CN103547674A - 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫刺激性寡脱氧核苷酸、包含此寡脱氧核苷酸的载体和疫苗、它们作为药物的用途、它们在预防或抵御传染病中的用途、用于检测此寡脱氧核苷酸的方法、以及要在这些方法中使用的细胞。
Description
本发明涉及免疫刺激性寡脱氧核苷酸、包含此寡脱氧核苷酸的载体和疫苗、它们作为药物的用途、它们在预防或抵御传染病中的用途、用于检测此寡脱氧核苷酸的方法、以及要在这些方法中使用的细胞。
在过去20年中,免疫科学中已经发现,脊椎动物的免疫系统具有通过受体介导识别病原体的独特特征而检测微生物感染并触发快速免疫活化的机制,即所谓与同源宿主病原体识别受体(PRR)相互作用的病原体相关分子模式(PAMP) (Iwasaki A, Medzhitov R. 2001. Science 327, 291-295;Medzhitov R., 2009. Immunity 30, 766-775)。
现在清楚某些形式的病原体脱氧核糖核酸(DNA)在这些PAMP之中。在1995年,报道称,细菌DNA中的非甲基化CpG基序触发鼠B细胞活化(Krieg等,1995)。此研究首次形成了细菌的含免疫刺激性非甲基化CpG的DNA的特异性识别与此前认识到的CpG抑制以及哺乳动物DNA中普遍的CpG甲基化之间的关联。证明最有效的B细胞刺激性非甲基化CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)具有序列元件GACGTT。
本领域中接下来的里程碑式的论文由日本大阪的Shizuo Akira实验室发表(Hemmi 等,2000)。通过小鼠中的基因克隆和靶向基因敲除方法,能够明确地显示小鼠中对CpG-ODN的细胞应答由toll样受体9(TLR9)介导。随后,证明CpG-ODN是主要通过NF κ-B途径的TLR9信号转导的激动剂(Medzhitov 2001)。在随后的十年中,已经发表了相当大量关于基础研究课题以及关于常规的潜在免疫治疗应用的研究(例如综述于Krieg 2002、2003、2006;Klinman 2004;Vollmer 2005;Wilson等,2006;Kindrachuk等,2008;Dorn和Kippenberger 2008;Vollmer和Krieg 2009;Wilson等,2009)。很多综述文章集中在CpG-ODN的抗感染应用(Krieg 2007)、TLR9激动剂在癌症治疗中的应用(Krieg 2007;Weiner 2009)、TLR9活化用于哮喘和变态反应治疗(Kline 2007;Kline和Krieg 2008;Fonseca和Kline 2009),以及作为疫苗佐剂(Klinman等,2004;Klinman 2006;Daubenberger 2007;Wagner 2009;Mutwiri等,2009;Klinman等,2009)中的应用。
还已经描述并讨论了CpG ODN作为兽医应用中的免疫刺激剂和疫苗佐剂,特别是在牛、猪、绵羊、狗、鸡和鱼中(Babiuk等,2003;Carrington和Secombes 2006;Griebel等,2005;Mutwiri等,2003;Singh和O’Hagan 2003;Werling和Jungi 2003)。
在鸡中的兽医用途领域中,已描述了在例如疫苗中的CpG寡脱氧核苷酸,用于保护鸡以抵抗新城疫的用途(Linghua 2007)。
近期显示,在鸡中,TLR21在CpG寡脱氧核苷酸的识别中发挥哺乳动物TLR9的功能同源物的作用(Brownlie等,2009)。
