CN116478939B - 表达禽脑脊髓炎病毒p1和3c基因的重组禽痘病毒及其构建方法 - Google Patents

表达禽脑脊髓炎病毒p1和3c基因的重组禽痘病毒及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒及其构建方法。本发明首先构建了AEV P1‑3C表达盒；将AEV P1‑3C表达盒插入pBlue‑FPV‑244载体，得到重组质粒FPV‑AEV；再构建eGFP表达盒；通过infusion技术，将eGFP表达盒插入到FPV‑AEV，获得FPV‑AEV‑eGFP；然后通过转染鸡胚成纤维细胞，筛选阳性克隆，得到带有eGFP筛选基因的重组禽痘病毒，最后通过cre酶剔除筛选基因，最终得到表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒，该重组禽痘病毒制备的疫苗可以诱导机体产生抗AEV的特异性抗体，对鸡，尤其是雏鸡，起到免疫保护作用。

Description

表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒及其构建 方法
技术领域
本发明属于基因工程疫苗领域，尤其是涉及一种表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒及其构建方法。
背景技术
禽脑脊髓炎（Avian Encephalomyelitis，AE）是由禽脑脊髓炎病毒（AvianEncephalomyelitis Virus，AEV）引起的一种侵害雏鸡和蛋鸡中枢神经系统，引起非化脓性脑炎的传染病。该病具有突然出现和难以预测持续期等特点，能造成雏鸡的损失和母鸡产蛋率的下降，给养鸡业带来较大的威胁，是当前世界上危害养禽业发展的主要疫病之一。目前针对禽脑脊髓炎尚无有效的治疗药物，预防主要以疫苗免疫为主。目前，国内使用的AEV灭活疫苗，工艺繁琐，免疫效果不佳，而AEV弱毒疫苗主要来自国外公司，价格昂贵，不利于AEV疫苗的推广，AEV活疫苗仅适用于12周龄以上的鸡，无法对雏鸡进行免疫进而起到早期免疫保护效果。因此，市场上亟需一种培养工艺简单，成本低廉，能够和野毒感染鉴别诊断、并且可以对雏鸡进行早期免疫的禽脑脊髓炎疫苗。
禽痘病毒（Fowlpox virus，FPV）是目前所知最大的动物病毒基因组，是基因工程活载体疫苗研制中应用极为广泛的一种工具。目前，已有禽源病原的保护性抗原基因在禽痘病毒或载体系统内得到了表达，并制备成了重组禽痘病毒疫苗，如表达新城疫病毒F基因和HN基因，表达H5亚型禽流感病毒HA基因等的重组禽痘病毒疫苗，都产生了一定的免疫效果，但未有关于禽脑脊髓炎病毒的基因在重组禽痘病毒或载体系统内得到表达的研究报道。现有技术中报道了鹅细小病毒VP3基因的重组禽痘病毒的成功开发，但禽脑脊髓炎病毒属于RNA病毒，其病毒基因组构成，有较高免疫原性的结构蛋白等都与鹅细小病毒相距甚远，从理论上，方案上都不能直接转用，而另一方面通过与禽脑脊髓炎病毒同科同属的口蹄疫病毒的研究表明，单独表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组病毒免疫效果并不理想，因此禽脑脊髓炎病毒的重组禽痘病毒疫苗的开发是否可行，还需要进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒。
本发明的目的在于提供一种表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒的构建方法。
为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒，所述重组禽痘病毒是通过将禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因以及eGFP基因的表达框插入到禽痘病毒基因组的FPV244和FPV245之间获得的。
所述禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因以及eGFP基因表达框的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
所述重组禽痘病毒的构建方法包括以下步骤：
1）通过PCR扩增得到禽脑脊髓炎病毒的P1和3C基因的cDNA片段；
2）将扩增获得的P1和3C基因cDNA片段连接，得到AEV P1-3C；
3）将禽痘病毒早晚期启动子与AEV P1-3C连接，得到AEV P1-3C表达盒；
4）将AEV P1-3C表达盒插入pBlue-FPV-244载体，得到重组质粒FPV-AEV；
5）将禽痘病毒晚期启动子与eGFP基因连接，得到eGFP表达盒；
6）通过infusion技术，将eGFP表达盒插入到FPV-AEV，获得FPV-AEV-eGFP；
