CN113388587A - 表达牛病毒性腹泻e2基因的重组牛结节疹病毒及其应用 - Google Patents

表达牛病毒性腹泻e2基因的重组牛结节疹病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达牛病毒性腹泻E2基因的重组牛结节疹病毒及其应用。本发明提供的重组牛结节疹病毒，含有如SEQ ID NO.1所示的牛病毒性腹泻E2基因，该重组病毒既保留了牛结节疹病毒的抗原，又表达有牛病毒性腹泻E2抗原，可直接作为活疫苗进行接种，无需灭活和佐剂乳化等工艺，对牛结节疹病毒和牛病毒性腹泻病毒具有良好的免疫原性，能够同时实现对牛病毒性腹泻或牛结节性皮肤病的预防，可通过商品化的鉴别诊断试剂盒鉴别诊断疫苗免疫和野毒感染，为疫病的进化提供物质保障。

Description

表达牛病毒性腹泻E2基因的重组牛结节疹病毒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达牛病毒性腹泻E2基因的重组牛结节疹病毒及其应用。
背景技术
牛病毒性腹泻(粘膜病)，是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起牛的以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的疾病。该病症传染性极强，不仅可感染牛，也可感染山羊和绵羊等反刍动物。母畜在受精时或胚胎发育时期内感染牛病毒性腹泻病，均可导致胚胎出现死亡或出现畸形胎。而产奶期若出现感染，则会导致产奶量下降，进一步降低乳制品的质量，甚至可能引起人畜交叉传染，对于养殖者的经济和生命都会造成一定威胁。
结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)又称牛结节疹，牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科的结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus，LSDV)引起的一种急性、亚急性或慢性传染病。感染该疾病的牛会发生消瘦，牛奶产量下降，皮张鞣制后具有凹陷或孔洞而导致其利用价值大大降低，造成极大的经济损失。
目前，对于上述两种疾病以疫苗预防为主，对于预防结节性皮肤病疫苗的常规制备方法为：将牛结节性皮肤病病毒接种到羊睾丸细胞上，依次经过培养、提取、灭活、添加佐剂等步骤后制备得到疫苗。
对于预防牛病毒性腹泻疫苗的常规制备方法主要包括两种：一种是将牛病毒性腹泻病毒接种到DMBK细胞上，依次经过培养、提取、灭活、添加佐剂等步骤后制备得到疫苗；另外一种是利用CHO细胞直接表达牛病毒性腹泻E2蛋白，依次经过提取纯化、添加佐剂等步骤后制备得到疫苗。
但是上述两种疫苗的制备的方法中都需要经过灭活和添加佐剂乳化的步骤，而且采用上述疫苗对牛进行免疫后只能实现对牛病毒性腹泻或结节性皮肤病其中一个的预防，即单个疫苗无法实现对以上两种疾病的同时预防。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种重组牛结节疹病毒，该重组牛结节疹病毒含有牛病毒性腹泻病毒E2基因，既表达有牛结节疹病毒的抗原，又表达有牛病毒性腹泻E2基因的抗原，可直接作为活疫苗进行接种，无需灭活和佐剂乳化等工艺。
本发明的第二目的在于提供一种重组牛结节疹病毒的制备方法，该制备方法简单，成本低。
本发明的第三目的在于提供一种重组牛结节疹病毒的培养方法。
本发明的第四目的在于提供一种重组牛结节疹病毒的应用。
本发明的第五目的在于提供一种预防牛结节疹和牛病毒性腹泻的疫苗，该疫苗对于牛结节疹病毒和牛病毒性腹泻病毒具有良好的免疫原性，能够同时实现对牛病毒性腹泻和结节性皮肤病的预防。
本发明的第六目的在于提供一种疫苗的制备方法，该制备方法简单快捷，无需灭活和添加佐剂。
第一方面，本发明提供了一种重组牛结节疹病毒，所述重组牛结节疹病毒为含有牛病毒性腹泻E2基因的牛结节疹病毒；所述牛病毒性腹泻E2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
作为进一步技术方案，所述牛病毒性腹泻E2基因插入在牛结节疹病毒的TK基因中，片段连接方式为TK2-第一启动子-E2-TK1；
优选地，所述第一启动子包括p7.5或p11；
优选地，片段TK2-第一启动子-E2-TK1为TK2-p7.5-E2-TK1，p7.5-E2-TK1核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为进一步技术方案，所述牛结节疹病毒的TK基因中还插入有标记基因，片段链接方式为TK1-E2-第一启动子-第二启动子-标记基因-TK2；
优选地，所述第二启动子包括p7.5或p11；优选地，标记基因包括EGFP、gpt或LacZ；
优选地，所述第二启动子为p11，标记基因为EGFP，P11-EGFP-TK2核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为进一步技术方案，片段TK1-E2-第一启动子-第二启动子-标记基因-TK2为TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2；
p7.5-E2-TK1核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
P11-EGFP-TK2核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本发明提供了一种重组牛结节疹病毒的制备方法，将含有SEQ ID NO.1的转移载体质粒导入感染牛结节疹病毒的细胞中，培养筛选得到所述重组牛结节疹病毒。
作为进一步技术方案，所述转移载体质粒的功能性片段为TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2，p7.5-E2-TK1核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P11-EGFP-TK2核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，转移载体质粒为pSP72或pBluescript II SK(-)；
优选地，细胞为羊睾丸细胞。