迄今为止,作为免疫调节剂的特异性CpG ODN的设计相当随机。对于非哺乳动物CpG ODN尤其如此。其原因是多因素的;首先没有关于用于人类TLR的免疫调节CpG基序与用于非人类(更不用说非哺乳动物物种)中的TLR的免疫调节CpG基序之间的相关性的知识。其次,没有可用的具有足够低的背景噪音比水平的细胞系统,以选择性地测试非常低浓度的CpG ODN的作用。此外,没有可用的高通量筛选方法,并且即便有,CpG ODN作为在非哺乳动物物种中的免疫调节剂的体内与体外功效之间也没有清楚的相关性。
因此,显然需要具有高免疫调节作用并且因此在低剂量下有效的新CpG ODN。并且,还需要选择性且灵敏的CpG ODN选择系统,用于显示CpG-活性的体外和体内活性之间的相关性的兽医目的。
本发明的目的之一是提供这样的新CpG ODN。
“免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸”是指包含非甲基化的胞苷-磷酸-鸟苷二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸,该序列刺激启动信号传导级联,导致转录因子,例如NF-κB或干扰素调节因子3(IRF3)的活化。正是这种活化进而导致炎性细胞因子的表达,以及其它细胞活化事件。Schindler和Baichwal (1994)尤其描述了NF-κB结合位点以及受到NF-κB影响的基因表达。
术语寡脱氧核苷酸是指,脱氧核苷酸的短核酸聚合物;即,包含连接到磷酸基团且连接到可交换的有机碱基的大量脱氧核糖的分子。此类有机碱基是取代的嘧啶或取代的嘌呤。实例分别为胞嘧啶和胸腺嘧啶,腺嘌呤和鸟嘌呤。
本发明的寡核苷酸可包含修饰。此类修饰的实例为,例如位于核苷的3'和/或5'末端的磷酸二酯核苷间桥中的修饰。此类修饰尤其涉及由例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯替换磷酸二酯。
其它修饰为,例如由脱磷桥替换磷酸二酯桥。脱磷桥的实例为甲基羟胺、甲乙缩醛(formacetal)和二亚甲基砜基团。
还有其它的修饰是,涉及由非天然核苷碱基(例如5-氟胞嘧啶、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶)替换天然核苷碱基的修饰。
再其它的修饰是,涉及糖单元的替换(通过修饰的糖单元,例如,如L-2'-脱氧核糖或2'-L-阿拉伯糖,替换β-核糖的糖或β-D-2'-核糖的糖单元)的修饰。
给出关于寡核苷酸的进一步理解的教科书是,例如“PCR Primer: A Laboratory Manual”,第二版,2003,Carl W. Dieffenbach编辑,National Institute of Allergy and Infectious Diseases;Gabriela S. Dreksler, Uniformed Services University of the Health Sciences, Cold Spring Harbor Laboratory Press ISBN 978-087969654-2。
携带CpG基序的结构代表了本发明ODN的活性免疫刺激部分。因此,本发明提供了包含这种所谓“骨架”的免疫刺激性寡脱氧核苷酸。
发现本发明的寡脱氧核苷酸的骨架,结构,必须存在至少两次,优选三次。因此,n应当是至少2。还发现,所述寡脱氧核苷酸的活性在n增大时提高。在n增大时此效果趋平(leveling)。因此,基本上,骨架结构的数量n应当是至少2。优选地,n的范围是3 ≤ n ≤ 100,这仅仅是因为合成的序列越长,其越难以制备的事实。在实践中,优选n的范围是2 ≤ n ≤ 18。更优选n的范围是3 ≤ n ≤ 18,甚至更优选n的范围是4 ≤ n ≤ 18,仍甚至更优选n的范围是5 ≤ n ≤ 18。
尤其通过使用比目前用于检测NF-κB活化的系统选择性更好的检测系统,使得鉴定本发明的CpG ODN成为可能。Brownlie等(2009)描述了基于NF-κB荧光素酶的报告系统。其它系统,例如,基于IL-8转录物测量,或细胞因子分泌,或NO分泌物的检测。
