JP5872684B2 - 免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド - Google Patents
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Description
従って、本実施形態の別の好ましい形は、5’[G]xおよび3’[G]zヌクレオチドがホスホロチオエート結合を有し、他のヌクレオチドはリン酸ジエステル結合を有する本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドに関するものである。
本実施形態のより好ましい形は、本発明に係る免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法に関するものであり、細胞は、ニワトリ細胞系HD11、またはニワトリTLR21がクローン化されているHEK293細胞系の細胞である。
実施例1
ニワトリTLR21の遺伝子クローニングおよび非相同発現
ニワトリTLR研究における最近の進展により、TLR21が、鳥種において、哺乳類TLR9の機能的相同体であることが示唆されている(Keestra 2008、Brownlieら 2009)。
Genbankデータベース配列NM_001030558に基づいて、プライマーペアを、ニワトリTLR21遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅用に合成した:
Ga−TLR21−for1
GAAGCTT(ACC)[ATG]ATGGAGACAGCGGAGAAGGC
Ga−TLR21−rev1
GGCGGCCG[CTA]CATCTGTTTGTCTCCTTCCCTG
プライマーは、フランキング位置制限クローニング部位(下線)、ならびにコザック配列(丸括弧)、開始コドンおよび終止コドン(角括弧)を与えるように設計した。これらのプライマーおよびテンプレートとしてニワトリ脾臓総RNAを用いて、RT−PCRを実行した。予想されるサイズ(約3000bp)のPCR産物を、pCR2.1−Topo内にクローン化し、5つの独立したプラスミドクローン(P1、P2、P12、P13、P14)を配列決定した。
ヒト胚腎臓(HEK)細胞293は、1970年代にウイルストランスフォーメーション(Grahamら,1977)によって生み出されたものであり、現在、細胞系リポジトリ(ATCC等)を経由して、研究コミュニティが利用できるものである。
X43−バッチ4:GGGGGGTTCGTCTTCGTCTTCGTCGGGGGから開始して、以下の修飾をし、試験した:
X43−I−T GGGGGGTTTCGTCTTTTCGTCTTTTCGTCTGGGGG
X43−I−C GGGGGGTTTCGTCCTTTCGTCCTTTCGTCCGGGGG
X43−II−T GGGGGGTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTGGGGG
X43−II−C GGGGGGTTTTCGTCCCTTTTCGTCCCTTTTCGTCCCGGGGG
X23−バッチ3 GGGGGGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGGGGG
X23−I GGGGGGTGTCGTCTTGTCGTCTTGTCGTCTGGGGG
図6からわかるように、オリゴヌクレオチドX43−IITは、試験した他のオリゴヌクレオチドと比較すると、最大反応に関して、リポータ細胞(HEK293−pNifty2−chickenTLR21)中のリポータ酵素SEAPの有色産物(405nmで吸光する)の極端な誘導量をもたらしている。
EC50計算値:
X43−バッチ4 3.91nM
X43−I−T >1200nM
X4−I−C >300nM
X43−II−T 0.53nM
X43−II−C 8.28nM
X23−バッチ3 6.08nM
X23−I >400nM
結論:以下のように、OD405nm/分を表す図6、およびナノモルのEC50を表す図7から、X43(→X43−II−T)中の3’−フランキング位置に2つのチミジン、および5’−フランキング位置に2つのチミジンを追加すると、最大反応およびEC50の双方に関して、効力が予想外に大きく増加する。化合物5’[G]6{[T]2TTCGTC[T]2}3[G]5 3’のEC50は、ピコモルの範囲にあることが示された。
本実施例において、nの数を、X43−II−tripのn=3から、n=4(X43−II−quad)、およびn=5(X43−II−pent)に変えた。
X4−pent 5’−GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG−3’(=標準形2)
X43−II−trip 5’−GGGGGGTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTGGGGG−3’(n=3、[pおよびq]=2)
X43−II−quad 5’−GGGGGGTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTGGGGG−3’(n=4、[pおよびq]=2)
X43−II−pent 5’−GGGGGGTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTGGGGG−3’(n=5、[pおよびq]=2)
図8に、数nの増大効果を示す。以下の表において、EC50に及ぼすnの増大効果を示す。nの増大によりEC50が減少することから、より高い免疫刺激効果が導かれることが明らかである。
X43−trip 338pM
X43−II−trip 155pM
X43−II−quad 132pM
X43−II−pent 59pM
X4−pent 340pM
実施例4
本実施例において、数pおよびqを、2(X43−II−trip)から、3(X43−III−trip)、および4(X43−IV−trip)にまで変えた。
(n=3、[pおよびq]=0)
X4−pent 5’−GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG−3’(=標準形2)
X43−II−trip 5’−GGGGGGTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTGGGGG−3’
(n=3、[pおよびq]=2)
