CN116286686A - 双基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种双基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用。本发明在ASFV CN/GS 2018病毒中联合缺失MGF505‑7R和I267L基因，降低了亲本毒株的毒性，获得了一株减毒非洲猪瘟疫苗株；所述减毒非洲猪瘟疫苗株免疫猪后对猪完全致弱、免疫猪100％存活，且能够对ASFV CN/GS/2018强毒株攻毒提供免疫保护，可作为安全有效的防控非洲猪瘟疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值。

Description

双基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因重组的减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L的构建及其作为疫苗的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁，其中与2018年8月相比，2019年9月中国生猪产量下降了40％，猪肉价格自2019年8月以来上涨了一倍，已造成全国40％以上减产率，损失严重。当前没有商品化的有效疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，无法满足我国规模化养猪的需要。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于我国规模养猪模式下的非洲猪瘟的防治至关重要。但非洲猪瘟病毒(ASFV)结构复杂、基因组庞大，大部分功能未知，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，其流行已逾百年，目前只有越南政府批准了一种基因缺失弱毒疫苗的商业化应用，但其安全性和有消息还需要进一步的验证。
目前对于非洲猪瘟疫苗的制备主要通过三种方式：一是直接对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二是筛选出有效诱导免疫应答的病毒蛋白，进而制备亚单位疫苗和活载体疫苗；三是采用基因缺失手段，敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲猪瘟病毒编码免疫抑制、免疫耐受和抗体依赖增强作用(ADE)等蛋白，灭活疫苗免疫猪内无法提供有效的免疫保护作用；第二种方面是非洲猪瘟病毒结构复杂，目前诱导免疫应答的蛋白还未清楚，获得的抗原还不足以诱导坚强的免疫保护作用。而目前最有望突破的疫苗就是基因敲除疫苗，通过对免疫抑制、耐受、ADE等毒力相关基因的敲除，获得既具有免疫原性，又能降低致病性，免疫猪获得免疫保护作用的疫苗候选毒株。
对于猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性，又要兼顾致病性和安全性能。但是现有技术中猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗还考量如下因素：(1)敲除的毒力基因是否减少带毒、排毒，是否带来组织损伤和影响生产性能等是生物安全的一个重要指标，也是基因缺失疫苗安全性不断提升的一个重要指标；(2)不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分存在毒力和致病性残留问题；以及多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险；(3)非洲猪瘟的全基因组测序工作虽然已经完成，但是组成非洲猪瘟病毒的调控基因和结构基因高达160多个，虽然工程巨大，但对调控基因和结构基因的功能对其致病机理和疫苗研制至关重要；(4)联合敲除毒力基因的选择至关重要，不同选择配合会产生不同甚至相反的免疫保护效果。
因此，虽然毒力基因的敲除是构建非洲猪瘟减毒株的一种策略，但是在不同病毒中敲除相同的基因也会导致效果的显著差异，而且在联合敲除过程中毒力基因的选择也至关重要，并不是任意毒力基因的联合敲除均会实现减毒保护的功效。例如，①在不同种类的非洲猪瘟病毒中敲除NL基因(即DP71L基因)后获得肩部保护效果不同，其中，在E70NL基因的敲除所得非洲猪瘟病毒株的毒力完全消失；在Pr4中敲除NL基因，所得毒株Pr4-ΔN-SL在102TCID50剂量下，虽然延迟了猪死亡及发病时间，但是有接近86％的致死率；在Mal中敲除NL基因所得毒株Mal-ΔNL仍保持极高的毒力，在102TCID50剂量下的致死率为100％。DP148R基因缺失的Benin 97/1株也能够使得病毒充分致弱，免疫猪后存活率也是100％，但DP148R基因缺失中国流行株免疫株后的存活率仅仅为0％；②虽然公开了将MGF505/530家族基因与MGF360家族基因联合敲除能够产生一定的减毒保护作用，但是MGF360与MGF505/530和B119L联合敲除时，不具有减毒保护作用；而在E70△NL(敲除NL基因的E70毒株)中联合删除MGF360/505的几个成员反而会导致减毒菌株(E70△NL)的毒性增强；③目前，公开较多的是CD2v与MGF360/505家族基因的联合敲除，例如CD2v与MGF360-12L、MG F360-13L、MGF360-14L的联合敲除、MGF360/505基因全部缺失以及CD2v与MGF360/505全部基因的联合缺失；但是获得的减毒株虽然会提供一定的免疫保护效果，但是在对猪免疫后，猪血清里仍然能够检测到病毒的存在，安全性仍然存在问题；而且发明人研究发现MGF 505-7R、MGF110-9L、DP71L和DP148R基因的联合缺失，构建的重组毒，免疫保护效果较差，保护率仅只有50％。
针对上述，本发明通过联合缺失MGF505-7R和I267L基因，获得了一株安全性较好的减毒非洲猪瘟病毒株；肌肉注射高剂量所述减毒非洲猪瘟病毒株(104HAD50/头)猪仍不发病，说明该毒株肌肉注射不能够致猪发病死亡；攻毒实验表明，所述减毒非洲猪瘟病毒株能对ASFV CN/GS/2018分离的强株攻毒具有较高的免疫保护效率，因此，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种构建减毒非洲猪瘟病毒株的策略，所述策略为：联合缺失亲本毒株中MGF505-7R基因的全部核苷酸序列和I267L基因的部分核苷酸序列，从而使这两个基因编码的蛋白均无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失。
