CN115627259A - 一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法 - Google Patents

一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，所述方法通过控制细胞维持液的血清含量为0.5~2%，细胞维持液的换液周期为2~6天，以及，鸡胚成纤维细胞的细胞密度为6~12×105个/mL，极大降低了鸡胚成纤维细胞维持培养阶段的代谢水平，进而延长了鸡胚成纤维细胞的体外存活时间（鸡胚成纤维细胞维持时间由优化前的12天提高到优化后的60~72天），使麻疹野生株感染鸡胚成纤维细胞后，能够在鸡胚成纤维细胞中进行长时间且持续的适应突变，利于突变体的快速富集，经3轮传代适应即可获得能够在鸡胚成纤维细胞中稳定增值复制的适应株。

Description

一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法
技术领域
本发明涉及一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，属于生物技术领域。
背景技术
麻疹是一种由麻疹病毒（measles virus，MV）引起的传染性疾病，主要临床症状是高烧、结膜炎、咳嗽、鼻炎、柯氏斑和全身性斑氏疹。麻疹病毒属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus），其病毒粒子呈球型，直径约120nm~250nm，包括单股负链RNA和核衣壳（nucleocapsid）结构。其基因组RNA能编码6个结构蛋白，分别是N蛋白、P蛋白、M蛋白、H蛋白、F蛋白和L蛋白。MV只有一个血清型，WHO根据MV的N基因序列将MV分为8个基因组（Geneticgroup），分别为A、B、C、D、E、F、G、H等23个基因型（Genotype）。
接种麻疹病毒疫苗是控制麻疹的重要手段。然而，在全球麻疹病毒疫苗接种率超过70%的条件下，麻疹并没有被清除。这主要是因为不同基因型麻疹病毒之间的交叉保护不全（尤其是A基因型麻疹病毒疫苗与其他基因型麻疹病毒之间）。当接种者体内某一基因型麻疹病毒疫苗免疫产生的中和抗体的滴度衰减到临界值附近，并且面临其他基因型麻疹病毒的攻击时，就有可能再次患麻疹。因此，针对不同基因型麻疹病毒（尤其是新基因型麻疹病毒）研发麻疹病毒疫苗对麻疹的进一步控制具有重要意义。
目前，麻疹病毒疫苗均为将麻疹病毒减毒株接种鸡胚成纤维细胞后经培养、收获、冻干制成的麻疹病毒减毒活疫苗，因此，生产不同基因型麻疹病毒疫苗首先要获得不同基因型的麻疹病毒减毒株。对于麻疹病毒这类负链RNA病毒，其自有的RNA聚合酶的纠错能力较弱，很容易产生子代突变体，因此，对麻疹病毒野生株进行减毒的本质就是通过将麻疹病毒野生株接种非最适细胞，在非最佳复制环境下提高自然选择压力，筛选出适应新宿主细胞的突变体，降低对人类细胞的致病力。
现阶段，麻疹病毒减毒株的制备方法是将麻疹病毒野生株在人原代细胞、动物传代细胞、鸡胚或者鸡胚成纤维细胞（CEF）中经历多轮传代，其传代次数往往达上百代才能成功获得一株稳定的减毒株，耗时较长且成功率低。例如，麻疹病毒减毒株Edmonston（ED）是经人肾细胞传代24代、人羊膜细胞传代28代、鸡胚中传代6代、鸡胚成纤维细胞中传代13代适应得到（参见文献：Katz S L . John F. Enders and measles virus vaccine--areminiscence.[J]. Current Topics in Microbiology & Immunology, 2009, 329:3.）；麻疹病毒减毒株S-191是经人胚肾细胞传代33代、人羊膜细胞传代39代、原代鸡胚细胞中传代15代适应适应得到（参见文献：徐闻青,陈志慧.“沪191”麻疹减毒活疫苗为中国消除麻疹作出贡献[J].上海医药,2010,31(02):59-61.）。因此，亟需开发一种更加快速并且成功率更高的制备麻疹病毒减毒株的方法。
研究表明，麻疹病毒野生株在适应鸡胚成纤维细胞的过程中，每代复制过程都会产生大量突变体，并且，麻疹病毒野生株在鸡胚成纤维细胞的适应过程中会大幅降低病毒的致病力，对于毒力致弱至关重要（参见文献：章以浩,吳紹沅,卢宝兰,王子柱,朱既明,张守德,武文煥,曽国华,肖俊.麻疹病毒減毒过程的观察[J].微生物学报,1966,12(01):15-23.），同时，将麻疹病毒减毒株接种在鸡胚成纤维细胞中进行培养和收获是使用麻疹病毒减毒株制备麻疹病毒减毒活疫苗的必要环节，因此，麻疹病毒野生株在鸡胚成纤维细胞中的适应性传代十分关键。若能提高麻疹病毒野生株在鸡胚成纤维细胞中进行适应性传代时产生突变体的比例，有望开发更加快速并且成功率更高的制备麻疹病毒减毒株的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为6~12×105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每2~6天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5~2%。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为8~10×105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每2~4天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5~1%。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为8×105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每4天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5%。
