinal modernas, Troxler et al. repetiram a recomendação por Lublin et al. de que uma vacina de proteção cruzada ampla precisaria incorporar todos os grupos de genótipos de reovírus aviário.
[022] Consequentemente, existe uma necessidade urgente no campo de criação de aves domésticas de ter disponível uma vacina contra reovírus aviário que seja amplamente protetora, e seja efetiva também contra cepas virulentas provenientes de falha vacinal.
[023] É, portanto, um objetivo da presente invenção superar desvantagens na técnica anterior, e acomodar esta necessidade no campo, fornecendo uma vacina que pode reduzir infecção por um espectro amplo de reovírus aviários, entre outros, por cepas virulentas provenientes de falha vacinal de reovírus aviário.
[024] Observou-se, surpreendentemente, que este objetivo pode ser alcançado e, consequentemente, desvantagens da técnica anterior podem ser superadas, fornecendo uma vacina para reduzir infecção por reovírus aviário, por meio do que a vacina compreende material antigênico de reovírus aviário que é derivado de apenas dois dos cinco grupos de genótipos de reovírus aviário, com base em comparação de sequência de aminoácidos da proteína sigmaC viral.
[025] Observou-se que uma vacina como essa fornece proteção de espectro amplo, reduzindo quase completamente a replicação de isolados de falhas vacinais recentes de reovírus aviário, após apenas uma única vacinação.
[026] Os inventores analisaram parte de 150 amostras de surtos de reovírus aviário entre 1993 e 2013 e de diversos países. Interessantemente, durante a comparação das sequências de aminoácidos de sua proteína sigmaC, os reovírus aviários recém-isolados pertenceram a todos os grupos de genótipos como detalhado a seguir. Isto amplia as observações de Troxler et al., e mostra que os surtos recentes de reovírus aviário não são causados por nenhum genótipo de reovírus aviário específico. Em vez disso, parece existir uma mudança geral das características do vírus que torna as vacinas existentes menos efetivas. Consequentemente, existe uma necessidade de uma atualização das vacinas contra reovírus aviário, e as vacinas provenientes de falha vacinal terão de proteger contra todos os genótipos existentes do vírus.
[027] Para a presente invenção, cepas de reovírus aviário e isolados são divididos em 5 grupos de genótipos, como definido aqui, com base na sequência de aminoácidos de sua proteína SigmaC. Isto deu uma divisão efetiva de todas as cepas conhecidas, bem como um modo para classificar cepas provenientes de falha vacinal recente. Também, observou-se que essa divisão em 5 grupos de genótipos corresponde estritamente com a divisão de genótipo como descrito por Kant et al. (supra).
[028] Os inventores se surpreenderam ao descobrir que uma vacina baseada em uma combinação específica de material antigênico de dois grupos de genótipos de reovírus aviário: genótipos grupos 1 e 4, tiveram um efeito protetor de espectro amplo. Ao contrário, uma vacina similar contendo material antigênico de reovírus aviário dos genótipos grupos 1 e 5, não forneceu uma ampla proteção como essa.
[029] Essa nova vacina forneceu às aves alvos uma proteção de espectro amplo contra a replicação de reovírus aviário, uma vez que esta vacina pôde reduzir quase completamente a replicação em um alvo por reovírus aviários. Isto se aplicou tanto a reovírus aviário do mesmo grupo de genótipo do material antigênico compreendido na vacina (reovírus aviário homólogo), quanto um reovírus aviário de um grupo de genótipo que foi diferente daquele de cujo material antigênico foi compreendido na vacina (isto é, reovírus aviário heterólogo). Esse efeito de vacinação foi obtido já após uma única vacinação, e foi ainda efetivo contra cepas de surto virulento recentes de reovírus aviário.
[030] Em decorrência disso, essa nova vacina de espectro amplo contra reovírus aviário reduz doença induzida por reovírus aviário em animais vacinados. Também, por redução da carga viral, isso reduz o espalhamento do vírus.
[031] Isso foi inesperado e, em contraste direto com a convicção geral no campo no momento da invenção, onde a opinião geral era de que as vacinas contra reovírus aviário são apenas totalmente efetivas contra vírus homólogos, e poderiam não fornecer proteção heteróloga efetiva sobre os diferentes grupos de genótipos, e que tal vacinação por padrão exigiria pelo menos duas administrações para ser efetiva. De fato, isso foi confirmado por Lublin et al. (supra) que testou uma vacina contra reovírus aviário ampla com base em material antigênico de representativos de cada qual dos grupos de genótipos descritos.
[032] Consequentemente, quando se segue essa recomendação no campo, o desenvolvimento de uma vacina efetiva com uma ampla faixa de proteção contra essas cepas provenientes de falha vacinal modernas de reovírus aviário exigiria a inclusão de material antigênico de reovírus aviários de todos os grupos de genótipos descritos.
[033] Não se sabe por que essa combinação específica de material antigênico dos genótipos grupos 1 e 4 do reovírus aviário pode fornecer um efeito de vacinação de espectro amplo efetiva como esse. Embora os inventores não queiram se ligar a nenhuma teoria ou modelo que possa explicar essas observações, eles especulam que essa combinação particular de material antigênico do reovírus aviário de genótipos grupos 1 e 4 deve estar apresentando ao sistema imune de uma ave alvo uma combinação de antígenos que desencadeia uma resposta imune que é de proteção cruzada sobre uma ampla faixa das especificidades do antígeno que os diferentes grupos de genótipos de reovírus aviário apresentam.
[034] Portanto, em um aspecto, a invenção fornece uma vacina para reduzir infecção por reovírus aviário, a vacina compreendendo material antigênico de reovírus aviário que é derivado do reovírus aviários de mais que um único grupo de genótipo e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que o material antigênico de reovírus aviário consiste de material antigênico derivado de reovírus aviários de cada um dos dois grupos de genótipos: genótipo grupo 1 e genótipo grupo 4.
[035] Como é facilmente aparente aos versados na técnica, uma vacina de espectro amplo como essa que pode ser baseada em apenas um número limitado de antígenos fornece diversas vantagens claras sobre uma mais vacina de combinação extensiva compreendendo antígenos de todos os grupos de genótipos. Essas vantagens se baseiam principalmente nas economias significantes que podem ser obtidas desta maneira em mão de obra e capital, devido à maior eficiência e simplicidade de produção, armazenamento, e controle de qualidade.
[036] Uma “vacina” é bem conhecida por ser uma composição que tem um efeito médico inerente, compreendendo um componente imunologicamente ativo, e um carreador farmaceuticamente aceitável. O ‘componente imunologicamente ativo’ é um antigênico (combinação de) molécula(s) que é reconhecido pelo sistema imune do alvo que induz uma resposta imunológica protetora. A resposta pode originar de o sistema imune inato e/ou adquirido do alvo, e pode ser do tipo celular e/ou humoral.
[037] Para a vacina de acordo com a invenção, a resposta imune induzida no animal alvo vacinado tem o efeito de “reduzir infecção por reovírus aviário”. Isto se refere a uma redução do nível ou da extensão da infecção, por exemplo, reduzindo a carga viral ou encurtando a duração de replicação viral no animal hospedeiro.
[038] Este efeito é obtido prevenindo ou reduzindo o estabelecimento ou a proliferação de uma infecção produtiva por reovírus aviário em seus órgãos alvos tais como tendão, ou intestinos. Por sua vez, isto leva a uma redução no animal alvo do número, da intensidade, ou da gravidade de lesões e sinais clínicos que poderiam ser causados pela infecção viral. Uma vacina como essa é coloquialmente referida como uma vacina ‘contra’ reovírus aviário, ou como uma ‘vacina de reovírus aviário’.
[039] A determinação da efetividade de uma vacina de acordo com a invenção para reduzir infecção por reovírus aviário está bem dentro da rotina dos versados na técnica, e pode ser feita, por exemplo, monitorando a resposta imunológica após a vacinação ou após uma infecção de desafio, por exemplo, monitorando os sinais do alvo da doença, pontuações clínicas, parâmetros sorológicos, ou por reisolamento do patógeno, e comparando esses resultados com a resposta de desafio de vacinação vista em animais falso vacinados.
[040] Várias modalidades, preferências e exemplos de uma vacina de acordo com a invenção serão esboçados a seguir.
[041] Um “reovírus aviário” é bem conhecido na técnica, e é um vírus que pertence à espécie Orthoreovirus aviário. Esses vírus e suas doenças induzidas são, por exemplo, descritos em livros textos bem conhecidos, como: “The Merck veterinary manual” (10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X), e: “Diesases of Poultry” (12th ed., 2008, Y.M. Saif edt., ISBN- 10: 0813807182).
[042] Um reovírus aviário exibe os recursos caracterizantes de seus membros do grupo taxonômico tais como as características morfológicas, genômicas, e bioquímicas, bem como as características biológicas tal como comportamento fisiológico, imunológico ou patológico. Como se sabe no campo, a classificação de micro-organismos é baseada em uma combinação de tais recursos. A invenção, portanto, também inclui reovírus aviários que são subclassificados a partir deles de qualquer maneira, por exemplo, como uma subespécie, cepa, isolado, genótipo, variante, subtipo ou subgrupo e similares.
[043] Ficará aparente aos versados na técnica que, embora um reovírus aviário para a presente invenção seja atualmente classificado em uma espécie ou gênero particular, esta é uma classificação taxonômica que poderia mudar em tempo, já que novos critérios levam a reclassificação em um novo ou diferente grupo taxonômico. Entretanto, já que isso não muda o micro-organismo por si mesmo, ou seu repertório de antígeno, mas apenas seu nome ou classificação científica, tais micro-organismos reclassificados permanecem no escopo da invenção.
[044] O termo “compreendendo” (bem como variações tais como “compreendem”, “compreende” e “compreendido”) como usado aqui se refere a todos os elementos, e em qualquer possível combinação concebível para a invenção, que são cobertos por ou incluídos na seção de texto, parágrafo, reivindicação, etc., nos quais este termo é usado, mesmo se tais elementos ou combinações não forem explicitamente citados; e não refere à exclusão de qualquer de tal/tais elemento(s) ou combinações. Consequentemente, qualquer tal seção de texto, parágrafo, reivindicação, etc., pode também relacionar a uma ou mais modalidade(s) em que o termo “compreendendo” (ou suas variações) é substituído por expressões tais como “consiste de”, “consistindo de”, ou “consiste essencialmente de”.
[045] O “material antigênico” para a invenção pode, em princípio, ser qualquer tipo de material derivado de um reovírus aviário para a invenção, desde que ele possa induzir uma resposta imune protetora (tanto por si mesmo quanto com um adjuvante). O material antigênico deve assim ser de um tamanho, estrutura, forma, ou qualidade de maneira tal que a resposta imune que ele induz na ave alvo vacinada é de intensidade suficiente para ser capaz para reduzir infecção por um reovírus aviário.
[046] O material antigênico para a invenção pode ser um reovírus aviário replicativo (isto é, um reovírus aviário ‘vivo’); um reovírus aviário inativado (‘exterminado’); ou uma parte de um reovírus aviário, tais como uma subunidade, extrato, fração, homogenato ou sonicato.
[047] No caso, o material antigênico para a invenção é uma parte de um reovírus aviário, ele pode ser uma proteína, lipoproteína, glicoproteína, molécula do ácido nucleico, ou uma combinação de um ou mais desses. O material antigênico pode ser de origem biológica ou sintética, e pode ser derivado direta ou indiretamente de um reovírus aviário para a invenção.