根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF505-7R和I267L基因编码的蛋白功能同时丧失，成功构建减毒非洲猪瘟病毒株，例如：移码突变、点突变、缺失或插入核苷酸序列等。
具体技术方案包括：
第一方面，本发明提供了通过在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，所述基因片段包括MGF505-7R基因的全部或部分核苷酸序列和I267L基因的全部或部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFVCN/GS 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。可以通过缺失MGF505-7R和I267L基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失，也可以仅通过缺失MGF505-7R和I267L基因的部分核苷酸序列(包括MGF505-7R和I267L基因的启动子序列)使MGF505-7R和I267L基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF505-7R和I267L基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。
优选地，所述缺失的基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。
第二方面，本发明提供了通过在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，所述基因片段包括MGF505-7R基因的全部或部分核苷酸序列和I267L基因的全部或部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。可以通过缺失MGF505-7R和I267L基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失，也可以仅通过缺失MGF505-7R和I267L基因的部分核苷酸序列(包括MGF505-7R和I267L基因的启动子序列)使MGF505-7R和I267L基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF505-7R和I267L基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。
优选地，所述缺失的基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。
第三方面，本发明提供了一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018；所述基因片段包括MGF505-7R基因的全部或部分核苷酸序列和I267L基因的全部或部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V202096。可以通过缺失MGF505-7R和I267L基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失，也可以仅通过缺失MGF505-7R和I267L基因的部分核苷酸序列(包括MGF505-7R和I267L基因的启动子序列)使MGF505-7R和I267L基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF505-7R和I267L基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。
优选地，所述缺失的基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。
第四方面，本发明提供了一种非洲猪瘟疫苗，所述非洲猪瘟疫苗包括上述第三方面所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株。
第五方面，本发明提供了一种制备上述第三方面所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，所述的方法是通过基因工程手段将原始II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018中MGF505-7R基因的全部或部分核苷酸序列和I267L基因的全部或部分核苷酸序列缺失。
优选地，所述方法为同源重组技术。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)设计MGF505-7R基因上游和下游序列各1.0kb作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂基因与eGFP基因筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40 polyA同时克隆至pUC57载体，获得重组质粒p7R-eGFP；
(2)设计I267L基因上下游序列各1.0kb作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂与mCherry基因筛选表达盒基因片段p72-mCherry-BGH polyA同时克隆至pUC57载体，获得重组质粒pI267L-mCherry；
(3)将重组质粒p7R-eGFP和pI267L-mCherry依次转染至感染ASFV原始毒株的BMDM细胞，构建得到MGF505-7R和I267L基因联合缺失的减毒非洲猪瘟病毒Δ7R/I267L。
本发明的有益效果是：本发明通过联合丧失MGF505-7R和I267L基因编码蛋白的功能，获得了一种减毒非洲猪瘟病毒株；所述的减毒非洲猪瘟病毒株毒力显著致弱，高剂量不产生发病和致死现象；用此减毒非洲猪瘟毒株免疫后，猪对亲本毒株ASFV CN/GS/2018分离株具有较好的保护作用，适于作为预防非洲猪瘟的疫苗候选株。
附图说明
图1ASFV MGF505-7R基因缺失策略示意图；
