CN116478280B - 牛结节性皮肤病病毒阳性血清及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清及其制备方法和应用。本发明以灭活疫苗接种健康阴性牛，接种次数≥2次，每次接种的灭活疫苗剂量≥6mL，最终制得了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清。该牛结节性皮肤病病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:32，能充分适用于疫苗研制过程中涉及的各检验项目，解决了困扰牛结节性皮肤病灭活疫苗研制过程中质量控制的瓶颈问题，填补了牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备工艺的空白，对于兽用生物制品行业的长足发展具有重要意义。

Description

牛结节性皮肤病病毒阳性血清及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清及其制备方法和应用。
背景技术
牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease，LSD）是由痘病毒科的牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）引起的牛疫病，临床表现为发热、皮肤水肿及局部坚硬的结节或溃疡，会严重影响牛的生产性能、产奶量和身体状况（损坏皮张、引起流产和不育等），造成养牛产业巨大的损失，研制针对该传染病的疫苗极为迫切。
在灭活疫苗研制的过程中，需要采用特异性血清对疫苗毒进行中和。目前市面上并未有针对LSDV灭活疫苗研制的阳性血清。且在当前的研究进程中，结合LSDV病毒的特性，参考现有各类病毒阳性血清制备技术，获得的阳性血清效价普遍偏低（低于或等于1:16），无法满足疫苗研发过程中的检验需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清及其制备方法和应用。所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:32，能充分适用于疫苗研制过程中涉及的各检验项目，解决了困扰牛结节性皮肤病灭活疫苗研制过程中质量控制的瓶颈问题，填补了牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备工艺的空白，对于兽用生物制品行业的长足发展具有重要意义。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清，所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:32；所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清以灭活疫苗接种健康阴性牛制得，所述接种的次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量≥6mL/头；优选的，每次接种的灭活疫苗剂量为8-12mL/头。
现有常规方法获得的牛结节性皮肤病病毒阳性血清效价普遍偏低（≤1:16），无法满足疫苗研发过程中的检验需求。本发明以灭活疫苗接种健康阴性牛，接种次数≥2次，每次接种的灭活疫苗剂量≥6mL，最终制得了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清。该牛结节性皮肤病病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:32，能满足疫苗研发过程中涉及的各检验项目使用要求。
第二方面，本发明提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清的制备方法。所述方法使用灭活疫苗接种健康阴性牛，制得中和抗体效价≥1:32的阳性血清；所述接种的次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量≥6mL/头；优选的，每次接种的灭活疫苗剂量为8-12mL/头；更优选的，每次接种的灭活疫苗剂量为10mL/头。
病毒阳性血清的生产过程须保障免疫动物的个体健康，通过持续生产阳性血清的方式，减少生成成本，避免经济损失。因此，本领域在使用牛结节性皮肤病病毒灭活疫苗接种健康阴性牛时，通常使用2-4mL/头的剂量进行免疫接种。而本发明使用超剂量注射的方式对健康阴性牛进行免疫，短时间内即获得了较高效价的牛结节性皮肤病病毒阳性血清，能满足疫苗研发过程中涉及的各检验项目使用要求。