[048] Para a invenção, uma "proteína” se refere a uma cadeia molecular de aminoácidos. Uma proteína não é de um comprimento, estrutura ou forma específicos, e pode, se exigido, ser modificada in vivo ou in vitro, por exemplo, por glicosilação, amidação, carboxilação, fosforilação, peguilação, ou mudanças em enovelamento espacial. Uma proteína pode ser uma proteína nativa ou uma madura, uma pré ou pró-proteína, ou uma parte de uma proteína. Uma proteína pode ser de origem biológica ou sintética. Entre outros, polipeptídeos e peptídeos, são incluídos nesta definição de proteína.
[049] Para a invenção, material antigênico é “derivado de” um reovírus aviário para a invenção se ele for de qualquer maneira obtido de um reovírus aviário ou de uma parte do mesmo. O material antigênico obtido para a invenção pode convenientemente ser compreendido em um carreador tal como um tampão, e preferivelmente será em uma forma líquida, para permitir o uso ou manipulação do material antigênico para a invenção. Versados na técnica podem perfeitamente selecionar e usar um carreador adequado com esse propósito.
[050] Exemplos de meios para derivar material antigênico para a invenção de um reovírus aviário podem ser proliferar um reovírus aviário para a invenção em uma célula hospedeira apropriada, após o que o vírus pode então ser colhido, e isolado por técnicas padrões bem conhecidas na técnica. O vírus replicativo colhido pode ser usado com ou sem a célula hospedeira ou partes da mesma.
[051] Reovírus aviário para a invenção pode também ser obtido em forma inativada, tratando reovírus aviário replicativo com qualquer técnica adequada tais como com calor, radiação, ou com substâncias químicas tais como formalina, beta-propiolactona, etilenoimina binária, ou beta- etanolamina.
[052] Adicionalmente, material antigênico derivado de um reovírus aviário para a invenção pode ser uma parte de um reovírus aviário, tais como uma subunidade, extrato, fração, homogenato ou sonicado. Esses podem ser preparados por técnicas padrões bem conhecidas na técnica, e podem começar de vírus replicativo ou inativado. O vírus usado pode ser derivado de uma cultura viral, tais como do precipitado celular, do sobrenadante da cultura, ou da cultura total.
[053] Material antigênico para a invenção pode também ser derivado por expressão de um gene Reoviral aviário em células de um sistema de expressão de DNA recombinante: essas células, o sobrenadante, ou a cultura total podem ser colhidos e purificados, por exemplo, por centrifugação ou filtração, opcionalmente seguido por concentração. Alternativamente, quando a proteína expressa permanece dentro das células do sistema de expressão, essas células podem ser colhidas, e a proteína pode ser produzida como uma subunidade, extrato, fração, homogenato ou sonicado dessas células. Tudo isso é bem conhecido na técnica. Os sistemas de expressão convenientes são de origem bacteriana, levedura, inseto, planta ou mamífero; por exemplo: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp., ou Caulobacter crescentus; Sacharomyces cereviseae, Pichia pastoris; célula de inseto/Baculovirus, Drosophila; Tobacco; ou células Hela ou CHO.
[054] Os métodos e materiais exigidos para obter material antigênico de reovírus aviário para a invenção são técnicas padrões em virologia, bioquímica e biologia molecular, todos bem conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, técnicas e materiais biológicos moleculares para obter RNA viral de um reovírus aviário para a invenção, para preparar DNAc, e para manipular isso para expressão, são bem conhecidos na técnica, e são, por exemplo, descritos extensivamente em livros textos bem conhecidos tais como: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989); Basic Methods em Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986); e: Sambrook & Russell, 2001, em: ‘Molecular cloning: a laboratory manual’, 3rd ed. New York, USA: Cold Spring Harbour Laboratory Press.
[055] Um “grupo de genótipo” no contexto de um reovírus aviário para a invenção se refere a inúmeros isolados de reovírus aviário que podem ser agrupados com base nos resultados de um alinhamento da sequência de aminoácidos de sua proteína Sigma C, como descrito aqui. Os membros em um grupo como esse são relacionados compartilhando um certo nível mínimo de identidade de sequência de aminoácidos para sua proteína sigmaC. Deste modo 5 grupos de genótipos de reovírus aviário foram definidos.
[056] Uma comparação de identidade de sequência de aminoácidos como essa é uma maneira bem conhecida para determinar o relacionamento evolucionário ou ‘filogenia’ entre proteínas. Ela é expressa como uma porcentagem de aminoácidos que são idênticos quando se comparam posições correspondentes entre sequências de aminoácidos, em relação ao comprimento da proteína alinhada em número de aminoácidos. NB: isso não deve ser confundido com similaridade de sequência, onde aminoácidos que são diferentes, mas similares, são também contados.
[057] Um alinhamento como esse é preferivelmente realizado usando um programa de computador para fazer alinhamentos em pares automatizados (múltiplos).
[058] Com o propósito de estabelecer um grupo de genótipo de reovírus aviário para a invenção, o teste decisivo é usando o programa de computador: “BLAST 2 SEQUENCES", disponível no NCBI website (selecionando "bl2seq", e sub-program: “blastP”, que pode ser encontrado em: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), usando seus ajustes de parâmetro padrões. O programa otimiza a maneira de duas sequências serem alinhadas, e exibe a região de sobreposição, e o número e a porcentagem de pareamentos idênticos entre aminoácidos.
[059] Para a invenção, o alinhamento da sequência de aminoácidos é feito sobre aminoácidos 1 - 277 da proteína sigmaC, com o metionina derivando da contagem do códon de partida como aminoácido no. 1.
[060] Listas de pontuações de alinhamento de reovírus aviários nos vários grupos de genótipos são apresentadas nas Tabelas anexas a elas.
[061] Para representar os relacionamentos evolucionários dentro, e entre grupos de genótipos, resultados de alinhamento podem ser apresentados como uma árvore filogenética. Isso pode também ser feito por computador, por exemplo, usando o programa PHYLIP (por exemplo, disponível pelo website: www.phylogeny.fr) ou MEGA (Tamura et al., 2013, Mol. Biol. e Evol., vol. 30, p. 2725-2729; versão mais recente: MEGA6). Figuras representando tais árvores filogenéticas dos grupos de genótipos dos reovírus aviários analisados para a invenção são representados nas Figuras anexas a eles.
[062] Em bases de dados públicas tais como GenBank ou EMBL acima de 200 sequências de aminoácidos são atualmente disponíveis de proteínas sigmaC de uma ampla variedade de isolados de reovírus aviário. Isso permitiu fazer alinhamentos comparativos, e a classificação de cepas de reovírus aviário públicas em grupos de genótipos como definido aqui.
[063] Além desta grande quantidade de informação de sequência pública, os inventores tiveram disponíveis as sequências de aminoácidos de proteínas sigmaC de muitas cepas de surto recentes. Detalhes são descritos na seção de Exemplos a seguir; resumidamente: uma amostra de tecido foi homogeneizada, e cultivada para amplificar qualquer vírus. RNA viral foi extraído, e usando oligonucleotídeos iniciadores específicos de SigmaC (Liu et al., supra) em um RT-PCR, a seção do genoma de reovírus aviário que codifica a proteína sigmaC foi amplificada, todos usando técnicas padrões. Em seguida, a sequência de ácido nucleico deste DNAc foi determinada, e a sequência de DNA traduzida em uma sequência de aminoácidos putativa. Isto foi então comparado com outras sequências de sigmaC, para determinar o grupo de genótipo do isolado de surto. Como descrito, representativos de todos os 5 grupos de genótipos foram identificados entre os isolados de surto.
[064] A sequência de aminoácidos da proteína sigmaC de inúmeros isolados recém-surgidos representativos de todos os 5 grupos de genótipos é apresentada na listagem de sequência anexa.
[065] A partir dessas análises observou-se que um reovírus aviário para a invenção é classificado como pertencente ao genótipo grupo 1 quando este reovírus aviário, em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 57 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1 (sequência de aminoácidos da proteína SigmaC de isolado do reovírus aviário SL11A0823-2 SER).
[066] Similarmente, um reovírus aviário para a invenção é classificado como pertencente ao genótipo grupo 4 quando este reovírus aviário, em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 66 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 4 (sequência de aminoácidos de isolado nr. SL11A0823-1 SER).
[067] Os termos “em uma forma replicativa“ são usados para referir a um reovírus aviário que é capaz de replicação, isto é, é vírus replicativo, não inativado, ou ‘vivo’. Assim, a vacina de acordo com a invenção emprega material antigênico que é derivado de um reovírus aviário que no mesmo ponto de tempo foi em uma forma replicativa, e então continha informação genética que codifica uma proteína sigmaC com o nível de identidade especificado. Entretanto, isso não significa que o material antigênico por si mesmo ainda precisa conter absolutamente esta informação genética, ou intacta.
[068] Um “carreador farmaceuticamente aceitável” é um auxiliar na preparação, armazenamento, ou administração de o composto imunoativo de uma vacina, sem causar efeitos adversos (graves) para a saúde do animal alvo no qual ele é administrado. Um carreador como esse pode, por exemplo, ser água estéril, ou sal fisiológico ou soluções de salina tamponada com fosfato. Em uma forma mais complexa, o carreador pode, por exemplo, ser um tampão, que pode compreender aditivos adicionais, tais como estabilizantes ou conservantes. Detalhes e exemplos são, por exemplo, descritos nos livros textos bem conhecidos tais como: “Remington: the science e practice de pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), e: “Veterinary vaccinology” (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
[069] Reovírus aviários que pertencem aos grupos de genótipos 1 ou 4 podem assim ser empregados para preparar uma vacina de acordo com a invenção. Tais reovírus aviários são descritos com detalhes aqui na seção de Exemplos, também eles são bem conhecidos na técnica, e podem facilmente ser obtidos pelos versados na técnica.
[070] Por exemplo, reovírus aviários podem ser usados a partir de amostras de reovírus aviário publicamente disponíveis; esses podem já ser classificados como pertencentes aos grupos de genótipos 1 ou 4, ou podem facilmente ser classificados como descrito aqui. Tais amostras são disponíveis a partir de uma variedade de universidades e instituições de pesquisa (aves domésticas), bem como de institutos depositários tais como o ATCC (Manassas, VA, USA), o CNCM (Institut Pasteur, Paris, França), ou o ECACC (Porton Down, UK).
[071] Alternativamente, reovírus aviário de genótipos grupos 1 e 4 pode ser obtido pelas amostras de campo de galinhas que exibem sinais clínicos de infecção por reovírus aviário, tais como artrite viral ou absorção deficiente. Amostras podem ser obtidas dos órgãos de pássaros afetados tais como de: tendão, articulação tibiotársica, fígado, baço, ou intestino tal como jejuno. O vírus pode ser cultivado in vitro e pode ser identificado como um reovírus aviário, por exemplo, a partir de seu cpe típico em cultura celular, ou usando anticorpos específicos de reovírus aviário. Também, RNA viral pode ser analisado por RT-PCR, usando oligonucleotídeos iniciadores como descrito na literatura ou aqui. Em seguida, análise por computador da sequência de aminoácidos de sigmaC indicará o grupo de genótipo da amostra.
[072] Usando esses métodos, os inventores isolaram e analisaram um grande número de isolados de reovírus aviário. Uma vacina de acordo com a invenção foi preparada de dois desses que foram isolados de reovírus aviário recém-surgidos em diferentes fazendas de galinha na Bélgica em 2011; os nomes do isolado são: SL11A0823-2BE e SL11A0823-1BE. Esses foram classificados como pertencentes aos genótipos grupos 1 e 4 como definido aqui, respectivamente. A sequência de aminoácidos de sua proteína sigmaC é apresentada nas SEQ ID NO’s: 1 e 4 respectivamente.