7）将FPV-AEV-eGFP转染至CEF细胞，筛选阳性克隆后，用cre酶剔除筛选基因，最终得到重组禽痘病毒FPV-AEV。
进一步的，步骤2）所述禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因之间通过弗林蛋白酶切位点序列和I型猪捷申病毒2A自切位点序列（Furin-P2A）连接。其中I型猪捷申病毒2A蛋白序列在翻译过程中可以自我切割，使AEV前体蛋白P1和3C蛋白独立分开，2A残余部分氨基酸序列连接在AEV前体蛋白VP1羧基端，通过弗林蛋白酶酶切位点序列被细胞内的弗林蛋白酶识别，完成进一步切割，残余的2A氨基酸序列会从VP1羧基端切割下来。
进一步的，步骤3）所述禽痘病毒早晚期启动子为LP2EP2。
进一步的，步骤5）所述禽痘病毒晚期启动子为P11。
进一步的，步骤5）所述eGFP基因表达框两侧均含有LOXP序列。
一种表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒在疫苗中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明将AEV的P1即VP4-VP2-VP3-VP1前体蛋白和3C基因表达框架插入FPV弱毒活疫苗株基因组中，构建了表达AEV VP4-VP2-VP3-VP1前体蛋白和3C蛋白的重组病毒。在3C蛋白酶作用下，表达的VP4-VP2-VP3-VP1前体蛋白能够裂解为VP0（VP4和VP2）、VP3、VP1三种AEV结构蛋白，并组装为病毒样颗粒，从而有助于表达的VP1蛋白形成正确的空间结构，提高其免疫原性。
本发明中AEV前体蛋白中大部分蛋白都是被3C蛋白完成其自身的裂解过程。病毒结构蛋白前体P1只有经3C蛋白酶裂解，才能形成独立的VP1、VP3和VP0蛋白（VP4和VP2），然后这些结构蛋白紧密结合在一起，形成病毒空衣壳，进而形成成熟的病毒样颗粒。而如果按照其他病毒的前体蛋白P1-P2-P3相连接的结构，禽痘病毒的P1与3C是一个整体，将不具备生物活性，3C也无法切割P1，也无法形成独立的VP1、VP3和VP0蛋白，因此本发明采用弗林蛋白酶切位点序列和I型猪捷申病毒2A自切位点序列（Furin-P2A）将P1与3C连接，使P1与3C在内部断裂后，再连接在一起，有助于释放3C蛋白的活性，提升免疫原性。采用禽痘病毒基因早晚期启动子LP2EP2启动AEV的VP4-VP2-VP3-VP1前体蛋白和3C基因的转录，使其可以在禽痘病毒中得到高效的表达。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为重组质粒FPV-AEV-eGFP的构建示意图；
图2为PCR扩增的鉴定结果图；其中1为A P1 F2和A3C R引物扩增结果；2为A P1 F2和A P1 R引物扩增结果；3为A 3C F和A 3C R引物扩增结果；
图3为重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果图，其中A为CEF对照；B为亲本FPV对照；C为重组禽痘病毒FPV-AEV；
图4为疫苗免疫后ELISA抗体变化情况图。
具体实施方式
以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
禽痘病毒弱毒株购自瑞普（保定）生物药业有限公司，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，酶和载体等试剂购自自生工生物工程（上海）股份有限公司。
实施例1禽痘病毒效价测定
取500微升稀释度为10-3、10-4、10-5的禽痘病毒弱毒株株病毒液接种CEF细胞数为1.3×106的六孔板中，且每一个稀释度做2个重复，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养5d后记录出现的蚀斑数量，计算每个稀释度的2个重复的蚀斑平均值，根据蚀斑数量换算病毒液中病毒蚀斑形成单位（PFU）。结果显示禽痘病毒弱毒株的效价为4.75×106PFU/ml。
实施例2. 表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒的构建
表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒的构建的思路是，首先将AEVVP4-VP2-VP3-VP1/3C表达盒和eGFP表达盒连接在一起，插入到FPV244/FPV245插入位点。第一步同源重组是将带有eGFP的转移质粒与FPV亲本病毒发生同源重组，筛选eGFP阳性病毒；第二轮筛选，是利用eGFP表达盒的两端含有LOXP位点，用cre酶剔除LOXP位点之间的序列，筛选得到无eGFP的PFV蚀斑病毒。具体的构建过程如下：
1. 重组禽痘病毒的构建
