CN117024577A - A型塞内卡病毒阳性血清及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种A型塞内卡病毒阳性血清及其制备方法和应用。本发明以灭活疫苗接种60‑90日龄的健康阴性架子猪，接种次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量为2‑6mL/头，最终制得了一种A型塞内卡病毒阳性血清。该A型塞内卡病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:1024，能充分适用于疫苗研制过程中涉及的各检验项目，解决了困扰猪水泡病灭活疫苗研制过程中质量控制的瓶颈问题。本发明所述制备方法特别适用于A型塞内卡病毒阳性血清的制备，获得的阳性血清效价高，产量大，对于兽用生物制品行业的长足发展具有重要意义。

Description

A型塞内卡病毒阳性血清及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种A型塞内卡病毒阳性血清及其制备方法和应用。
背景技术
A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)又称为塞内加谷病毒(SVV)，是小RNA病毒科塞内卡病毒属唯一的成员，能引起猪水泡病(Idiopathic Vesicular Disease，IVD)，其进化和传播速度很快。该病毒可导致类似于口蹄疫的临床症状，主要感染新生仔猪，可导致新生仔猪急性死亡，其中1-4日龄的仔猪死亡率最高，约为30％-70％。近年来，SVA在多地均有流行，虽然SVA目前还没有给养猪业带来类似口蹄疫般的毁灭性危害，但小RNA病毒基因变异和重组能力极强，很难预测其未来的流行发展情况。然而，直到现在没有特效的药物用来治疗由A型塞内卡病毒感染引起的疾病，也没有商业疫苗和诊断试剂可用。因此加快对A型塞内卡病毒疫苗和诊断产品的研制对于A型塞内卡病毒的防控具有十分重要的意义。
在兽用生物制品制造的过程中，无论是活病毒疫苗成品、灭活疫苗成品还是制作疫苗的种毒均需要抗A型塞内卡病毒的特异性血清进行中和试验，以检验外源病毒。中低效价的A型塞内卡病毒血清不能完全中和疫苗毒以及种毒，严重影响产品的质量检验。在A型塞内卡病毒诊断产品的研制中，标准参考品主要用于评价该项试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性，研究者先期进行标准参考品的研制是必要的。目前尚未有商品化的猪塞内卡病毒的高免血清及标准阳性血清。现有技术仅公布的猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清及其制备方法(申请号为CN202010898616.0)是以豚鼠为刺激实验动物，由于刺激动物体型较小，该方法获得的特异性血清含量少，不具备工业化生产的条件。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株特异性阳性血清及其制备方法和应用。
通过该方法制备的阳性血清中和效价高，能解决目前兽用生物制品外源病毒检验时中和不完全的问题；且纯净性好，不含有其他猪常见病原；特异性好，不含有除塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株抗体外的其他猪常见病原抗体。
同时，本发明提供的塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株阳性血清可作为猪塞内卡病毒病疫苗动物免疫后中和抗体检测的标准阳性血清使用，在疫苗外源病毒及特异性检验中能够充分中和A型塞内卡病毒，为A型塞内卡病毒疫苗的质量检验提供了很好的技术支撑。