[073] Vacinas foram preparadas usando procedimentos padrões, resumidamente: vírus foram amplificados a partir de amostra de campo, e foram purificados na placa três vezes. Em seguida, vírus foi cultivado em células Vero, foi inativado usando formalina, e concentrado, então material antigênico viral foi formulado como uma emulsão água em óleo com óleo mineral leve e emulsificantes.
[074] Uma única dose de vacina foi administrada uma vez em galinhas poedeiras SPF em diferentes grupos de tratamento, por administração intramuscular. Ovos fertilizados dessas galinhas vacinadas foram coletados começando de 5 semanas após a vacinação. Esses foram chocados, e pintinhos progênies receberam uma inoculação de desafio com reovírus aviário replicativo de diferentes grupos de genótipos. A eficácia da vacina para a progênie foi determinada por detecção de vírus de desafio em amostras de sangue tiradas a 3 dias após inoculação de desafio.
[075] Os resultados de vacinação são descritos com detalhes na seção de Exemplos, mas uma proteção de espectro amplo efetiva foi observada apenas para a vacina contendo antígenos do reovírus aviário dos grupos de genótipos 1 e 4: praticamente nenhum vírus de desafio pôde ser isolado dos pintinhos que receberam as várias inoculações de desafio homólogas ou heterólogas.
[076] Ao contrário, grupos de pintinhos que receberam uma vacina contendo material antigênico de apenas um único isolado de reovírus aviário, foram protegidos apenas contra a cepa de desafio homóloga; controles não vacinados foram positivos para vírus de desafio em todas as amostras; e uma vacina de combinação com antígenos do reovírus aviário dos grupos de genótipos 1 e 5 apenas protegidos contra vírus de desafio dos genótipos grupos 1 ou 2, a mesma de uma vacina do genótipo 1 multivalente.
[077] Em uma modalidade preferida, um reovírus aviário que pertence ao genótipo grupo 1 de acordo com a invenção, contém (em forma replicativa) informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 58 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1. Mais preferidos: 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1, nesta ordem de preferência.
[078] Em uma modalidade preferida, um reovírus aviário pertencente ao genótipo grupo 4 de acordo com a invenção contém (em forma replicativa) informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 67 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1. Mais preferidos: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 4, nesta ordem de preferência.
[079] Em uma modalidade de uma vacina de acordo com a invenção, o material antigênico de reovírus aviário consiste de material antigênico derivado de dois tipos de reovírus aviário; o primeiro tipo é um reovírus aviário que em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 57 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1; e o segundo tipo é um reovírus aviário que em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 66 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 4.
[080] Para a invenção, as indicações “primeiro” e “segundo” são usadas apenas para facilidade de referência, e não para indicar qualquer ordem numérica ou dependência.
[081] Em uma modalidade preferida, um primeiro tipo de reovírus aviário contém (em forma replicativa) informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 58 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1. Mais preferidos: 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1, nesta ordem de preferência.
[082] Em uma modalidade preferida, um segundo tipo de reovírus aviário contém (em forma replicativa) informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 67 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 4. Mais preferidos: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 4, nesta ordem de preferência.
[083] Em suas análises das cepas provenientes de falha vacinal recente de reovírus aviário, os inventores observaram que a maioria dos isolados que classificaram como genótipo grupo 1 (como definido aqui), de fato formaram um subgrupo de genótipo que foi claramente distinto das cepas tipo vacina clássica que também pertencem ao genótipo grupo 1. Isto está também em linha com as descobertas de Troxler et al. (supra). Os inventores, portanto, se referem ao grupo de genótipo da cepa de vacinas contra reovírus aviário clássicas como genótipo subgrupo 1A e ao grupo de genótipo desta seção de isolados recém-surgidos como genótipo subgrupo 1B.
[084] Portanto, em uma modalidade de uma vacina de acordo com a invenção, o material antigênico derivado de reovírus aviário do genótipo grupo 1 é derivado de reovírus aviário do genótipo subgrupo 1B.
[085] Um reovírus aviário para a invenção é classificado como pertencente ao genótipo subgrupo 1B quando este reovírus aviário em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 78 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1.
[086] Em uma modalidade adicional, um reovírus aviário que pertence ao genótipo subgrupo 1B de acordo com a invenção, contém (em forma replicativa) informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 79 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1. Mais preferidos: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1, nesta ordem de preferência.
[087] A fim de caracterizar particularmente os outros grupos de genótipos de reovírus aviário que são empregados aqui, esses podem também ser definidos por meio do nível de identidade de sequência de aminoácidos de sua proteína SigmaC em relação a uma sequência de aminoácidos de referência.
[088] Um reovírus aviário é classificado para a invenção como pertencente ao genótipo subgrupo 1A quando este reovírus aviário, em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 79 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos representada no número de acesso no GenBank AAB61607 (cepa 1733 do reovírus aviário). Mais preferidos: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos representada no número de acesso no GenBank AAB61607, nesta ordem de preferência.
[089] Um reovírus aviário é classificado para a invenção como pertencente ao genótipo grupo 2 quando este reovírus aviário, em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 58 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 2 (sequência de aminoácidos da proteína SigmaC de isolado do reovírus aviário SL11A0294-12 FR). Mais preferidos: 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 2, nesta ordem de preferência.
[090] Um reovírus aviário é classificado para a invenção como pertencente ao genótipo grupo 3 quando este reovírus aviário, em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 57 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3 (sequência de aminoácidos da proteína SigmaC de isolado do reovírus aviário SL10A1581-32 ES). Mais preferidos: 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3, nesta ordem de preferência.
[091] Um reovírus aviário é classificado para a invenção como pertencente ao genótipo grupo 5 quando este reovírus aviário, em uma forma replicativa contém informação genética que codifica uma proteína sigmaC tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 65 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 5 (sequência de aminoácidos da proteína SigmaC de cepa ERS do reovírus aviário). Mais preferidos: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 5, nesta ordem de preferência.
[092] Em uma modalidade, material antigênico para a invenção que é derivado de reovírus aviário é: reovírus aviário replicativo, reovírus aviário inativado, ou uma parte de reovírus aviário, tais como uma subunidade, extrato, fração, homogenato ou sonicado de reovírus aviário. Mais preferido é reovírus aviário inativado.
[093] Quando o material antigênico é reovírus aviário inativado, ou é uma parte de reovírus aviário, o material antigênico ainda contém (todos) componentes de um reovírus aviário que contribuem para uma resposta imune.
[094] A quantidade de material antigênico de reovírus aviário compreendido em uma vacina de acordo com a invenção, quando este material antigênico é reovírus aviário inativado, ou é uma parte de reovírus aviário, é entre cerca de 1 e cerca de 1.000 μg por dose de animal. A quantidade preferível de material antigênico de reovírus aviário é entre cerca de 10 e cerca de 500 μg/dose; mais preferivelmente entre 10 e 250 μg/dose, e entre 25 e 100 μg/dose de animal.
[095] Para a invenção, a quantidade preferida de material antigênico de reovírus aviário por dose de animal pode se relaciona à quantidade do material antigênico de cada qual dos dois genótipos grupos 1 e 4 separadamente, ou à quantidade de ambos combinados. Também, a quantidade de material antigênico por dose de animal de um grupo de genótipo não precisa ser a mesma do material antigênico do outro grupo de genótipo. Esta última modalidade permite otimização adicional da eficácia de uma vacina de acordo com a invenção, adaptando a quantidade de antígeno, em sentido absoluto e relativo.
[096] Quando material antigênico derivado de um reovírus aviário para a invenção é na forma de reovírus aviário inativado, ou é uma parte de reovírus aviário, então a quantidade por dose de animal pode ser expressa por referência à quantidade de vírus replicativo que foi usada para a inativação ou a extração, fracionamento, homogeneização, etc. Alternativamente, a quantidade por dose de animal pode ser expressa em termos bioquímicos, por exemplo, como uma quantidade de proteína, ou em unidades Elisa arbitrárias, relativo a um padrão conhecido. Tudo isso é bem conhecido pelos versados na técnica.
[097] Quando material antigênico derivado de um reovírus aviário para a invenção é na forma de reovírus aviário replicativo, então a quantidade do vírus por dose de animal de uma vacina de acordo com a invenção, não é tão crítica quanto quando a vacina seria com base em reovírus aviário inativado ou em uma subunidade do mesmo. Isto é em virtude de que o reovírus aviário replicativo replicará na ave alvo até um nível de viremia que é biologicamente sustentável. No entanto, uma dose mínima deve ser dada para obter uma ‘tomada’ efetiva da vacina ‘viva’. Com relação a isso, existem diferentes meios para quantificar um reovírus aviário replicativo; conveniente é um que conta as partículas de vírus viáveis reais, tais como em um experimento de titulação de cultura de tecido, ou em um ensaio de placa em uma camada de célula suscetível. Quantidades do reovírus aviário para a invenção podem então ser expressas como inúmeras unidades em 50% de dose infecciosa de cultura de tecido (TCID50), ou unidades formadoras de placa (pfu). Também, o que constitui uma dose de inóculo efetiva depende da viabilidade e intensidade replicativa do reovírus particular que é usado para a invenção.
[098] Quando o material antigênico derivado de um reovírus aviário para a invenção é na forma de reovírus aviário replicativo, a quantidade preferida de reovírus aviário replicativo para a vacina de acordo com a invenção é entre cerca de 10 e cerca de 1x10A7 TCID50 do reovírus aviário por dose de animal, mais preferivelmente entre 1x10A2 e 1x10A6, entre 1x10A2 e 1x10A5, entre 1x10A2 e 1x10A4, e ainda entre 500 e 5.000 TCID50/dose, nesta ordem de preferência.
[099] Vacinas de acordo com a invenção podem ser administradas em um volume que é aceitável para o animal alvo, e podem, por exemplo, ser entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mL em volume. Preferivelmente, uma dose é em um volume entre cerca de 0,2 e cerca de 3 mL.
[0100] Em uma modalidade, uma vacina de acordo com a invenção adicionalmente compreende um estabilizante. Isto pode servir para proteger componentes propensos a degradação, e/ou para intensificar o prazo de validade da vacina. No geral, tais estabilizantes são grandes moléculas de alto peso molecular, tais como lipídios, carboidratos ou proteínas; por exemplo, leite em pó, gelatina, albumina de soro, sorbitol, sacarose, trealose, espermidina, aminas NZ, Dextrano ou polivinil pirrolidona, e tampões, tais como fosfatos de metal alcalino.
[0101] Preferivelmente, o estabilizante é sem compostos de origem animal, ou ainda: é quimicamente definido, como descrito em WO 2006/094,974.
[0102] Também, conservantes podem ser adicionados, tais como timerosal, mertiolate, compostos fenólicos e/ou gentamicina.
[0103] Técnicas e procedimentos gerais em vacinologia são bem conhecidos na técnica e são descritas, por exemplo, em regulamentos governamentais tais como a Farmacopéia, e em livros textos bem conhecidos tais como: “Remington” e “Veterinary vaccinology” (supra).
[0104] Animais alvos para uma vacina de acordo com a invenção são aves que são suscetíveis a infecção com reovírus aviário. Preferido alvos aviários são espécie de ave de relevância para humanos ou para o campo veterinário, por exemplo: galinha, peru, pato, ganso, perdiz, pavão, codorniz, pombo, faisão, galinha d’angola, tentilhão, corvo, periquito, papagaio, cavalo árabe, arara, cacatua, tentilhão, falcão, gavião, ave pernalta, casuar ou avestruz.