图2ASFV I267L基因缺失策略示意图；
图3减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L纯净性检测结果图；
图4减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫后动物体温变化图，其中，每条曲线代表一头动物，横坐标为免疫后天数，纵坐标为体温；
图5减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫后实验猪的存活率，横坐标为免疫后天数，纵坐标为存活率；
图6减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫后动物血液中p72抗体检测结果图，其中，每个点代表一头动物，横坐标分别为免疫后天数，纵坐标为p72抗体阻断率；
图7减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫攻毒后动物体温变化图，其中，每条曲线代表一头动物，横坐标为免疫后天数，纵坐标为体温；
图8减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫攻毒后实验猪的存活率，其中横坐标为免疫后天数，纵坐标为存活率。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：
原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的重组猪GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，更换培养基，继续诱导3-7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩繁ASFV，并进行病毒含量的滴定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。
II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为1×105HAD50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202096；保藏地址：中国武汉，武汉大学；联系电话：027-68752319。
peGFP-N1载体、pUC57和pcDNA-mCherry载体均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；无内毒素的质粒提取试剂盒，购于OMEGA公司。
实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
定义
术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中插入部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。
术语“基因缺失”是指染色体上某一区段及其带有的基因一起丢失，从而引起变异的现象。
术语“基因突变”是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因，基因突变导致后代的表现中也就突然地出现从未有的新性状。
基因缺失的方法一般是指基因敲除，是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。基因敲除的方法一般包括：同源重组技术、随机插入突变技术以及RNA干扰技术；其中，同源重组技术又叫基因打靶，是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合到预定的位置上，从而改变某些遗传特性的方法，重组的目的是为了敲除某个基因；随机插入突变技术是指利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞；RNA干扰技术是指由与生物体内源靶基因mRNA同源的双链RNA特异性引发的靶mRNA降解，导致目的基因表达沉默的一种反向遗传学技术。
本发明的目的在于通过对非洲猪瘟病毒中MGF505-7R和I267L基因的核苷酸序列进行敲除，导致MGF505-7R和I267L基因编码蛋白的功能丧失，进而构建了MGF505-7R和I267L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒，并用于非洲猪瘟疫苗的生产。
由于MGF505-7R和I267L是不相邻的两个基因，因此可以分别用两个同源重组打靶载体将p72-eGFP-SV40 polyA和p72-mCherry-BGH polyA元件置换这两个基因，从而使这两个基因编码的蛋白均无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失。
根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF505-7R和I267L基因编码蛋白的原有性能消失，实现减毒非洲猪瘟重组病毒的构建。例如：基因缺失、基因突变、碱基插入、RNA干扰技术等。
本发明虽然仅通过同源重组技术对MGF505-7R和I267L基因进行敲除，但是通过上述随机插入突变技术以及RNA干扰技术也能够对和I267L基因进行敲除。
本发明在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018中联合缺失了MGF505-7R和I267L基因，所述的MGF505-7R基因序列位于II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第40752-42335位(SEQ ID NO.1所示)；所述的I267L基因序列位于II型非洲猪瘟病毒株ASFVCN/GS 2018全长序列的第169671-170474位(其基因表达的序列位于ASFV CN/GS 2018基因组的负链，因此其序列如SEQ ID NO.2所示)；本发明在ASFV CN/GS 2018毒株中联合缺失了MGF505-7R基因的全部核苷酸序列(II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第40752-42335位)和I267L的部分核苷酸序列(II型非洲猪瘟病毒株ASF V CN/GS 2018全长序列的第169821-170380位)，导致这两个病毒蛋白功能性缺失，成功构建了MGF505-7R和I267L基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，并作为疫苗侯选株。