此外，塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株阳性血清在研制酶联免疫试剂盒中起着重要的作用，对于提升我国A型塞内卡病毒疫苗质量和A型塞内卡病毒防控水平具有重要意义。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种A型塞内卡病毒阳性血清，所述A型塞内卡病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:1024；所述A型塞内卡病毒阳性血清以灭活疫苗接种健康阴性架子猪制得；所述健康阴性架子猪为60-90日龄；所述接种的次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量为2-6mL/头。
现有常规方法获得的A型塞内卡病毒阳性血清效价普遍较低，无法满足疫苗研发过程中的检验需求。现有专利(申请号为CN202010898616.0)公开了一种猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清及其制备方法，该方法获得的阳性血清虽然具有较高的效价，但其以豚鼠为刺激实验动物，由于刺激动物体型较小，该方法获得的特异性血清含量少，不具备工业化生产的条件。
本发明以灭活疫苗接种60-90日龄的健康阴性架子猪，接种次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量为2-6mL/头，最终制得了一种A型塞内卡病毒阳性血清。该A型塞内卡病毒阳性血清的中和抗体效价≥1∶1024，能满足疫苗研发过程中涉及的各检验项目使用要求。
第二方面，本发明提供了一种A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，使用灭活疫苗接种健康阴性架子猪，制得中和抗体效价≥1:1024的阳性血清；所述健康阴性架子猪为60-90日龄；所述接种的次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量为2-6mL/头。
在本发明中，所述灭活疫苗优选由A型塞内卡病毒液经灭活和纯化浓缩处理后，与W/O/W型油佐剂混合制得。
其中，所述A型塞内卡病毒液优选以塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株毒种接种PK-15悬浮细胞，进行毒种扩繁后制得。其病毒含量优选≥108.0TCID50/mL，更优选≥108.5TCID50/mL。
其中，所述W/O/W型油佐剂优选为MONTANIDE ISA 206，由于其内溶成分的特殊，在与水相的混和乳化中不需再添加其他乳化剂，即可与水相结合成稳定的乳剂，油、水相按54∶46的比例混合到一起进行乳化。
本发明将A型塞内卡病毒液经灭活和纯化浓缩处理后，与双相油乳佐剂混合制得灭活疫苗。该乳液状的灭活疫苗注射到动物体内可延长抗原在体内的存留时间，缓慢释放抗原，从而持续刺激机体，有助于更好的激发免疫动物的免疫反应；其中的乳剂成分有助于包裹抗原，保护其不被体液中的酶迅速分解，延长抗原刺激机体的时间；同时，其中的乳剂成分会在注射部位引起细胞浸润，促使抗原呈递细胞的聚集和增殖从而提高免疫应答水平，获得的阳性血清效价更高。
在本发明中，所述灭活选用的灭活剂优选为二乙烯亚胺，所述二乙烯亚胺的工作浓度优选为0.001mol/L-0.005mol/L，更优选为0.003mol/L。所述灭活的温度优选为28-32℃，更优选为30℃；所述灭活的时间优选为28-35h，更优选为33h。本发明选用二乙烯亚胺(BEI)用作病毒灭活，对病毒蛋白质成分结构的影响微小，能最大限度地保留病毒抗原性。
本发明优选在灭活结束后进行灭活检验，然后将灭活检验合格的病毒液用于纯化浓缩处理。
在本发明中，所述纯化浓缩使用的中空纤维柱孔径规格优选为300-500KD，更优选为500KD。所述纯化浓缩的浓缩程度优选为8-12倍，更优选为10倍。500KD的中空纤维柱可截留90％的SVA病毒蛋白，收率相较更高，免疫效果好。
为了获得更好的免疫效果，本发明优选对所述健康阴性架子猪进行抗原和/或抗体检测。其中，所述抗原包括A型塞内卡病毒，还包括如下病毒抗原：口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒；所述抗体包括A型塞内卡病毒抗体。在本发明中，所述健康阴性架子猪的抗原和/或抗体检测结果应为阴性。