在本发明的一种实施方式中，以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞生长液中的含量为2~4%。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞培养的温度为36~38℃、时间为12~36h。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育的温度为34~36℃、时间为0.5~2h。
在本发明的一种实施方式中，所述病毒培养的温度为34~36℃、时间为60~72天。
在本发明的一种实施方式中，所述病毒为麻疹病毒。
在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒为A基因型麻疹病毒、B1-3基因型麻疹病毒、C1-2基因型麻疹病毒、D1-11基因型麻疹病毒、E基因型麻疹病毒、F基因型麻疹病毒、G1-3基因型麻疹病毒或H1-2基因型麻疹病毒。
在本发明的一种实施方式中，所述鸡胚成纤维细胞为原代鸡胚成纤维细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述原代鸡胚成纤维细胞的制备方法为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，并剪成组织块后，加入胰酶进行消化，消化后进行吹打，得到原代鸡胚成纤维细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述原代鸡胚成纤维细胞的制备方法为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，使用剪刀剪成1~3mm3的组织块后，以3~10mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶，于37℃下消化10~30min，消化后进行吹打，得到原代鸡胚成纤维细胞。
本发明还提供了一种病毒鸡胚成纤维细胞适应株的培养方法，所述方法为：使用上述病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法对病毒野生株进行适应，得到病毒鸡胚成纤维细胞适应株。
在本发明的一种实施方式中，所述病毒为麻疹病毒。
在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒为A基因型麻疹病毒、B1-3基因型麻疹病毒、C1-2基因型麻疹病毒、D1-11基因型麻疹病毒、E基因型麻疹病毒、F基因型麻疹病毒、G1-3基因型麻疹病毒或H1-2基因型麻疹病毒。
本发明还提供了上述病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法或上述病毒鸡胚成纤维细胞适应株的培养方法在制备病毒鸡胚成纤维细胞适应株中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述病毒为麻疹病毒。
在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒为A基因型麻疹病毒、B1-3基因型麻疹病毒、C1-2基因型麻疹病毒、D1-11基因型麻疹病毒、E基因型麻疹病毒、F基因型麻疹病毒、G1-3基因型麻疹病毒或H1-2基因型麻疹病毒。
本发明技术方案，具有如下优点：
研究发现，在鸡胚成纤维细胞中的长时间维持培养对麻疹病毒野毒株的快速适应至关重要，基于此发现，本发明提供了一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，所述方法通过控制细胞维持液的血清含量为0.5~2%，细胞维持液的换液周期为2~6天，以及，鸡胚成纤维细胞的细胞密度为6~12×105个/mL，极大降低了鸡胚成纤维细胞维持培养阶段的代谢水平，进而延长了鸡胚成纤维细胞的体外存活时间（鸡胚成纤维细胞维持时间由优化前的12天提高到优化后的60~72天），使麻疹野生株感染鸡胚成纤维细胞后，能够在鸡胚成纤维细胞中进行长时间且持续的适应突变，利于突变体的快速富集，经3轮传代适应即可获得能够在鸡胚成纤维细胞中稳定增值复制的适应株，具有快速且成功率高的优势。
附图说明
图1：不同血清含量下鸡胚成纤维细胞的维持时间。
图2：不同换液周期下鸡胚成纤维细胞的维持时间。
图3：不同细胞密度下鸡胚成纤维细胞的维持时间。
图4：不同感染复数（MOI）下麻疹病毒野毒株MV-1在鸡胚成纤维细胞中的生长特性。
图5：不同传代次数下所得上清中麻疹病毒的病毒滴度（实施例1）。
图6：不同传代次数下所得上清中麻疹病毒的病毒滴度（对比例1~2）。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例、对比例和实验例中涉及的原代鸡胚成纤维细胞如下：
原代鸡胚成纤维细胞：取0.2g依地酸二钠、1.25g胰酶粉末（购自GIBCO公司，货号27250018）加入pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液定容至1L后过滤除菌，得到胰酶溶液；将孵化9~11日龄的鸡胚（购自浙江立华公司），去头去内脏，使用剪刀剪成1.5mm3的组织块后，以5mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶溶液，于37℃下消化20min，消化后进行吹打，得到原代鸡胚成纤维细胞。