[0105] Preferidas são espécies de alvo aviário selecionadas do grupo que consiste de: galinha, peru, pato e ganso. Mais preferido é: galinha, em virtude de para esta espécie de alvo aviário o impacto econômico de infecção e doença por reovírus aviário ser mais pronunciado.
[0106] Para a invenção, uma ave pode ser de qualquer tipo, raça, ou variedade, tais como: poedeiras, reprodutoras, frangos de corte, raças de combinação, ou linhagens parentais de qualquer de tais raças. Tipos preferidos são: frango de corte, reprodutores e poedeira. As galinhas reprodutoras mais preferidas são, já que para este tipo de pássaros sua vacinação resulta em proteção de sua progênie, que é mais suscetível a infecção com reovírus aviário.
[0107] Para a invenção, não é necessário que a espécie de ave que é o alvo para vacinação seja a mesma da espécie de ave da qual o reovírus aviário foi isolado que foi usado para derivar material antigênico para a vacina de acordo com a invenção.
[0108] Em uma modalidade preferida, um reovírus aviário que foi isolado de uma galinha é usado para uma vacina de acordo com a invenção.
[0109] Uma vacina de acordo com a invenção pode servir como uma efetivação de vacina primária, que pode mais tarde ser seguida e amplificada por uma vacinação de reforço.
[0110] O animal alvo para a vacina de acordo com a invenção pode, em princípio, ser saudável ou doente, e pode ser positivo ou negativo para presença de reovírus aviário, ou para anticorpos contra reovírus aviário. Também, o alvo pode ser de qualquer idade na qual ele é suscetível a vacinação. Entretanto, ele é evidentemente favorável para vacinar alvos saudáveis, não infectados, e para vacinar tão cedo quanto possível para prevenir qualquer infecção de campo.
[0111] Uma vacina de acordo com a invenção pode assim ser usada tanto como um tratamento profilático quanto como um terapêutico, ou ambos, já que ela interfere tanto no estabelecimento quanto na progressão de uma infecção por um reovírus aviário.
[0112] A esse respeito, um efeito vantajoso adicional da redução de carga viral pela vacina de acordo com a invenção, é a prevenção ou redução da irradiação e por meio disso o espalhamento do vírus, tanto verticalmente em progênie, quanto horizontalmente em um bando ou população de pássaros, e em uma área geográfica. Consequentemente, o uso de uma vacina de acordo com a invenção leva a uma redução da prevalecência de reovírus aviário.
[0113] Portanto, aspectos adicionais da invenção são: - o uso de uma vacina de acordo com a invenção para reduzir a prevalecência de reovírus aviário em uma população ou em uma área geográfica, e - a vacina de acordo com a invenção para reduzir a prevalecência de reovírus aviário em uma população ou em uma área geográfica.
[0114] O esquema para a administração de uma vacina de acordo com a invenção em uma ave alvo pode ser em doses únicas ou múltiplas, que podem ser dadas simultânea, concomitante ou sequencialmente, de uma maneira compatível com a dosagem e formulação visadas, e em uma quantidade como essa como será imunologicamente efetiva.
[0115] O esquema para a administração de uma vacina de acordo com a invenção idealmente é integrado em programas de vacinação existentes de outras vacinas que a ave alvo pode exigir, para reduzir tensão para as aves e reduzir custos de mão de obra.
[0116] A vacina contra reovírus aviário de acordo com a invenção, em princípio, pode ser dada a uma ave alvo por diferentes vias de aplicação, e em diferentes pontos em sua existência, desde que a vacina administrada possa estabelecer uma resposta imune efetiva.
[0117] Em uma modalidade, uma vacina de acordo com a invenção é administrada em pintinhos no dia do choco ou logo depois disso, isto é, no dia 1 a 3 de idade. Alternativamente, a vacina de acordo com a invenção é administrada em ovo, logo antes do choco; para galinhas isso é em cerca do dia 18 de desenvolvimento embriônico.
[0118] A vacina de acordo com a invenção é preferivelmente administrada em um animal alvo aviário, não menos que 4 semanas antes do início de ação esperado da postura.
[0119] Desta maneira, progênie pode ser efetivamente protegida por anticorpos maternalmente derivados, e/ou infecção por transmissão vertical é reduzida ou prevenida.
[0120] Vias preferidas para a administração de uma vacina de acordo com a invenção em uma ave alvo são: como uma aplicação parenteral por injeção, por exemplo, intramuscular ou subcutânea; por gotas grandes, por exemplo, como uma pulverização, aplicação de colírio ou oro-nasal; ou por meio da via alimentar.
[0121] A via de aplicação preferida é por injeção intramuscular ou subcutânea; preferivelmente intramuscularmente no músculo da coxa ou peito, ou subcutaneamente no pescoço. Isto se aplica igualmente para quando o material antigênico de um reovírus aviário para a invenção é vírus replicativo, vírus inativado, ou uma subunidade.
[0122] Não precisa dizer que a via de aplicação ideal dependerá da formulação de vacina específica que é usada, e das características particulares da ave alvo.
[0123] Está bem dentro dos preceitos dos versados na técnica otimizar opcionalmente uma vacina de acordo com a invenção. No geral, isto envolve o ajuste fino da eficácia da vacina, de maneira que ele fornece suficiente proteção imune. Isto pode ser feito adaptando a dose da vacina, ou usando a vacina em uma outra forma ou formulação, ou adaptando os outros constituintes da vacina (por exemplo, o estabilizante ou o adjuvante), ou aplicação por meio de uma diferente via.
[0124] A vacina pode adicionalmente compreender outros compostos, tal como um adjuvante, um antígeno adicional, uma citocina, etc. Alternativamente, uma vacina de acordo com a invenção pode vantajosamente ser combinada com um componente farmacêutico, por exemplo, um antibiótico, um hormônio, um medicamento anti-inflamatório ou um antiparasítico.
[0125] Em uma modalidade, uma vacina de acordo com a invenção compreende um adjuvante.
[0126] Isto se aplica em particular quando o material antigênico derivado de um reovírus aviário para a invenção é na forma de vírus inativado, ou é uma parte de um reovírus aviário de acordo com a invenção. Como formas não replicativas tais materiais antigênicos tipicamente exigem estímulo imune adicional para ser capaz de induzir uma vacinação efetiva de espectro amplo.
[0127] Um “adjuvante” é um ingrediente de vacina bem conhecido, que em geral é uma substância que estimula a resposta imune do alvo de uma maneira não específica. Muitos diferentes adjuvantes são conhecidos na técnica. Exemplos de adjuvantes são adjuvante Completo e Incompleto de Freund, vitamina E, composições de alumínio tais como Alumino-fosfato ou hidróxido de Alumínio, polímeros em bloco não iônicos e poliaminas tais como dextranossulfato, Carbopol®, pirano, Saponina, tal como: Quil A®, ou Q-vac®. Os componentes de saponina e vacina podem ser combinados em um ISCOM® (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).
[0128] Além disso, peptídeos tais como muramildipeptídeos, dimetilglicina, tuftsina, são frequentemente usados como adjuvante, e emulsões de óleo, usando óleo mineral, por exemplo, Bayol™ ou Markol™, Montanide™ ou óleo mineral leve (parafina); ou óleo não mineral tais como esqualeno, esqualano, ou óleos vegetais, por exemplo, oleato de etila. Também, produtos de combinação tal como ISA™ da Seppic™, ou DiluvacForte™ podem vantajosamente ser usados. Uma emulsão pode ser água em óleo (a/o), óleo em água (o/a), água em óleo em água (a/o/a), ou uma dupla emulsão de óleo (DOE), etc.
[0129] Em uma modalidade preferida, uma vacina de acordo com a invenção compreende uma emulsão água em óleo.
[0130] Tal emulsão fornece um efeito de liberação controlada em um animal vacinado que libera lentamente o antígeno, por meio disso fornecendo um estímulo prolongado do sistema imune do alvo.
[0131] Em uma modalidade preferida, a fase oleosa da emulsão água em óleo compreende um óleo mineral, ou um oleato de etila.
[0132] Em uma modalidade da vacina de acordo com a invenção, o material antigênico é reovírus aviário inativado que é formulado em uma emulsão água em óleo, por meio do que a fase oleosa da emulsão água em óleo compreende um óleo mineral, ou um oleato de etila.
[0133] Não precisa dizer que outras maneiras de adjuvantar, adicionando veículo compostos ou diluentes, emulsificar ou estabilizar uma vacina de acordo com a invenção estão também no escopo da invenção.
[0134] Em uma modalidade, uma vacina de acordo com a invenção adicionalmente compreende um oligodeoxinucleotídeo que é um oligodeoxinucleotídeo contendo CpG não metilado imunoestimulador (INO). Um INO preferido é um agonista 21 do receptor tipo Toll aviário (TLR), tal como descrito em WO 2012/089,800 (família X4), WO 2012/160,183 (família X43), ou WO 2012/160,184 (família X23).
[0135] Uma vacina de acordo com a invenção pode vantajosamente ser combinada com material antigênico adicional em uma vacina de combinação. Entretanto, não é exigido nenhum material antigênico adicional derivado de um reovírus aviário.
[0136] Portanto, em uma modalidade de uma vacina de acordo com a invenção a vacina compreende material antigênico adicional que é derivado de um micro-organismo patogênico para uma ave, mas não de um reovírus aviário.
[0137] O “material antigênico adicional” pode por si mesmo ser em forma replicativa ou inativada, ou uma subunidade, e pode ser com ou sem um adjuvante. O material antigênico adicional é derivado de um microorganismo adicional que é patogênico para uma ave alvo. Ele pode, por exemplo, compreender uma molécula biológica ou sintética tais como uma proteína, um carboidrato, um lipopolissacarídeo, um ácido nucleico que codifica um antígeno proteináceo. Também, uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico como esse, ou um micro-organismo carreador recombinante vivo contendo um ácido nucleico como esse, pode ser maneira de dispensar o ácido nucleico ou o material antigênico adicional para a ave alvo. Alternativamente, o material antigênico adicional pode compreender um micro-organismo inativado tais como um parasita, bactéria ou vírus.
[0138] Alternativamente, a vacina de acordo com a invenção pode por si mesma ser adicionada em uma vacina.
[0139] Um efeito vantajoso de uma vacina de combinação para a invenção é que ela não induz uma resposta imune apenas contra reovírus aviário, mas também contra outros patógenos de uma ave alvo, enquanto apenas um único manuseio do animal alvo para a vacinação é exigido, por meio disso reduzindo desconforto para o alvo, bem como custos de tempo e mão de obra.
[0140] Um “micro-organismo patogênico para uma ave” para a invenção, é bem conhecido na técnica. O material antigênico adicional pode, portanto, ser derivado, em princípio, de qualquer vírus (exceto reovírus aviário), bactéria, parasita, fungo, rickéttsia, protozoário e/ou parasita que é patogênico para uma ave que é também um alvo para uma vacina para reduzir infecção por reovírus aviário de acordo com a invenção.
[0141] Em uma modalidade preferida, um vírus patogênico para aves é selecionado dentre: vírus de bronquite infecciosa, vírus da doença de Newcastle, adenovírus aviário, astrovírus aviário, paramixovírus aviário, vírus da síndrome da queda de postura, adenovírus de aves, IBDV, vírus de anemia da galinha, vírus de encefalomielite de ave, vírus da gripe aviária, vírus de rinotraqueíte de peru, vírus da peste de pato, vírus da hepatite viral de pato, vírus da gripe de pombo, vírus da doença de Marek, vírus da leucose aviária, vírus da laringotraqueíte infecciosa, metapneumovírus aviário, vírus da influenza aviária, e parvovírus de ganso.
