CN114807062A - 非洲猪瘟病毒i73r基因条件性缺失毒株的构建及其作为疫苗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒I73R基因条件性缺失毒株的构建及其作为疫苗的应用。本发明在基因Ⅱ型非洲猪瘟(African swine fever，ASF)亲本毒株ASFV CN/GS/2018中条件性敲除I73R基因构建了ASFV I73R基因条件性缺失毒株(vI73Ri)；所述vI73Ri是一株安全性高的减毒ASF候选疫苗株，对猪完全致弱、免疫猪无典型ASF临床症状、免疫后在猪血液内检测到非常低的病毒，且能够对ASFV CN/GS/2018强毒株攻毒提供100％免疫保护，可作为安全和有效的防控ASF疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值。

Description

非洲猪瘟病毒I73R基因条件性缺失毒株的构建及其作为疫苗 的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒I73R基因条件性缺失毒株的构建及其作为疫苗的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。当前没有商品化的有效疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，同时无法满足我国规模化养猪的需要。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染最有效、最经济的手段，对于我国规模养猪模式下的非洲猪瘟的防治至关重要。但非洲猪瘟病毒(ASFV)结构复杂、基因组庞大，大部分功能未知，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，非洲猪瘟流行已逾百年，但仍未有商品化的疫苗问世。

目前对于非洲猪瘟疫苗的制备主要通过三种方式：一是直接对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二是筛选出有效诱导免疫应答的病毒蛋白，进而制备亚单位疫苗和活载体疫苗；三是采用基因缺失手段，敲除毒力或与复制等相关的基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲猪瘟病毒编码免疫抑制、免疫耐受和抗体依赖增强作用(ADE)等蛋白，灭活疫苗无法引起免疫猪体内有效的免疫保护作用；同时由于非洲猪瘟病毒结构复杂，目前诱导免疫应答的蛋白还未清楚，通过第二种方法获得的抗原还不足以诱导坚强的免疫保护作用。而目前最有望突破的疫苗就是基因敲除疫苗，通过对免疫抑制、耐受、ADE等毒力相关基因的敲除，获得既具有免疫原性，又能降低致病性，免疫猪获得免疫保护作用的疫苗候选毒株。例如，中国专利CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株，该弱毒株是非洲猪瘟病毒SY18分离株的四基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物和三个多基因家族基因(MGF-360-12L、MGF-360-13L、MGF-360-14L)编码产物，接种仔猪免疫28天后，以ASFV原始毒进行攻毒试验，结果免疫猪群均获得完全保护；又如中国专利CN110093324B公开了一种基因II型的非洲猪瘟病毒MGF-360-505R缺失和CD2V与MGF-360-505R联合缺失的基因缺失病毒，这两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，这两株基因缺失病毒免疫后21天能够提供充分的强毒攻击保护。

综上，对于猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性，又要兼顾致病性和安全性能，作为疫苗还需要考虑其生产能力。但是现有技术中猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗还考量如下因素：(1)敲除的毒力基因是否减少带毒、排毒，是否带来组织损伤和影响生产性能等是生物安全的一个重要指标，也是基因缺失疫苗安全性不断提升的一个重要指标；(2)不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分存在毒力和致病性残留问题；以及多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险；(3)直接敲除毒力基因会导致病毒复制下降，无法作为可生产的疫苗；(4)非洲猪瘟的全基因组测序工作虽然已经完成，但是组成非洲猪瘟病毒的调控基因和结构基因高达160多个，虽然工程巨大，但对调控基因和结构基因的功能对其致病机理和疫苗研制至关重要。

本发明首先发现，在亲本非洲猪瘟病毒株中抑制I73R基因表达或敲除I73R基因能够获得一种减毒株，所述减毒株作为候选疫苗株对猪完全致弱、免疫猪无典型ASF临床症状、免疫后在猪血液内检测不到病毒，且能够对ASFV CN/GS/2018强毒株攻毒提供100％免疫保护，可作为安全和有效的防控ASF疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值。其次，本发明发现，通过构建条件性敲除片段，实现对I73R基因的条件性抑制或敲除，获得的减毒株在IPTG诱导下能够正常复制，可实现所述减毒株的生产，而在无IPTG诱导条件下能直接抑制I73R基因的表达，可作为安全有效的生产疫苗。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种构建减毒非洲猪瘟病毒株的策略，所述策略为：通过抑制亲本毒株中I73R基因表达或敲除I73R基因制备减毒非洲猪瘟病毒株。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种通过抑制基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中I73R基因表达制备减毒非洲猪瘟病毒株或减毒非洲猪瘟病毒疫苗的应用。