更优选的，所述健康阴性架子猪的抗原和抗体检测结果均为阴性。其中，所述抗原包括A型塞内卡病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒；所述抗体包括A型塞内卡病毒抗体。
该筛选操作保证了获得血清的纯净性，不含有除A型塞内卡病毒抗体外的其他猪常见病原抗体。且获得的血清特异性好。
进一步的，在本发明优选的实施方式中：
所述接种的次数为两次；第一次接种和第二次接种的时间间隔为14-28天，优选为27天；A型塞内卡病毒阳性血清的收获时间为第二次接种后的第N天，N≥7。
更优选的，A型塞内卡病毒阳性血清的收获时间为第二次接种后的第14-21天。
经上述方法制备的A型塞内卡病毒(塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株)特异性阳性血清猪轮状病毒特异性阳性血清的效价在1:1024以上，能解决目前兽用生物制品外源病毒检验时A型塞内卡病毒活疫苗中和不完全的问题；且纯净性好，不含有其他猪常见病原；特异性好，不含有除A型塞内卡病毒抗体外的其他猪常见病原抗体，能够解决长期困扰猪塞内卡病毒活疫苗单苗以及联苗的质量控制的瓶颈问题。
第三方面，本发明还提供了所述A型塞内卡病毒阳性血清，或者所述制备方法获得的A型塞内卡病毒阳性血清的应用，所述应用包括如下方式中的至少一种：
(1)制备用于A型塞内卡病毒检验或鉴定的试剂或试剂盒；
(2)在A型塞内卡病毒阳性血清灭活疫苗生产中用于外源病毒检验或细胞中和检验；
(3)制备A型塞内卡病毒阳性血清标准品。
本发明提供的所述A型塞内卡病毒阳性血清可作为猪塞内卡病毒病疫苗动物免疫后中和抗体检测的标准阳性血清使用；可用于制备A型塞内卡病毒检验或鉴定的试剂或试剂盒；或者在A型塞内卡病毒阳性血清灭活疫苗生产中用于外源病毒检验或细胞中和检验。
有益效果：
A型塞内卡病毒阳性血清是目前主要应用于鉴别、检验、诊断的蛋白类物质，在清除细菌和病毒中起着重要的作用，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。本发明以灭活疫苗接种60-90日龄的健康阴性架子猪，接种次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量为2-6mL/头，最终制得了一种A型塞内卡病毒阳性血清。该A型塞内卡病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:1024，能充分适用于疫苗研制过程中涉及的各检验项目，解决了困扰猪水泡病灭活疫苗研制过程中质量控制的瓶颈问题。本发明所述制备方法特别适用于A型塞内卡病毒阳性血清的制备，获得的阳性血清效价高，产量大，对于兽用生物制品行业的长足发展具有重要意义。
具体实施方式
本发明提供了一种塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株特异性阳性血清，其制备方法具体包括如下步骤：
(1)制备灭活疫苗：使用塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株毒种接种PK-15悬浮细胞，进行毒种扩繁；将扩繁好的培养物进行离心、浓缩、灭活和乳化，制备出免疫用的灭活疫苗。
(2)动物的选择：所选60-90日龄架子猪符合国家规定的清洁级实验动物，且其不带有病原体及其抗体，病原体包括A型塞内卡病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒中的任一种或多种的组合。本发明在实验动物选择方面，严格遵守动物福利与伦理中的“3R”原则。
(3)动物免疫和抗体水平检测：60-90日龄架子猪免疫猪塞内卡灭活疫苗(CH/ZZ/2016株)，21日后再次接种疫苗，加强免疫后14天开始每隔7天采血检测血清中A型塞内卡病毒中和抗体效价。以血清中和抗体效价高于1∶1024作为最佳采血时间。
(4)血清采集：在最佳采血时间对免疫猪采取颈动脉放血法采集免疫血清。
(5)分离血清：采用孵育、离心的方法分离血清。
(6)血清检验：随机抽取上述血清样品，分别进行物理性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、血清中和效价和特异性检验，确定血清的纯净性、中和抗体滴度以及特异性，所述的外源病毒包括口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒。