[0142] Em uma modalidade preferida, uma bactéria patogênica para aves é selecionada dentre os gêneros bacterianos: Escherichia, Salmonella, Ornithobacterium, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Erysipelothrix, Mycoplasma, Campylobacter, Borrelia, Enterococcus, Avibacterium, Riemerella, Listeria, Shigella, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, Chlamydia e Clostridium.
[0143] Em uma modalidade preferida, um parasita patogênico para aves é selecionado dentre os gêneros parasitas: Eimeria e Cryptosporidium.
[0144] Em uma modalidade preferida, um fungo patogênico para aves é selecionado dentre os gêneros fúngicos: Aspergillus e Cândida.
[0145] Em um aspecto adicional a invenção se refere a métodos para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção.
[0146] Tais métodos resultam na disponibilidade de uma vacina de acordo com a invenção, a vacina tendo o efeito favorável de reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave, como descrito anteriormente.
[0147] A “preparação” de uma vacina de acordo com a invenção é realizada por meios bem conhecidos pelos versados na técnica. Tais métodos de fabricação em geral compreenderão das etapas de misturar e formular material antigênico derivado de um reovírus aviário para a invenção, com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, seguido por partilha em recipientes de tamanho apropriado. Os vários estágios do processo de fabricação precisarão ser monitorados por testes adequados, por exemplo, por testes imunológicos quanto a qualidade e quantidade dos antígenos; por testes microbiológicos quanto a esterilidade e ausência de agentes estranhos; e finalmente por experimentos in vitro ou in vivo para determinar a eficácia e segurança da vacina. Todos esses são bem conhecidos pelos versados na técnica, e são prescritos nos livros textos e nos regulamentos governamentais tal como a Farmacopeia.
[0148] Uma vacina de acordo com a invenção pode ser preparada em uma forma que é adequada para administração a uma ave alvo, e que emparelha com a via de aplicação desejada, e com o efeito desejado.
[0149] Preferivelmente, uma vacina de acordo com a invenção é formulada como um líquido injetável, tais como: uma suspensão, solução, dispersão ou emulsão. Comumente tais vacinas são preparadas estéreis.
[0150] Em uma modalidade, uma vacina de acordo com a invenção é preparada de um material antigênico de reovírus aviário que foi inativado. Uma vacina contra reovírus aviário inativada como essa pode agora ser fabricada para a invenção usando técnicas bem conhecidas.
[0151] Portanto, em um aspecto adicional a invenção se refere a um método para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção, compreendendo a etapa de inativar reovírus aviário de cada um dos dois grupos de genótipos: genótipo grupo 1 e genótipo grupo 4.
[0152] Replicação de um reovírus aviário de acordo com a invenção pode ser feita de muitas maneiras, por exemplo, usando um animal hospedeiro, e colhendo vírus de sangue e/ou órgãos. Entretanto, é preferido um sistema de cultura in vitro usando células hospedeiras suscetíveis ao reovírus aviário. Um sistema de cultura como esse pode ser mais bem monitorado e controlado do que produção in vivo, e rendimentos virais podem ser otimizados. Tipicamente, um sistema de cultura in vitro emprega um vaso de cultura e um meio de cultura (semi)definidos. As células hospedeiras podem ser derivadas de um animal, que produz células primárias, ou podem ser células imortalizadas tal como de uma linhagem celular estabelecida. Em pequena escala, o vaso de cultura pode ser frascos de garrafa de fundo chato ou redondo; para cultura em grande escala o vaso de cultura pode ser um fermentador, que também permite diversos parâmetros críticos da cultura para ser monitorado e ajustado quando apropriado, e isso pode ainda ser automatizado. Técnicas, materiais e equipamento para um sistema de cultura in vitro para a invenção em qualquer escala são bem conhecidos e facilmente disponíveis de muitos fornecedores comerciais na indústria de ciência da vida.
[0153] Em uma modalidade, um método para a preparação de acordo com a invenção compreende as etapas de: a. propagar um reovírus aviário em uma cultura celular in vitro, b. colher e inativar o dito reovírus aviário, e c. misturar o reovírus aviário inativado com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0154] Em uma modalidade adicional, um método para a preparação de acordo com a invenção compreende a etapa de misturar material antigênico de reovírus aviário como definido na invenção, com um adjuvante.
[0155] Em aspectos adicionais, a invenção se refere a diferentes usos médicos da vacina de acordo com a invenção, ou de material antigênico de reovírus aviário como descrito para a invenção. Esses materiais e métodos resultam no efeito favorável de reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave, como descrito anteriormente.
[0156] Portanto, em aspectos adicionais, a invenção se refere a: - Uma composição compreendendo material antigênico de reovírus aviário que consiste de material antigênico derivado de reovírus aviários de cada um dos dois grupos de genótipos: genótipo grupo 1 e genótipo grupo 4, para uso em uma vacina para reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave. - O uso de material antigênico de reovírus aviário que consiste de material antigênico derivado de reovírus aviários de cada um dos dois grupos de genótipos: genótipo grupo 1 e genótipo grupo 4, para a fabricação de uma vacina para reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave. - Uma vacina de acordo com a invenção para uso na redução de infecção por reovírus aviário em uma ave. - O uso de uma vacina de acordo com a invenção, ou de uma vacina obtenível por um método de acordo com a invenção, para reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave. - Um método para reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave, compreendendo a administração de uma vacina de acordo com a invenção, ou de uma vacina obtenível por um método de acordo com a invenção, em uma ave.
[0157] A invenção será agora descrita adicionalmente pelos seguintes exemplos não limitantes.
[0158] Reovírus aviário foi isolado dos órgãos de galinha cultivando homogenatos de tecido nas células do fígado do embrião da galinha (CEL). Resumidamente: tecidos tais como tendão, fígado, jejuno, e sangue foram obtidos de galinhas (potencialmente) infectadas. Sangue foi centrifugado e soro coletado. Amostras de tecidos foram cortadas. Essas foram colocadas em tubos de 6 mL contendo cerca de 0,5 cc de glóbulos de vidro de cerca de 1 mm de diâmetro, e 1 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) que continha um coquetel de compostos antibióticos e antifúngicos. Amostras foram homogeneizadas agitando por 20 minutos em um moinho de bolas Mixer Mill (Retsch), seguido por clarificação por centrifugação. Sobrenadante foi coletado e pôde ser armazenado congelado a -70 °C para uso posterior.
[0159] Células CEL primárias foram preparadas frescas antes de uso, de acordo com um protocolo padrão, resumidamente: embriões de galinha SPF de 14 a 16 dias de idade foram usados para obter fígados. Os fígados foram lavados duas vezes em PBS para remover sangue, e foram então incubados agitando ao mesmo tempo em uma solução de tripsina/PBS a 37 °C por 15 minutos. A tripsina foi neutralizada com FCS, a mistura tripsinada foi centrifugada por 10 minutos a 600xg. O precipitado foi ressuspenso em meio de crescimento padrão (compreendendo um coquetel de antibióticos e 5 % de soro bovino fetal (FCS)). Isso foi filtrado uma vez para remover aglomerados, e então as células CEL foram contadas e usadas diretamente.
[0160] CEL foram semeadas a 1,5 x 10A6 células/mL em 5 mL de meio de crescimento (5 % de FCS) em frascos de cultura T25, e incubadas por toda um noite em um incubador umedecido a 37° C e a 5 % CO2, para permitir estabelecimento de uma monocamada. No dia seguinte o meio de cultura foi substituído por meio compreendendo 2 % de FCS, e os frascos foram inoculados com uma amostra do vírus como 50 μL de sobrenadante de soro ou tecido, em seguida os frascos foram incubados por 4 a 7 dias.
[0161] Após a primeira rodada de incubação, a camada de célula CEL frequentemente pareceu danificada por detritos, de maneira que não foi visível nenhum efeito citopático distinto (cpe), assim uma segunda passagem foi normalmente dada: CEL frescas foram preparadas, semeadas, e incubadas como monocamada, então 50 μL do sobrenadante da cultura da primeira passagem foram inoculados. Isso foi incubado por 4 dias, após o que cpe de reovírus aviário específico (células CEL parecem ficar escuras e granulares, com vesículas translúcidas tipo blásticas) pôde ser claramente observado em um frasco. Para frascos negativos de cpe, uma terceira passagem pôde ser dada. Finalmente, o sobrenadante da cultura da 2a ou 3a passagem foi colhido e armazenado congelado (-70°C) para uso posterior.
[0162] Os isolados foram nomeados e numerados, por meio do que SL quer dizer ‘laboratório de serviço’, seguido por dois dígitos para o ano de isolamento, um número de isolado cronológico, e o código de 2 letras do país do material doador usado para o isolamento.
[0163] As amostras do vírus isoladas puderam ser usadas diretamente para isolamento de RNA, RT-PCR e análise da sequência. Os isolados que foram usados em experimentos em animal foram dados tratamento adicional: amostras usadas para inoculações de desafio foram amplificadas diretamente do isolado amplificado da terceira rodada, para obter maiores tituladores e maiores volumes por proliferação em CEL de células CEF em vasos de cultura sucessivamente maiores, tais como em T75 (15 mL de cultura) ou T175 (25 mL de cultura) em frascos de cultura celular de fundo plano Cellstar™ (Greiner Bio-A), ou em frascos de garrafa de rolamento de 490 cm2 (150 mL de cultura) (Corning, Fischer Scientific), todos em meio de cultura padrão e em condições de cultura padrões. Desta maneira, inóculos de desafio foram preparados de: - SL11A823-2 SER (genótipo grupo 1): 7,95 Log10 TCID50/mL - SL11A294-12 FR (genótipo grupo 2): 6,32 Log10 TCID50/mL - SL10A1581-32 ES (genótipo grupo 3): 5,95 Log10 TCID50/mL - SL11A823-1 SER (genótipo grupo 4): 7,70 Log10 TCID50/mL
[0164] Amostras de isolados recém-surgidos do reovírus aviários que foram usados para a preparação de vacinas foram primeiramente purificadas na placa 3 vezes como descrito a seguir, e então amplificadas de maneira similar.
[0165] Em linha com postulados de Koch, a patogenicidade e reisolamento dos isolados reoviral aviário foram demonstrados em infecções experimentais de galinhas. Os pintinhos de um dia de idade foram usados, tanto de mães sem patógeno especificado (SPF), quanto de mães vacinadas contra reovírus. O teste nesses últimos pintinhos, que foram positivos para anticorpos derivados maternalmente (MDA+) contra cepas de reovírus clássicas, serviu para confirmar a capacidade de ressurgimento da vacinação desses isolados virais. Os vírus usados para as inoculações de desafio foram isolados: SL11A823-1BE, SL11A823-2BE, SL11A0294-12 FR, e SL10A1581-32 ES, que foram isolados e amplificados como descrito anteriormente. Inoculações foram aplicadas oralmente para imitar a via de infecção natural, ou alternativamente por via intramuscular, que foram observadas ser uma via ainda mais efetiva de inoculação de desafio.