优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。

优选地，所述I73R基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述I73R基因序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种减毒非洲猪瘟病毒株，所述减毒非洲猪瘟病毒株为I73R基因表达抑制，或I73R基因缺失，或I73R基因条件性敲除的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒株。

优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096；所述I73R基因位于ASFV CN/GS/2018分离株中第172118-172336位。

优选地，所述I73R基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述I73R基因序列如SEQ ID NO.1所示。

第三方面，本发明提供了一种I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株，所述I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株为I73R上游基因的终止密码子与I73R起始密码子之间任一位点插入条件性敲除基因片段的基因Ⅱ型非洲猪病毒株；所述条件性敲除基因片段从5’-3’依次包含lac阻遏子基因表达元件和lac操纵子基因表达元件。

优选地，所述条件性敲除基因片段从5’-3’依次为筛选标记物基因表达元件、lac阻遏子基因表达元件和lac操纵子基因表达元件。

优选地，所述筛选标记物基因表达元件包括筛选标记物基因及其启动子；所述lac阻遏子基因表达元件包括lac阻遏子基因及其启动子；所述lac操纵子基因表达元件包括lac操纵子基因及其启动子。

优选地，所述启动子为真核启动子中的任一种；所述筛选标记物可为荧光蛋白中的任一种。

优选地，所述筛选标记物基因表达元件包括eGFP基因及p72启动子；所述lac阻遏子基因表达元件包括lac阻遏子基因及U104L启动子；所述lac操纵子基因表达元件包括lac操纵子基因及p72启动子。

优选地，所述筛选标记物基因表达元件的基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述lac阻遏子基因表达元件的基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述lac操纵子基因表达元件的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

优选地，所述条件性敲除基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株为ASFV CN/GS/2018分离株；所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。

优选地，所述I73R基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述I73R基因序列如SEQ ID NO.1示。

优选地，所述条件性敲除基因片段位于ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第172117-172118位之间。

第四方面，本发明提供了一种制备上述第三方面所述I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株的方法，所述的方法为：

(1)将条件性敲除基因片段插入表达载体，构建pUC118-ASFV IPTG载体；

(2)设计I73R基因起始密码子上下游序列作为左右同源重组臂，通过Gibson连接的方法，分别将两个同源臂克隆入到上述pUC118-ASFV IPTG载体，所述左右同源重组臂分别位于条件性敲除基因片段5’和包含I73R基因在内的3’末端，得到了同源重组转移载体pUC118-LR-iI73R-eGFP-lacI；

(3)将同源重组转移载体pUC118-LR-iI73R-eGFP-lacI转染至感染了原始基因Ⅱ型非洲猪病毒株的BMDM细胞，筛选获得基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株。

优选地，所述步骤(1)中的表达载体选自pUC18、pUC19、pUC57、pUC118、pUC119、pCA、pCK、pCC、pCC1中的任意一种或其变体，但不局限于pUC18、pUC19、pUC57、pUC118、pUC119、pCA、pCK、pCC、pCC1中的任意一种或其变体。

优选地，所述步骤(1)为：pUC118载体经EcoRI和HindIII限制性内切酶酶切，回收骨架片段；然后将lac阻遏子基因表达元件、lac操纵子基因表达元件、筛选标记物基因表达元件同时连接到pUC118的骨架片段中得到pUC118-ASFV IPTG载体；所述载体中从左至右依次为p72启动子、eGFP基因、U104L启动子、lac阻遏子表达基因、p72启动子、lac操纵子表达基因。

本发明的有益效果是：本发明首先发现，在亲本非洲猪瘟病毒株中抑制I73R基因表达或敲除I73R基因能够获得一种减毒株，所述减毒株作为候选疫苗株对猪完全致弱、免疫猪无典型ASF临床症状、免疫后在猪血液内检测不到病毒，且能够对ASFV CN/GS/2018强毒株攻毒提供100％免疫保护，可作为安全和有效的防控ASF疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值；其次，本发明发现，通过构建条件性敲除片段，实现对I73R基因的条件性抑制或敲除，获得的减毒株在IPTG诱导下能够正常复制，不影响所述减毒株的生产，而在无IPTG诱导条件下能直接抑制I73R基因的表达，可作为安全有效的生产疫苗。

附图说明

图1非洲猪瘟病毒I73R基因条件性敲除策略示意图；

图2 I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)荧光检测结果；

图3检测I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)是否纯化干净；

图4检测在有无IPTG情况下I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)毒株中I73R基因表达结果；

图5 I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)免疫后实验猪的体温变化图；其中每条曲线代表一头动物，横坐标分别为免疫时间和攻毒时间，纵坐标为体温；

图6 I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)免疫后亲本毒攻毒实验猪体温变化图；其中每条曲线代表一头动物，横坐标分别为免疫时间和攻毒时间，纵坐标为体温；