根据GenBank中登录的AEV 1143株基因序列（登录号：AJ225173.1）合成完整的AEV多聚蛋白。然后，以A P1 F1和A 2B R、A 3C F和A 3C R为引物，以完整的AEV多聚蛋白为模板，分别PCR扩增得到2B-1、3C片段；然后，以2B-1为模板，A P1 F2和A P1 R为引物，PCR扩增获得P1片段，同时通过合成的长引物A P1 F2在P1片段的左侧引入禽痘病毒LP2EP2早晚期启动子；为了在P1和3C之间引入Furin-P2A序列，我们在扩增3C片段时，通过A 3C F引物引入Furin-P2A右半部分序列；在扩增P1片段时，通过A P1 R引物引入Furin-P2A左半部分序列，两段序列之间重叠部分碱基序列，然后我们通过infusion同源重组的方式，将AEV P1-3C插入经Srf I酶切处理的pBlue-FPV-244载体，获得表达AEV P1和3C基因的表达盒，构建的中间质粒命名为FPV-AEV；为了获得eGFP筛选基因，我们以pSC11质粒为模板，promoter-F和promoter-R为引物，PCR扩增获得P11启动子序列；以eGFP基因为模板，FPV-eGFP F和FPV-eGFP R为引物，PCR扩增得到eGFP片段，通过融合PCR将痘病毒P11启动子序列和eGFP片段连接，得到eGFP表达盒，将eGFP表达盒通过infusion连接插入经Srf I酶切处理的FPV-AEV载体，获得含有筛选基因eGFP基因的共表达AEV VP4-VP2-VP3-VP1前体蛋白和3C基因的最终重组质粒FPV-AEV-eGFP，禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因以及eGFP基因表达框的基因序列如SEQ ID NO.1所示，构建示意图如图1所示，上述引物序列见表1。
表1：FPV-AEV-eGFP构建所用引物
2.重组禽痘病毒的转染与纯化
重组禽痘病毒的构建的具体方法如下：转染按脂质体LipofectamineTM3000转染试剂的说明进行。在六孔板中培养CEF细胞至形成单层，以0.1 MOI的CVCC AV1003疫苗株感染CEF细胞，37℃培养3~4h，后以重组质粒FPV-AEV-eGFP转染已感染禽痘病毒（FPV）的CEF细胞，质粒转染量为2.5μg，重组质粒FPV-AEV-eGFP与FPV基因组DNA之间通过同源臂发生同源重组，使AEV VP4-VP2-VP3-VP1前体蛋白和3C基因插入禽痘病毒的基因组中从而获得重组病毒。该重组禽痘病毒含有eGFP基因，转染72h后用倒置荧光显微镜观察到绿色荧光，结果表明FPV-AEV-eGFP质粒已在CEF细胞中表达。挑取带有绿色荧光的蚀斑，经过多次筛选和纯化获得较纯的重组病毒，直到纯化的重组病毒产生的蚀斑在倒置荧光显微镜下全部带有绿色荧光，获得的重组病毒命名为FPV-AEV-eGFP。为了剔除eGFP基因，将FPV-AEV-eGFP接种CEF扩大培养，然后将重组病毒FPV-AEV-eGFP按照0.1 MOI接种CEF细胞，2-4h后，转染cre表达质粒pCDNA3.1-cre，转染按脂质体LipofectamineTM3000转染试剂的说明进行，质粒转染量为2.5μg，由于eGFP两端含有LOXP位点，会在cre酶的作用下发生同源重组。转染72h后，在荧光显微镜下观察，标注不带绿色荧光的蚀斑，然后消化下来，继续接种鸡胚成纤维细胞，在荧光显微镜下观察，继续挑取不带绿色荧光的蚀斑，直至所有的视野均无荧光为止，这样的到的重组病毒就是不带荧光的重组病毒，将重组毒命名为FPV-AEV。
3. 重组禽痘病毒的鉴定
将蚀斑纯化的重组禽痘病毒以0.5 MOI感染接种CEF，待细胞出现病变时收集病毒并使用酚仿法抽提DNA，以病毒DNA为模板，用引物A P1 F2和A P1 R、A 3C F和A 3C R、A P1F2和A3C R进行PCR扩增，同时设置未重组的禽痘病毒作为对照。重组禽痘病毒通过PCR扩增，可扩增出大小为2400bp的P1基因片段、730bp的3C基因片段和3200bp的P1-3C片段，表明FPV-AEV-eGFP质粒和禽痘病毒重组成功（参见图2）。
4. 间接免疫荧光检测目的基因的表达
将未重组的禽痘病毒和纯化的重组禽痘病毒分别以0.5MOI感染CEF细胞，待感染后的CEF出现病变时，用禽脑脊髓炎的阳性血清作为一抗，Alexa Fluor-488标记的羊抗鸡的荧光二抗做间接免疫荧光试验检测目的基因的表达。接种重组禽痘病毒的CEF细胞病变区域发出较亮的绿色荧光，接种未重组禽痘病毒的CEF细胞没有检测出绿色荧光，说明目的基因在重组禽痘病毒中很好的表达（参见图3）。
实施例3.重组禽痘病毒载体疫苗FPV-AEV的免疫攻毒试验。