本发明使用灭活疫苗接种健康阴性牛，所述灭活疫苗的牛结节性皮肤病病毒含量优选≥0.5×106.0TCID50/mL，更优选≥0.5×107.0TCID50/mL，该规格条件的灭活疫苗能获得更佳的免疫效果，进而有助于提高免疫后阳性血清的中和抗体效价。
本发明使用灭活疫苗接种健康阴性牛，所述灭活疫苗优选由灭活的抗原原液与病毒佐剂复配得到；所述抗原原液由牛结节性皮肤病病毒接种宿主细胞培养得到；所述培养使用的维持液配方优选包括11801-211、V006201-010和CM-VA001。
其中，11801-211、V006201-010和CM-VA001均为商业途径购买得到的维持液，11801-211购自健顺生物科技有限公司；V006201-010购自上海奥浦迈生物科技有限公司；CM-VA001购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
牛结节性皮肤病病毒培养较为困难，常规培养获得的病毒液中，病毒含量仅在104.0TCID50/mL左右，用于后续免疫时效果不佳。本发明在牛结节性皮肤病病毒培养过程中，优选使用包括11801-211、V006201-010和CM-VA001的牛结节性皮肤病病毒专用维持液配方，可显著提高病毒液中牛结节性皮肤病病毒含量。
在该专用维持液配方中，11801-211、V006201-010和CM-VA001优选按各自的标示量配置后，再按特定的体积比例混合均匀得到。在本发明中，11801-211、V006201-010和CM-VA001的体积比优选为1-2:1-2:5-9，更优选为1.5:1.5:7。将该优选的维持液配方用于牛结节性皮肤病病毒培养，能使每1mL病毒液中的病毒含量提升至107.0TCID50-107.5TCID50。
在本发明中，所述抗原原液在灭活前，优选经中空纤维浓缩纯化处理。所述中空纤维的规格优选为400-600KD，更优选为450-550KD，更优选为500KD。经中空纤维超滤浓缩纯化处理后的抗原原液安全性更好，将其用于本发明阴性健康牛的超剂量免疫，更有助于保障免疫动物的健康安全。
在本发明中，常规市售来源的病毒佐剂、宿主细胞及灭活剂均可制备得到本发明用于阳性血清制备的灭活疫苗。
优选的，所述病毒佐剂选自206佐剂；所述宿主细胞选自MDBK细胞；所述抗原原液使用的灭活剂选自β-丙内酯。相较于其他来源，本发明优选的206佐剂对免疫反应的提升效果更为明显，MDBK细胞获得的病毒液病毒含量更好，且获得的速度较快，β-丙内酯在有效灭活病毒的同时，对抗原特性的影响更小。
在本发明提供的更为优选的实施方式中，所述灭活疫苗的制备步骤包括：
S1：将牛结节性皮肤病病毒接种MDBK细胞后，37℃培养5-8d，收获病毒液，并冻融三次后，8000r/min离心30min，取离心后上清液经500KD中空纤维超滤浓缩7倍，然后用无菌PBS洗滤3次后，即为抗原浓缩洗滤液。
S2：将步骤S1获得的抗原浓缩洗滤液经β-丙内酯液按1:2000（v/v）的比例于4℃进行灭活24h，接着于37℃水浴2h，得到灭活抗原液。
S3：将步骤S2制备的灭活抗原液，8000r/min离心20min，取上清，作为水相。另取经检验合格的206佐剂，经高压灭菌后，待降温至30℃，作为油相。然后将水相与油相按质量比1:1混合后，于30-33℃乳化30min，得到灭活疫苗。
进一步的，本发明使用灭活疫苗接种健康阴性牛，所述健康阴性牛优选为2-3月龄。
更优选的，所述健康阴性牛的抗原和/或抗体检测结果为阴性；所述抗原包括牛结节性皮肤病病毒；所述抗体包括牛结节性皮肤病病毒抗体，还至少包括如下至少一种：牛口蹄疫病毒抗体、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒抗体、牛传染性鼻气管炎病病毒抗体。
进一步优选的，所述健康阴性牛的抗原和抗体检测结果为阴性；所述抗原包括牛结节性皮肤病病毒；所述抗体包括牛结节性皮肤病病毒抗体、牛口蹄疫病毒抗体、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒抗体和牛传染性鼻气管炎病病毒抗体。
在阳性血清的生产过程中，免疫动物对最终产品效价的影响较大。本发明优选的健康阴性牛对牛结节性皮肤病病毒的免疫反应更为强烈，且能持续、稳定的保持较高的抗体效价，获得的阳性血清质量更好。
在本发明提供的更为优选的实施方式中，所述健康阴性牛选取刚出生3-5天健康易感牛若干，先分别进行静脉采血，接着将选定的牛分别隔离饲养，同时将采好的血样室温放置约2h后，移入2-8℃静置过夜后，4000r/min离心10min，吸取上层血清进行抗原（牛结节性皮肤病病毒）、抗体（牛结节性皮肤病病毒抗体、牛口蹄疫病毒抗体、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒抗体、传染性鼻气管炎病病毒抗体）检测。选取检测结果均为阴性的牛立即移入符合兽药GMP要求的动物舍进行长期饲养至2-3月，得到待接种的健康阴性牛。