第三方面，本发明提供了一种重组牛结节疹病毒的培养方法，利用VERO细胞悬浮培养。
第四方面，本发明提供了一种重组牛结节疹病毒在制备预防牛结节疹和牛病毒性腹泻的疫苗中的应用。
第五方面，本发明提供了一种预防牛结节疹和牛病毒性腹泻二联疫苗，活性成分为重组牛结节疹病毒。
第六方面，本发明提供了一种疫苗的制备方法，将重组牛结节疹病毒稀释得到所述疫苗；
优选地，采用生理盐水进行稀释。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的重组牛结节疹病毒，含有如SEQ ID NO.1所示的牛病毒性腹泻E2基因，该重组病毒既保留了牛结节疹病毒的抗原，又表达有牛病毒性腹泻E2抗原，可直接作为活疫苗进行接种，无需灭活和佐剂乳化等工艺，对牛结节疹病毒和牛病毒性腹泻病毒具有良好的免疫原性，能够同时实现对牛病毒性腹泻或牛结节性皮肤病的预防。本发明提供的重组牛结节疹病毒的培养方法，将重组牛结节疹病毒在VERO细胞中悬浮培养，简化了重组牛结节疹病毒的制备工艺，避免了原代细胞培养的不足，降低了生产成本。本发明提供的重组牛结节疹病毒制备得到的活疫苗与常规全病毒灭活疫苗相比，不仅安全性好、成本低，而且免疫效力明显高于单苗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pSP72-p7.5-TK1、pSP72-P11-TK2的酶切鉴定结果；
图2为pSP72-p7.5-E2-TK1、pSP72-P11-EGFP-TK2的酶切鉴定结果；
图3为pB-TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2的酶切鉴定。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种重组牛结节疹病毒，该重组牛结节疹病毒的基因组中插入有牛病毒性腹泻E2基因，牛病毒性腹泻E2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
牛病毒性腹泻E2蛋白是刺激宿主免疫应答的主要抗原蛋白之一，能诱导宿主产生高水平的体液免疫反应和细胞免疫反应，据此，在本发明中，以牛病毒性腹泻E2基因作为重组牛结节疹病毒的外源基因。
本发明提供的重组牛结节疹病毒由于含有可表达的牛病毒性腹泻E2基因，因此该重组病毒既表达有牛结节疹病毒的抗原，又表达有牛病毒性腹泻E2基因抗原，可在不经过灭活和添加佐剂的前提下直接作为活疫苗进行接种，能够同时实现对牛病毒性腹泻或牛结节性皮肤病的预防，可通过商品化的鉴别诊断试剂盒鉴别诊断疫苗免疫和野毒感染，为疫病的进化提供物质保障。
牛病毒性腹泻E2基因的核苷酸序列如下所示：
CAATAGCGGCCGCTATGCACCTCGACTGTAAGCCAGAGTACCAGTACGCTATCGCAAAGGATGAGCGCATCGGTCCGCTGGGGGCTGAGGGGCTGACTACCACCTGGAAATCATATAGCCATGAAATGACGCTCGAGGACACAATGGTCGTGGCTTGGTGTAAGGACGGAAAATTCACCTACCTTCAGAGGTGTACCCGCGAAACTAGATACCTGGCCACACTCCACGCAAGAGCTCTGCCTACTTCAGTGGTCTTTAAGAAATTGTTCGGCTGGCGCAGACAGGAGGACGTGGTCGAGATGGATGATAATTTTGAATTTGGCCTGTGTCCATGCGACGCTAAGCCCATTGTCCGGGGAAAGTTCAACACCACCCTTCTCAACGGTCCAGCCTTTCAGCTGGTGTGCCCTATCGGCTGGACAGGCACCGTGTCATGCATGCTGGCCAACCGGGACACTCTGTCTACAACAGTCGTCCGAATTTACCGGAGATCCGTGCCTTTCCCCTACAGGCAGGGATGCATTACTCAGCGGACGCTTGGCGAAGACCTTTATAATTGCGATCTCGGAGGCAACTGGACATGCGTTACCGGAGAGATGCTGCGATACACAGGCGGTTCCATTGAATCCTGCAAGTGGTGCGGATACAAGTTTCAGAAGAGCGAGGGGTTGCCACACTACCCCATCGGCAAGTGTAGACTGGAAAACGAGACCGGTTACAGGCTCCTGGACGACACCTCTTGCAACCGGGAGGGCGTGGCTATCGTCCCGCATGGCACAATCAAGTGTAGAATCGGGGACACAATTGTGCAGGTCCTGGCTATGGACAACAAGCTGGGCCCCATGCCATGTAAGCCGTATGAGATAATCCCTAGCGAGGGACCAGTTGAAAAGACTGCCTGCACTTTCAATTATACCCGAACTCTGAGAAACAAATACTTTGAGCCTCGCGATAGTTATTTTCAGCAATACATGCTGAAAGGCGAATATCAGTACTGGTTCGACTTGGAGGTCACCGACCATCATAGAGACTACTTTGCCGAGTCAATCCTTGTCGTGGTGGTGGCTTTGCTGGGGGGACGGTACGTGCTCTGGCTGCTCGTTACGTATATGGTCCTGTCAGAGCAGAAGGCGCTGGGGACTCAGTACGGGGCGACTAGTATCAT(SEQ ID NO.1)。
在一些优选的实施方式中，以牛结节疹病毒的TK基因为外源基因的插入位点，将牛病毒性腹泻E2基因插入在牛结节疹病毒的TK基因中，在不影响牛结节疹病毒的抗原表达的同时，使得重组牛结节疹病毒表达牛病毒性腹泻E2抗原。插入后，牛病毒性腹泻E2基因与牛结节疹病毒的TK基因的连接方式为TK2-第一启动子-E2-TK1，其中，第一启动子包括p7.5或p11，当第一启动子为p7.5时，片段TK2-第一启动子-E2-TK1为TK2-p7.5-E2-TK1，p7.5-E2-TK1核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
需要说明的是，TK1和TK2分别代表由牛病毒性腹泻E2基因分开的两个牛结节疹病毒TK基因的两个片段。
p7.5-E2-TK1核酸片段的核苷酸序列如下所示：