取2周龄SPF鸡45只，疫苗免疫组15只，翅内侧无血管处皮下刺种，接种剂量为2000FPU；禽痘病毒对照组15只，翅内侧无血管处皮下此种，接种剂量为2000PFU；空白对照组15只。免疫3周后，用禽脑脊髓炎强毒株VR株，经脑内接种，接种剂量为10000 EID50。接种后，逐日观察，所有鸡的临床症状和死亡情况。并且，在接种后定期采集鸡血，用商品化的禽脑脊髓炎病毒抗体检测试剂盒检测免疫后抗体变化规律，试验结果表明，空白对照组在整个免疫期间，用AEV抗体检测试剂盒检测，没有检测到AEV抗体；FPV对照组鸡在免疫期间也未检测到抗体，但在攻毒后1周，略微检测到AEV ELISA抗体；FPV-AEV免疫组，在免疫后1周即可检测到AEV ELISA抗体，并且抗体水平逐渐升高，3周后攻毒，抗体水平进一步提升（参见图4）。从整个攻毒后的临床症状观察，禽脑脊髓炎典型的临床症状为神经症状，如共济失调，站立困难，也有发病鸡表现为精神沉郁，对外界反应迟缓等。试验结果详见表2，结果表明，空白组鸡，未接种AEV强毒，没有任何临床症状；亲本疫苗对照组接种AEV强毒后，绝大部分鸡出现AEV强毒接种后的临床症状，如共济失调，站立困难，也有鸡表现为精神沉郁、厌食等；而FPV-AEV疫苗免疫组绝大多数鸡没有任何临床症状。以上研究结果说明，我们所构建的表达AEV VP4-VP2-VP3-VP1/3C重组蛋白空衣壳颗粒疫苗FPV-AEV在临床保护AEV强毒感染方面具有良好的保护效果。
表2：FPV-AEV免疫攻毒保护试验结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒，其特征在于，所述重组禽痘病毒是通过将禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因以及eGFP基因的表达框插入到禽痘病毒基因组的FPV244和FPV245之间获得的；
所述禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因以及eGFP基因表达框的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
所述禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因之间通过弗林蛋白酶切位点序列和I型猪捷申病毒2A自切位点序列（Furin-P2A）连接;
所述重组禽痘病毒的构建方法包括以下步骤：
1）通过PCR扩增得到禽脑脊髓炎病毒的P1和3C基因的cDNA片段；
2）将扩增获得的P1和3C基因cDNA片段连接，得到AEV P1-3C；
3）将禽痘病毒早晚期启动子与AEV P1-3C连接，得到AEV P1-3C表达盒；
4）将AEV P1-3C表达盒插入pBlue-FPV-244载体，得到重组质粒FPV-AEV；
5）将禽痘病毒晚期启动子与eGFP基因连接，得到eGFP表达盒；
6）通过infusion技术，将eGFP表达盒插入到FPV-AEV，获得FPV-AEV-eGFP；
7）将FPV-AEV-eGFP转染CEF细胞，筛选阳性克隆后，用cre酶剔除筛选基因，最终得到重组禽痘病毒FPV-AEV。
2.根据权利要求1所述的表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒，其特征在于，步骤3）所述禽痘病毒早晚期启动子为LP2EP2。
3.根据权利要求1所述的表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒，其特征在于，步骤5）所述禽痘病毒晚期启动子为P11。
4.根据权利要求1所述的表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒，其特征在于，步骤5）所述eGFP基因表达框两侧均含有LOXP序列。
5.一种如权利要求1所述表达禽脑脊髓炎病毒P1和3C基因的重组禽痘病毒在制备疫苗中的应用。
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EP1059357A1 (en) * 1999-06-09 2000-12-13 Universite Pierre Et Marie Curie Paris Vi Replicating or semi-replicating retroviral constructs, preparation and uses for gene delivery
CN110257345A (zh) * 2019-07-18 2019-09-20 河南农业大学 一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

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Title
共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性;金宁一, 张洪勇, 尹革芬, 郑敏, 刘彤, 江文正, 李子健;科学通报(第06期);摘要 *

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