进一步的，本发明使用灭活疫苗接种健康阴性牛，所述接种的次数优选为两次，且第一次接种和第二次接种的时间间隔优选为14-28d，更优选为14-21天，更优选为21天；牛结节性皮肤病病毒阳性血清的收获时间为第二次接种后的第N天，N的值优选≥7，更优选的，N的值优选为14-21，更优选为21。上述优选的接种程序有助于获得更高效价的阳性血清，且免疫动物能在更长的时间内作为阳性血清的供血源。
在本发明提供的更为优选的实施方式中，将筛选好的阴性牛饲养至2-3月龄后，将制备好的牛结节性皮肤病灭活疫苗每头牛肌肉注射10mL，记为一免；一免后21日，按同样接种途径每头牛肌肉注射10mL，记为二免；二免后14日开始，每隔7天采血检测血清中LSDV中和抗体效价，当抗体值均大于1∶16时，可以进行采血分离血清；当抗体值低于1∶16时，每间隔1个月，按二免的方法及剂量加强免疫一次，直至抗体值大于1∶16，再进行采血。
在本发明中，所述采血的方式优选为颈静脉全封闭采血法，具体操作为：
M1：将试验牛站立保定其后腿及头部，使其不能随意移动及伤人。用电动剃毛剪将颈部一侧的毛剃干净；接着用碘酊消毒，再用75%酒精脱碘；局部消毒后，用日常惯用手找出颈静脉，另外一只手按压住颈下部（按压力度应适中，不可太轻也不可太重），待颈静脉因减缓的血流而胀大后，沿与颈静脉平行的角度轻轻地插入专用采血针头，其中采血针头的另一端将连接经消毒后清洗干净且高压灭菌的硅胶管，而硅胶管的另一端则连接无菌的采血瓶（袋）；待看到有血采出后，立即用专用胶带将针头及连接的硅胶管的上半部分固定于颈部，以防针头滑落或错位；采血过程中应经常使其适当活动，或锤击其心脏部位，以增加出血量。本步骤获得阳性全血。
M2：将M1获得的阳性全血于常温条件下静置2h，然后移入2-8℃静置16-24h，静置方式以血样最大面积接触采血瓶（袋）为宜；接着在洁净区（万级区）II级生物安全柜内将析出的血清移入离心管中，于6000r/min离心20min，收集上清液，获得阳性血清。
M3：将M2获得的阳性血清按牛号分别混匀后，于56℃水浴30min后，利用0.45μm及0.22μm两级滤芯进行过滤、除菌，然后每瓶取若干瓶小样待检（1ml/瓶），剩余血清置-80℃保存即可。
在本发明中，采血后，优选对血样进行检验。所述检验优选包含性状检验、无菌检验、支原体检验、中和效价测定、特异性检验。其中，中和抗体效价测定应用细胞中和法检测，每瓶血清LSD中和抗体效价不低于1:16；特异性检查应牛结节性皮肤病病毒抗体应为阳性，牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病病毒抗体均应为阴性。
第三方面，本发明提供了所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清，或者所述制备方法获得的牛结节性皮肤病病毒阳性血清的应用，所述应用包括如下方式中的至少一种：
（1）制备用于牛结节性皮肤病病毒检验或鉴定的试剂或试剂盒；
（2）在牛结节性皮肤病灭活疫苗生产中用于外源病毒检验或细胞中和检验；
（3）制备牛结节性皮肤病病毒阳性血清标准品。
有益效果
本发明提供了一种特异性的牛结节性皮肤病病毒阳性血清及其制备方法和应用。所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:32，能充分适用于疫苗研制过程中涉及的各检验项目，解决了困扰牛结节性皮肤病灭活疫苗研制过程中质量控制的瓶颈问题。所述制备方法特别适用于牛结节性皮肤病病毒阳性血清的制备，填补了行业内该病毒阳性血清制备方法的空白，对于兽用生物制品行业的长足发展具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为本发明实施例2中牛结节性皮肤病病毒抗原PCR检测电泳图。其中，“M”为DL2000 DNA Marker；“＋”为阳性对照；“-”为阴性对照；1～20号泳道代表牛号依次为：230006/5190/1659/5408/6108/5465/5902/6025/5331/5328/5985/5301/5311/5703/5237/6035/5115/5383/5401/5387，PCR检测结果均为阴性。
图2为本发明实验例2中不同效价血清中和LSDV后，MDBK细胞病变情况图片。其中，A表示LSDV被中和后，细胞形态正常图片；B表示LSDV未被中和，致细胞病变图片。
具体实施方式
本发明提供过来一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清及其制备方法和应用。所述阳性血清主要用于牛结节性皮肤病灭活疫苗研制或生产过程中的质量控制。所述阳性血清以牛结节性皮肤病灭活疫苗作为免疫原，选用2-3月龄健康易感牛进行多次免疫，采用全封闭模式采血后，经血清分离后获得。该血清中和抗体效价高（≥1:32），制备工序包含灭活疫苗的制备、阴性动物筛选、免疫及采血检测抗体水平、血清采集与分离、血清的检验等。
