CN111593028A - 一种缺失mgf360-9l基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及缺失MGF360‑9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用。非洲猪瘟病毒的MGF360‑9L基因具有显著抑制宿主面应应答的功能，所述缺失MGF360‑9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株是采用基因工程手段，利用同源重组的方法从ASFV CN/GS/2018分离株全基因组中敲除基因MGF‑360‑9L，以此达到毒力减弱的目的。经过靶动物仔猪动物实验表明，本发明所述的MGF360‑9L单基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株具有良好的使用安全性，可作为制备非洲猪瘟疫苗的候选毒株。

Description

一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用。

背景技术

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swinefever virus, ASFV）感染引起的一种猪烈性传染病，该病发病过程短，病死率接近100%，被世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。该病于1921年首先在肯尼亚报道，并于2018年传入中国，随后非洲猪瘟在我国大面积暴发导致养猪业损失惨重，至2019年12月，已有32个省、市、自治区发生161起疫情（157起家猪、4起野猪），扑杀超过百万头猪，是我国养猪业的“头号杀手”。目前，猪存栏数锐减、肉价飞涨，对我国养猪业健康发展、猪肉稳定供应和经济稳定发展等带来严峻挑战。有效应对非洲猪瘟已经成为我国乃至国际社会面临的共同任务，也是当前农业农村主战场需求。

虽经各国科学家努力攻关，研究人员已经对 ASFV 的生物学知识已经有了较深入的了解，但在ASFV商品化疫苗方面仍未取得重大突破，截止目前还尚无有效的ASFV商品化疫苗可供使用。根据前期对于非洲猪瘟的防控经验，非洲猪瘟疫情一旦发生，想要彻底根除，一般通过扑杀手段，这样不仅导致经济损失，而且需要花费漫长的时间。而疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于非洲猪瘟的防治至关重要，因此急需开展安全有效的非洲猪瘟疫苗的创新。

天然免疫是宿主抵御病原体感染和入侵的第一道防线，在宿主抗病毒反应中发挥着重要作用。而ASFV进化出多种免疫逃逸机制拮抗天然免疫以保障自身增殖，这个过程一般是由多个毒力基因共同发挥作用的，这就导致天然ASFV灭活疫苗中存在多种毒力基因，导致疫苗的毒性作用大于预防效果，在接种疫苗后，容易导致猪的死亡。因此对于既具有免疫原性，又能降低毒性，保持猪的存活的非洲猪瘟疫苗的研发是近年来的研究热点。

减毒活疫苗具有能有效激活机体免疫系统的优点，通过敲除毒力基因获得的减毒活疫苗既能保持免疫原性，又具有较好的保护效果，是当前研究的热点。其中中国专利CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株，该弱毒株是非洲猪瘟病毒SY18分离株的四基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物和三个多基因家族基因（MGF360 12L、MGF360 13L、MGF360 14L）编码产物，接种仔猪免疫28天后，以ASFV亲本毒进行攻毒试验，结果免疫猪群均获得完全保护。但是，该弱毒株疫苗接种初期会出现短暂的体温升高，存在一定的安全风险，并且接种后获得免疫原性的周期较长，需要28天或更长。

截止目前毒力基因敲除疫苗还是存在如下问题：不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分引起的免疫副反应以及多基因缺失造成的过度致弱会使致弱毒株失去免疫原性或保护作用等问题；并且敲除的基因较多，操作复杂，成本高，还会导致敲除成功率下降。因此，对于敲除毒力基因的选择也是至关重要的，往往需要考虑到免疫副反应，又要兼顾安全性能。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒MGF-360-9L单基因缺失毒株，该毒株安全性良好，可作为制备非洲猪瘟疫苗的毒株。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，该减毒株是将非洲猪瘟病毒的MGF360-9L基因缺失后得到的。

作为本发明的优选方案，所述非洲猪瘟病毒为基因II型的非洲猪瘟病毒毒株。

作为本发明的优选方案，原始毒株（基因II型的非洲猪瘟病毒毒株）为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株。

作为本发明的优选方案，缺失的所述MGF360-9L基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

上述缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株是通过同源重组手段制备，具体包括以下步骤：

（1）eGFP筛选表达盒构建：将PCR扩增得到的p72启动子序列和以peGFP-N1载体为模板扩增得到绿色荧光蛋白基因通过融合PCR的方法连接，即得。

（2）同源重组转移载体的构建：设计MGF-360-9L基因上下游序列作为同源重组臂，分别克隆入骨架载体pUC57中，并在重组转移载体的左、右臂基因序列中间插入p72-eGFP-SV40 polyA筛选表达盒基因片段，测序确认载体的正确性。