X43−III−trip 5’−GGGGGGTTTTTCGTCTTTTTTTTCGTCTTTTTTTTCGTCTTTGGGGG−3’
(n=3、[pおよびq]=3)
X43−IV−trip 5’−GGGGGGTTTTTTCGTCTTTTTTTTTTCGTCTTTTTTTTTTCGTCTTTTGGGGG−3’
(n=3、[pおよびq]=4)
図9に、数pおよびqの増大効果を示す。以下の表において、EC50に及ぼすnの増大効果を示す。pおよびqの増大によりEC50が減少することから、より高い免疫刺激効果が導かれることが明らかである。
X43−trip 338pM
X43−II−trip 155pM
X43−III−trip 148pM
X23−IV−trip 104pM
X4−pent 340pM
本実施例において、数xを6から7に増大させ(X43−II−5735)、zを5から2に減少させた(X43−II−5732)。
(=標準形1、X43−II−trip)
X4−pent 5’−GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG−3’
(=標準形2)
X43−II−5735 5’−GGGGGGGTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTGGGGG−3’
(→x=7、z=5、pおよびqの双方=2、ならびにn=3)
X43−II−5732 5’−GGGGGGGTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTGG−3’
(→x=7、z=2、pおよびqの双方=2、ならびにn=3)
図10に、数xの増大効果および数zの減少効果を示す。以下の表において、EC50に及ぼすnの増大効果を示す。xの増大およびzの減少の双方によりEC50が増大することから、より高い免疫刺激効果が導かれる。
X43−II−trip 155pM
X43−II−5735 105pM
X23−II−5732 <<100pM
X4−pent 340pM
Claims (15)
- 式
5’[G]x{[T]pTTCGTC[T]q}n[G]z 3’
を有し、
式中、p=1から15、q=1から15、n=2から100、x=3から10、およびz=0から10である、免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、またはその医薬的に許容可能な塩。 - p>1である、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- p>2である、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- q>1である、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- q>2である、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- n=3から18である、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- 5’[G]xおよび3’[G]zヌクレオチドがホスホロチオエート結合を有し、他のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を有することを特徴とする、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- {[T]pTTCGTC[T]q}nがホモポリマーである、請求項1から請求項7の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチドは、担体またはハプテンに結合されている、請求項1から請求項8の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- 請求項1から請求項8の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチドを含むベクター。
- 感染症を防ぐまたは感染症と闘うためのワクチンであって、
免疫刺激量の、請求項1から請求項9の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫学的量の抗原成分若しくは抗原成分をコードするポリヌクレオチド、および/または
請求項10に記載のベクターおよび免疫学的量の抗原成分もしくは抗原成分をコードするポリヌクレオチド、ならびに
医薬的に許容可能な担体を含むことを特徴とする、ワクチン。 - 前記抗原成分が、野生型の形態で家禽類に対する病原性を有するウイルスまたは微生物であるか、このウイルスまたは微生物に由来することを特徴とする、請求項11に記載のワクチン。
- 前記ウイルスまたは微生物が、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウスのう病(ガンボロ)、ニワトリ貧血エージェント、トリレオウイルス、マイコプラズマ・ガリセプティカム(Mycoplasma gallisepticum)、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)(コリーザ)、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス、アイメリア属種、オルニソバクテリウム・ライノトラキア(Ornithobacterium rhinotracheale)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、マイコプラズマ・シノビエ (Mycoplasma synoviae)、サルモネラ(Salmonella)属種および大腸菌(E.coli)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項12に記載のワクチン。
- 薬剤として使用するための、請求項1から請求項9の何れかに記載の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、または請求項10に記載のベクター。
- 家禽類において感染症の予防に使用するための、請求項1から請求項9の何れかに記載の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、または請求項10に記載のベクター。
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