其中，健康阴性牛自出生后便在GMP动物房隔离饲养，从而避免受到其他病原的感染。健康阴性牛经超剂量灭活疫苗多次免疫后获得阳性血清，该阳性血清特异性好、无菌、无支原体、无外源病毒污染。中和抗体效价高（≥1:32）。
本发明制备的牛结节性皮肤病病毒阳性血清可以有效的中和LSDV，当阳性血清效价大于或等于1:32时，均能中和106.50TCID50/mL或以上的LSDV；当效价稀释为1:16时，仍能中和106.50TCID50/mL的LSDV。说明本发明制备的牛结节性皮肤病病毒特异性阳性血清能满足LSDV毒种的外源病毒检验。
本发明制备的牛结节性皮肤病病毒阳性血清可以在牛结节性皮肤病灭活疫苗研制过程中作为细胞中和检验中阳性对照血清使用。
本发明所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备工艺包括灭活疫苗的制备、阴性动物筛选、免疫及采血检测抗体水平、血清采集与分离、血清的检验等工序。
在一些实施方式中，本发明中所述的灭活疫苗的制备是通过以下工序实现的：
S1：将牛结节性皮肤病病毒接种MDBK细胞后，37℃培养5-8日，收获病毒液，并冻融三次后，8000r/min离心30min，取离心后上清液经500KD中空纤维超滤浓缩7倍，然后用无菌PBS洗滤3次后，即为抗原浓缩洗滤液。
S2：将步骤S1获得的抗原浓缩洗滤液经β-丙内酯液按1:2000（v/v）的比例于4℃进行灭活24h，接着于37℃水浴2h，得到灭活抗原液。
S3：将步骤S2制备的灭活抗原液，8000r/min离心20min，取上清，作为水相。另取经检验合格的206佐剂，经高压灭菌后，待降温至30℃，作为油相。然后将水相与油相按质量比1:1混合后，于30-33℃乳化30min，得到灭活疫苗。
在一些实施方式中，本发明中所述的阴性动物筛选是通过以下方式实现的：
选取刚出生3-5天健康易感牛若干，先分别进行静脉采血，接着将选定的牛分别隔离饲养，同时将采好的血样室温放置约 2 h后，移入2-8℃静置过夜后，4000r/min 离心 10分钟，吸取上层血清进行抗原、抗体检测。出具结果后将选定的阴性牛立即移入符合兽药GMP要求的动物舍进行长期饲养。实验前动物舍经过严格的消毒处理，实验期间严格控制动物舍的环境卫生和人员流动，避免交叉污染。
本发明中阴性动物筛选中所述的抗原检测项目为：牛结节性皮肤病病毒抗原PCR检测，检测方法为GBT39602-2020中所述普通PCR法；其他《中国兽药典》中要求的外源病毒检测，检测方法参照“兽药典”所述方法。
本发明中阴性动物筛选中所述抗体检测项目包含：牛结节性皮肤病病毒抗体检测，检测方法为《中国兽药典》中所述细胞中和检测方法，要求抗体值不高于1:4判为阴性；牛口蹄疫病毒抗体检测，利用ELISA方法检测，购自中国农业科学院兰州兽医研究所；牛病毒性腹泻/黏膜病病毒抗体检测，利用ELISA方法检测，购自北京爱德士生物科技有限公司（IDEXX，货号：P00645-5）；牛传染性鼻气管炎病病毒抗体检测，利用ELISA方法检测，购自北京爱德士生物科技有限公司（IDEXX，货号：99-41459）。ELISA检测按照试剂盒说明书进行。检测项目中任一项检测结果为阳性时，则该对应动物不作为本研究试验动物，且该血清样品可不再进行其他项目检测。
在一些实施方式中，本发明所述的免疫及采血检测抗体水平是通过以下方式实现的：将筛选好的阴性牛饲养至2-3月龄后，将制备好的牛结节性皮肤病灭活疫苗每头牛肌肉注射10mL记为一免；一免后21日，按同样接种途径每头牛肌肉注射10mL记为二免；二免后14日开始，每隔7天采血检测血清中LSDV中和抗体效价，当抗体值均大于1∶16时，可以进行采血分离血清；当抗体值低于1∶16时，每间隔1个月，按二免的方法及剂量加强免疫一次。直至抗体值大于1∶16，再进行采血。出生之初便在洁净区隔离饲养，能有效避免其他病原的侵染，制备的阳性血清特异性强，注射疫苗后，其产生的效价更高（与自然环境饲养的健康易感牛相比较）。
在一些实施方式中，本发明所述的血清采集与分离是采取颈静脉采血法采集牛血。具体操作为:
动物保定：将待采血的试验牛赶入试验牛保定专用走廊后，用专用绳站立保定其后腿及头部，使其不能随意移动及伤人。
采血：用电动剃毛剪将颈部一侧的毛剃干净；接着用碘酊消毒，再用75%酒精脱碘；局部消毒后，用日常惯用手找出颈静脉，另外一只手按压住颈下部（按压力度应适中，不可太轻也不可太重），待颈静脉因减缓的血流而胀大后，沿与颈静脉平行的角度轻轻地插入专用采血针头，其中采血针头的另一端将连接经消毒后清洗干净且高压灭菌的硅胶管，而硅胶管的另一端则连接无菌的采血瓶（袋）；待看到有血采出后，立即用专用胶带将针头及连接的硅胶管的上半部分固定于颈部，以防针头滑落或错位；采血过程中应经常使其适当活动，或锤击其心脏部位,以增加出血量。每头牛单独使用一套采血器具器材。