(7)分装：将检验合格的血清无菌分装于1.5mL冻存管中，每瓶1mL，贴上标签，注明血清名称、批号、规格、生产日期等，-15℃以下保存。
其中，步骤(1)用PK-15细胞培养所述的A型塞内卡病毒CH/ZZ/2016株；优选的，所述培养是将A型塞内卡病毒CH/ZZ/2016株接种无血清全悬浮培养的PK-15细胞，进行无血清全悬浮培养，收集培养物。
步骤(1)A型塞内卡病毒CH/ZZ/2016株毒种灭活前每毫升病毒含量≥108.0TCID50。
步骤(1)所述乳化中所用的佐剂为双相油乳剂。
步骤(5)所述孵育，先置37℃静置0.5小时，再置4℃静置过夜。
本发明提供的塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株特异性阳性血清效价高(在1:1024以上)，能解决目前兽用生物制品外源病毒检验时A型塞内卡病毒中和不完全的问题。
本发明提供的塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株特异性阳性血清纯净性好，不含有其他猪常见病原。
本发明提供的塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株特异性阳性血清特异性好，不含有除A型塞内卡病毒抗体外的其他猪常见病原抗体，能够解决长期困扰A型塞内卡病毒疫苗的质量控制问题。
本发明提供的塞内卡病毒SVV/CH/ZZ/2016株特异性阳性血清主要用于兽用生物制品质量控制，也可用于A型塞内卡病毒的其他相关检测。
本发明提供的制备方法具有产血清量大的优点，可满足商业化生产条件。
进一步的，在本发明更优选的具体实施方式及实施例中，还具有如下技术改进：
本发明采用纯净、高效价的毒种作为免疫原，毒种不含除SVA以外的任何病毒，确保阳性血清的纯净性和免疫效果。
本发明采用无血清全悬浮培养工艺制备灭活疫苗，具有生产成本低、产品批次之间差异小、安全性好的优点。
本发明采用的纯化浓缩方法成熟，确保了种毒的病毒含量及毒价的稳定性。
本发明采用猪作为免疫动物，确保了阳性血清获取量充足稳定。
本发明采用的免疫动物经多方面检测，确保了免疫动物的纯净性和免疫血清抗体的唯一性。
本发明采用多次免疫，密集监测抗体水平，确保了阳性血清高效价。
本发明采用正压环境免疫及饲养动物，确保了免疫动物不受外源病毒侵染。
本发明采用一房三头，一室三房的饲养密度及饲养空间，确保免疫动物生活环境的舒适性。
本发明对血清进行全面的鉴定，确保了阳性血清的质量。该工艺制备的阳性血清，适用于任何毒株的A型塞内卡病毒毒种、制品的外源病毒检验、鉴别检验等。
本发明可作为猪塞内卡病毒病疫苗动物免疫后中和抗体检测用的标准阳性血清。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供了一种A型塞内卡病毒阳性血清制备方法，包括灭活疫苗制备，阴性动物筛选，接种免疫和血清分离步骤。
其中，灭活疫苗制备步骤如下：
1.细胞的培养
取PK-15JY冻存细胞2支，置37℃水浴1min内快速融化细胞，加入少量无血清悬浮培养基，以1000rpm离心5min去除冷冻保护剂，用适量无血清悬浮培养基轻轻吹打细胞，接种至125mL细胞摇瓶中，补液至30mL，置于37℃，5％CO2，90rpm专用细胞摇床中进行无血清悬浮培养。
待细胞活化3代，细胞计数后，细胞密度达到2.0×106cell/mL，细胞存活率在90％以上，可进行种毒接种。
2.病毒接种及收获
将A型塞内卡病毒CH/ZZ/2016株按细胞培养体积的0.2％-0.5％进行接种，然后置于37℃，含5％CO2，90rpm专用细胞摇床中进行无血清悬浮培养。待细胞活率下降至30％以下，收获病毒液。本发明中，无血清悬浮培养基为CDPK15培养基，购自甘肃健顺生物科技有限公司。
3.免疫用毒种病毒含量及纯净性检测
3.1病毒含量按以下方法：