CTAGTAAGCTCATCTATATACTATATAGTAATACCAATACTCAAGACTACGAAACTGATACAATCTCTTATCATGTGGGTAATGTTCTCGATGTCGATAGCCATATGCCCGGTAGTTGCGATATACATAAACTGATCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGAATCATAAAGAACAGTGACGGATCCCCGGCGGCCGCTATGCACCTCGACTGTAAGCCAGAGTACCAGTACGCTATCGCAAAGGATGAGCGCATCGGTCCGCTGGGGGCTGAGGGGCTGACTACCACCTGGAAATCATATAGCCATGAAATGACGCTCGAGGACACAATGGTCGTGGCTTGGTGTAAGGACGGAAAATTCACCTACCTTCAGAGGTGTACCCGCGAAACTAGATACCTGGCCACACTCCACGCAAGAGCTCTGCCTACTTCAGTGGTCTTTAAGAAATTGTTCGGCTGGCGCAGACAGGAGGACGTGGTCGAGATGGATGATAATTTTGAATTTGGCCTGTGTCCATGCGACGCTAAGCCCATTGTCCGGGGAAAGTTCAACACCACCCTTCTCAACGGTCCAGCCTTTCAGCTGGTGTGCCCTATCGGCTGGACAGGCACCGTGTCATGCATGCTGGCCAACCGGGACACTCTGTCTACAACAGTCGTCCGAATTTACCGGAGATCCGTGCCTTTCCCCTACAGGCAGGGATGCATTACTCAGCGGACGCTTGGCGAAGACCTTTATAATTGCGATCTCGGAGGCAACTGGACATGCGTTACCGGAGAGATGCTGCGATACACAGGCGGTTCCATTGAATCCTGCAAGTGGTGCGGATACAAGTTTCAGAAGAGCGAGGGGTTGCCACACTACCCCATCGGCAAGTGTAGACTGGAAAACGAGACCGGTTACAGGCTCCTGGACGACACCTCTTGCAACCGGGAGGGCGTGGCTATCGTCCCGCATGGCACAATCAAGTGTAGAATCGGGGACACAATTGTGCAGGTCCTGGCTATGGACAACAAGCTGGGCCCCATGCCATGTAAGCCGTATGAGATAATCCCTAGCGAGGGACCAGTTGAAAAGACTGCCTGCACTTTCAATTATACCCGAACTCTGAGAAACAAATACTTTGAGCCTCGCGATAGTTATTTTCAGCAATACATGCTGAAAGGCGAATATCAGTACTGGTTCGACTTGGAGGTCACCGACCATCATAGAGACTACTTTGCCGAGTCAATCCTTGTCGTGGTGGTGGCTTTGCTGGGGGGACGGTACGTGCTCTGGCTGCTCGTTACGTATATGGTCCTGTCAGAGCAGAAGGCGCTGGGGACTCAGTACGGGGCGA CTAGTATGGACTACGGGTATATCCACCTCATCATTGGTCCAATGTTCTCAGGTAAAAGCACAGAACTCATAAGGATTGTGAAGCGGTATCAGATCGCACAGTATAAATGCTGCGTGGTGAAATATCTGAAGGATATCCGGTACGGAAATTCTGTATATACCCACGATAACAACCATGTAAGCGCCATCAGCACCACTCTGCTGTATGATGTCGTCGACAAGATCATGACCGCGG(SEQ ID NO.2)。
在一些优选的实施方式中，牛结节疹病毒的TK基因中还插入有标记基因，片段链接方式为TK1-E2-第一启动子-第二启动子-标记基因-TK2；
在本发明中，通过在牛结节疹病毒的TK基因中同时插入牛病毒性腹泻E2基因和标记基因，根据标记基因的特性，实现对含有牛病毒性腹泻E2基因的重组牛结节疹病毒的筛选。
优选地，所述第二启动子包括但不限于p7.5或p11，或者本领域技术人员所熟知的启动子，优选为于p11；
优选地，标记基因包括但不限于EGFP、gpt或LacZ等，优选为EGFP；
当第二启动为p11、标记基因为EGFP时，P11-EGFP-TK2核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
P11-EGFP-TK2核酸片段的核苷酸序列如下：
AGATGCATCGATAGCGATGCTACGCTAGTCACAATCACCACTTTCATATTTAGAATATATGTATGTAAAAATATAGTAgAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATAGATCTATGTCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGGTAGATTTATGCATCCTCTTGTCATGAGAAGTCGAATTGTTCCCATTCTGTGTGTTGCAGCTACAGATGGAGATACATAGAGATACTCGTGGATTTTGCTTAGTGTTGAGTTTTGTTCTGGTTGTGAACTAAAAGTTTATACATTTGCAGGAAATAAATAGCCTTTTGTTTAAATCAAAAGGTCTTACCTATGTTATTGCGTGAGGCATTGGATCCCAAAGAGAGAACTCCAAAATGCGAGGCTACATGTTATGGACTAGTATCAGGTTGGGAGACCTCCTGAGAAGCTCCAGCAAGTAAGCCTCGATCACGCAAAATGTTTGAGGTCTGATGTTCAATAGCTTGTTTTGTTTCACTTTGCTTTGGACTTTCTTTTCGCCAATGAGCTATGTTTCTGATGGTTTTCACTCTTTTGGTGTGTAGAGAACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAGAATTCAGTAAATGGAGTGCTACAAAGACGCCGCTTTTAGCAAACGGATAACAAAAGAAAAGGAGATCGAGTTGATCGGCGGTAAAGAGAAATATAAATCTGTGTGTCGCAAGTGCTATTTCCTGGAAGGGCCCACTGCT(SEQ ID NO.3)。