血清分离制备：采血完毕后将采血瓶（袋），封闭采血端硅胶管，于常温条件下静置2h，静置方式以血样最大面积接触采血瓶（袋）为宜；然后移入2-8℃静置16-24h，静置方式为：使采血瓶（袋）置于高处，另一端连接血清收集瓶的无菌硅胶管口朝下，使析出的血清全部流入血清收集瓶中；接着在洁净区（万级区）II级生物安全柜内将析出的血清移入离心管中，于6000r/min离心20min，取上清备用。
血清检验及保存：分离的血清混匀后，于56℃水浴30min后，利用0.45μm及0.22μm两级滤芯进行过滤、除菌，然后每瓶取若干瓶小样待检（1ml/瓶），剩余血清置-80℃保存。
在制备阳性血清的过程中，现有的大动物（牛）采血技术，对动物的创伤较大，阳性血清制备成本高。本发明采用的采血方法可有效减少创伤，采血后，实验动物还可良好生长，可以进行多次采血，或用于其他试验，有效降低试验成本。另外，该采血方法全程封闭，有助于避免污染；牛保持正常站立体态，采血量大。
在一些实施方式中，本发明所述的血清的检验包含性状检验、无菌检验、支原体检验、中和效价测定、特异性检验。
性状：随机抽取5管血清肉眼观察，应为淡黄色透明液体。
无菌检验：随机抽取5管血清，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
支原体检验：随机抽取5管血清，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。
中和抗体效价：测定随机抽取5管血清，应用细胞中和法检测，每瓶血清LSD中和抗体效价不低于1:16。
特异性：牛结节性皮肤病病毒抗体应为阳性，牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病病毒抗体均应为阴性。
在一些实施方式中，本发明所制备的阳性血清在细胞中和试验中，作为阳性对照血清使用。其检验方法为：先用含2%新生牛血清的DMEM培养基将中和用LSDV病毒稀释成200TCID50/0.1ml；接着，将非免疫牛（或豚鼠）血清及阴性血清用含2%新生牛血清的DMEM培养液作1∶2、1∶4、1∶8稀释，将阳性血清及免疫豚鼠血清作2倍系列稀释至1∶64（或根据实际情况适当增加稀释度），将各稀释度待检血清以及阳性和阴性血清分别加入96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，每孔50μl。此外，再设正常细胞对照和中和病毒对照各4孔，不加样；然后，向各待检血清、中和病毒对照、阴性血清及阳性血清中加入200TCID50/0.1ml的中和病毒工作液50μl/孔。向各中和病毒对照孔中加入含2%新生牛血清的DMEM培养液50μl/孔，向正常细胞对照孔中加入含2%新生牛血清的DMEM培养液100μl/孔，振摇混匀后，置37℃中和1h，期间振摇2-3次；最后，向所有孔中加入浓度约为20万个细胞/ml的含8-10%新生牛血清的MDBK细胞悬液100μl/孔，置37℃、5%CO2培养箱培养5-8日，每日用倒置显微镜观察细胞病变。
在一些实施方式中，本发明制备的阳性血清在-80℃保存1年后，依旧可以保证原有的效价，可以保证细胞中和等使用阳性血清的检验项目的顺利进行
本发明解决了困扰牛结节性皮肤病灭活疫苗研制过程中质量控制体系（如：毒种鉴定鉴别等）中缺少标准阳性血清的瓶颈问题，对于提升我国牛结节性皮肤病灭活疫苗质量和牛结节性皮肤病疫病防控水平等具有重要意义。
本发明采用纯净、且病毒含量高的毒种制备灭活疫苗，确保了阳性血清的纯净性和免疫效果。
本发明使用的免疫动物一直于GMP动物舍饲养，进一步确保了阳性血清纯净性。
本发明采用多次免疫的方式，定期监测抗体水平，确保了阳性血清高效价。
本发明在采血过程中，采用全封闭的模式采血，采血全过程中，并未与外界接触，进一步降低阳性血清污染其他病原（或微生物）的风险；同时对制备的血清进行全面的检定，确保了阳性血清的质量。
本发明制备的阳性血清，适用于牛结节性皮肤病病毒毒种、制品的外源病毒检验、鉴别检验等。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备方法，包括灭活疫苗制备，阴性动物筛选，接种免疫和血清分离步骤。
其中，灭活疫苗制备步骤如下：
（1）抗原制备：将牛结节性皮肤病病毒按2-5%（v/v）接种MDBK细胞，使用专用维持液（11801-211、V006201-010和CM-VA001复配，先按各维持液标示量配制，然后按1.5:1.5:7的体积比混合均匀），37℃培养5-8日，在致细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）达80%或以上时收获。将收获的病毒液冻融三次后，8000r/min离心30min去除细胞碎片，取样检测TCID50，每1ml的病毒含量应≥106.0TCID50。同时取离心后上清液经500KD中空纤维超滤浓缩7倍，然后用无菌PBS洗滤3次后，即为抗原浓缩洗滤液。