与此相反,在本发明中使用了基于分泌的碱性磷酸酶的检测系统(SEAP)。SEAP是哺乳动物系统中的报告酶(Yang等,1997)。此系统变得出人预料地灵敏,并且还出人预料地提供了所测试的CpG ODN的体外和体内活性之间的密切相关性。以对硝基苯基磷酸盐(pNPP)作为底物,使用SEAP系统。
超过现有系统的另一个改进是将携带SEAP基因的质粒引入并稳定保持在细胞中。迄今为止,所有检测系统均使用报告基因对细胞的瞬时转染。正是由于将报告基因引入并稳定保持在细胞中,现在第一次能够绘制剂量/响应曲线。如果要进行各种CpG ODN的活性之间的可靠比较,这种曲线是必需的。
因此,本发明实施例部分中详细描述的方法和细胞系首次允许进行各种CpG ODN之间的可靠的并排比较。
实施例部分中给出了所使用的系统的进一步细节。
由于本发明的方法和细胞系现允许各种CpG ODN之间的可靠的并排比较,因此,可以确定其中p > 1的本发明的寡脱氧核苷酸具有比p = 1时更高的活性水平。因此,在此实施方式的优选形式中,p > 1。以优先度的顺序,更优选2、3、4、5或6的p值。还更优选>6的p值,尽管活性的提高趋于稳定。
超过15的p值将愈发难以合成。因此,优选地,p的数值不应超过15。
还可以确定,其中q > 1的本发明的寡脱氧核苷酸具有比q = 1时更高的活性水平。因此,在此实施方式的优选形式中,q > 1。以优先度的顺序,更优选2、3、4、5或6的q值。还更优选>6的q值,尽管活性的提高趋于稳定。
超过15的Q值将愈发难以合成。因此,优选地,q的数值不应超过15。
发现在结构的5'-末端的G的数量增加,导致CpG ODN活性提高。数值x应当是至少3,但提高G的数量至20个G,改进了CpG ODN的活性。因此,优选地,以优先度提高的顺序,x是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
还发现在结构的3'-末端的G的数量增加,导致CpG ODN活性(轻微)下降。数值z应当为10或小于10,但减少G的数量至0个G,改进了CpG ODN的活性。因此,更优选地,以优先度提高的顺序,z是9、8、7、6、5、4、3、2、1或0。
如上文所述,位于核苷的3'和/或5'末端的磷酸二酯核苷间桥中的多种修饰是可行的。但是,基本上,基于合成的方式,两个核苷酸之间的常见普通类型的键为:磷酸二酯(PDE)键和硫代磷酸酯(PTO)键。为了改进CpG ODN的稳定性和免疫刺激作用,通常向合成寡脱氧核苷酸的构建嵌段提供硫代磷酸酯,以便它们形成PTO键。
然而,意外地发现,当只有5' [G]x和3' [G]z核苷酸通过PTO键键合且其它核苷酸通过PDE键键合时,本发明的寡脱氧核苷酸的功效进一步提高。(在这种情况下,5' [G]x与的键是PTO键,而与[G]z 3'的键是PDE键。)
因此,这种实施方式的另一个优选形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸,其中5' [G]x和3' [G]z核苷酸具有硫代磷酸酯键且其它核苷酸具有磷酸二酯键。
本发明的CpG寡脱氧核苷酸在皮摩尔(亚-纳摩尔)的量下具有活性;其EC50低于1 nM。
寡脱氧核苷酸的半-最大有效浓度(EC50)是在报告细胞(HEK293-pNifty2-鸡TLR21或HD11-pNifTy2Hyg)中诱导给出半-最大酶促反应速率的量的报告酶SEAP (其产生具有405 nm吸收的有色产物)所必需的寡脱氧核苷酸的量。如果寡脱氧核苷酸在这些细胞中的EC50低于1 nM,则认为其在皮摩尔(亚-纳摩尔)的量下具有活性。
通过反应性的化学基团将本发明的寡脱氧核苷酸连接到载体或半抗原,是完全可以的。这种连接增强了组合分子的免疫刺激作用。
此类组分的单纯实例为,例如地高辛(digoxigenin)、氨基己基-、得克萨斯红和生物素。