在一些优选的实施方式中，片段TK1-E2-第一启动子-第二启动子-标记基因-TK2为TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2；
p7.5-E2-TK1核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
P11-EGFP-TK2核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种重组牛结节疹病毒的制备方法，将含有SEQ ID NO.1的转移载体质粒导入感染牛结节疹病毒的细胞中，培养筛选得到所述重组牛结节疹病毒。本发明提供的重组牛结节疹病毒的制备方法，根据同源重组原理，将转移载体质粒与牛结节疹病毒在宿主细胞中实现同源重组，将牛病毒性腹泻E2基因插入在牛结节疹病毒的基因组中，实现了牛病毒性腹泻E2基因在牛结节疹病毒中表达，同时不影响牛结节疹病毒的抗原表达，本发明的重组牛结节疹病毒的制备方法简单方便，成本低廉。
在一些优选的实施方式中，转移载体质粒的功能性片段为TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2，p7.5-E2-TK1核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P11-EGFP-TK2核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。其中，转移载体质粒可以为pSP72或pBluescript IISK(-)，细胞可以为羊睾丸细胞。
本发明还提供一种重组牛结节疹病毒的培养方法，利用VERO细胞悬浮培养，由贴壁培养驯化为悬浮培养。
一种可行的VERO细胞悬浮培养方法例如可以为：将VERO细胞复苏，于培养基(含8％的血清)中传代培养2～3代，当VERO细胞生长平稳后逐渐减少培养基中的血清添加量(每经过一次传代培养，培养基中的血清含量减少2％～3％)，当培养基中的血清含量下降至5％后，向培养基中添加1.5％～3％的植物水解蛋白和1.5％～3％的酵母提取物，期间如果发现VERO细胞生长缓慢，则在原血清含量的培养基中继续培养，直到培养基中的血清含量下降至1％，待VERO细胞增殖平稳后，继续培养1～2代后，将其以1.0×106cells/mL的接种密度转入摇瓶中进行悬浮培养，倍增后传代(约68h)。摇瓶中悬浮培养的培养条件为：温度37℃、含5.0％CO2，湿度＞60％，转速80r/min～120r/min。摇瓶中悬浮培养的培养基含有：1％的酵母提取物、1％的植物水解蛋白、1mmol/L的L－谷氨酰胺、1.5mmol/L的L－谷氨酸、0.05mmol/L的L－亮氨酸、1.5mmol/L的L－甲硫氨酸、1.5mg/L的维生素B6、1.0mg/L的维生素B12、0.15mg/L的烟酰胺、1.5mg/L的硫酸镁。VERO细胞生长平稳后，部分进行冷冻储存，部分接种重组病毒获得抗原。
本发明提供了一种重组牛结节疹病毒在制备预防牛结节疹和牛病毒性腹泻的疫苗中的应用。
由于本发明提供的重组牛结节疹病毒含有牛病毒性腹泻病毒E2基因，既具有牛结节疹病毒的抗原，又有牛病毒性腹泻E2基因的抗原，对牛结节疹病毒和牛病毒性腹泻病毒均具有良好的免疫原性，因此能够用于制备预防牛结节疹和牛病毒性腹泻的疫苗。
本发明提供了一种预防牛结节疹和牛病毒性腹泻的疫苗，活性成分为重组牛结节疹病毒。
本发明提供的预防牛结节疹和牛病毒性腹泻的疫苗，该疫苗对牛结节疹病毒和牛病毒性腹泻病毒均具有良好的免疫原性，能够同时预防以上两种病毒的感染。与常规全病毒灭活疫苗相比，本发明提供的预防牛结节疹和牛病毒性腹泻的疫苗不仅生产成本低，而且在生产应用中能够产生良好的体液免疫和细胞免疫。
本发明提供了一种预防牛结节疹和牛病毒性腹泻疫苗的制备方法，将重组牛结节疹病毒稀释得到疫苗，优选将重组牛结节疹病毒采用生理盐水进行稀释得到疫苗。
本发明提供的预防牛结节疹和牛病毒性腹泻疫苗的制备方法，简单方便，成本低廉，无需进行灭活和佐剂乳化。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明。
实施例1转移载体质粒的制备
pSP72-p7.5-E2-TK1质粒的构建
查找得到TK基因的核苷酸序列，根据所要插入外源基因的位置，将其从插入位点分开，得到TK1核酸片段和TK2核酸片段。查找得到P7.5启动子的核苷酸序列，分别在P7.5启动子的5′端和3′端设计添加HindIII(AAGCT)酶切位点和NotI(GCGGCCGC)酶切位点；查找得到TK1核酸片段的核苷酸序列，分别在TK1核酸片段的5′端和3′端设计添加SpeI(ACTAGT)酶切位点和SacII(CCGCGG)酶切位点，并将上述设计得到的带有酶切位点的P7.5启动子和TK1核酸片段连接，将连接得到的核酸片段记为P7.5-TK1。
查找得到E2基因的核苷酸序列，分别在E2基因的5′端和3′端设计添加NotI(GCGGCCGC)酶切位点和SpeI(ACTAGT)酶切位点。
对pSP72质粒和P7.5-TK1核酸片段采用HindIII限制性内切酶和SacII限制性内切酶酶切，回收酶切产物，分别获得带有HindIII酶切位点和SacII酶切位点的pSP72核酸片段和P7.5-TK1核酸片段，将pSP72核酸片段和P7.5-TK1核酸片段进行连接，并将连接后得到的质粒转化至感受态细胞中，于37℃条件下在含有AmP的固体培养基中培养约12h，培养结束后挑取单个菌落在37℃条件下于培养液中摇床培养约12h。发酵结束后将细胞进行裂解，并提取细胞内的质粒，对获得的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图1所示，将鉴定为阳性的质粒记为pSP72-p7.5-TK1。
对pSP72-p7.5-TK1质粒和E2基因采用NotI限制性内切酶和SpeI限制性内切酶酶切，回收酶切产物，分别获得带有NotI酶切位点和SpeI酶切位点的pSP72-p7.5-TK1核酸片段和E2基因片段，将pSP72-p7.5-TK1核酸片段和E2基因片段进行连接，并将连接后得到的质粒转化至感受态细胞中，于37℃条件下在含有AmP的固体培养基中培养约12h，培养结束后挑取单个菌落在37℃条件下于培养液中摇床培养约12h。发酵结束后将细胞进行裂解，并提取细胞内的质粒，对获得的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图2所示，将鉴定为阳性的质粒记为pSP72-p7.5-E2-TK1。