其中，以批号LSD22001的抗原制备过程为例，该抗原生产明细参见表1；抗原液病毒含量、无菌检验结果参见表2。
表1 抗原生产明细
表2 抗原液病毒含量、无菌检验结果
（2）抗原灭活：将β-丙内酯液按1:2000（v/v）的比例加入到上述抗原浓缩洗滤液液中，于4℃进行灭活24h（每120min均匀搅拌一次），接着于37℃水浴2h，得到灭活抗原液。
以批号LSD22001的抗原为例，对灭活抗原液进行灭活检验，其灭活检验结果参见表3。
表3 抗原液灭活检验结果
（3）疫苗配制
水相制备：取步骤（2）中制备的合格的灭活抗原液，8000r/min离心20min，取上清，作为水相。
油相制备：取经检验合格的206佐剂，经高压灭菌后，待降温至30℃，作为油相。
乳化：水相与油相按质量比1:1混合后（将水相加入油相），于30-33℃乳化30min。将乳化好的疫苗按规格标示量分装，贴好标签后，于2-8℃保存备用。
（4）检验：分别进行性状检验、无菌检验、安全检验和效力检验。各项检验方法均按照《中国兽药典》所述方法进行。
以批号LSDM22001灭活抗原配制得到的疫苗（批号22001）为例，各项检验结果参见表4、表5和表6。
表4 灭活疫苗性状、装量检查、无菌检验结果
表5 安全性检验结果
表6 牛效力检验（免疫攻毒法）统计结果
检验结果表明：该批次疫苗各项检验均合格，2-8℃保存备用。
实施例2
本实施例提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备方法，包括灭活疫苗制备，阴性动物筛选，接种免疫和血清分离步骤。
其中，阴性动物筛选步骤如下：
选取刚出生3-5d健康易感牛若干，先分别进行静脉采血，接着将选定的牛分别隔离饲养，同时将采好的血样室温放置约2h后，移入2-8℃静置过夜后，4000r/min离心10min，吸取上层血清进行抗原、抗体检测。
抗原检测项目为：牛结节性皮肤病病毒抗原PCR检测，检测方法为GBT39602-2020中所述普通PCR法；其他《中国兽药典》中要求的外源病毒检测，检测方法参照“兽药典”所述方法。
抗体检测项目包含：牛结节性皮肤病病毒（LSDV）抗体检测，检测方法为《中国兽药典》中所述细胞中和检测方法，要求抗体值不高于1:4判为阴性；牛口蹄疫病毒（FMDV）抗体检测，利用ELISA方法检测，购自中国农业科学院兰州兽医研究所；牛病毒性腹泻/黏膜病病毒（BVDV）抗体检测，利用ELISA方法检测，购自北京爱德士生物科技有限公司（IDEXX，货号：P00645-5）；牛传染性鼻气管炎病病毒（IBRV）抗体检测，利用ELISA方法检测，购自北京爱德士生物科技有限公司（IDEXX，货号：99-41459）。ELISA检测按照试剂盒说明书进行。
检测项目中任一项检测结果为阳性时，则该对应动物不作为本研究试验动物，且该血清样品可不再进行其他项目检测。
本实施例从金宇保灵生物药品有限公司合作牧场筛选20头牛，血清检测结果参见表7。
表7 阴性血清检测结果
选择其中两头牛作为试验牛，牛号分别为23006、5328。随即将这两头牛移入符合兽药GMP要求的动物舍（本次试验在金宇保灵生物药品有限公司P10动物房牛舍）饲养，实验前动物舍经过严格的消毒处理，实验期间严格控制动物舍的环境卫生和人员流动，避免交叉污染。
实施例3
本实施例提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备方法，包括灭活疫苗制备，阴性动物筛选，接种免疫和血清分离步骤。
其中，接种免疫的操作如下：
使用实施例1中制备好的牛结节性皮肤病灭活疫苗（批号：22001）和实施例2中筛选得到的阴性牛（牛号：23006、5328），将筛选好的阴性牛饲养至2-3月龄，然后将制备好的牛结节性皮肤病灭活疫苗每头牛肌肉注射10mL，记为一免；一免后21日，按同样接种途径每头牛肌肉注射10mL，记为二免。
二免后14日开始，每隔7天采血检测血清中LSDV中和抗体效价，当抗体值大于1∶16时，进行采血分离血清（当抗体值低于1∶16时，每间隔1个月，按二免的方法及剂量加强免疫一次，直至抗体值大于1∶16，再进行采血分离血清）。
本实施例中，二免后14日及21日的抗体值检测结果参见表8。
表8 不同免疫时间中和抗体检测结果
各血样抗体值均不低于1∶32。同时，LSDV抗原为阴性，符合技术要求。
实施例4
本实施例提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备方法，包括灭活疫苗制备，阴性动物筛选，接种免疫和血清分离步骤。