图7 I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)免疫及亲本毒攻毒后实验猪的存活率结果图；其中横坐标分别为免疫时间和攻毒时间，纵坐标为存活率；

图8 I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)免疫后亲本毒攻毒实验猪的存活率结果图；其中横坐标分别为免疫时间和攻毒时间，纵坐标为存活率；

图9 I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)免疫和亲本毒攻毒后实验猪血液带毒结果图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：

中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：

原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的重组猪GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO₂培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，换液继续诱导，经5-7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩增ASFV，并进行病毒含量的滴定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。

Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS/2018来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为5×10⁷TCID₅₀/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202096；保藏地址：中国武汉，武汉大学；联系电话：027-68752319；以下实施例中简称为ASFV CN/GS/2018分离株。

以下实施例中以Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS/2018分离株为例，进行I73R基因敲除重组病毒株的构建，获得了一株安全性高且完全免疫的减毒非洲猪瘟候选疫苗株，但并不局限于ASFV CN/GS/2018分离株。以其他Ⅱ型非洲猪瘟病毒株为亲本毒，条件性诱导敲除I73R基因也能够获得安全性高且完全免疫的减毒非洲猪瘟候选疫苗株。其中以Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS/2018分离株为例，所述I73R基因位于ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第172118-172336位，所述I73R基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述I73R基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

pUC118载体购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司。

实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。

以下实施例中，为了便于后续纯化病毒，在合成调控序列的同时，也合成了p72启动子启动表达的eGFP基因筛选标记物元件，但并不局限于eGFP基因筛选标记物，其他用于基因工程领域的筛选标记物基因均适用，所述筛选标记物优选荧光蛋白。

本实施虽然以I73R基因起始密码子上下游序列选择了特定的同源重组臂序列(LA，序列如SEQ ID NO.11所示；和RA，序列如SEQ ID NO.12所示)，但是在不敲除目的基因的上下游基因，且不破坏目的基因序列完整性(包括目的基因的起始密码子)的基础上，均可对同源重组臂序列进行选择，其中同源重组臂序列的选择符合以下方面均可实现：所述LA选自I73R基因起始密码子上游的连续片段，但不包括I73R基因的起始密码子，且所述LA序列3’端的端点位于I73R基因的起始密码子与I73R基因的上游基因的终止子之间；所述RA选自I73R基因的起始密码子下游的连续片段，包括I73R基因的起始密码子。

操纵子是指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称，是转录的功能单位。本发明所述的lac操纵子即乳糖操纵子，是一个在大肠杆菌及其他肠道菌科细菌内负责乳糖的运输及代谢的操纵子。

阻遏子属于调节基因，是指在诱导表达系统中，其表达产物与操纵子基因结合时，核糖核酸多聚酶就不能通过操纵基因，因而信使核糖核酸的合成受到阻碍，阻止酶的合成表达的基因片段；本发明所述的lac阻遏子的表达产物与大肠杆菌乳糖操纵子结合时，核糖核酸多聚酶就不能通过操纵基因，因而信使核糖核酸的合成受到阻碍，阻止基因的合成表达；其中诱导物(例如IPTG)可以和lac阻遏子相结合而使lac阻遏子失去活性，抑制其与lac操纵子基因相结合，解除lac操纵子的抑制，使目的基因正常合成表达。

同源重组臂通常是指打靶载体上待插入的外源序列两侧的与基因组序列完全一致的侧翼序列，用于识别并发生重组的区域。

质粒是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。本发明构建的含有条件敲除片段的质粒能够在转染至细胞后能与病毒基因组发生重组，并通过条件诱导调控I73R基因的表达，实现I73R基因的敲除。

基因缺失的方法一般是指基因敲除，是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。基因敲除的方法一般包括：同源重组技术、随机插入突变技术以及RNA干扰技术；其中，同源重组技术又叫基因打靶，是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合到预定的位置上，从而改变某些遗传特性的方法，重组的目的是为了敲除某个基因；随机插入突变技术是指利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞；RNA干扰技术是指由与生物体内源靶基因mRNA同源的双链RNA特异性引发的靶mRNA降解，导致目的基因表达沉默的一种反向遗传学技术。

术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的非洲猪瘟疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。

本发明公开的非洲猪瘟疫苗也可被用于制备联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。联合疫苗可以包含不同基因型的多种减毒非猪瘟病毒，如此可以诱导针对多种非猪瘟病毒基因型的交叉保护性免疫应答。