实验例1：血清含量对鸡胚成纤维细胞维持时间的影响
本实验例提供了血清含量对鸡胚成纤维细胞维持时间的影响实验，实验过程如下：
将原代鸡胚成纤维细胞用含3%（v/v）胎牛血清（FBS，购自兰州荣晔）的细胞生长液（细胞生长液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）稀释至细胞密度为1.0×106个/mL，得到原代鸡胚成纤维细胞悬液；取120mL原代鸡胚成纤维细胞悬液均分至12个T25细胞瓶中，于37℃培养24h，培养24h后，将12个T25细胞瓶分为四组，每组3个，弃去四组T25细胞瓶内上清，将10mL分别含4%、2%、1%和0.5%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（细胞维持液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）分别添加至四组T25细胞瓶中，于35℃进行培养，培养期间，每4天更换一次新鲜的分别含4%、2%、1%和0.5%（v/v）细胞维持液，并分别记录细胞开始显著脱落的时间，记录结果见图1；其中，显著脱落的标准为：细胞成片卷边、脱落20%以上。
由图1可知，在胎牛血清含量高于1%（v/v）时，鸡胚成纤维细胞代谢水平明显提高，维持天数明显下降，表明细胞维持液中胎牛血清的浓度对鸡胚成纤维细胞的代谢水平和维持时间影响很大，应选择胎牛血清含量为0.5~1%（v/v）的细胞维持液对鸡胚成纤维细胞进行培养以降低其代谢水平，进而提高其维持时间。
实验例2：换液周期对鸡胚成纤维细胞维持时间的影响
本实验例提供了换液周期对鸡胚成纤维细胞维持时间的影响实验，实验过程如下：
将原代鸡胚成纤维细胞用含3%（v/v）胎牛血清（FBS，购自兰州荣晔）的细胞生长液（细胞生长液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）稀释至细胞密度为1.0×106个/mL，得到原代鸡胚成纤维细胞悬液；取120mL原代鸡胚成纤维细胞悬液均分至12个T25细胞瓶中，于37℃培养24h，培养24h后，将12个T25细胞瓶分为四组，每组3个，弃去四组T25细胞瓶内上清，将10mL含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（细胞维持液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）添加至四组T25细胞瓶中，于35℃进行培养，培养期间，四组T25细胞瓶分别每2天、4天、6天和8天更换一次新鲜的含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液，并分别记录细胞开始显著脱落的时间，记录结果见图2；其中，细胞显著脱落的标准为：细胞成片卷边、脱落20%以上。
由图2可知，换液周期大于4天时，细胞代谢水平提高，脱落速度加快，换液周期2天时，操作繁琐且维持天数没有增加，因此，选择4天换液一次用于细胞培养最佳。
实验例3：细胞密度对鸡胚成纤维细胞维持时间的影响
本实验例提供了细胞密度对鸡胚成纤维细胞维持时间的影响实验，实验过程如下：
将原代鸡胚成纤维细胞用含3%（v/v）胎牛血清（FBS，购自兰州荣晔）的细胞生长液（细胞生长液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）稀释至细胞密度分别为4×105个/mL、8×105个/mL、1.6×106个/mL，得到细胞浓度不同的原代鸡胚成纤维细胞悬液；各取30mL细胞浓度不同的原代鸡胚成纤维细胞悬液分别添加至3个T25细胞瓶中，于37℃培养24h，培养24h后，弃去T25细胞瓶内上清，将10mL含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（细胞维持液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）分别添加至T25细胞瓶中，于35℃进行培养，培养期间，每4天更换一次新鲜的含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液，并分别记录细胞开始显著脱落的时间，记录结果见图3；其中，细胞显著脱落的标准为：细胞成片卷边、脱落20%以上。
由图3可知，当细胞浓度为8×105个/mL时，细胞的代谢水平最低，维持时间最久。
实验例4：MOI对麻疹病毒在鸡胚成纤维细胞中生长特性的影响
本实验例提供了MOI对麻疹病毒在鸡胚成纤维细胞中生长特性的影响实验，实验过程如下：
将原代鸡胚成纤维细胞用含3%（v/v）胎牛血清（FBS，购自兰州荣晔）的细胞生长液（细胞生长液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）稀释至细胞密度为8×105个/mL，得到原代鸡胚成纤维细胞悬液；取10mL原代鸡胚成纤维细胞悬液添加至T25细胞瓶中，于37℃培养24h，培养24h后，弃去T25细胞瓶内上清，将H1a基因型的麻疹病毒野毒株MV-1（由江苏省疾病预防控制中心提供）分别以MOI=0.01、0.001和0.00001的接种量接种至T25细胞瓶内，于35℃孵育1h后，弃去T25细胞瓶内上清，将10mL含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（细胞维持液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）分别添加至T25细胞瓶中，于35℃进行培养，培养期间，每4天更换一次新鲜的含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液，并分别从T25细胞瓶中对上清进行取样并检测病毒滴度（检测方法参见中国药典三部麻疹减毒活疫苗2.2.3.2病毒滴定方法），检测结果见图4。