本实施例在实施例3的基础上，于免疫后21日，采取颈静脉采血法采集牛血，之后分离血清并检验。
血清分离操作如下：
采血完毕后将采血瓶（袋），封闭采血端硅胶管，于常温条件下静置2h，静置方式以血样最大面积接触采血瓶（袋）为宜；然后移入2-8℃静置16-24h，静置方式为：使采血瓶（袋）置于高处，另一端连接血清收集瓶的无菌硅胶管口朝下，使析出的血清全部流入血清收集瓶中；接着在洁净区（万级区）II级生物安全柜内将析出的血清移入离心管中，于6000r/min离心20min，取上清备用。
本实施例中，阳性血清的具体制备情况参见表9。
表9 阳性血清制备情况
血清分离后进行检验与保存：将分离得到的血清混匀，于56℃水浴30min后，利用0.45μm及0.22μm两级滤芯进行过滤、除菌，然后每瓶取若干瓶小样待检（1ml/瓶），剩余血清置-80℃保存。
检验项目包括性状检验、无菌检验、支原体检验、中和效价测定、特异性检验，具体如下：
性状：随机抽取5管血清肉眼观察，应为淡黄色透明液体；
无菌检验：随机抽取5管血清，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长；
支原体检验：随机抽取5管血清，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长；
中和抗体效价测定：随机抽取5管血清，应用细胞中和法检测，每瓶血清LSD中和抗体效价不低于1:16；
特异性检验：牛结节性皮肤病病毒抗体应为阳性，牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病病毒抗体均应为阴性。
将检验合格的血清，按牛号分别分装，贴上标签,注明血清名称、批号、规格、生产日期等，置-80℃保存。
本实施例制备的两批阳性血清检测结果参见表10。
表10 阳性血清检测结果
两批血清的中和效价均不低于1:32，且均为淡黄色透明液体；无菌、无支原体；均未检出牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病病毒抗体，特异性良好。
实验例1
本实验例选取实施例4中制备得到的两批阳性血清，分别中和不同浓度的LSDV。
结果表明:当阳性血清效价大于或等于1:32时,均能中和106.50TCID50/mL或以上的LSDV；当效价稀释为1:16时，仍能中和106.50TCID50/mL的LSDV。说明采用本发明工艺制备的牛结节性皮肤病病毒特异性阳性血清能满足LSDV毒种的外源病毒检验。
实验例2
本实验例提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清在牛结节性皮肤病灭活疫苗研制过程中细胞中和检验中的应用：选取实施例4中制备得到的两批阳性血清，分别用于细胞中和检验的阳性血清对照品。
检验方法为：先用含2%新生牛血清的DMEM培养基将中和用LSDV病毒稀释成200TCID50/0.1ml；接着，将非免疫牛血清（本实验以非免疫牛血清用于检验，本领域技术人员结合实际情况，可选择替换为非免疫豚鼠血清）及阴性血清用含2%新生牛血清的DMEM培养液作1∶2、1∶4、1∶8稀释，将阳性血清及免疫豚鼠血清作2倍系列稀释至1∶64（本实验以此标准进行稀释，本领域技术人员可结合实际情况适当增加稀释度），将各稀释度待检血清以及阳性和阴性血清分别加入96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，每孔50μl。再设正常细胞对照和中和病毒对照各4孔，不加样；然后，向各待检血清、中和病毒对照、阴性血清及阳性血清中加入200TCID50/0.1ml的中和病毒工作液50μl/孔。向各中和病毒对照孔中加入含2%新生牛血清的DMEM培养液50μl/孔，向正常细胞对照孔中加入含2%新生牛血清的DMEM培养液100μl/孔，振摇混匀后，置37℃中和1h，期间振摇2～3次；最后，向所有孔中加入浓度约为20万个细胞/ml的含8～10%新生牛血清的MDBK细胞悬液100μl/孔，置37℃、5%CO2培养箱培养5～8日，每日用倒置显微镜观察细胞病变。
检验结果参见表11。
表11 细胞中和多次检测结果汇总
结果显示:两批阳性血清经过多次试验验证，其效价能维持原有结果（稍有波动属正常现象），且未出现因阳性血清造成的细胞毒性等问题。
实验例3
本实验例选取实施例4中制备得到的两批阳性血清，分别在保存后每3个月进行一次效价检测，每次检测随机抽取5支血清，目前检测至12个月，效价未见降低。
不同保存时间的中和抗体检测结果参见表12。
表12 不同保存时间中和抗体检测结果
结果表明：本发明制备的牛结节性皮肤病病毒阳性血清可以保证细胞中和等使用阳性血清的检验项目顺利进行。
对比例1