[0166] Pintinhos SPF de 200 dias de idade, de sexo misturado, foram marcados usando bandas de asa, e colocados em isoladores de pressão negativa separados, em 20 pintinhos por grupo. Os pintinhos foram de poedeiras White Leghorn, alimento e água foram disponíveis ad libitum, e pintinhos evidentemente fracos ou pequenos não foram incluídos. Além disso, 10 ninhadas foram sangradas para fornecer amostras de soro para testar estado do anticorpo.
[0167] Uma inoculação de desafio foi administrada no mesmo dia de colocação, e no total 10 isoladores foram usados para alojar os diferentes grupos: 2 isoladores para cada qual dos inóculos com isolados de reovírus aviário, com um grupo recebendo uma inoculação oral e o outro uma intramuscular. Como controle positivo, um isolador foi adicionado no qual os pintinhos receberam uma inoculação de controle com a cepa 1133 de vacina contra reovírus atenuado vivo por via intramuscular. Também, um isolador alojou um grupo de controle negativo que recebeu apenas uma inoculação falsa.
[0168] Todas as inoculações foram dadas em uma dose de 0,1 mL por pintinho, e a 4,5 Log10 TCID50/pintinho, tanto pela via oral quanto pela intramuscular. As diluições vírus-inóculo foram preparadas frescas e em 1 hora antes de administração, e foram mantidas em gelo até o uso. Os inóculos restantes foram usados para retrotitulação, para confirmar a dose de inóculo que foi aplicada.
[0169] Todos os pintinhos foram observados diariamente durante o curso do experimento por pessoal qualificado quanto a ocorrência de sinais clínicos de doença ou outras anormalidades. Animais apresentando dor ou desconforto foram eutanizados e submetidos a exame posterior à morte.
[0170] Os pintinhos selecionados foram retirados para amostragem a 3 e a 10 dias após a inoculação, por meio do que sangue e amostra de tecidos foram coletados. A partir do sangue, soro foi obtido, metade do qual foi usada para reisolamento do vírus, e metade para determinação de anticorpo. Os vários tecidos (tendão, fígado e jejuno) foram usados para homogeneização e reisolamento do vírus.
[0171] Os pintinhos de controle negativo, ou qualquer de suas amostras, bem como os soros das ninhadas do dia zero, não apresentaram nenhum sinal de doença ou infecção que seria relevante para o experimento. Também, o grupo de controle positivo inoculado com cepa de vacina 1133 contra reovírus aviário exibiu amostras de tecido positivo do vírus (tendão, fígado) e de soro (a 10 dias p.i.) como esperado, de maneira que o experimento foi válido.
[0172] Retrotitulação das amostras de inoculação mostrou que todas as inoculações foram em ±0,2 Log10 TCID50 dos 4,5 Log10 TCID50 dose/pintinho visada. 2.2.1. Observações gerais: - Reisolamentos virais de sangue foram apenas positivos a 3 dias p.i., não a 10 dias p.i. - Detecção de soro-resposta mostrou negativo a 3 ou 10 dias p.i. para os isolados de campo, apenas isolado 1133 inoculados não se tornaram anticorpo positivo Reo a 10 dias p.i.. Aparentemente, tituladores de anticorpo não foram ainda bastante altos neste momento para permitir detecção pelo teste comercial para anticorpos de reovírus aviário usados (Elisa de anticorpo IDEXX REO). - Inoculação intramuscular fez com que muito mais amostras fossem positivas para reisolamento do vírus do que inoculação oral, para todos os isolados de vírus testados, e tanto a 3 quanto a 10 dias p.i. - Todos os isolados de campo foram virulentos tanto por via oral quanto por via i.m. Os sinais clínicos observados foram depressão e retardo de crescimento, claudicação na perna inoculada, ou imobilidade completa. Também, inflamação intestinal e necrose do fígado foram frequentemente observadas. Ocasionalmente, ainda mortalidade foi observada nos animais de teste: para o SL11A823-2 SER (genótipo grupo 1) isolado por via oral, e para o SL10A1581-32 ES (genótipo grupo 3) isolado por via i.m.. - Enquanto cepa 1133 demonstrou uma preferência para tendão, os isolados de campo foram reisolados em quantidades maiores de fígado ou jejuno; o reisolamento maior geral foi obtido para cada qual dos isolados de campo de jejuno a 7 dias p.i.
[0173] Sobrenadante da cultura da a 2a ou 3a passagem de isolamento, foi usado para isolar RNA do reovírus aviário viral total. Isto foi usado para preparar e amplificar DNAc, que poderia então ser usado para sequenciamento de DNA. Métodos e condições padrões foram aplicados para todos os procedimentos, empregando kits comerciais e equipamento de laboratório automatizado.
[0174] Resumidamente, isolamento de RNA viral foi realizado em amostras de 200 μL de sobrenadante da cultura, usando o MagNA Pure™ 96 (Roche). Este equipamento aplica lise da amostra, e isola ácido nucleico usando glóbulos magnéticos. Em seguida, o ácido nucleico eluído foi usado para preparar DNAc da primeira fita, por transcrição reversa com o kit de síntese da primeira fita SuperScript™ III (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante.
[0175] Os oligonucleotídeos iniciadores usados, específicos para o gene SigmaC do reovírus aviário foram: REO FW1: 5’- AGTATTTGTGAGTACGATTG - 3’ (SEQ ID NO: 19) REO REV5: 5’- GGCGCCACACCTTAGGT - 3’ (SEQ ID NO: 20)
[0176] Por meio disto, oligonucleotídeo iniciador REO FW1 se liga à montante do gene SigmaC (localização aproximada no segmento do genoma do reovírus aviário S1: nucleotídeos 533-552), e oligonucleotídeo iniciador REO REV5 se liga na extremidade 3’ do gene SigmaC (localização aproximadamente no segmento S1: 1621 - 1605); isso fez com que o penúltimo nucleotídeo à jusante do gene SigmaC não fosse determinado. O oligonucleotídeo iniciador REO FW1 foi usado para primeira síntese da fita, e oligonucleotídeos iniciadores tanto FW1 quanto REV5 foram usados para reações de amplificação e PCR de sequenciamento. Esses oligonucleotídeos iniciadores puderam ser usados para amostras de reovírus aviário de todos os grupos de genótipos, entretanto, ocasionalmente o oligonucleotídeo iniciador reverso não foi bastante efetivo, de maneira que para as mesmas amostras de reovírus aviário adicional oligonucleotídeos iniciadores foram projetados e usados para amplificar ainda mais o ácido nucleico viral.
[0177] Após síntese de DNAc, amostras foram amplificadas por PCR, usando os oligonucleotídeos iniciadores FW1 e REV5 a concentração final de 0,4 μM em 50 μL de amostras com 2 μL de amostra de DNAc, usando o DNA polimerase e mistura mestre Phusion™ High-Fidelity (Thermo Scientific). As condições de PCR usadas foram: 60s. 98°C; 35 ciclos de: 10s. 98°C, 30s. de 58°C, e 30s. 72°C; seguido por 10 minutos a 72°C.
[0178] A preparação de DNAc foi verificada por eletroforese de gel de agarose em a 1% de gel de agarose (Hispanagar), contendo brometo de etídio, e por comparação com uma pista de marcador de 200 a 10.000 bp Smartladder™ (Eurogentec). Bandas de gel de cerca de 1,1 kbp foram rotineiramente obtidas, ilustrativas de amplificação do gene SigmaC do reovírus aviário bem-sucedida.
[0179] As amostras de PCR positivas para a banda de 1.088 bp foram purificadas usando o kit de purificação de PCR QIAquick™ (Qiagen). Em seguida, a concentração de DNA foi medida em um espectrofotômetro NanoDrop™ (Thermo Scientific). Tipicamente, entre 10 e 40 ng/μL de DNAc viral foram obtidos.
[0180] A determinação de sequência de DNA foi feita usando equipamento de sequenciamento de ciclo automatizado e leituras de sequência foram montadas, alinhadas e analisadas usando software de computador, todas de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente: primeiro PCR de sequenciamento de ciclo foi realizado com 20 a 70 ng de DNAc viral (tipicamente 1 ou 2 μL da amostra de DNAc viral amplificada por PCR purificada), e 0,5 μM do oligonucleotídeo iniciador FW1 ou REV5 em 20 μL por reação, usando o kit Big Dye™ Terminator Cycle Sequenciamento (Applied Biosystems). O programa de PCR de sequenciamento foi: 25 ciclos de: 10 s. 96°C, 5 s. 50°C, e 2 min. 60°C. Em seguida, amostras foram mantidas a 15°C até análise.
[0181] Em seguida, as amostras do PCR de sequenciamento foram purificadas usando o kit Dye Ex™ Spin (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, e as amostras foram armazenadas a 4°C até a corrida de sequenciamento começar.
[0182] O sequenciamento de DNA foi realizado por eletroforese capilar usando um ABI 3500 Genetic Analyzer™ e software correspondente (Applied Biosystems). Dados da sequência foram então analisados usando software Sequencher™ v.54 (Gene Codes Corp.).
[0183] Algumas ambiguidades nas sequências montadas puderam ser resolvidas por uso de oligonucleotídeos iniciadores adicionais, hibridizando nas regiões internas do gene SigmaC, para fornecer leituras de sobreposição adicionais.
[0184] As sequências de aminoácidos do reovírus aviário de proteína SigmaC foram analisadas, tanto de isolados de campo sequenciados como descrito anteriormente, quanto de bases de dados públicas. As sequências de aminoácidos foram alinhadas usando uma combinação de programas, tais como: SIAS (http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html) para múltiplos alinhamentos de sequência em pares, e MEGA6 (supra) para coleta de resultados e filogenia. Alinhamentos foram verificados por alinhamentos um em um usando BlastP (supra), e as pontuações deste programa foram decisivas em atribuir um genótipo grupo a uma sequência viral.
[0185] Em diversos dos isolados de surto do reovírus aviário, os últimos 30 ou assim ácidos nucleicos da região 3’ do gene que codifica a proteína sigmaC não puderam ser determinados com confidência, já que essas bases diretamente seguiram o oligonucleotídeo iniciador de PCR à jusante. Também, para diversas das sequências da informação das bases de dados públicas na extremidade C-terminal sigmaC, proteína estava faltando. Assim, para otimizar a sobreposição nos alinhamentos, a extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos da proteína sigmaC não foi usada nessas análises. Entretanto, isso pareceu não afetar a fidelidade do agrupamento, como Kant et al. (supra) também notaram: usando menos que uma sequência de aminoácidos da proteína sigmaC completa ainda pôde fornecer agrupamento confiável. Similarmente, uma ambiguidade de sequência ocasional não impediu a análise.
[0186] Alinhamentos foram feitos usando aminoácidos 1-277 da proteína SigmaC quando possível; sequências que foram muito curtas não foram incluídas nas análises. Uma sequência ligeiramente mais curta, tal como ISR-5223 foi ainda incluída já que isso forneceu uma ligação do agrupamento tipo genótipo com a técnica anterior.
[0187] As pontuações de alinhamento foram arredondadas em números inteiros totais, em linha com os resultados de pontuação fornecidos pelo programa BLAST. Entretanto, isso significa que esses números são precisos até 0,49%, que, em um comprimento de 277 aminoácidos, corresponde a 2 aminoácidos.
[0188] As Tabelas descrevendo as várias sequências analisadas, e seu agrupamento são dadas na seção de Tabelas a seguir, e representações gráficas da filogenia dos cinco grupos de genótipos são apresentadas nas Figuras. Das muitas amostras de campo testadas, apenas um número selecionado de amostras relevantes e representativas é reproduzido aqui: Tabela 1 descreve uma das mais relevantes amostras de campo, e uma seleção adicional foi feita para aquelas para as quais a sequência de aminoácidos total é apresentada na listagem de sequência anexa, vide Tabela 2. Na Tabela 3 são listadas as mais relevantes das sequências publicamente disponíveis, com seus números de acesso de Base de dados correspondentes, e seu agrupamento de genótipo anterior.