优选的载体或半抗原是3'-和5'-标记的得克萨斯红和5'-标记的地高辛。寡脱氧核苷酸与半抗原/载体的连接是本领域中公知的。
本发明的另一个实施方式涉及包含本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸的载体。此载体可以是核酸分子,例如质粒、病毒、噬菌体或分子生物学中使用的任何其它载体。仅作为实例:包含免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸的载体可以例如是DNA分子(如能够在细菌中增殖的质粒),所述DNA分子中已经克隆了本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸。此类质粒优选具有活跃的复制起始点,导致在所述宿主中存在大量的所述质粒。大规模培养所述细菌和随后分离质粒,提供了本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸的合成生产的备选方案。
本发明的目的之一是提供新的CpG ODN,其能够作为成功的免疫刺激性组分,与抗原组分或编码抗原组分的遗传信息,以及药学可接受的载体一起用在预防或抵御传染病的疫苗中。
通常,术语抗原组分是指包含至少一个表位的物质组合物,所述表位在向人或动物施用时能够诱导、刺激或增强免疫应答。
所述抗原组分可以是任何种类的抗原组分,但优选源自在其野生型形式下对人或动物具有致病性的微生物或病毒。
所述抗原组分可以是完整病原体,优选灭活或减毒形式的完整病原体,病原体的提取物,或者病原体的免疫原性蛋白。
如果所述抗原组分是病原体的免疫原性蛋白,则该免疫原性蛋白优选从体外培养的细胞中表达并回收。
因此,另一个实施方式涉及用于预防或抵御传染病的疫苗,其特征在于,所述疫苗包含免疫刺激量的本发明的寡脱氧核苷酸和/或本发明的载体,免疫原性量的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息,以及药学可接受的载体。
当然,所述寡脱氧核苷酸的免疫刺激量和抗原组分的免疫原性量是强烈相关的。本发明的优点之一在于,本发明的寡脱氧核苷酸的存在能够降低预防或抵御传染病所必需的抗原组分的量。
预防或抵御传染病所必需的抗原组分的量称作抗原组分的免疫原性量。
寡脱氧核苷酸的免疫刺激量是能够降低抗原组分的免疫原性量(即,预防或抵御传染病所必需的抗原组分的量)的量。
因此,基本上,表述“寡脱氧核苷酸的免疫刺激量”与“免疫原性量”必须被视为是彼此相关的。
不言而喻地,如果所述疫苗包含编码抗原组分的遗传信息,则由这种遗传信息表达的抗原组分的量应足以预防或抵御传染病,即,其必须为免疫原性量。
本发明的非甲基化寡脱氧核苷酸是免疫刺激性的,这个事实是指它们增强疫苗中的抗原组分的免疫功效。因此,与不存在本发明的寡脱氧核苷酸的情况相比,本发明的疫苗在很多情况下可包含较少的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息。
在一些情况下,没有添加免疫刺激性寡核苷酸的同样的抗原组分,可具有如此之低的免疫原性性质,以至于无论如何也必须给予高剂量,即便没有达到期望的免疫原性水平。然而现在,在这些情况下,可以与本发明的寡脱氧核苷酸一起给予通常的高浓度的所述抗原组分,从而以此获得期望的免疫原性水平。
因此,根据经验,与本发明的寡核苷酸一起施用的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息的量可以等于或低于在不存在所述寡核苷酸的情况下给予的量。参与特定疫苗制造的技术人员知晓用于该特定疫苗的量。此外,实施例还给出了,例如,如在以下3种不同的灭活病毒疫苗中使用的抗原组分的量的充分指导:新城疫病毒疫苗、传染性支气管炎病毒疫苗和火鸡鼻气管炎疫苗。