本对比例提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备方法，与实施例1相比，区别仅在于抗原的制备方法不同。
本对比例中抗原制备方法与实施例1的制备流程一致，区别在于使用的维持液为：11801-211（编号：A）、V006201-010（编号：V）、CM-VA001（编号：C）中的一种或多种，按各自维持液标示量配制后，按一定的体积比混合。本对比例中使用的维持液配比及用相应维持液制备抗原液的病毒含量检测结果见表13。
表13 不同免疫时间中和抗体检测结果
本对比例中，二免后14日及21日的抗体检测结果见表14。
表14 不同免疫时间中和抗体检测结果
本对比例制备得到的抗原液中病毒含量远低于阴性牛接种免疫用疫苗对抗原液中病毒含量的要求，其最终制备得到的阳性血清效价≤1:8，达不到检验要求。
对比例2
本对比例提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备方法，与实施例3相比，区别仅在于：选用2-3月龄自然饲养牛进行接种（购自呼和浩特市周边牧场，LSDV抗原、抗体检测均为阴性）。
本对比例中，二免后14日及21日的抗体值检测结果参见表15。
表15 不同免疫时间中和抗体检测结果
可见：本对比例选用自然饲养牛进行接种，二免后的抗体值检测结果明显低于实施例3。
对比例3
本对比例提供了一种牛结节性皮肤病病毒阳性血清制备方法，与实施例3相比，区别仅在于：选用2-3月龄自然饲养牛进行接种（购自呼和浩特市周边牧场，LSDV抗原、抗体检测均为阴性）；疫苗接种剂量为2ml。
本对比例中，二免后14日及21日的抗体值检测结果参见表16。
表16 不同免疫时间中和抗体检测结果
可见：本对比例选用自然饲养牛进行接种，二免后的抗体值检测结果明显低于实施例3。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.牛结节性皮肤病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，使用灭活疫苗接种健康阴性牛，制得中和抗体效价≥1:32的阳性血清；所述接种的次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量≥6mL/头；
所述灭活疫苗的牛结节性皮肤病病毒含量≥0.5×107.0TCID50/mL；
所述灭活疫苗由灭活的抗原原液与病毒佐剂复配得到；所述抗原原液由牛结节性皮肤病病毒接种宿主细胞培养得到；所述培养使用的维持液配方包括11801-211、V006201-010和CM-VA001；11801-211、V006201-010和CM-VA001的体积比为1-2:1-2:5-9；
所述抗原原液在灭活前，经400-600KD的中空纤维浓缩纯化处理；
所述病毒佐剂选自206佐剂；
所述宿主细胞选自MDBK细胞；
抗原原液使用的灭活剂选自β-丙内酯。
2.根据权利要求1所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述健康阴性牛为2-3月龄。
3.根据权利要求1所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述健康阴性牛的抗原和/或抗体检测结果为阴性；
所述抗原包括牛结节性皮肤病病毒；
所述抗体包括牛结节性皮肤病病毒抗体，还至少包括如下至少一种：牛口蹄疫病毒抗体、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒抗体、牛传染性鼻气管炎病病毒抗体。
4.根据权利要求3所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述健康阴性牛的抗原和抗体检测结果为阴性；所述抗体包括牛结节性皮肤病病毒抗体、牛口蹄疫病毒抗体、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒抗体和牛传染性鼻气管炎病病毒抗体。
5.根据权利要求1所述牛结节性皮肤病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述接种的次数为两次；第一次接种和第二次接种的时间间隔为14-28天；牛结节性皮肤病病毒阳性血清的收获时间为第二次接种后的第N天，N≥7。
6.权利要求1-5任意一项所述制备方法获得的牛结节性皮肤病病毒阳性血清的应用，所述应用包括如下方式中的至少一种：
（1）制备用于牛结节性皮肤病病毒检验或鉴定的试剂或试剂盒；
（2）在牛结节性皮肤病灭活疫苗生产中用于外源病毒检验或细胞中和检验；
（3）制备牛结节性皮肤病病毒阳性血清标准品。
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