由图4可知，对于没有适应鸡胚成纤维细胞的麻疹病毒野毒株来说，在以较低的感染复数进行病毒接种时（如MOI≤0.001），经过多次换液后细胞上清中的滴度快速下降，且在后续培养周期中检测不到病毒粒子存在。而当MOI提高至0.01时可在培养后期检测到病毒增殖复制，这说明，在麻疹病毒的原代鸡胚成纤维细胞适应过程中，使用尽量高的MOI是必要的，分离的野毒株初次接种鸡胚成纤维细胞所用MOI应≥0.01。
实施例1：麻疹病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法
本实施例提供了一种麻疹病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，所述方法如下：
将原代鸡胚成纤维细胞用含3%（v/v）胎牛血清（FBS，购自兰州荣晔）的细胞生长液（细胞生长液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）稀释至细胞密度为8×105个/mL，得到原代鸡胚成纤维细胞悬液；取10mL原代鸡胚成纤维细胞悬液添加至T25细胞瓶中，于37℃培养24h，培养24h后，弃去T25细胞瓶内上清，将H1a基因型的麻疹病毒野毒株MV-1（由江苏省疾病预防控制中心提供）以MOI=0.01的接种量接种至T25细胞瓶内，于35℃孵育1h后，弃去T25细胞瓶内上清，将10mL含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（细胞维持液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）分别添加至T25细胞瓶中，于35℃进行培养，培养期间，每4天更换一次新鲜的含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液，并分别从T25细胞瓶中对上清进行取样并检测病毒滴度（检测方法参见中国药典三部，病毒滴度检测结果见图5），并分别记录细胞开始显著脱落的时间；选取维持培养60天以上且病毒滴度最高的上清重复上述操作进行下一代接种，直至第4代；其中，细胞显著脱落的标准为：细胞成片卷边、脱落20%以上。
由图5可知，第1代时，上清中麻疹病毒滴度在前20天快速下降至0，然后在第32d检测到上清中重新出现麻疹病毒，并且滴度逐渐上升至2.75 lgCCID50，此后滴度维持震荡直至维持到第72天细胞开始显著脱落，此结果表明在鸡胚成纤维细胞中的长时间维持培养对麻疹病毒野毒株的快速适应是至关重要的；第2代适应培养前期和第一代相似，上清中滴度快速下降并在第12天降为0，然而第16天上清中就开始检测到麻疹病毒，并且滴度逐渐上升至3.0 lgCCID50，与第1代相比，第2代适应培养的出毒时间提前，并且最高滴度有所提高，此结果进一步证实在鸡胚成纤维细胞中的长时间维持培养对麻疹病毒野毒株的快速适应帮助极大；第3代适应培养前期，上清中病毒滴度没有降为0，并且，最高滴度达到了3.5lgCCID50，同时，在培养第60天细胞才开始显著脱落，说明经过在鸡胚成纤维细胞中的3次长时间维持培养，麻疹病毒已经逐渐开始适应鸡胚成纤维细胞；第4代适应培养前期，上清中麻疹病毒滴度一直维持在3.5 lgCCID50以上，并且最高滴度达到了4.0 lgCCID50，表明经过在鸡胚成纤维细胞中的4次长时间维持培养，麻疹病毒已经基本适应鸡胚成纤维细胞。
对比例1：麻疹病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法
本对比例提供了一种麻疹病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，所述方法如下：
将原代鸡胚成纤维细胞用含3%（v/v）胎牛血清（FBS，购自兰州荣晔）的细胞生长液（细胞生长液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）稀释至细胞密度为1×106个/mL，得到原代鸡胚成纤维细胞悬液；取10mL原代鸡胚成纤维细胞悬液添加至T25细胞瓶中，于37℃培养24h，培养24h后，弃去T25细胞瓶内上清，将H1a基因型的麻疹病毒野毒株MV-1（由江苏省疾病预防控制中心提供）以MOI=0.01的接种量接种至T25细胞瓶内，于35℃孵育1h后，弃去T25细胞瓶内上清，将10mL含2%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（细胞维持液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）分别添加至T25细胞瓶中，于35℃进行培养，培养期间，每4天更换一次新鲜的含4%（v/v）胎牛血清的细胞维持液，培养12d后，T25细胞瓶中的细胞显著脱落，此时，取T25细胞瓶冻融3次，6000g离心10min后取上清，检测上清的病毒滴度（检测方法参见中国药典三部，病毒滴度检测结果见图6）并使用上清重复上述操作进行下一代接种，直至第12代；其中，细胞显著脱落的标准为：细胞成片卷边、脱落20%以上。
由图6可知，麻疹病毒在前4代传代时上清中滴度呈持续下降的趋势并在第4代降为0，之后直到第12代都没有再检测到麻疹病毒滴度，据此结果表明麻疹病毒适应鸡胚成纤维细胞失败。
对比例2：麻疹病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法