（3）细胞转染和重组病毒筛选：同源重组转移质粒pUC57-LR ΔMGF-360-9L-eGFP转染至猪BMDM细胞中，一段时间后感染非洲猪瘟病毒原始毒株，荧光显微镜观察重组病毒感染细胞情况。细胞消化后挑选单个荧光细胞反复冻融，随后再次接种BMDM细胞，观察出现荧光的细胞孔。

优选的，所述原始毒株为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株。

（4）重组病毒的纯化和鉴定：通过有限稀释，扩大培养，纯净性检验、目的基因PCR测定，以确定获得纯化的ASFV MGF-360-9L基因缺失病毒。

本发明实施例中目的基因PCR测定显示所述减毒非洲猪瘟病毒株相较于原始毒株CN/GS/2018全长序列缺失了第24164-25216位的核苷酸。

另一方面， 本发明的提供一种上述非洲猪瘟病毒减毒株在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。

再一方面，本发明提供一种含有上述非洲猪瘟病毒减毒株的疫苗。

本发明的还提供了一种针对所述毒力基因MGF-360-9L设计的引物对，其序列如SEQ ID NO:2～3所示。

另外，本发明提供一种上述的引物对在制备鉴别上述缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株与原始毒株试剂盒中的应用。

另外，本发明的提供一种鉴别上述缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株与原始毒株的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明仅通过敲除ASFV毒力基因MGF-360-9L获得了MGF-360-9L单基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，该毒株具有良好的安全性，适于作为制备非洲猪瘟疫苗的毒株，对于非洲猪瘟的疫苗制备和防控具有重要的实际意义。

（2）MGF 360家族是ASFV致病的毒力基因之一，其本身含有约20个成员。MGF 360-9L是MGF 360家族成员之一，本发明研究发现，MGF 360-9L具有显著抑制宿主细胞天然免疫应答的功能，缺失MGF 360后ASFV致病性大幅度降低。

附图说明

图1为CN/GS/2018 ASFV MGF-360-9L基因敲除策略示意图。

图2为转染同源重组转移载体6小时后，接种AFSV CN/GS/2018毒株（MOI=1）并继续培养48小时后疑似重组病毒感染细胞的情况，标尺400μM。图A是明场下细胞的图片；图B是图A的GFP荧光图片。

图3为单个GFP阳性细胞接种96孔板中BMDM细胞72h后的荧光情况，标尺400μM。

图4为重组病毒ΔMGF-360-9L纯度鉴定结果图。WT为ASFV CN/GS/2018野毒株，Deleted代表ΔMGF-360-9L重组毒株。

图5为亲本毒株和缺失毒株感染动物后的存活情况。Re-40代表ΔMGF-360-9L重组毒株。

图6为MGF360-9L抑制HT-DNA诱导的干扰素的活性情况图。1-70表示非洲猪瘟病毒相关的蛋白，40为MGF-360-9L。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经中国农业科学院兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、中国农业科学院兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

实施例中所用材料来源：

细胞和病毒：本发明所用原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage, PAM)及原代骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage, BMDM)均分离自2～4月龄健康猪(购自中国农业科学院兰州兽医研究所动物中心)，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)去除红细胞，低速离心，弃上清，将细胞重悬于含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的重组猪GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO₂培养箱中诱导，每2～3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞瓶中，换液继续诱导，经3～7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩增ASFV，并进行病毒效价的测定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。ASFV CN/GS/2018为中国农业科学院兰州兽医研究所前期分离得到的病毒分离株，属于基因II型，病毒效价为10⁶ HAD₅₀，分装保存于-80℃备用。

实施例1 MGF360-9L基因缺失非洲猪瘟病毒的构建、纯化和鉴定

1.1 eGFP筛选表达盒构建

通过PCR扩增得到从p72启动子序列，即从p72基因上游的- 97 nt到ATG起始密码子之前序列；同时，以peGFP-N1载体为模板，扩增得到绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein, eGFP)基因。将两个基因通过融合PCR的方法连接，获得eGFP筛选表达盒基因片段，命名p72-eGFP-SV40 polyA，该表达盒序列含SV40 polyA终止序列。

1.2 同源重组转移载体的构建

利用pUC57载体作为骨架载体，构建MGF-360-9L基因敲除用同源重组转移载体。具体步骤为：设计MGF-360-9L基因上下游序列1.5 kb作为同源重组臂，分别克隆入骨架载体pUC57载体中，在MGF-360-9L的重组转移载体的左、右臂基因序列中间插入p72-eGFP-SV40 polyA筛选表达盒基因片段。经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为pUC57-LR ΔMGF-360-9L-eGFP；用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测定浓度，-20℃保存备用。重组策略如图1所示，缺失的MGF-360-9L基因是非洲猪瘟病毒全基因序列中位于24164-25216 的核酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