[0189] A Tabela 4 apresenta -em diversas seções- os resultados de múltiplos alinhamentos em pares de sequências de aminoácidos do reovírus aviário SigmaC para os diferentes grupos de genótipos; a sequência de aminoácidos da cepa de referência do grupo de genótipo foi alinhada com as sequências listadas. Os resultados são em porcentagem de identidade de aminoácido, e são apresentados para membros representativos do (sub) grupo de genótipo, bem como para as cepas de referência dos outros grupos de genótipos. A partir desses alinhamentos, os valores de corte foram subtraídos o que serve para caracterizar os diferentes grupos de genótipos como definidos aqui.
[0190] Para duas das cepas provenientes de falha vacinal do reovírus aviário, isolamento de placa foi realizado para obter um isolado viral clonalmente puro para estudos de vacinação. Esses foram os isolados: SL11A823-1BE, e: SL11A823-2BE, respectivamente que pertencem aos grupos de genótipos: 4 e 1. Isto foi feito usando isolamento padrão de placas virais em células CEL em pratos de cultura de tecido sob ágar. Resumidamente: diluições foram preparadas dos dois isolados de vírus, até 1x10A-8. Em seguida, pratos de cultura celular de 6 cm de diâmetro foram inoculados com 1 mL de células CEL a 5x10A6 células/mL, 1 mL de diluição viral, e 3 mL de meio de crescimento padrão com FCS e antibióticos. Os pratos foram incubados O/N. O meio de sobrenadante do dia seguinte foi descartado, e a monocamada foi lavada duas vezes com PBS. Em seguida, os pratos receberam 5 mL de cobertura de agarose de uma mistura 1:1 de: bacto ágar dissolvido a 2,25 % em água destilada a 49°C, e 2x meio de cultura a 37°C. Pratos foram incubados por 4 dias, e manchados com vermelho neutro: cada prato recebeu 2 mL de uma solução de 0,04 % de vermelho neutro v/v em PBS. Isto foi incubado por 6 horas, após o que as placas virais ficaram visíveis.
[0191] Para cada isolado viral, diversas placas individuais foram escolhidas de um prato com placas claramente separadas de altas diluições. As placas foram tomadas em 0,5 mL de PBS. Em seguida, cada isolado da placa recebeu uma rodada de amplificação em células CEL em um frasco de cultura T25.
[0192] Os isolamentos da placa foram repetidos por mais duas rodadas usando 0,1 mL do amplificado da placa da rodada anterior, até um total de três rodadas de purificação da placa; pratos e frascos do controle negativo foram sempre incluídos.
[0193] Os isolados do reovírus aviário purificados na placa da 3a rodada foram então amplificados nas células do fibroblasto do embrião de galinha primárias (CEF) em grandes frascos de cultura de tecido; células CEF foram preparadas essencialmente da mesma maneira das células CEL, exceto que embriões totais foram usados para a tripsinização. As amplificações produziram grandes volumes de altos estoques de vírus titulado para uso adicional; tituladores de 7 - 8 Log10 TCID50/mL puderam ser rotineiramente obtidos.
[0194] Os isolados de reovírus aviário purificados na placa foram adicionalmente amplificados para a produção de vacinas experimentais. Com esse propósito, os vírus foram propagados nas células Vero, os sobrenadantes da cultura foram colhidos, inativados com formaldeído, e o antígeno viral inativado foi usado para emulsificação com um adjuvante de óleo mineral em uma vacina em emulsão água em óleo. Resumidamente: uma suspensão de células Vero a 1x10A5 células/mL foi semeada em garrafas de rolamento de 1.750 cm2 com 500 mL de meio de crescimento padrão com 5% de FCS e antibióticos. As garrafas de rolamento foram inoculadas com 1 mL de isolados de reovírus aviário purificados na placa amplificada SL11A823-1BE ou SL11A823-2BE, e incubadas a 37°C durante rolamento.
[0195] Após 5 a 6 dias 100% de cpe foram observados, e o sobrenadante da cultura foi colhido. Formalina diluída foi adicionada ao sobrenadante da cultura a uma concentração final de 0,2% v/v. Esta mistura foi deixada inativar por 48 horas a 37°C, agitando ao mesmo tempo a 200 rpm.
[0196] Após a inativação, os antígenos do reovírus aviário foram concentrados cerca de 20 vezes por ultrafiltração. Na escala de laboratório isto foi realizado usando um dispositivo de filtro centrífugo Centriprep™ (Millipore) com uma membrana de corte de 10 kDa: amostras de 15 mL de volume foram centrifugadas por 40 minutos a 3.000xg a 20 °C. O antígeno viral concentrado foi armazenado refrigerado a 2 a 8°C até o uso adicional.
[0197] Uma vacina adjuvantada foi preparada combinando o material antigênico de reovírus aviários com uma fase oleosa. A fase aquosa foi preparada agitando assepticamente água para injeção com o antígeno viral concentrado. A fase oleosa conteve parafina líquida como óleo mineral e emulsificantes que (na escala de laboratório) foram homogeneizados com o óleo usando um Ultra Turrax™ (IKA), em seguida a fase oleosa foi esterilizada com filtro através de um filtro de náilon Ultipor™ de 0,2 μm (Pall). As fases oleosa e aquosa foram então emulsificadas usando um Ultra Turrax, em corridas de alguns minutos para evitar aquecimento da mistura acima de 40°C. Homogeneidade foi então verificada por microscopia óptica. Isto foi repetido até todas as vesículas de água ficarem menores que 3 μm.
[0198] Em seguida, a vacina pronta foi dispensada em garrafas estéreis rotuladas em condições assépticas, as garrafas em condições assépticas foram fechadas com rolhas de borracha de nitrila, e vedadas com uma tampa de alumínio codificada. O produto da vacina final foi armazenado refrigerado até o uso.
[0199] Desta maneira, vacinas contra reovírus aviário de acordo com a invenção foram preparadas. Para uma dose da vacina de 0,5 mL por galinha, a vacina foi feita para conter 1 % de v/v por mL (sobre o volume final da vacina emulsificada) de antígeno viral de SL11A823-1BE (a 8,32 Log10 TCID50/mL), e 2% de v/v de SL11A823-2BE (a 6,45 Log10 TCID50/mL). Vacinas de controle contiveram tanto nenhum antígeno viral quanto apenas um desses dois antígenos virais.
[0200] Vacinas similares foram preparadas para servir como exemplos comparativos, contendo outros antígenos do reovírus aviário: tanto cepas de vacina “clássicas” 1733 e 2408, ou uma única vacina do genótipo grupo multimérica; quanto uma combinação de cepas 1733, 2408 e ERS, contendo antígenos dos genótipos grupos 1 (em duas vezes) e 5. As quantidades de antígeno usadas para essas vacinas comparativas foram as mesmas das vacinas comerciais atuais, e foram medidas em unidades Elisa arbitrárias contra a referência padrão conhecida.
[0201] As vacinas água em óleo preparadas como descrito anteriormente foram usadas em experimentos desafio de vacinação de animal. Em uma série de experimentos, galinhas poedeiras foram vacinadas com uma vacina de acordo com a invenção, com base em material antigênico de reovírus aviário dos genótipos grupos 1 e 4, enquanto sua progênie foi submetida por inoculação de desafio a uma infecção grave com reovírus aviário de diferentes grupos de genótipos, para demonstrar as propriedades protetoras de espectro amplo e de proteção cruzada de tais vacinas, para infecção de vírus de desafio homólogo e heterólogo.
[0202] Galinhas poedeiras SPF saudáveis normais foram designadas para 8 grupos de 12 galinhas cada. As galinhas foram poedeiras White Leghorn, cerca de 32 semanas de idade, e a cada grupo de 12 galinhas um galo foi adicionado.
[0203] As galinhas foram vacinadas com uma dose (0,5 mL) da vacina água em óleo como descrito anteriormente, intramuscularmente no músculo do peito direito. Os galos não foram vacinados para fornecer amostras de soro de controle negativo. A partir de cinco semanas após vacinação os ovos foram coletados diariamente para os experimentos de inoculação de desafio subsequentes na progênie. Os ovos foram armazenados a 4 °C até o uso.
[0204] Todas as galinhas foram alojadas em instalações de contenção, com entradas e saídas de ar Hepa filtradas. Alimento de galinha padrão e água potável foram disponíveis ad libitum.
[0205] As Galinhas foram designadas para os grupos à medida que elas vinham à mão, enquanto cada grupo de galinhas foi provido com um galo. Galinhas foram marcadas individualmente usando bandas na asa ou etiquetas Swift.
[0206] Todas as galinhas foram colocadas uma semana antes da vacinação para aclimatização, e foram observadas diariamente durante o curso do experimento por pessoal qualificado quanto a ocorrência de sinais clínicos de doença ou outras anormalidades.
[0207] Programa de vacinação do pai: Grupo 1: vacina: antígeno SL11A823-1BE Grupo 2: vacina: antígeno SL11A823-2BE Grupo 3: vacina: antígeno SL11A823-1BE e antígeno SL11A823-2BE Grupo 4: falsa vacina (não contendo antígeno do reovírus aviário) Grupo 5: vacina contra reovírus aviário ‘clássica’: ‘cepas 1733 e antígenos 2408 (vacina similar à vacina comercial Nobilis® Reo Inac). Grupo 6: vacina contra reovírus aviário ‘clássica’ (cepas 1733 e antígenos 2408) com antígeno da cepa ERS Galos: nenhuma vacina
[0208] Este experimento serviu para testar a proteção em progênie dos pais vacinados, quanto sua capacidade de superar uma infecção grave por reovírus aviário, mesmo quando o vírus de desafio foi de um grupo de genótipo diferente do vírus da vacina. Em virtude da escala e tamanho, isto foi realizado em dois experimentos consecutivos, um testando inoculação de desafio com isolados SL11A294-12 FR (genótipo grupo 2) e SL10A1581-32 ES (genótipo grupo 3), e dois semanas mais tarde em nova progênie dos mesmos pais, uma série adicional de inoculações de desafio usando isolados: SL11A823-1 SER (genótipo grupo 4), e SL11A823-2 SER (genótipo grupo 1).
[0209] Para ambos esses experimentos, ovos coletados do experimento de vacinação parental foram incubados - divididos por seus grupos de tratamento parental - em incubadoras para chocar padrões até o choco no dia 21. Os pintinhos de um dia de idade (de sexo misturado) foram agrupados e foram marcados usando bandas de asa. Os pintinhos evidentemente fracos ou pequenos não foram incluídos. De cada grupo de tratamento parental 10 pintinhos foram sangrados para fornecer amostras de soro para testar estado inicial dos ‘pintinhos’. Então os pintinhos foram divididos por colocação em isoladores de pressão negativa separados, de maneira que de cada grupo de tratamento parental tivesse um isolador, contendo 24 a 30 pintinhos. Alimento e água foram disponíveis ad libitum.
[0210] A inoculação de desafio foi administrada no mesmo dia de colocação: por isolador um tipo de vírus de desafio foi usado, por meio do que metade dos pintinhos recebeu o desafio por via oral e a outra metade por via intramuscular. Os pintinhos foram sangrados para coleta de amostras de sangue a 3 ou a 10 dias p.i.