本发明的非洲猪瘟疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。

在本发明中虽然以基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS/2018分离株为例，构建了I73R基因条件性敲除的非洲猪瘟减毒株，但是本发明并不局限于ASFV CN/GS/2018分离株。本领域技术人员公知：在不同的ASFV基因组中条件性删除相关的基因后，观察到的表型差异与基因组成相关；并且现有流行的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒(包括China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV CzechRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium2018/1、ASFV Germany2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASFV/pig/China/CAS19-01/2019)与本申请所述的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒ASFV CN/GS/2018分离株的基因组成完全相同。因此，在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒的基因组成相同的基础上，以上述其他Ⅱ型非洲猪瘟病毒为出发毒株同样能够成功构建获得相关减毒非洲猪瘟病毒株及疫苗。

实施例1I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)的构建

1.I73R基因条件性敲除同源重组转移载体的构建

(1)基因合成

合成编码lac阻遏子基因序列(SEQ ID NO.7所示)、编码lac操纵子的基因序列(SEQ ID NO.8所示)；同时合成U104L启动子(SEQ ID NO.10所示)启动的lac阻遏子基因元件(SEQ ID NO.5所示)、由p72启动子(SEQ ID NO.9所示)启动的lac操纵子基因元件(SEQID NO.6所示)。

(2)筛选表达盒构建

为了便于后续纯化病毒，我们在合成调控序列的同时，合成p72启动子(SEQ IDNO.9所示)启动表达的eGFP基因筛选标记物元件，所述p72启动子启动表达的eGFP基因筛选标记物元件的序列如SEQ ID NO.4所示。

(3)同源重组转移载体的构建

pUC118载体经EcoRI和HindIII限制性内切酶酶切，回收骨架片段；然后将步骤(1)合成的lac阻遏子基因表达元件lacI、lac操纵子基因表达元件lacO、eGFP筛选标记物元件同时连接到pUC118的骨架片段中得到pUC118-ASFV IPTG载体；所述载体中从左至右依次为p72启动子(p72 promoter，序列如SEQ ID NO.9所示)、eGFP基因、U104L启动子(U104Lpromoter，序列如SEQ ID NO.10所示)、lac阻遏子表达基因(lacI)、p72启动子(p72promoter，序列如SEQ ID NO.9所示)、lac操纵子表达基因(lac operator)；

设计I73R基因起始密码子上下游序列作为同源重组臂(LA，序列如SEQ ID NO.11所示；和RA，序列如SEQ ID NO.12所示)，通过Gibson连接的方法，分别将两个同源臂克隆入到上述pUC118-ASFV IPTG载体中eGFP筛选标记物元件的左侧和lac操纵子基因表达元件lacO的右侧，得到了用于条件性敲除I73R基因的同源重组转移载体pUC118-LR-iI73R-eGFP-lacI。

具体构建策略如图1所示，其中，图中所示的lacI为lac阻遏子表达基因。

本实施虽然以I73R基因起始密码子上下游序列选择了特定的同源重组臂序列(LA，序列如SEQ ID NO.11所示；和RA，序列如SEQ ID NO.12所示)，但是在不敲除I73R基因上下游基因，且不破坏I73R基因序列完整性的基础上，均可对同源重组臂序列进行选择，其中同源重组臂序列的选择符合以下方面均可实现：所述LA包括I73R基因启动子全部或部分序列，和/或I73R基因的上游基因的部分或全部序列，且所述LA序列3’端的端点选择自I73R基因的起始密码子与I73R基因的上游基因的终止密码子之间的序列；所述RA为I73R基因右同源重组臂序列，包括I73R基因的全部或部分基因序列，且所述RA的5’端自I73R基因起始密码子开始。

2.细胞转染和重组病毒筛选

复苏BMDM细胞，铺6孔板(细胞数约为10⁶个/孔)，用

-Macrophage DNA转染试剂转染上述1中制备的同源重组转移载体pUC118-LR-i I73R-eGFP-lacI。在EP管中加入500μl buffer，2μg重组质粒，6μl转染试剂，充分混匀后静置10min，然后加入六孔板中。

转染6h后，弃掉转染用的完全培养液，换成含有IPTG的完全培养基，用ASFV CN/GS/2018病毒株(MOI＝1)直接感染BMDM细胞，感染后不换液，48h后使用荧光显微镜观察荧光细胞数并拍照，在用含有IPTG的完全培养基培养后，可观察到大量荧光的表达，说明疑似重组病毒成功感染细胞(图2，GFP，IPTG+)；细胞消化后，挑取所有单孔中的荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1小时，挑取感染孔中所有单个荧光细胞，反复冻融后，接种到预先铺好的、用含有IPTG的完全培养基培养的96孔板BMDM细胞中(培养基中IPTG终浓度为1.25mM)，每12小时观察一次，观察出现荧光的细胞孔，标记后，继续观察至72h。结果显示，部分孔中荧光细胞数量比例可达100％，这说明I73R基因条件性敲除毒株构建成功(图2，TRANS，IPTG+)，将其命名为ASFV i I73R-eGFP-lacI(vI73Ri)。