术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的基因缺失减毒病毒疫苗，其中所述缺失的基因为MGF505-7R和I267L；突变被理解为在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018中野生型或未修饰的MGF505-7R基因和I267L基因的遗传信息中的变化。应当理解的是，由MGF505-7R基因和I267L基因突变获得重组突变体也可以用于制备非洲猪瘟疫苗。
本发明的非洲猪瘟疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂、赋形剂、载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
本发明公开的非洲猪瘟疫苗也可被用于制备联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗、三价苗等。联合疫苗可以包含不同基因型的多种减毒非猪瘟病毒，如此可以诱导针对多种非猪瘟病毒基因型的交叉保护性免疫应答。
本发明的非洲猪瘟疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射、鼻内、口服、皮下、透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7、14、21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免使用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
实施例1减毒非洲猪瘟病毒株的构建及纯化鉴定
1.筛选表达盒构建
为了便于筛选，构建筛选标记基因的表达盒。
增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein，eGFP)基因筛选表达盒构建：参照文献(O'Donnell V.African Swine Fever Virus Georgia 2007with aDeletion of Virulen ce-Associated Gene 9GL(B119L)，when Administered at LowDoses,Leads to Virus Atten uation in Swine and Induces an EffectiveProtection against Homologous Challenge.JVirol.2015；89(16):8556-66)，通过PCR扩增p72启动子(从p72基因上游的-196nt到+17之前序列)，备用；扩增引物为：正向引物5’-TTATAAAACATATGTTCATAAAAAGGGTCGCCGGAGGA AAAGTC-3’(SEQ ID NO.7所示)和反向引物5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATATATAATG TTATAAAAATAATT-3’(SEQ ID NO.8所示)；以peGFP-N1载体为模板，扩增eGFP基因，备用，扩增引物为：正向引物5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQID NO.9所示)和反向引物5’-ACCACAACTAGAATGCAGTG-3’(SEQ ID NO.10所示)；参照文献(BorcaMV.CRISPR-Cas9,a tool to efficiently increase the development ofrecombinant African swine fever viruses.Sci Rep.2018；8(1):3154)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和eGFP两个基因通过融合PCR的方法连接，获得eGFP筛选表达盒基因片段，命名为p72-eGFP-SV40polyA，该表达盒序列含SV40polyA终止序列。
红色荧光蛋白基因mCherry筛选表达盒构建：以pcDNA3-mCherry载体为模板，扩增红色荧光蛋白mCherry基因，正向引物5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQ ID NO.11所示)和反向引物5’-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO.12所示)；参照文献(Borca MV，.CRISPR-Cas9,a tool to efficiently increase the development of recombinantAfrican swine fever viruses.Sci Rep.2018；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和mCherry两个基因通过融合PCR的方法连接，获得mCherry筛选表达盒基因片段，命名为p72-mCherry-bGHpolyA，该表达盒序列含bGHpolyA终止序列。
2.同源重组转移载体的构建
利用pUC57载体作为骨架载体，构建ASFV MGF505-7R基因敲除用同源重组转移载体，所述缺失的基因序列位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因序列的第40752-42335位。设计针对MGF505-7R基因的打靶载体时，对这个基因的编码区域进行了缺失，在MGF505-7R基因编码区域的上下游序列作为左右同源臂(Left arm，SEQ ID NO.3所示；Right arm，SEQID NO.4所示)，并分别克隆入pUC57载体中，获得MGF505-7R基因组片段的重组转移载体，然后再在该载体的左右同源臂基因序列中间插入p72-eGFP筛选表达盒基因片段，经过测序正确后，将该同源重组转移载体命名为p7R-eGFP；用无内毒素的质粒提取试剂盒提取，将DNA，测定浓度，-20℃保存备用。具体构建策略见图1。