将收获的病毒液用病毒维持液(DMEM)作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8 4个稀释度，每个稀释度分别接种96孔细胞培养板，每孔100μL，每个稀释度接种4孔，然后每孔补加100μl细胞液，同时设正常细胞对照4孔，每孔100μL稀释液，再补加100μLPK-15细胞悬液，置37℃、含5％ CO2的培养箱中培养至少48小时，显微镜下观察细胞病变，记录各稀释度细胞病变孔数，按照Reed-Muench法计算TCID50，经检测，该病毒液的病毒含量为108.5TCID50/mL。
3.2纯净性检测
为确保毒种的纯净性，对收获的病毒液进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验。所述的外源病毒包括口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒。经检测，收获的病毒液无菌检验、支原体检验均呈阴性，病毒液中不含上述所述的外源病毒任何一种。
4.疫苗的配制
向上述检验合格的病毒液中加入终浓度为0.003mol/L的BEI进行灭活；灭活条件为30℃维持33h。灭活结束后进行灭活检验。将灭活检验合格的病毒液用500KD孔径的中空纤维住对免疫原进行10倍浓缩作为水相。将水相(纯化抗原)与佐剂(MONTANIDE ISA 206)分别进行水浴加热升温至30℃，在搅拌条件下，将混合抗原液按46:54的比例缓慢加入到乳化容器中，乳化20min左右，抗原与佐剂充分混合，乳化成双相型(W/O/W)油乳剂疫苗，配制塞内卡病毒灭活疫苗。
实施例2
本实施例提供了一种A型塞内卡病毒阳性血清制备方法，所述制备方法在实施例1所述灭活疫苗的基础上，进一步进行阴性动物的筛选，阴性动物筛选及接种免疫的步骤具体如下：
1.试验动物筛选
试验选择5头60-90日龄架子猪，塞内卡病毒抗体阴性，且不携带A型塞内卡病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒。实验前动物舍要经过严格的消毒处理，实验期间要严格控制动物舍的环境卫生和人员流动，避免交叉污染。
2.动物免疫
采用颈部肌肉注射的方式免疫，免疫剂量为4ml/头，颈部左右各2ml，免疫后21天以相同免疫方式及剂量进行二次免疫，免疫后14天开始每隔7天进行颈静脉采血检测血清中A型塞内卡病毒中和抗体效价。以血清中和抗体效价高于1∶1024作为最佳采血时间。
3.血清中和抗体检测
被检血清以及阴、阳性血清用前均于56℃水浴锅中灭活30min。用DMEM做2倍倍比稀释至1:4096，每个样品做4个重复，加入含200TCID50/0.1mL的病毒液50μL，混匀置37℃孵育60min。每孔加细胞悬液100μL(约2.5×106cell/孔)。将加好样品的96孔板，置37℃二氧化碳培养箱内，培养3d后，逐日观察并记录细胞病变。经检测(参见表1)，5头猪在免疫后14天的塞内卡病毒中和抗体分别为1∶2896、1∶2896、1∶2048、1:4096和1:4096，均高于1:1024。
表1阴性动物血清中和抗体检测结果
实施例3
本实施例提供了一种A型塞内卡病毒阳性血清制备方法，所述制备方法在实施例2获得的免疫动物基础上，进一步进行血清分离，血清分离的操作具体如下：
1.猪血清采集采取颈动脉放血法，可最大程度保证无菌操作。
使用的容器具均需灭菌处理。
具体操作如下：
猪仰卧固定后，将颈部用碘酊消毒后，再用75％酒精脱碘。局部消毒后，在靠近气管的一侧切开皮肤将皮下组织与肌肉作钝性分离，以手指沿气管处摸到强烈博动的颈动脉，轻轻用手指勾出并小心将其与颈静脉和迷走神经分开，剥离动脉外结缔组织，将颈动脉两端用止血钳夹住，以手术刀在两止血钳之间的动脉上作一纵行切口，将连有消毒硅胶管的玻璃牛角管插入动脉腔内并固定，将橡皮管的另一端插入消毒的采血容器内，打开近血端的止血钳让血液流入牛角管内。待采血到猪失去挣扎能力时，将猪四肢松绑，活动其四肢，并锤击猪心脏部位，以增加出血量。每头猪采血时均需更换容器具和器材。
2.血清的分离
将采集的血液先置37℃静置0.5小时，再置4℃静置过夜，在生物安全柜内分离血清，3000rpm离心10min，取上清。
实施例4
本实施例选取实施例3中制备得到的阳性血清，进行血清检验。