同样，挑取上述荧光细胞，换成不含有IPTG的完全培养基，培养48h后使用荧光显微镜观察荧光细胞数并拍照，在用不含有IPTG的完全培养基培养后，荧光细胞比例大幅下降(图2，GFP，IPTG-)；细胞消化后，挑取所有单孔中的荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1小时，挑取感染孔中所有单个细胞，反复冻融后，接种到预先铺好的、用不含有IPTG的完全培养基培养的96孔板BMDM细胞中，每12小时观察一次，观察出现荧光的细胞孔，标记后，继续观察至72h。结果显示，96孔板中仍然观察不到荧光细胞(图2，TRANS，IPTG*)；说明重组病毒I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)在无IPTG条件下，使I73R不表达，即，(vI73Ri)在无IPTG条件下实现了I73R的条件性敲除。

3.基因敲除结果鉴定

对100％阳性孔进行10次有限稀释扩大培养获得重组病毒，期间用病毒基因组提取试剂盒(购自北京天根生物科技公司)提取野生ASFV和重组ASFV基因组DNA，用ASFV I73R的引物(ASFV I73R sur-F:cgtcttacctacaggatcta；ASFV I73R sur-R:ttatcccccgctttggatac)对其纯净度进行PCR鉴定。

纯净性检测结果如图3所示显示，第八代F8缺失毒可以检测到vI73Ri的左右同源臂，及其I73R基因的插入。第八代F8中已经不存在野毒，说明IPTG条件性诱导I73R基因敲除毒株(vI73Ri)已经构建且纯化成功。

此外，I73R基因表达检测结果如图4所示，在有或无IPTG的条件下(IPTG+)，对P72和P30没有影响，而I73R基因表达存在差异，进一步表明构建的I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)在无IPTG的条件下实现了I73R基因的条件性敲除，获得了I73R条件性基因敲除的重组毒。

实施例2病毒滴度的测定

非洲猪瘟病毒的滴度采用半数血细胞吸附量(50％haemadsorption,HAD₅₀)表示，HAD₅₀实验具体操作见文献(Borca MV,Ramirez-Medina E,Silva E,Vuono E,Rai A,PruittS,Holinka LG,Velazquez-Salinas L,Zhu J,GladueDP.Development of a highlyeffective African swine fever virus vaccine by deletion of the I177L generesults in sterile immunity against the current epidemic Eurasiastrain.JVirol.2020.pii:JVI.02017-19)，同时对其进行适当调整：在96孔板中按照约1x10⁵/孔细胞接种原代PAM细胞，待检I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)连续10倍梯度稀释，共7个稀释度，每个稀释度下8孔，按照100μL/孔将稀释毒加至96孔板PAM中，随即加入红细胞，共三次重复。病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的花环进行判定，连续观察6天，统计阳性孔数，计算半数血细胞吸附量(HAD₅₀)。滴度测定合格，进行致病性评价。

实施例3 I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)的毒力评价

为了检测I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)的毒力，本实验用10⁴HAD₅₀剂量经肌肉注射仔猪对其毒力进行评价。

本实验用12头非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康长白仔猪，共分为2组，其中I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)免疫组6头，ASFV CN/GS/2018分离株攻毒组6头。免疫后每天测量体温变化情况，采集外周血和唾液，参照文献(King DP,Reid SM,Hutchings GH,GriersonSS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos AD,Drew TW.2003.Development of a TaqMan PCRassay with internal amplification control for the detection of African swinefever virus.J Virol Methods107:53-61)，并通过荧光定量PCR方法测定血液中的ASFV病毒含量，检测至19天终止。统计免疫组和攻毒组动物的致死率，体温变化结果如图5所示和存活率如图7所示，I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)经过肌肉注射后，免疫组猪的体温正常，均未出现持续高温，且未出现死亡，存活率均为100％。

血液中的ASFV病毒含量检测结果如图9(免疫部分)所示，注射I73R基因缺失重组毒后，免疫组猪在免疫7天后血液中检测到少量病毒，但在免疫至第19天后未检测到血液病毒；而攻毒对照组猪血毒含量很高，并且在第7天全部死亡。这些实验结果表明，在亲本ASFVCN/GS/2018分离株中条件性敲除I73R基因，使I73R基因编码蛋白功能丧失后，获得的I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)的毒力完全致弱，安全性较好。

实施例4 I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)的免疫保护效果评价

为了检测I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)的免疫保护效果，本实验用10²HAD₅₀剂量的亲本ASFV CN/GS/2018分离株对实施例3中的经过I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)免疫的免疫组猪(6头)和未免疫的对照组猪(6头)进行攻毒实验。