利用pUC57载体作为骨架载体，构建ASFV I267L基因敲除的同源重组转移载体。所述缺失的基因序列位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的第169821-170380位。针对I267L基因片段的上下游序列作为左右同源臂(Left arm，SEQ ID NO.5所示，Right arm，SEQ ID NO.6所示)，并分别克隆入pUC57载体中，获得I267L基因的重组转移载体；在该重组转移载体左、右臂基因序列中间插入mCherry筛选表达盒基因片段p72-mCherry-bGHpolyA；经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为pI267L-mCherry；用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。具体构建策略见图2。
3.细胞转染和重组病毒筛选
将同源重组转移载体p7R-eGFP和
Figure BDA0004144348640000091
-Macrophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至取自2-4月龄健康猪的状态良好的骨髓巨噬细胞(BMDM)细胞，直接感染1MOI ASFVCN/GS/2018纯化病毒株，得到ASFV MGF505-7R基因缺失的ASFV重组病毒Δ7R；随后，以ASFV重组病毒Δ7R为亲本毒株，将pI267L-mCherry转染至BMDM细胞，感染ASFV重组病毒Δ7R，纯化病毒株，得到I267L基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L。
纯净性检测：选取以下引物对对各个基因的纯净性进行检测：
MGF505-7R-check-F：TTTGGGAAAATCCCGCGGAAAGAA(SEQ ID NO.13所示)；
MGF505-7R-check-R：TCCTGTAGGGAGAACATTTTCTCT(SEQ ID NO.14所示)；
I267L-check-F：AGGGTGAATGGATACGAAGTTTCA(SEQ ID NO.15所示)；
I267L-check-R：ACATGTGTGGTAAACAACATATGG(SEQ ID NO.16所示)。
同时选取病毒基因组中的p72为内参基因，确保所检测病毒基因组的质量，针对P72检测的引物分别为p72-F：CGGGGGTTTTAATCGCATTGC(SEQ ID NO.17所示)和p72-R：CGGGGGTTTTAATCGCATTGC(SEQ ID NO.18所示)。
结果如图3所示，其中WT为ASFV CN/GS 2018分离株，NC为水作为模板的阴性对照。结果表明，基因缺失减毒非洲猪瘟病毒的基因组中均已经检测不到MGF505-7R和I267L基因片段，说明MGF505-7R和I267L基因敲除成功；以上结果表明双基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株已构建成功，并且已纯化，命名为Δ7R/I267L。
综上所述，本发明通过同源重组技术成功构建了MGF505-7R和I267L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF505-7R和I267L基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。
本发明并不局限于同源重组技术，在本发明的基础上，通过其他技术手段使MGF505-7R和I267L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。
实施例2病毒滴度的测定
非洲猪瘟病毒的滴度采用半数血细胞吸附量(50％haemadsorption，HAD50)表示，HAD50实验具体操作见文献(Borca MV.Development of a highly effective Africanswine fever virus vaccine by deletion of the I177L gene results in sterileimmunity against the current epidemic Eurasia strain.JVirol.2020.pii:JVI.02017-19)，同时对其进行适当调整：在96孔板中按照约1×105/孔细胞接种原代PAM细胞，待检重组毒连续10倍梯度稀释，共7个稀释度，每个稀释度下8孔，按照100μL/孔将稀释毒加至96孔板PAM中，随即加入红细胞，共三次重复。病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的花环进行判定，连续观察6天，统计阳性孔数，计算半数血细胞吸附量(HAD50)。滴度测定合格，进行致病性评价。
实施例3基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的毒力评价
为了检测基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的毒力，本实验用104HAD50剂量经肌肉注射仔猪对其毒力进行评价。
本实验用17头非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康长白仔猪，共分为3组，其中基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫组(ASFVΔ7R/I267L)9头，基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L同居组(同居动物)3头，野生型ASFV CN/GS/2018免疫组(ASFV CN/GS/2018)5头。免疫后每天测量体温变化情况，采集外周血和唾液，参照文献(King DP.Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for thedetection of Africa n swine fever virus.J Virol Methods 107:53-61)，并通过荧光定量PCR方法测定血液中的ASFV病毒含量，检测至19天终止。统计免疫组和同居组动物的体温变化和致死率，体温变化结果如图4所示，致死率结果如图5所示，结果表明，基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L经过肌肉注射后，ASFVΔ7R/I267L组和同居动物组猪的体温均正常，未出现持续高温，且未出现死亡，存活率均为100％；而野生型ASFV CN/GS/2018经过肌肉注射后，实验猪的体温持续升高，并于免疫至第5天时出现死亡，至第8天时全部死亡，存活率为0。