需要与抗原组分或编码抗原组分的遗传信息一起施用的本发明的寡脱氧核苷酸的量取决于所选择的寡脱氧核苷酸和抗原组分二者。
本发明的寡脱氧核苷酸的非常适合的量通常可在1和100纳摩尔之间变化。已例如,使用1-10 μg曾在体外测试中显示在纳摩尔范围内具有活性的,平均长度为30个脱氧核苷酸的本发明的寡脱氧核苷酸,获得了非常好的体内结果。
如果寡脱氧核苷酸选自在皮摩尔范围内具有活性的寡脱氧核苷酸的组,则技术人员可意识到,在测试纳摩尔的量之前,值得测试低于、可能远低于1纳摩尔的量,即皮摩尔的量。
本发明的疫苗包含药学可接受的载体。此载体的性质特别依赖于施用途径。如果施用途径是通过口服或鼻内途径,则所述载体可以如无菌水、生理盐溶液或缓冲液一样简单。如果注射是优选的途径,则所述载体应优选是等渗的且具有pH的限制,以使其适合用于注射。然而,此类载体是本领域中广泛知晓的。
本发明的疫苗,在所述抗原组分或编码抗原组分的遗传信息以及本发明的寡脱氧核苷酸之外,还包含佐剂。佐剂通常是以非特异性的方式增强宿主免疫应答的物质。
本领域中已知很多佐剂都是适合的,例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,维生素E,非离子型嵌段聚合物和聚阴离子,如硫酸葡聚糖,卡波普(carbopol)和吡喃,氢氧化铝(alum hydroxide)。经常使用的是磷酸铝、皂苷类、植物油,例如生育酚和矿物油。非常有效的佐剂是水包油乳剂,并且特别是油包水乳剂,进一步也称作水包油佐剂和油包水佐剂。这些乳剂是本领域中公知的。因此,优选地,所述疫苗包含油包水佐剂。
优选地,所述抗原组分是或源自在其野生型形式下对家禽具有致病性的病毒或微生物。
更优选地,所述病毒或微生物选自:传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病(甘布罗病,Gumboro)、鸡贫血病原体、禽呼肠孤病毒、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、火鸡鼻气管炎病毒、副鸡嗜血杆菌(鼻炎)、鸡痘病毒、禽脑脊髓炎病毒、减蛋综合症病毒、传染性喉气管炎病毒、火鸡的疱疹病毒、艾美虫属物种、鼻腔鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、沙门氏菌属(Salmonella)物种和大肠杆菌(Escherichia coli)。
本发明的再另一个实施方式涉及本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸,其作为药物使用。
本发明的再另一个实施方式涉及本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸,其用于预防或抵御家禽中的传染病。
迄今为止,所有检测系统均使用报告基因对细胞的瞬时转染。此类瞬时系统不允许可靠地并排比较CpG ODN的功效。如上文所述,超过现有系统的主要改进是将携带报告基因的质粒引入并稳定保持在细胞中。稳定是指质粒在数个细胞分裂周期后仍存在于细胞中。
常常通过在一种或多种选择试剂(例如抗生素)的压力下培养细胞,从而获得质粒的稳定保持,其中在所述质粒上存在针对该选择试剂的抗性基因。因而,质粒的丢失将导致丢失该质粒的细胞死亡。剩余的活细胞将仍带有所述质粒。
稳定保持的另一种方式是使用线性化的质粒转染。此类质粒通常变得整合到细胞的基因组中,并因此被稳定地保持。
因此,本发明的再另一个实施方式涉及包含TLR21受体和编码NF-κB报告基因的质粒的细胞,其中,所述质粒稳定保持在所述细胞中。此类细胞非常适合用于筛选CpG分子,更具体地,筛选本发明的CpG分子。
实施例给出了关于如何获得包含能够稳定地保持在细胞中的编码报告基因的质粒的此类细胞的充分指导。