攻毒后每天测量体温变化情况，采集外周血，观察至17天终止。其中存活率结果如图8所示，其中横坐标为攻毒时间，纵坐标为存活率，亲本ASFV CN/GS/2018分离株攻毒后，免疫组猪的存活率100％，而对照组猪在攻毒至第15天时全部死亡。体温变化结果如图6所示，免疫组猪均未出现发热的典型病症，而对照组猪在攻毒后体温急剧升高，并在攻毒至第15天时全部死亡。上述结果说明，在亲本ASFV CN/GS/2018分离株攻毒后，I73R基因缺失重组毒免疫组猪的体温正常，存活率100％，即I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)对亲本ASFVCN/GS/2018分离株具有完全的免疫保护效果。

本实验参照文献(King DP,Reid SM,Hutchings GH,Grierson SS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos AD,Drew TW.2003.Development of a TaqMan PCR assay withinternal amplification control for the detection of African swine fevervirus.J Virol Methods 107:53-61)，通过荧光定量PCR方法测定血液中的ASFV病毒含量，对免疫后攻毒猪和未免疫攻毒猪的血液带毒情况进行了检测。免疫组和未免疫组血液带毒情况如图9所示，其中横坐标为攻毒时间，纵坐标为ASFV病毒含量，对照组猪在攻毒至第7天时全部死亡。实验结果表明，ASFV CN/GS/2018分离株攻毒后1-5天内免疫组中只有1头猪血液中出现少量病毒，第5天后已基本检测不到免疫组动物血液中的病毒。

上述结果进一步说明，I73R基因条件性敲除毒株(vI73Ri)对亲本ASFV CN/GS/2018分离株有完全的免疫保护效果。

综上所述，在通过同源重组技术成功构建了I73R编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒的基础上，为制备出更加安全有效的非洲猪瘟疫苗提供了基础。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 非洲猪瘟病毒I73R基因条件性缺失毒株的构建及其作为疫苗的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 219

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 1

atggagactc agaagttgat ttccatggtt aaggaagcct tagaaaaata tcaataccct 60

cttactgcta aaaatattaa agtagtgata caaaaagagc acaatgtcgt cttacctaca 120

ggatctataa atagcatact gtacagtaac tcagaacttt ttgagaagat tgataagaca 180

aataccattt atcccccgct ttggatacgg aaaaactaa 219

<210> 2

<211> 72

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 2

Met Gly Thr Gly Leu Leu Ile Ser Met Val Leu Gly Ala Leu Gly Leu

1 5 10 15

Thr Gly Thr Pro Leu Thr Ala Leu Ala Ile Leu Val Val Ile Gly Leu

20 25 30

Gly His Ala Val Val Leu Pro Thr Gly Ser Ile Ala Ser Ile Leu Thr

35 40 45

Ser Ala Ser Gly Leu Pro Gly Leu Ile Ala Leu Thr Ala Thr Ile Thr

50 55 60

Pro Pro Leu Thr Ile Ala Leu Ala

65 70

<210> 3

<211> 2512

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagctcgcgc atacgatctg ggtcgccgga ggaaaagtca aaaggggcag gtagttcata 60

caccaaaaag tttttttttt ctgccagcaa gagcgtgtca ataattttaa gctgatcgtt 120

aattaatttt tggtttaact ctttgttatt atcaagatcc ttcgcataaa ccgccatatt 180

taataaaaac aataaattat ttttataaca ttatatatcc ggatggtgag caagggcgag 240

gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 300

aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 360

ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 420

tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 480

tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 540

tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 600

aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 660

aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 720

aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 780

acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 840

gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 900

gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aagtccccgg ggacaaaaaa 960

aaaactcgat cgacctcgat ggtacccgtc gacggctttt aattagattt gtgaaaattt 1020

ttttccagat ctataaaaag ggcttttttt tccaaatttt aacatgtttt ttcgtaatat 1080

aacactacac ttaagatgaa accagtaacg ttatacgatg tcgcagagta tgccggtgtc 1140

tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac caggccagcc acgtttctgc gaaaacgcgg 1200

gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg aattacattc ccaaccgcgt ggcacaacaa 1260

ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc gttgccacct ccagtctggc cctgcacgcg 1320

ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct cgcgccgatc aactgggtgc cagcgtggtg 1380

gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa gcctgtaaag cggcggtgca caatcttctc 1440

gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac tatccgctgg atgaccagga tgccattgct 1500

gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg ttatttcttg atgtctctga ccagacaccc 1560

atcaacagta ttattttctc ccatgaagac ggtacgcgac tgggcgtgga gcatctggtc 1620

gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta gcgggcccat taagttctgt ctcggcgcgt 1680

ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc actcgcaatc aaattcagcc gatagcggaa 1740

cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt tttcaacaaa ccatgcaaat gctgaatgag 1800

ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc aacgatcaga tggcgctggg cgcaatgcgc 1860

gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt gcggatattt cggtagtggg atacgacgat 1920

accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg ttaaccacca tcaaacagga ttttcgcctg 1980

ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg caactctctc agggccaggc ggtgaagggc 2040

aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa agaaaaacca ccctggcgcc caatacgcaa 2100

accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 2160

ctggaaagcg ggcagtgagt cgaggggatc cactagattc gacaaaaaaa aaactcgacc 2220

ttcagctcga cctgcaggca tgccgtacgg gggatctggg tcgccggagg aaaagtcaaa 2280

aggggcaggt agttcataca ccaaaaagtt ttttttttct gccagcaaga gcgtgtcaat 2340

aattttaagc tgatcgttaa ttaatttttg gtttaactct ttgttattat caagatcctt 2400

cgcataaacc gccatattta ataaaaacaa taaattattt ttataacatt atatatctag 2460

aaattgtgag cggataacaa ttgcctaggt cacttaggct agccgtaagc tt 2512

<210> 4

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggtcgccgg aggaaaagtc aaaaggggca ggtagttcat acaccaaaaa gttttttttt 60

tctgccagca agagcgtgtc aataatttta agctgatcgt taattaattt ttggtttaac 120

tctttgttat tatcaagatc cttcgcataa accgccatat ttaataaaaa caataaatta 180

tttttataac attatatatc cggatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 240

tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 300

agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 360

agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 420

gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 480

acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 540

tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 600

aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 660

tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 720

aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 780

ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 840

acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 900

gcatggacga gctgtacaag taagtccccg gggacaaaaa aaaaa 945

<210> 5

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgacggct tttaattaga tttgtgaaaa tttttttcca gatctataaa aagggctttt 60

ttttccaaat tttaacatgt tttttcgtaa tataacacta cacttaagat gaaaccagta 120

acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg 180

aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag 240

ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt 300

ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa 360

tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc 420

gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt 480

aactatccgc tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg 540

gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa 600

gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg 660

ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat 720

ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc 780

ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt 840

gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt 900

ggtgcggata tttcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg 960

ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg 1020

ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg 1080

aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat 1140

tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg a 1191

<210> 6

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggtcgccgg aggaaaagtc aaaaggggca ggtagttcat acaccaaaaa gttttttttt 60

tctgccagca agagcgtgtc aataatttta agctgatcgt taattaattt ttggtttaac 120

tctttgttat tatcaagatc cttcgcataa accgccatat ttaataaaaa caataaatta 180

tttttataac attatatatc tagaaattgt gagcggataa caatt 225

<210> 7

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60

tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 120

gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 180

tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 240

gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 300

cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 360

gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 420

actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 480

ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag 540

caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc 600

tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg 660

agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact 720

gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc 780

gggctgcgcg ttggtgcgga tatttcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca 840

tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc 900

gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc 960

gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 1020

gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 1080

tga 1083

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aattgtgagc ggataacaat t 21

<210> 9

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggtcgccgg aggaaaagtc aaaaggggca ggtagttcat acaccaaaaa gttttttttt 60

tctgccagca agagcgtgtc aataatttta agctgatcgt taattaattt ttggtttaac 120

tctttgttat tatcaagatc cttcgcataa accgccatat ttaataaaaa caataaatta 180

tttttataac attatata 198

<210> 10

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgacggct tttaattaga tttgtgaaaa tttttttcca gatctataaa aagggctttt 60