血液中的ASFV p72抗体水平的检测结果如图6所示，注射基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L后，免疫组猪(ASFVΔ7R/I267L)在免疫后13天血液中p72抗体水平开始明显升高，至19天抗体水平达到较高水平；同居组猪(contact)在免疫后血液中p72抗体水平始终没有明显升高，只有1头猪的抗体水平在实验末期有略微升高。
上述实验结果表明，在亲本ASFVCN/GS/2018分离株中使ASFV MGF505-7R和I267L基因编码蛋白功能丧失后，获得的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的毒力显著致弱，安全性良好。
实施例4基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的免疫保护效果评价
为了检测基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的免疫保护效果，本实验用100HAD50剂量的亲本ASFV CN/GS 2018分离株对未免疫的对照组猪(3头)及实施例3中的经过基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫的免疫组猪(9头)进行攻毒实验。
攻毒后每天测量体温变化情况，采集外周血，观察至19天终止。其中体温变化结果如图7所示，攻毒后存活率结果如图8所示：经过基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫的免疫组猪(ASFVΔ7R/I267L免疫)在亲本ASFV CN/GS 2018分离株攻毒后均未出现发热的典型病症，且存活率达到78％(2/9)以上；而未经免疫的对照组猪(Control)在亲本ASFV CN/GS 2018分离株攻毒后体温急剧升高，并在攻毒后第8天时出现死亡，至第9天全部死亡，存活率为0。
上述结果说明，在亲本ASFV CN/GS 2018分离株攻毒后，基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L免疫组猪的体温正常，存活率较高，即，基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ7R/I267L对亲本ASFV CN/GS 2018分离株具有较高的免疫保护效果。

Claims (10)

1.通过在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，其特征在于，所述基因片段MGF505-7R基因的全部或部分核苷酸序列和I267L基因的全部或部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFVCN/GS 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。
3.通过在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF505-7R基因的全部或部分核苷酸序列和I267L基因的全部或部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因片段为基因II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。
5.一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018；所述基因片段包括MGF505-7R基因的全部或部分核苷酸序列和I267L基因的全部或部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。
6.如权利要求5所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。
7.一种非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗包括权利要求5或6所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株。
8.一种制备权利要求5或6所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段将原始II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018中MGF505-7R基因的全部或部分核苷酸序列缺失和I267L基因的全部或部分核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法为同源重组技术。
10.一种制备权利要求5或6所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)设计MGF505-7R基因上游序列和下游序列各1.0kb作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂基因与eGFP基因筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40 polyA同时克隆至pUC57载体，获得重组质粒p7R-eGFP；
(2)设计I267L基因上下游序列各1.0kb作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂与mCherry基因筛选表达盒基因片段p72-mCherry-BGH polyA同时克隆至pUC57载体，获得重组质粒pI267L-mCherry；
(3)将重组质粒p7R-eGFP和pI267L-mCherry依次转染至感染ASFV原始毒株的BMDM细胞，构建得到MGF505-7R和I267L基因联合缺失的减毒非洲猪瘟病毒Δ7R/I267L。
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