pSP72-P11-EGFP-TK2质粒的构建
查找得到P11启动子的核苷酸序列，分别在P11启动子的5′端和3′端设计添加BspdI(ATCGAT)酶切位点和BglII(AGATCT)酶切位点；查找得到TK2核酸片段的核苷酸序列，分别在TK2核酸片段的5′端和3′端设计添加EcoRI(GAATTC)酶切位点和ApaI(GGGCCC)酶切位点，并将上述设计得到的带有酶切位点的P11启动子和TK2核酸片段连接，将连接得到的核酸片段记为P11-TK2。
查找得到EGFP基因的核苷酸序列，分别在EGFP基因的5′端和3′端设计添加BglII(AGATCT)酶切位点和EcoRI(GAATTC)酶切位点。
对pSP72质粒和P11-TK2核酸片段采用BspdI限制性内切酶和ApaI限制性内切酶酶切，回收酶切产物，分别获得带有BspdI酶切位点和ApaI酶切位点的pSP72核酸片段和P11-TK2核酸片段，将pSP72核酸片段和P11-TK2核酸片段进行连接，并将连接后得到的质粒转化至感受态细胞中，于37℃条件下在含有AmP的固体培养基中培养约12h，培养结束后挑取单个菌落在37℃条件下于培养液中摇床培养约12h。发酵结束后将细胞进行裂解，并提取细胞内的质粒，对获得的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图1所示，见1号泳道和3号泳道，将鉴定为阳性的质粒记为pSP72-P11-TK2。
对pSP72-P11-TK2质粒和EGFP基因采用BglII限制性内切酶和EcoRI限制性内切酶酶切，回收酶切产物，分别获得带有BglII酶切位点和EcoRI酶切位点的pSP72-P11-TK2核酸片段和EGFP核酸片段，将pSP72-P11-TK2核酸片段和EGFP核酸片段进行连接，并将连接后得到的质粒转化至感受态细胞中，于37℃条件下在含有AmP的固体培养基中培养约12h，培养结束后挑取单个菌落在37℃条件下于培养液中摇床培养约12h。发酵结束后将细胞进行裂解，并提取细胞内的质粒，对获得的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图2所示，见3号泳道，将鉴定为阳性的质粒记为pSP72-P11-EGFP-TK2。
对pSP72质粒和P7.5-TK1核酸片段采用BspdI限制性内切酶和SacII限制性内切酶酶切，回收酶切产物，分别获得带有BspdI酶切位点和SacII酶切位点的pSP72核酸片段和P7.5-TK1核酸片段，将pSP72核酸片段和P7.5-TK1核酸片段进行连接，并将连接后得到的质粒转化至感受态细胞中，于37℃条件下在含有AmP的固体培养基中培养约12h，培养结束后挑取单个菌落在37℃条件下于培养液中摇床培养约12h。发酵结束后将细胞进行裂解，并提取细胞内的质粒，对获得的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图2所示，见1号泳道，将鉴定为阳性的质粒记为pSP72-p7.5-E2-TK1。
pB-TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2转移载体的构建
对pBluescript II SK(-)质粒和pSP72-p7.5-E2-TK1质粒采用HindIII限制性内切酶和SacII限制性内切酶酶切，回收酶切产物，分别获得带有HindIII酶切位点和SacII酶切位点的pBluescript II SK(-)(以下简称PB)核酸片段和p7.5-E2-TK1核酸片段，将pBluescript II SK(-)核酸片段和p7.5-E2-TK1核酸片段进行连接，并将连接后得到的质粒转化至感受态细胞中，于37℃条件下在含有AmP的固体培养基中培养约12h，培养结束后挑取单个菌落在37℃条件下于培养液中摇床培养约12h。发酵结束后将细胞进行裂解，并提取细胞内的质粒，对获得的质粒进行酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒记为pB-p7.5-E2-TK1。
对pB-p7.5-E2-TK1质粒和pSP72-P11-EGFP-TK2质粒采用BspdI限制性内切酶和ApaI限制性内切酶酶切，回收酶切产物，分别获得带有BspdI酶切位点和ApaI酶切位点的pB-p7.5-E2-TK1核酸片段和P11-EGFP-TK2核酸片段，将pB-p7.5-E2-TK1核酸片段和P11-EGFP-TK2核酸片段进行连接，并将连接后得到的质粒转化至感受态细胞中，于37℃条件下在含有AmP的固体培养基中培养约12h，培养结束后挑取单个菌落在37℃条件下于培养液中摇床培养约12h。发酵结束后将细胞进行裂解，并提取细胞内的质粒，对获得的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图3所示，见2号泳道。将鉴定为阳性的质粒记为pB-TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2。
实施例2重组牛结节疹病毒的制备
将羊睾丸细胞(LT)接种至孔板中培养，待羊睾丸细胞培养至单层细胞后，以感染复数为0.1接种牛结节疹弱毒株，令牛结节疹弱毒株在37℃条件下吸附2小时，之后将实施例1中得到的质粒pB-TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2转染羊睾丸细胞(转染方法参照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent试剂盒说明书)。转染2天后观察羊睾丸细胞的病变和荧光，当观察到90％的羊睾丸细胞出现病变并发出荧光后，收获病毒，并以10倍梯度对收获的病毒进行稀释，其稀释的梯度分别记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。
将羊睾丸细胞接种至孔板中培养，待羊睾丸细胞培养至单层细胞后每孔添加稀释梯度为10-5～10-7的病毒各100μL，并添加2mL的无血清培养基继续培养，培养2h后，去掉培养基的上清溶液，在羊睾丸细胞上覆盖一层培养基(含2％血清和低熔点胶)，于37℃条件下培养48小时，观察并标记发出荧光的位置，对发出荧光部位的病毒进行提取和鉴定，将鉴定为阳性的病毒记为r LSD-BVDV-E2。