此外,如上所述,发现基于分泌的碱性磷酸酶(SEAP)的检测系统非常适合于所使用的检测系统。
因此,优选地,所述报告基因是编码分泌的碱性磷酸酶的基因。
基本上,允许引入且优选稳定保持携带NF-κB报告基因(优选如上所述的SEAP基因)的质粒的携带且表达TLR21的任何细胞或细胞系,都适合用于测试TLR21-特异性CpG ODN。
用于测试TLR21-特异性CpG ODN的此类适合的细胞系的优选实例是鸡细胞系HD11。
因此,优选地,用于所述检测系统中的细胞系是包含编码报告基因的稳定质粒的HD11细胞系。
鸡细胞系例如HD11细胞系展示了鸡-TLR的全体成员。这在一定的条件下可产生一定的背景活性。
因此,非家禽细胞系,例如哺乳动物细胞系是更优选的细胞系。此类哺乳动物细胞系的实例是其中已克隆了TLR21的HEK293细胞。此细胞系对于TLR21-活化信号具有更特异的选择性。
因此,更优选地,用于所述检测系统中使用的细胞系是包含稳定保持的报告基因的哺乳动物细胞系HEK293,并且在所述HEK293细胞中已经克隆了TLR21。
本发明的再另一个实施方式涉及用于检测本发明的免疫刺激性寡脱氧核苷酸的方法,其中,所述方法包括以下步骤:a) 使寡脱氧核苷酸与本发明的细胞接触,b) 检测报告基因的产物的水平。
在此方法的优选形式中,报告基因的产物是SEAP。
此实施方式的更优选的形式涉及用于检测本发明的免疫刺激性寡脱氧核苷酸的方法,其中,所述细胞是鸡细胞系HD11的细胞,或者其中已经克隆了鸡TLR21的HEK293细胞系的细胞。
实施例
实施例1:
鸡TLR21的基因克隆和异源表达
鸡TLR研究中的最新进展表明,TLR21是禽类物种中的哺乳动物TLR9的功能性同源物(Keestra 2008;Brownlie等,2009)。
TLR21基因克隆的概要
基于Genbank数据库序列NM_001030558,合成用于鸡TLR21基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增的引物对:
设计所述引物以提供在起始和终止密码子(粗体)侧翼的限制性克隆位点(下划线)和Kozak序列(斜体)。使用这些引物以及作为模板的鸡脾总RNA进行RT-PCR。将预期大小(~ 3000 bp)的PCR产物克隆到pCR2.1-Topo中,并对5个独立的质粒克隆(P1、P2、P12、P13、P14)进行测序。
所使用的鸡TLR21的DNA序列。
使用pcDNA3.1(+)-Neo-chiTLR21转染HEK293-pNifTy2-Zeo (克隆的细胞系)
人胚肾(HEK)细胞293在1970年代通过病毒转化产生(Graham等,1977),并且研究团体现在可通过细胞系保藏单位例如ATCC获得。
pNifty2是允许检测NFκB转录因子活化的质粒,NFκB转录因子活化是很多免疫刺激性作用(其中有Toll样受体活化)的标志。pNifTy2中的其转录/翻译依赖于NFκB活化的报告基因是分泌的碱性磷酸酶(SEAP)。详细资料描述于销售此质粒的公司:Invivogen的数据表中。通过向生长培养基添加博莱霉素(zeocin),在细菌和哺乳动物细胞二者中选择通过pNifty2的转化/转染事件。
通过标准方法(脂质体转染),以pNifTy2转染HEK293细胞,选择稳定的细胞系,通过使用人肿瘤坏死因子α (Sigma)的刺激建立NF-κB/SEAP轴的功能性。通过微量滴定板比色法,采用碱性缓冲液(50 mM NaHCO3,pH9.6,2 mM MgCl2)中的发色底物,对硝基苯基磷酸盐(pNPP,5 mM),测定所刺激的细胞的培养上清中的分泌的SEAP。通过微量滴定板读数器监测显色(λ = 405 nm)。此读数还用于(通过有限稀释法)选择具有高信噪比的克隆系。随后,将所选择的这些克隆之一(称为克隆11)用于使用鸡TLR21的进一步研究。