为确保血清的纯净性，本实验例随机抽取每头猪的血清样品3份，分别进行物理性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、血清中和效价和特异性检验，确定血清的纯净性、中和抗体滴度以及特异性，所述的外源病毒包括猪塞内卡病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒。
血清检测项目参见表2。
表2血清检测项目
血清检验完成后，进行分装：
将检验合格的血清无菌分装于1.5mL冻存管中，每瓶1mL，贴上标签，注明血清名称、批号、规格、生产日期等，-15℃以下保存。
采集的5头猪血清中和效价分别为1:2896、1:2896、1:2048、1:4096和1∶4096，且均为淡黄色或澄清液体，无明显溶血或异物；无菌、无支原体、无外源病毒污染；血清中均未检出口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒，特异性良好。
实施例5
本实施例提供了一种A型塞内卡病毒阳性血清制备方法，所述制备方法在实施例1所述灭活疫苗的基础上，将佐剂更换为弗氏佐剂，其他步骤与实施例2、3、4完全一致。
其中，灭活疫苗制备步骤如下：
1.细胞的培养
取PK-15JY冻存细胞2支，置37℃水浴1min内快速融化细胞，加入少量无血清悬浮培养基，以1000rpm离心5min去除冷冻保护剂，用适量无血清悬浮培养基轻轻吹打细胞，接种至125mL细胞摇瓶中，补液至30mL，置于37℃，5％CO2，90rpm专用细胞摇床中进行无血清悬浮培养。
待细胞活化3代，细胞计数后，细胞密度达到2.0×106cell/mL，细胞存活率在90％以上，可进行种毒接种。
2.病毒接种及收获
将A型塞内卡病毒CH/ZZ/2016株按细胞培养体积的0.2％-0.5％进行接种，然后置于37℃，含5％CO2，90rpm专用细胞摇床中进行无血清悬浮培养。待细胞活率下降至30％以下，收获病毒液。本发明中，无血清悬浮培养基为CDPK15培养基，购自甘肃健顺生物科技有限公司。
3.免疫用毒种病毒含量及纯净性检测
3.1病毒含量按以下方法：
将收获的病毒液用病毒维持液(DMEM)作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8 4个稀释度，每个稀释度分别接种96孔细胞培养板，每孔100μL，每个稀释度接种4孔，然后每孔补加100μl细胞液，同时设正常细胞对照4孔，每孔100μL稀释液，再补加100μLPK-15细胞悬液，置37℃、含5％ CO2的培养箱中培养至少48小时，显微镜下观察细胞病变，记录各稀释度细胞病变孔数，按照Reed-Muench法计算TCID50，经检测，该病毒液的病毒含量为108.5TCID50/mL。
3.2纯净性检测
为确保毒种的纯净性，对收获的病毒液进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验。所述的外源病毒包括口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒。经检测，收获的病毒液无菌检验、支原体检验均呈阴性，病毒液中不含上述所述的外源病毒任何一种。
4.疫苗的配制
向上述检验合格的病毒液中加入终浓度为0.003mol/L的BEI进行灭活；灭活条件为30℃维持33h。灭活结束后进行灭活检验。将灭活检验合格的病毒液用500KD孔径的中空纤维住对免疫原进行10倍浓缩作为水相。将水相(纯化抗原)分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂在搅拌条件下，将混合抗原液按1∶1的比例缓慢加入到乳化容器中，乳化20min左右，抗原与佐剂充分混合，乳化成油包水型油乳剂疫苗，配制塞内卡病毒灭活疫苗。
动物首次免疫用用弗氏完全佐剂乳化的灭活疫苗，采用颈部肌肉注射的方式免疫，免疫剂量为4ml/头，颈部左右各2ml。免疫后21天用弗氏不完全佐剂乳化的灭活疫苗以相同免疫方式及剂量进行二次免疫，二免疫后7天和14天进行颈静脉采血检测血清中A型塞内卡病毒中和抗体效价。