1.3 细胞转染和重组病毒筛选

将同源重组转移质粒pUC-LR ΔMGF-360-9L-eGFP (2μg)用6μL JetPEI®-MacrophageDNA转染试剂转染至猪BMDM细胞(细胞数约为10⁶个/孔)。转染6h后，弃掉完全培养液，用ASFV CN/GS/2018 纯化病毒株(MOI=1)直接感染BMDM细胞，感染后不换液，48h时后使用荧光显微镜观察荧光细胞数并拍照，镜下可观察到大量荧光的表达，说明疑似重组病毒成功感染细胞(图2)。细胞消化后，挑取所有单孔中的荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1小时，挑取感染孔中所有单个荧光细胞，反复冻融后，接种到预先铺好的96孔板BMDM细胞中，每12小时观察一次，观察出现荧光的细胞孔，标记后，继续观察至72h。结果显示，部分孔中荧光细胞数量比例可达100％，这说明重组病毒构建成功(图3)，将其命名为ASFV ΔMGF-360-9L。相对于非洲猪瘟分离株ASFV/CN/GS/2018的全长序列而言，该重组毒株缺失了第24164-25216 位核苷酸。

1.4 重组病毒的纯化和鉴定

对100%阳性孔进行10次有限稀释扩大培养获得重组病毒，期间用病毒基因组提取试剂盒(购自北京天根生物科技公司)提取野生ASFV和重组ASFV基因组DNA，用针对ASFV MGF-360-9L的引物（ASFV MGF-360-9L-F : 5’-TTGTCGATCGTTACGGACCC-3’；如SEQ. ID NO：2所示，ASFV MGF-360-9L-R: 5’-TTTGACTTTTCCTCCGGCGA-3’ ，如SEQ. ID NO：3所示）对其纯净度进行进行PCR鉴定，确认是否缺失成功。结果显示，重组毒的基因组中已经检测不到MGF-360-9L基因，如图4所示。该结果进一步表明重组毒已重组成功，并且已得到纯化。

实施例2病毒滴度的滴定

非洲猪瘟病毒的滴定采用半数血球吸附量(50％haemadsorption，HAD₅₀)方法进行操作。HAD₅₀试验根据文献（Borca MV, Ramirez-Medina E, Silva E, Vuono E, Rai A,Pruitt S, Holinka LG, Velazquez-Salinas L, Zhu J, GladueDP.Development of ahighly effective African swine fever virus vaccine by deletion of the I177Lgene results in sterile immunity against the current epidemic Eurasiastrain.JVirol. 2020. pii: JVI.02017-19）进行操作，并作适当调整：在96孔细胞培养板中接种原代PBMC，将待检样品进行10倍梯度稀释，每孔接种0.02ml，病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的玫瑰花环进行判定，观察7天，根据Reed and Muench方法(Reed，L .andH .Muench，A simple method of estimaing fifty percent endpoints.American Journal of Epidemiology 1938 .27：p .493-497)计算半数血球吸附剂量(HAD₅₀)。

测定结果显示非洲猪瘟病毒野生毒株HAD₅₀为10^5.5/100微升，而MGF-360-9L基因缺失的重组病毒HAD₅₀为10^4.0/100微升，结果显示MGF-360-9L基因缺失后病毒滴度下降。

实施例3动物攻毒实验

为了检测基因敲除ΔMGF-360-9L毒株的致病力，本实施例用10 HAD₅₀剂量经肌肉注射仔猪对其致病性进行评价。具体的，本实施例用10头非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康长白仔猪，共分为2组每组五头分别攻亲本毒株（非洲猪瘟病毒野生毒株）和缺失毒株，攻毒后测定每天测量体温变化情况，采集外周血和唾液，通过荧光定量PCR方法测定ASFV病毒血液含量，观察至19天终止。

结果：通过致病性评价显示，亲本毒株经过肌肉注射10 HAD₅₀后出现ASFV典型症状：高温，到后期全部死亡；而缺失毒株显示大部分动物经过5天后下降到正常体温，并存活，只有一头显示ASFV典型症状而死，见图5。总之，MGF-360-9L缺失毒株与亲本毒株的致病性有显著性差异，缺失MGF-360-9L的ΔMGF-360-9L毒株的毒力大部分致弱。

实施例4 MGF 360-9L显著抑制宿主细胞天然免疫应答

将状态良好的HEK293细胞（购于ATCC公司）用胰酶消化后铺于24孔板，放到37°C，5%CO₂细胞恒温箱培养培养10 h，待细胞密度将近70%～80% 即可进行Lipofectamine TM 2000（购于Invitrogen）转染。转染用到的质粒主要有IFN-β-Luc报告质粒（购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司）（100 ng）、内参海肾荧光素酶报告基因TK（购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司）（10 ng）以及MGF360-9L质粒(根据GenBank公布的Georgia 2007/1（FR682468.1）基因组数据，以该毒株中MGF 360-9L基因序列为参考，合成该基因并构建重组真核表达质粒pEGFP-C1(K+)-MGF 360-9L，经序列测定该基因正确插入到表达质粒中)（100 ng），转染24h后再次转染HT-DNA（购于Sigma）（1g/mL）12 h。实验中至少需要设置三个平行孔以保证实验结果的可靠性。每孔加入50 μL 1×passive lysis buffer室温裂解15～20 min，充分裂解后检测双荧光素酶报告基因活性。结果如图6所示，与其它非洲猪瘟病毒相关的蛋白相比，MGF360-9L能够显著抑制HT-DNA诱导的干扰素的活性。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用