pcDNA3.1(+)-neo是购自于Invitrogen的标准哺乳动物表达载体。鸡TLR21基因向此载体中的亚克隆通过由PCR引入的侧翼Hind III (起始密码子)和Not I (终止密码子)位点完成。(参见图1)。
随后,将此质粒转染(脂质体转染)进入克隆的HEK293-pNifty2-zeo系,并通过向生长培养基中添加博来霉素和G418两者来选择重组细胞。通过用ODN-X4和ODN-HEK1-PTO刺激培养物和检测SEAP,评估所得多克隆重组细胞系的功能性。随后,通过有限稀释法、随后的刺激和SEAP检测来鉴定优异的克隆系。
SEAP是哺乳动物系统中的报告酶(Yang等,1997)。SEAP是人胚胎碱性磷酸酶的分泌形式。其主要优点是高稳定性和极高的特异活性,这确保了检测的灵敏度和稳健性。已描述了用于SEAP检测的多种底物,但选择了经济且稳健的pNPP,这是因为其反应产物对硝基苯酚盐以高灵敏度检出(ε405 = 18500 M-1 cm-1)。在本测试设置中,本发明人进行了动力学试验,这是因为动力学试验提供了更宽的定量动态范围。
使用pcDNA3.1(+)-Neo-chiTLR21 (使用Pvu I线性化)转染HEK293-pNifTy2-Zeo细胞,并且通过向培养基补充350 μg/ml博来霉素和600 μg/ml G418选择多克隆细胞系。通过使用ODN-X4 (PDE)并使用ODN-HEK1 (PTO)刺激细胞,进行功能性测试。所选择的细胞产生分泌的碱性磷酸酶(SEAP),但亲本HEK293-pNifTy2-Zeo细胞系没有产生。进行单细胞克隆,并且分析单个克隆对ODN-X4 (PDE) (GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG)和ODN-HEK1 (PTO) (TCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTT)的响应性。
在46个zeo/G418-双抗性克隆细胞系中,仅有3个对ODN刺激作出明显的响应,同时,还有3-4个细胞系显示了较弱的信号。因此,85%的所选克隆没有功能。
对于所有的进一步研究,使用到目前为止对ODN-X4 (PDE)和ODN-HEK1 (PTO)刺激的响应产生最高SEAP读数信号的克隆细胞系38。
图2-5给出了多种zeo/G418双抗性克隆细胞系的SEAP活性的概述。
实施例2
由图6可见,对于最大响应,与所测试的其它寡核苷酸比较时,寡核苷酸X43-II-T在报告细胞(HEK293-pNifty2-鸡TLR21)中给出了极大诱导的量的报告酶SEAP的具有405 nm吸收的有色产物。
在图6的基础上,对各化合物进行以下EC50计算:
EC50计算:
结论:根据表现OD405nm/min的图6和表现以纳摩尔计的EC50的图7,在X43中添加2个3’-侧翼的胸腺嘧啶和2个5’-侧翼的胸腺嘧啶(→ X43-II-T)导致在最大响应和EC50两个方面的功效预想不到地强烈提高。显示化合物的EC50在皮摩尔范围。
实施例3
在此实施例中,n的数量从X43-II-trip中的n=3变为n=4 (X43-II-quad)和n=5 (X43-II-pent)。
在图8中显示了n数量增加的作用。在下表中,显示了n的增加对EC50的作用。很明显,n的增加导致EC50减少,并由此导致更高的免疫刺激作用。
实施例4:
在此实施例中,p和q的数量从2(X43-II-trip)变成3(X43-III-trip)和4(X43-IV-trip)。
在图9中显示了p和q的数量增加的作用。在下表中,显示了n的增加对EC50的作用。很明显,p和q的增加导致EC50减少,并由此导致更高的免疫刺激作用。
实施例5:
在此实施例中,x的数量从6增加到7(X43-II-5735),并且z的数量从5减少到2(X43-II-5732)。
在图10中显示了x数量增加和z数量减少的作用。在下表中,显示了n的增加对EC50的作用。x的增加和z的减少都导致EC50提高,并由此导致更高的免疫刺激作用。