ttttccaaat tttaacatgt tttttcgtaa tataacacta ca 102

<210> 11

<211> 900

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 11

tggataaaca tctgtgtgaa acaaataatg agcttcgtca ggaatgtaaa gaaactattt 60

ttgatttaaa ggtggtagga aatgtttagc caataaactc atgcccgcat tttttacagg 120

tacaaaatat cgtggatggc tcatcgaggg cgcgtgtttg tacttctctg taggtacaca 180

tacgctgctt gcagttggga cacttataaa gttgtgacgt cttttcggcg accttttgct 240

gcgaacgtag agtaatttct gtcttctcct ttaaggcggc agaggggcaa agctcggcga 300

acgtcatgct accaattgcc tccggtttta gctcgccaga aattagctta ttaagggcat 360

cgttatcctg ttgttggtga cttttttttt cgcagttaat aatatgattg atcgtcccac 420

aacgggttga atattcttct aaaaaggttt tttcttgttg ctggtacgta taatgataac 480

acgaggcctc gattttttgc gcgtattcgg tgcataaatc agtatgttcc ttaaaaaaca 540

tatgtttttg aagcgttcta aaaaacatca tttggatgat atcacgcatt tccaaaataa 600

tatagggttc tagtcttttg gaatctttca taactagatc ggtggtaata ttcttagtca 660

tacaatttat taaaaatggt ttaatatatt gtaaatattt tttaggcgtg tcagcctgta 720

aaaaacattc ttgttcaatc ttatttgtaa ggatagtatt ttgcaaatac ttatttagca 780

aaaatacgat agaatcgcgg gctatatgca ttttcatata attttttttt taaaatttaa 840

tacaaaaaaa agaagtatag actcttcttc tagtccggtt agttcgttgg ttgcctcaac 900

<210> 12

<211> 900

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 12

atggagactc agaagttgat ttccatggtt aaggaagcct tagaaaaata tcaataccct 60

cttactgcta aaaatattaa agtagtgata caaaaagagc acaatgtcgt cttacctaca 120

ggatctataa atagcatact gtacagtaac tcagaacttt ttgagaagat tgataagaca 180

aataccattt atcccccgct ttggatacgg aaaaactaat tgtaaccagt agtacattta 240

aggatagttt aagcagtaaa tgtagaataa cacagttaag caataaataa caagtatata 300

ggaatatata ggaatatata ggaatatata gaaatatata gaaatagcta agcttaatac 360

taattcagct ttttttttaa ctaaaacctg aatagatgcg aagtagcgga catatacata 420

ctaaaataag ccatacattt actttcttct tgaacatgaa accttttttt cttctgttgt 480

tggtatataa acaataggac tgtttgctga ggttgtatga tcttctacaa ctgctgtctc 540

aggatgacga tgttttttta aactaaaagt gtaggatgga atgagtggaa tatagttatg 600

gctcgactta tcctgtttcg tacaggaata ttttttacaa atagaacgca acaagcatat 660

gaataaaaac agaaatgata tacaggagca taaaatagat atgaacacta aggggtagca 720

gcttttataa cgttccgtat ttttcttagc tatcaattga tttaccgtaa tatttatctc 780

gggaaacttt gttctacaat attttgtttg gtattccaga aactcatgtc ctggcttatt 840

cccgcagctt aaaaaatgat acaaaaatgt gttattgtta ctaaaattaa ttcttcttaa 900

Claims (12)

1.通过抑制基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中I73R基因表达制备减毒非洲猪瘟病毒株或减毒非洲猪瘟病毒疫苗的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。

3.一种减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述减毒非洲猪瘟病毒株为I73R基因表达抑制，或I73R基因缺失，或I73R基因条件性敲除的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒株。

4.如权利要求3所述的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096；所述I73R基因位于ASFV CN/GS/2018分离株中第172118-172336位。

5.一种I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株为I73R上游基因的终止密码子与I73R基因起始密码子之间任一位点插入条件性敲除基因片段的基因Ⅱ型非洲猪病毒株；所述条件性敲除基因片段从5’-3’依次包含lac阻遏子基因表达元件和lac操纵子基因表达元件。

6.如权利要求5所述的I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述条件性敲除基因片段从5’-3’依次为筛选标记物基因表达元件、lac阻遏子基因表达元件和lac操纵子基因表达元件。

7.如权利要求6所述的I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述筛选标记物基因表达元件包括筛选标记物基因及其启动子；所述lac阻遏子基因表达元件包括lac阻遏子基因及其启动子；所述lac操纵子基因表达元件包括lac操纵子基因及其启动子。

8.如权利要求7所述的I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述筛选标记物基因表达元件的基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述lac阻遏子基因表达元件的基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述lac操纵子基因表达元件的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

9.如权利要求8所述的I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述条件性敲除基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

10.如权利要求5-9任一所述的I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株为ASFV CN/GS/2018分离株；所述ASFVCN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。

11.如权利要求10所述的I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述条件性敲除基因片段位于ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第172117-172118位之间。

12.一种制备权利要求10所述的I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述的方法为：

(1)将条件性敲除基因片段插入表达载体，构建pUC118-ASFV IPTG载体；

(2)设计I73R基因起始密码子上下游序列作为左右同源重组臂，通过Gibson连接的方法，分别将两个同源臂克隆入到上述pUC118-ASFV IPTG载体，所述左右同源重组臂分别位于条件性敲除基因片段5’和包含I73R基因在内的3’末端，得到了同源重组转移载体pUC118-LR-iI73R-eGFP-lacI；

(3)将同源重组转移载体pUC118-LR-iI73R-eGFP-lacI转染至感染了原始基因Ⅱ型非洲猪病毒株的BMDM细胞，筛选获得I73R基因条件性敲除的减毒非洲猪瘟病毒株。

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