实施例3重组牛结节疹病毒的驯化
将VERO细胞复苏，于培养基(含8％的血清)中传代培养2～3代，当VERO细胞生长平稳后逐渐减少培养基中的血清添加量(每经过一次传代培养，培养基中的血清含量减少2％～3％)，当培养基中的血清含量下降至5％后，向培养基中添加1.5％～3％的植物水解蛋白和1.5％～3％的酵母提取物，期间如果发现VERO细胞生长缓慢，则在原血清含量的培养基中继续培养，直到培养基中的血清含量下降至1％，待VERO细胞增殖平稳后，继续培养1～2代后，将其以1.0×106cells/mL的接种密度转入摇瓶中进行悬浮培养，倍增后传代(约68h)。摇瓶中悬浮培养的培养条件为：温度37℃、含5.0％CO2，湿度＞60％，转速80r/min～120r/min。摇瓶中悬浮培养的培养基含有：1％的酵母提取物、1％的植物水解蛋白、1mmol/L的L－谷氨酰胺、1.5mmol/L的L－谷氨酸、0.05mmol/L的L－亮氨酸、1.5mmol/L的L－甲硫氨酸、1.5mg/L的维生素B6、1.0mg/L的维生素B12、0.15mg/L的烟酰胺、1.5mg/L的硫酸镁。
待细胞稳定增殖后，以0.1的感染复数接种实施例2中得到重组牛结节疹病毒，当VERO细胞存活率约60％时收获重组牛结节疹病毒，并对获得的重组牛结节疹病毒的滴度进行检测，然后将重组病毒继续在VERO细胞中进行悬浮培养，直至病毒滴度达到107.5TCID50/mL，完成对重组牛结节疹病毒的驯化。
实施例4预防牛结节疹和牛病毒性腹泻二联疫苗的制备
将上述测定病毒滴度的r LSD-BVDV-E2与冻干保护剂混合后，冻干。随机抽取三瓶进行病毒含量测定，每头份免疫剂量约为107.0TCID50/mL。
实施例5疫苗的安全性验证
实验对象：3～5月龄的犊牛20头；
实验分组：实验组15头、对照组5头；
实验方法：实验组皮内注射1mL(含108.0TCID50)实施例4提供的疫苗，对照组皮内注射相同体积的生理盐水，接种完毕后观察实验组和对照组犊牛的体温、采食和其他异常临床症状。
实验结果：实验组和对照组犊牛的体温正常、采食无明显异常，亦无异常临床症状。
实施例6疫苗的效力验证
实验对象：3～5月龄的犊牛20头；
实验分组：分成4组，每组5头，第一组为LSD弱毒株组、第二组为重组牛结节疹病毒组、第三组为BVDV全病毒灭活疫苗组、第四组为对照组，如表1所示；
实验方法：如表1所示，第一组皮内注射免疫剂量为107.0TCID50的LSD弱毒株；第二组皮内注射免疫剂量为107.0TCID50的重组牛结节疹病毒；第三组肌肉注射免疫剂量为2ml/头的BVDV全病毒灭活疫苗；第四组不做处理。第一组至第三组第一次免疫21天后进行第二次免疫。第一次免疫后21日和第二次免疫后14日静脉采血分离血清进行中和抗体检测，血清以1:2的倍比进行稀释。
表1三种不同疫苗效力检验分组
Figure BDA0003150496690000171
注：“-”不适用
实验结果：如表2所示，第一次免疫后，接种重组牛结节疹病毒的犊牛血清对于LSD抗体的中和能力略优于LSD弱毒株组，对于BVDV抗体的中和能力略优于BVDV全病毒灭活疫苗组；第二次免疫后，接种重组牛结节疹病毒的犊牛血清对于LSD抗体的中和能力明显优于LSD弱毒株组，对于BVDV抗体的中和能力明显优于BVDV全病毒灭活疫苗组。说明本发明提供的疫苗对牛结节疹病毒和牛病毒性腹泻病毒均具有良好的免疫原性，并且免疫效力明显优于单苗的效果。
表2不同疫苗免疫后中和抗体滴度
Figure BDA0003150496690000181
实施例7疫苗的成本核算
如表3所示，生产100头份的LSD弱毒的成本为15元、生产100头份BVDV全病毒灭活疫苗的成本为150元，而本发明提供的Vero悬浮培养重组牛结节疹病毒生产100头份的成本仅为5元，本发明提供的疫苗在免疫效力在不低于LSD弱毒和BVDV全病毒灭活疫苗的前提下，能够同时实现对牛病毒性腹泻和结节性皮肤病的预防，而常规疫苗要想实现上述效果需要分别接种LSD弱毒和BVDV全病毒灭活疫苗，其成本为165元/100头份。可见本发明提供的疫苗大大降低了生产成本，更适于生产应用。
表3成本核算
Figure BDA0003150496690000191
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康制药（苏州）有限公司
<120> 表达牛病毒性腹泻E2基因的重组牛结节疹病毒及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caatagcggc cgctatgcac ctcgactgta agccagagta ccagtacgct atcgcaaagg 60
atgagcgcat cggtccgctg ggggctgagg ggctgactac cacctggaaa tcatatagcc 120
atgaaatgac gctcgaggac acaatggtcg tggcttggtg taaggacgga aaattcacct 180
accttcagag gtgtacccgc gaaactagat acctggccac actccacgca agagctctgc 240
ctacttcagt ggtctttaag aaattgttcg gctggcgcag acaggaggac gtggtcgaga 300
tggatgataa ttttgaattt ggcctgtgtc catgcgacgc taagcccatt gtccggggaa 360
agttcaacac cacccttctc aacggtccag cctttcagct ggtgtgccct atcggctgga 420
caggcaccgt gtcatgcatg ctggccaacc gggacactct gtctacaaca gtcgtccgaa 480
tttaccggag atccgtgcct ttcccctaca ggcagggatg cattactcag cggacgcttg 540
gcgaagacct ttataattgc gatctcggag gcaactggac atgcgttacc ggagagatgc 600
tgcgatacac aggcggttcc attgaatcct gcaagtggtg cggatacaag tttcagaaga 660
gcgaggggtt gccacactac cccatcggca agtgtagact ggaaaacgag accggttaca 720