图注
图1:pcDNA3.1(+)-chiTLR21的质粒图;
图2-5:各种zeo/G418双抗性克隆细胞系的SEAP活性的概述。
图6:此图显示了所测试的各种化合物在报告细胞(HEK293-pNifty2-鸡TLR21)中诱导报告酶SEAP的一定量的具有405 nm吸收的有色产物中的强度。
图7:此图显示了所测试的各种化合物的以皮摩尔计的EC50数值。
图8-10:这些图显示了进一步修饰的测试化合物在报告细胞(HEK293-pNifty2-鸡TLR21)中诱导报告酶SEAP的一定量的具有405 nm吸收的有色产物中的强度。
Claims (18)
2.如权利要求1的寡脱氧核苷酸,其中p > 1。
3.如权利要求1的寡脱氧核苷酸,其中p > 2。
4.如权利要求1的寡脱氧核苷酸,其中q > 1。
5.如权利要求1的寡脱氧核苷酸,其中q > 2。
6.如权利要求1的寡脱氧核苷酸,其中n = 3 - 18。
7.如权利要求1的寡脱氧核苷酸,其特征在于所述5' [G]x和3' [G]z核苷酸具有硫代磷酸酯键且其它核苷酸具有磷酸二酯键。
8.如权利要求1-7中任一项的寡脱氧核苷酸,其特征在于是同聚物。
9.如权利要求1-8中任一项的寡脱氧核苷酸,其中所述寡脱氧核苷酸偶联到载体或半抗原。
10.载体,其包含如权利要求1-8中任一项的寡脱氧核苷酸。
11.用于预防或抵御传染病的疫苗,其特征在于,所述疫苗包含免疫刺激量的如权利要求1-9中任一项的寡脱氧核苷酸和/或如权利要求10的载体,免疫量的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息,以及药学可接受的载体。
12.如权利要求11的疫苗,其特征在于,所述抗原组分是或源自在其野生型形式下对家禽具有致病性的病毒或微生物。
13.如权利要求12的疫苗,其特征在于,所述病毒或微生物选自:传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病(甘布罗病)、鸡贫血病原体、禽呼肠孤病毒、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、火鸡鼻气管炎病毒、副鸡嗜血杆菌(鼻炎)、鸡痘病毒、禽脑脊髓炎病毒、减蛋综合症病毒、传染性喉气管炎病毒、火鸡的疱疹病毒、艾美虫属物种、鼻腔鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、沙门氏菌属(Salmonella)物种和大肠杆菌(Escherichia coli)。
14.如权利要求1-9中任一项的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸或如权利要求10的载体,其作为药物使用。
15.如权利要求1-9中任一项的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸或如权利要求10的载体,其用于预防家禽中的传染。
16.用于检测如权利要求1-9中任一项的免疫刺激性寡脱氧核苷酸的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:a) 使寡脱氧核苷酸与包含TLR21受体和编码NF-κB报告基因的质粒的细胞接触,其中所述质粒稳定保持在所述细胞中,和b) 检测所述报告基因的产物的水平。
17.如权利要求16的方法,其中所述报告基因的产物是分泌的碱性磷酸酶。
18.如权利要求16或17的用于检测免疫刺激性寡脱氧核苷酸的方法,其特征在于,所述细胞是鸡细胞系HD11的细胞,或其中已经克隆了鸡TLR21受体基因的HEK293细胞系的细胞。
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