[0211] As inoculações de desafio foram dadas em uma dose de 0,1 mL com 4,5 Log10 TCID50/pintinho, para cada qual dos quatro vírus de desafio testados, e foram inoculados por meio da via intramuscular (i.m.). As diluições do vírus de desafio foram preparadas frescas e em 1 hora antes de administração, e foram mantidas no gelo até o uso. Inóculos restantes foram usados para retrotitulação, para confirmar a dose de inóculo que foi aplicada.
[0212] Todos os pintinhos foram observados diariamente durante o curso do experimento por pessoal qualificado quanto a ocorrência de sinais clínicos de doença ou outras anormalidades. Animais apresentando dor ou desconforto foram eutanizados e submetidos a exame posterior à morte.
[0213] Dos pais, amostras de sangue foram tiradas a 1a 2 e 4 semanas após vacinação, bem como na 1 semana antes da vacinação (dia 0). Da progênie, amostras de sangue foram tiradas no início do experimento e a 3 ou 10 dias p.i.
[0214] As amostras de sangue foram transportadas para o laboratório à temperatura ambiente. Após coagulação à temperatura ambiente, soro foi coletado. Para a progênie: metade do soro foi armazenada a -70 °C para isolamento do vírus; amostras de soro restantes foram inativadas termicamente por 30 minutos a 56°C, e subsequentemente, armazenada a - 20°C até o uso.
[0215] A detecção de anticorpos de reovírus aviário no soro foi feita usando o anticorpo Elisa IDEXX REO, de acordo com as instruções do fabricante.
[0216] A validade dos experimentos foi determinada com base na ausência de anticorpos nos pais contra reovírus aviário nas amostras do dia 0, e nas amostras de controle negativo.
[0217] Progênie das galinhas vacinadas foi MDA+ contra reovírus aviário, dependendo do tratamento dos seus pais.
[0218] Soro para reisolamento do vírus foi obtido após coagulação da amostra de sangue, e isso foi congelado a -70°C sem tratamento adicional. Durante o teste dessas amostras, células CEL foram semeadas em placas de cultura de tecido de 6 poços, a 2 mL por poço com 1x10A6 células/mL, em meio de cultura padrão com 5% de FCS e antibióticos. Isto foi incubado por toda a noite para formar uma monocamada. No dia seguinte o sobrenadante da cultura foi removido e substituído com 4 mL meio sem FCS padrão. Os poços foram inoculados com 40 μL do soro de teste, e incubados por 5 dias. Então 100 μL do sobrenadante do poço foram inoculados nos poços de uma nova placa de 6 poços com monocamada de CEL, e incubados n novamente por 5 dias. Em seguida, cpe de reovírus aviário específico foi avaliada por microscopia ótica. Uma vez que as amostras negativas continuaram negativas mesmo após uma terceira passagem, as duas passagens foram usadas como padrão.
[0219] Uma vez que todas as amostras de controle positivo e negativo pontuaram como se esperava, portanto, o experimento foi considerado válido.
[0220] Na avaliação dos resultados dos experimentos em vacinação do pai e desafio da progênie, as muitas amostras coletadas durante o curso do experimento foram analisadas e comparadas. Soro foi obtido e testado para anticorpos e para reisolamento do vírus; como para sorologia observou-se que o período de medição do dia 3 a 10 não foi longo bastante para dar resultados positivos claros. Reisolamento do vírus positivo do soro foi um indicador para uma viremia do reovírus aviário ativo, e observou-se que o reisolamento do vírus do soro coletados a 3 dias após a inoculação intramuscular, deu a clara imagem do efeito dos diferentes tratamentos. Desta maneira poderia ser determinado que vacinação do pai poderia reduzir a infecção de reovírus aviário vírus de desafio na progênie.
[0221] Para o grupo de tratamento recebendo desafio i.m., e soros coletados a 3 dias p.i., o soro de 5 pintinhos (um grupo apenas 4) por grupo foram disponíveis para reisolamento do vírus. Como um corte, grupos tendo 3 ou mais animais positivos para reisolamento do vírus em soro tirado a 3 dias p.i., foram considerados não apresentar redução de infecção do vírus de desafio; 2 animais positivos foi considerados duvidosos; e zero ou 1 positivo foi considerado mostrar redução de infecção. Resultados são mostrados na Tabela 5, que exibem se (SIM), ou se não (NÃO) redução de infecção pela cepa de desafio de reovírus aviário na progênie foi induzida pelas diferentes vacinações dos pais. Entre parênteses é indicada a base para esta conclusão pelo número de pintinhos do total testado, para os quais a amostra de soro tirada a 3 d. p.i. foi positiva para reovírus aviário como determinado lendo cpe após duas passagens nas células CEL.
[0222] Como é apresentado na Tabela 5, para todos os pintinhos derivados de pais falso vacinados (teste de vacinação grupo 4), reovírus aviário pôde ser reisolado do soro tirado no dia 3 após inoculação, e este foi o caso para todos os vírus de desafio aplicados. Isto indicou que o vírus de desafio replicou desimpedido nos pintinhos e, consequentemente, que os pintinhos não foram protegidos por fatores transferidos de seus pais (falso vacinados). Sinais clínicos não foram muito aparentes, já que as galinhas usadas aqui foram do tipo poedeiras, que são menos sensíveis do que galinhas do tipo mais pesado tais como frangos de corte. No entanto claras diferenças na eficácia da vacinação foram observadas.
[0223] Os pais no grupo de teste 5 receberam uma única vacinação com uma vacina contendo material antigênico de duas cepas de reovírus aviário ‘clássicas’: cepas 1733 e 2408, para imitar uma ampla vacina do genótipo grupo 1. Esta vacina induziu na progênie uma redução significante de infecção por reovírus aviário vírus de desafio que pertence aos genótipos grupos 1 ou 2 como definido aqui. Entretanto, não foi induzida nenhuma redução de infecção contra o vírus de desafio do Reovírus aviário dos genótipos grupos 3 ou 4.
[0224] Notavelmente, pais no grupo de teste 6 não forneceram uma proteção para sua progênie que foi mais ampla do que aquela já provida pelo material antigênico do genótipo grupo 1 como usado para a vacinação do grupo de teste 5. Isto ainda embora a vacina usada para grupo 6 tenha tido material antigênico adicional de reovírus aviário: da cepa ERS (cepa ERS pertencente ao genótipo grupo 5 como definido aqui). Isso mostra que aparentemente não existe ampliação automática de proteção obtida do uso de vacinas contendo material antigênico de reovírus aviário de mais que um único grupo de genótipo.
[0225] As vacinas usadas para grupos de teste 1 ou 2 continham material antigênico de reovírus aviário tanto do genótipo grupo 1 quanto 4 (respectivamente). Os pais desses grupos de teste forneceram total proteção em sua progênie contra a replicação de reovírus aviário vírus de desafio que foi do mesmo genótipo da cepa de vacina. Entretanto, não foi induzido nenhum espectro amplo ou proteção heteróloga, já que essas vacinas não reduziram infecção por reovírus aviário de um grupo de genótipo que foi diferente do seu próprio genótipo grupo.
[0226] Entretanto, observou-se surpreendentemente que um forte efeito sinergístico foi obtido mediante a combinação de material antigênico de reovírus aviário dos genótipos grupos 1 e 4: pais que receberam a vacina de grupo de teste 3, que combinaram material antigênico dos genótipos grupos 1 e 4 do reovírus aviário (como definido aqui) não forneceram proteção de espectro amplo para sua progênie: os pintinhos desses pais foram capazes de reduzir significativamente a infecção de todos as cepas de desafios de reovírus aviário testadas, tanto homólogas quanto heterólogas para a vacina aplicada, e após uma única vacinação. Tabelas Tabela 1: Lista de isolados de surto de campo do reovírus aviário mencionados nos Exemplos Tabela 2: Descrição das sequências apresentadas na listagem de sequência
Tabela 3: Lista de reovírus aviários da técnica anterior, mencionados nos Exemplos Tabela 4: Múltiplos alinhamentos em pares de sequências de aminoácidos do reovírus aviário SigmaC. Tabela 4 (continuada): Múltiplos alinhamentos em pares de sequências de aminoácidos do reovírus aviário SigmaC. Tabela 4 (continuação): Múltiplos alinhamentos em pares de sequências de aminoácidos do reovírus aviário SigmaC. Tabela 4 (continuação): Múltiplos alinhamentos em pares de sequências de aminoácidos do reovírus aviário SigmaC. Tabela 4 (continuação): Múltiplos alinhamentos em pares de sequências de aminoácidos do reovírus aviário SigmaC. Tabela 4 (continuação): Múltiplos alinhamentos em pares de sequências de aminoácidos do reovírus aviário SigmaC. Tabela 5: Resultados de vacinação - experimentos de desafio n.d = não feito
[0227] Árvores filogenéticas de alinhamentos da sequência de aminoácidos das proteínas sigmaC de reovírus aviários representativos que foram analisados e comparados nos Exemplos, para todos os (sub)grupos de genótipos. As árvores foram extraídas usando MEGA6, primeiro calculando pontuações de alinhamento em pares, e então extraindo árvores não enraizadas usando o método união de vizinho (Saitou N. & Nei M., 1987, Mol. Biol. E Evol., vol. 4, p. 406-425). A barra de escala indica a distância genética relativa. Figura 1: Genótipo subgrupo 1A Figura 2: Genótipo subgrupo 1B Figura 3: Genótipo grupo 2 Figura 4: Genótipo grupo 3 Figura 5: Genótipo grupo 4 Figura 6: Genótipo grupo 5
Claims (9)
1. Vacina para reduzir infecção por reovírus aviário, caracterizada pelo fato de que a vacina compreende material antigênico de reovírus aviário que é derivado de reovírus aviários de mais que um único grupo de genótipo, e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que o material antigênico de reovírus aviário consiste em material antigênico derivado de cepas de reovírus aviários SL11A823-2 BE (genótipo grupo 1) e SL11A823-1 BE (genótipo grupo 4), as proteínas SigmaC das quais possuindo SEQ ID NOs: 1 e 4, respectivamente, em que o material antigênico derivado de reovírus aviário é um reovírus aviário inativado, e em que a vacina compreende um adjuvante.
2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o material antigênico derivado de reovírus aviário do genótipo grupo 1, é derivado de reovírus aviário do genótipo subgrupo 1B.
3. Vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a vacina compreende material antigênico adicional que é derivado de um micro-organismo patogênico para uma ave, mas não de um reovírus aviário.
4. Método para a preparação de uma vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de inativar reovírus aviário de cada um dos dois grupos de genótipos: genótipo grupo 1 e genótipo grupo 4.
5. Método para a preparação de uma vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de misturar material antigênico do reovírus aviário como definido nas reivindicações 1 a 4 com um adjuvante.
6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o material antigênico do reovírus aviário que consiste em material antigênico derivado de reovírus aviários de cada um dos dois grupos de genótipos: genótipo grupo 1 e genótipo grupo 4, para uso em uma vacina para reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave.
7. Uso de material antigênico do reovírus aviário, caracterizado pelo fato de que consiste de material antigênico derivado de reovírus aviários de cada um dos dois grupos de genótipos: genótipo grupo 1 e genótipo grupo 4, para a fabricação de uma vacina para reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave.
8. Uso de uma vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma vacina obtenível por um método como definido na reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que é para reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave.
9. Método para reduzir infecção por reovírus aviário em uma ave, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma vacina obtenível por um método como definido na reivindicação 4 ou 5, a uma ave.
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