ggctcctgga cgacacctct tgcaaccggg agggcgtggc tatcgtcccg catggcacaa 780
tcaagtgtag aatcggggac acaattgtgc aggtcctggc tatggacaac aagctgggcc 840
ccatgccatg taagccgtat gagataatcc ctagcgaggg accagttgaa aagactgcct 900
gcactttcaa ttatacccga actctgagaa acaaatactt tgagcctcgc gatagttatt 960
ttcagcaata catgctgaaa ggcgaatatc agtactggtt cgacttggag gtcaccgacc 1020
atcatagaga ctactttgcc gagtcaatcc ttgtcgtggt ggtggctttg ctggggggac 1080
ggtacgtgct ctggctgctc gttacgtata tggtcctgtc agagcagaag gcgctgggga 1140
ctcagtacgg ggcgactagt atcat 1165
<210> 2
<211> 1670
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctagtaagct catctatata ctatatagta ataccaatac tcaagactac gaaactgata 60
caatctctta tcatgtgggt aatgttctcg atgtcgatag ccatatgccc ggtagttgcg 120
atatacataa actgatcact aattccaaac ccacccgctt tttatagtaa gtttttcacc 180
cataaataat aaatacaata attaatttct cgtaaaagta gaaaatatat tctaatttat 240
tgcacggtaa ggaagtagaa tcataaagaa cagtgacgga tccccggcgg ccgctatgca 300
cctcgactgt aagccagagt accagtacgc tatcgcaaag gatgagcgca tcggtccgct 360
gggggctgag gggctgacta ccacctggaa atcatatagc catgaaatga cgctcgagga 420
cacaatggtc gtggcttggt gtaaggacgg aaaattcacc taccttcaga ggtgtacccg 480
cgaaactaga tacctggcca cactccacgc aagagctctg cctacttcag tggtctttaa 540
gaaattgttc ggctggcgca gacaggagga cgtggtcgag atggatgata attttgaatt 600
tggcctgtgt ccatgcgacg ctaagcccat tgtccgggga aagttcaaca ccacccttct 660
caacggtcca gcctttcagc tggtgtgccc tatcggctgg acaggcaccg tgtcatgcat 720
gctggccaac cgggacactc tgtctacaac agtcgtccga atttaccgga gatccgtgcc 780
tttcccctac aggcagggat gcattactca gcggacgctt ggcgaagacc tttataattg 840
cgatctcgga ggcaactgga catgcgttac cggagagatg ctgcgataca caggcggttc 900
cattgaatcc tgcaagtggt gcggatacaa gtttcagaag agcgaggggt tgccacacta 960
ccccatcggc aagtgtagac tggaaaacga gaccggttac aggctcctgg acgacacctc 1020
ttgcaaccgg gagggcgtgg ctatcgtccc gcatggcaca atcaagtgta gaatcgggga 1080
cacaattgtg caggtcctgg ctatggacaa caagctgggc cccatgccat gtaagccgta 1140
tgagataatc cctagcgagg gaccagttga aaagactgcc tgcactttca attatacccg 1200
aactctgaga aacaaatact ttgagcctcg cgatagttat tttcagcaat acatgctgaa 1260
aggcgaatat cagtactggt tcgacttgga ggtcaccgac catcatagag actactttgc 1320
cgagtcaatc cttgtcgtgg tggtggcttt gctgggggga cggtacgtgc tctggctgct 1380
cgttacgtat atggtcctgt cagagcagaa ggcgctgggg actcagtacg gggcgactag 1440
tatggactac gggtatatcc acctcatcat tggtccaatg ttctcaggta aaagcacaga 1500
actcataagg attgtgaagc ggtatcagat cgcacagtat aaatgctgcg tggtgaaata 1560
tctgaaggat atccggtacg gaaattctgt atatacccac gataacaacc atgtaagcgc 1620
catcagcacc actctgctgt atgatgtcgt cgacaagatc atgaccgcgg 1670
<210> 3
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agatgcatcg atagcgatgc tacgctagtc acaatcacca ctttcatatt tagaatatat 60
gtatgtaaaa atatagtaga atttcatttt gtttttttct atgctataaa tagatctatg 120
tctagagtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 180
gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 240
tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 300
accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 360
aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga ggtagattta 420
tgcatcctct tgtcatgaga agtcgaattg ttcccattct gtgtgttgca gctacagatg 480
gagatacata gagatactcg tggattttgc ttagtgttga gttttgttct ggttgtgaac 540
taaaagttta tacatttgca ggaaataaat agccttttgt ttaaatcaaa aggtcttacc 600
tatgttattg cgtgaggcat tggatcccaa agagagaact ccaaaatgcg aggctacatg 660
ttatggacta gtatcaggtt gggagacctc ctgagaagct ccagcaagta agcctcgatc 720
acgcaaaatg tttgaggtct gatgttcaat agcttgtttt gtttcacttt gctttggact 780
ttcttttcgc caatgagcta tgtttctgat ggttttcact cttttggtgt gtagagaacc 840
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 900
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 960
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 1020
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 1080
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 1140
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 1200
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 1260
agaattcagt aaatggagtg ctacaaagac gccgctttta gcaaacggat aacaaaagaa 1320
aaggagatcg agttgatcgg cggtaaagag aaatataaat ctgtgtgtcg caagtgctat 1380
ttcctggaag ggcccactgc t 1401

Claims (10)

1.一种重组牛结节疹病毒，其特征在于，所述重组牛结节疹病毒为含有牛病毒性腹泻E2基因的牛结节疹病毒；所述牛病毒性腹泻E2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组牛结节疹病毒，其特征在于，所述牛病毒性腹泻E2基因插入在牛结节疹病毒的TK基因中，片段连接方式为TK2-第一启动子-E2-TK1；
优选地，所述第一启动子包括p7.5或p11；
优选地，片段TK2-第一启动子-E2-TK1为TK2-p7.5-E2-TK1，p7.5-E2-TK1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的重组牛结节疹病毒，其特征在于，所述牛结节疹病毒的TK基因中还插入有标记基因，片段链接方式为TK1-E2-第一启动子-第二启动子-标记基因-TK2；
优选地，所述第二启动子包括p7.5或p11；
优选地，标记基因包括EGFP、gpt或LacZ；
优选地，所述第二启动子为p11，标记基因为EGFP，P11-EGFP-TK2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的重组牛结节疹病毒，其特征在于，片段TK1-E2-第一启动子-第二启动子-标记基因-TK2为TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2；
p7.5-E2-TK1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
P11-EGFP-TK2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求1所述重组牛结节疹病毒的制备方法，其特征在于，将含有SEQ ID NO.1的转移载体质粒导入感染牛结节疹病毒的细胞中，培养筛选得到所述重组牛结节疹病毒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述转移载体质粒的功能性片段为TK1-E2-p7.5-P11-EGFP-TK2，p7.5-E2-TK1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P11-EGFP-TK2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，转移载体质粒为pSP72或pBluescript II SK(-)；
优选地，细胞为羊睾丸细胞。
7.权利要求1-4任一项所述重组牛结节疹病毒的培养方法，其特征在于，利用VERO细胞悬浮培养。
8.权利要求1-4任一项所述的重组牛结节疹病毒在制备预防牛结节疹和牛病毒性腹泻的疫苗中的应用。
9.一种预防牛结节疹和牛病毒性腹泻二联疫苗，其特征在于，活性成分为权利要求1-4任一项所述的重组牛结节疹病毒。
10.权利要求9所述疫苗的制备方法，其特征在于，将重组牛结节疹病毒稀释得到所述疫苗；
优选地，采用生理盐水进行稀释。
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