被检血清以及阴、阳性血清用前均于56℃水浴锅中灭活30min。用DMEM做2倍倍比稀释至1:4096，每个样品做4个重复，加入含200TCID50/0.1mL的病毒液50μL，混匀置37℃孵育60min。每孔加细胞悬液100μL(约2.5×106cell/孔)。将加好样品的96孔板，置37℃二氧化碳培养箱内，培养3d后，逐日观察并记录细胞病变。经检测(参见表3)，5头猪在免疫后14天的塞内卡病毒中和抗体分别为1:512、1∶724、1:1024、1∶724和1∶724。实施例5中二次免疫后14天获得的血清的塞内卡病毒中和抗体均不高于实施例2。
表3阴性动物血清中和抗体检测结果
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.A型塞内卡病毒阳性血清，其特征在于，所述A型塞内卡病毒阳性血清的中和抗体效价≥1:1024；所述A型塞内卡病毒阳性血清以灭活疫苗接种健康阴性架子猪制得；所述健康阴性架子猪为60-90日龄；所述接种的次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量为2-6mL/头。
2.A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，使用灭活疫苗接种健康阴性架子猪，制得中和抗体效价≥1:1024的阳性血清；所述健康阴性架子猪为60-90日龄；所述接种的次数≥2次；每次接种的灭活疫苗剂量为2-6mL/头。
3.根据权利要求2所述A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述灭活疫苗由A型塞内卡病毒液经灭活和纯化浓缩处理后，与双相油乳佐剂混合制得。
4.根据权利要求3所述A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述A型塞内卡病毒液的病毒含量≥108.0TCID50/mL。
5.根据权利要求3或4所述A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述灭活选用的灭活剂为二乙烯亚胺，所述二乙烯亚胺的工作浓度为0.001mol/L-0.005mol/L；
优选的，所述灭活的温度为28-32℃，所述灭活的时间为28-35h。
6.根据权利要求3-5任意一项所述A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述纯化浓缩使用300-500KD孔径的中空纤维柱；
优选的，所述纯化浓缩的浓缩程度为8-12倍。
7.根据权利要求2～6任意一项所述A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述健康阴性架子猪的抗原和/或抗体检测结果为阴性；
所述抗原包括A型塞内卡病毒，还包括如下病毒抗原：口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒；
所述抗体包括A型塞内卡病毒抗体。
8.根据权利要求7所述A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述健康阴性架子猪的抗原和抗体检测结果为阴性；所述抗原包括A型塞内卡病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒。
9.根据权利要求2～8任意一项所述A型塞内卡病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，所述接种的次数为两次；第一次接种和第二次接种的时间间隔为14～28天；A型塞内卡病毒阳性血清的收获时间为第二次接种后的第N天，N≥7；
优选的，A型塞内卡病毒阳性血清的收获时间为第二次接种后的第14～21天。
10.权利要求1所述A型塞内卡病毒阳性血清，或者权利要求2～9所述制备方法获得的A型塞内卡病毒阳性血清的应用，所述应用包括如下方式中的至少一种：
(1)制备用于A型塞内卡病毒检验或鉴定的试剂或试剂盒；
(2)在A型塞内卡病毒阳性血清灭活疫苗生产中用于外源病毒检验或细胞中和检验；
(3)制备A型塞内卡病毒阳性血清标准品。
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