<130> 无

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 1

ttatatatca ttaaacccat cattaatata gtgtttatgt gctatggaca ggttttttga 60

atgataatct tttaacatac gttttataac ttcgggatca gtttctttta aagataaaga 120

atcattcatg ttataacaat ttaatgataa catgctggca atgaacgagt tgtctttttg 180

atgcgctaga gtctttccct cctcaaaggc attggcgcct aagtctatac aaaagaatat 240

gtttccgata ttatagaact gaatagaatg aaacatggcc tgattgatat cagcccctaa 300

gacgacgcaa cagtaataaa tcgttaaata gttatagttc ttgcgacagg cccactttag 360

catttcattc atgtctatgc gaatcctctc cttttcgtac acttcgtgaa gttcaaacac 420

attattgtaa aaaagggcgc acataagccg ccaccgatgt agatgagcat atctctgata 480

aaaatagcaa atcgcctcct taaggttaca ttctattgcc atcgcgtacc aatatttagt 540

aaacatctcg cttaatatat cggtttctac cattaatccc tccagttgtt cataaatcat 600

tccctttact tcaaaacgat ttatggtatc taaaatggga ttattagaaa atacctcatg 660

gcagaaaatg atgttactgc tagttagatc acgtttcaat gtgtaaaaaa atcgtaaaat 720

ttcctggtca tttaactgtt ctttggcacc tagctgcctg cacaggtctc gggtgtgctc 780

cgtgttgaca gaaagcaaac cgtagttgat gtttgcaccc cactcggtga acaattctat 840

tagatcgtga ttgttttcct ccacagcttt caccaaggcc gcgttaagat ttgtgccgtt 900

cttaaaatac ggcgtccata ttttcttttg atgatacatg atagggccat tatgccacca 960

tagaccgcag cacttcaaaa aatgaggatg gcatttggcc ggatactggc tggccagcac 1020

ctttttggtg agagtctgca gagagaggac cat 1053

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

ttgtcgatcg ttacggaccc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

tttgactttt cctccggcga 20

Claims (10)

1.一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，其特征在于，该减毒株是将非洲猪瘟病毒的MGF360-9L基因缺失后得到的。

2.根据权利要求1所述的一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为基因II型的非洲猪瘟病毒毒株。

3.根据权利要求1所述的一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，其特征在于，所述基因II型的非洲猪瘟病毒毒株为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株。

4.根据权利要求2所述的一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，其特征在于，缺失的所述MGF360-9L基因序列如SEQ ID NO:1所示。

5.权利要求4所述的一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株的制备方法，其特征在于，通过同源重组方式将原始非洲猪瘟病毒中的MGF360-9L基因缺失后得到缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株。

6.根据权利要求5所述的一种缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）eGFP筛选表达盒构建：将PCR扩增得到的p72启动子序列和以peGFP-N1载体为模板扩增得到绿色荧光蛋白基因通过融合PCR的方法连接，即得；

（2）同源重组转移载体的构建：设计MGF-360-9L基因上下游序列作为同源重组臂，分别克隆入骨架载体pUC57中，并在重组转移载体的左、右臂基因序列中间插入p72-eGFP-SV40polyA筛选表达盒基因片段；

（3）细胞转染和重组病毒筛选：同源重组转移质粒pUC57-LR ΔMGF-360-9L-eGFP转染至猪BMDM细胞中，然后感染非洲猪瘟病毒原始毒株，细胞消化后挑选单个荧光细胞反复冻融，随后再次接种BMDM细胞；

（4）重组病毒的纯化和鉴定：通过有限稀释，扩大培养，纯净性检验、目的基因PCR测定，以确定获得纯化的ASFV MGF-360-9L基因缺失病毒。

7.权利要求1～4任一项所述缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。

8.含有权利要求1～4任一项所述缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株的疫苗。

9.SEQ ID NO:2～3所示的引物对在制备鉴别权利要求1～4任一项所述缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株与原始毒株试剂盒中的应用。

10.一种鉴别权利要求1～4任一项所述缺失MGF360-9L基因的非洲猪瘟病毒减毒株与原始毒株的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID NO:2～3所示的引物对。

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