本对比例提供了一种麻疹病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，所述方法如下：
将原代鸡胚成纤维细胞用含3%（v/v）胎牛血清（FBS，购自兰州荣晔）的细胞生长液（细胞生长液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）稀释至细胞密度为2×106个/mL，得到原代鸡胚成纤维细胞悬液；取10mL原代鸡胚成纤维细胞悬液添加至T25细胞瓶中，于37℃培养24h，培养24h后，弃去T25细胞瓶内上清，将H1a基因型的麻疹病毒野毒株MV-1（由江苏省疾病预防控制中心提供）以MOI=0.01的接种量接种至T25细胞瓶内，于35℃孵育1h后，弃去T25细胞瓶内上清，将10mL含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（细胞维持液为M199培养基，购自GIBCO公司，型号31100019）分别添加至T25细胞瓶中，于35℃进行培养，培养期间，每5天更换一次新鲜的含1%（v/v）胎牛血清的细胞维持液，培养12d后，T25细胞瓶中的细胞显著脱落，此时，取T25细胞瓶冻融3次，6000g离心10min后取上清，检测上清的病毒滴度（检测方法参见中国药典三部，病毒滴度检测结果见图6）并使用上清重复上述操作进行下一代接种，直至第12代；其中，细胞显著脱落的标准为：细胞成片卷边、脱落20%以上。
由图6可知，麻疹病毒在前4代传代时上清中滴度呈持续下降的趋势并在第4代降为0，之后直到第12代都没有再检测到麻疹病毒滴度，据此结果表明麻疹病毒适应鸡胚成纤维细胞失败。
比较对比例1~2和实施例1的结果可知，通过调整细胞维持液的血清含量、细胞维持液的换液周期和鸡胚成纤维细胞的细胞密度，可有效降低原代鸡胚成纤维细胞的代谢，进而实现麻疹病毒在原代鸡胚成纤维细胞上的长时间适应，使得适应性突变麻疹病毒在充足的生长时间和相对较小的免疫压力条件下逐步富集，从而使得麻疹病毒能够更高效的适应原代鸡胚成纤维细胞，快速获得鸡胚成纤维细胞适应株，为麻疹病毒减毒活疫苗开发打下基础。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (18)

1.一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，其特征在于，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为6~12×105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每2~6天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5~2%。
2.如权利要求1所述的适应方法，其特征在于，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为8~10×105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每2~4天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5~1%。
3.如权利要求2所述的适应方法，其特征在于，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为8×105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每4天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5%。
4.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞生长液中的含量为2~4%。
5.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，所述细胞培养的温度为36~38℃、时间为12~36h。
6.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，所述孵育的温度为34~36℃、时间为0.5~2h。
7.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，所述病毒培养的温度为34~36℃、时间为60~72天。
8.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，所述病毒为麻疹病毒。
9.如权利要求6所述的适应方法，其特征在于，所述麻疹病毒为A基因型麻疹病毒、B1-3基因型麻疹病毒、C1-2基因型麻疹病毒、D1-11基因型麻疹病毒、E基因型麻疹病毒、F基因型麻疹病毒、G1-3基因型麻疹病毒或H1-2基因型麻疹病毒。
10.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，所述鸡胚成纤维细胞为原代鸡胚成纤维细胞。
11.如权利要求8所述的适应方法，其特征在于，所述原代鸡胚成纤维细胞的制备方法为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，并剪成组织块后，加入胰酶进行消化，消化后进行吹打，得到原代鸡胚成纤维细胞。
12.如权利要求9所述的适应方法，其特征在于，所述原代鸡胚成纤维细胞的制备方法为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，使用剪刀剪成1~3mm3的组织块后，以3~10mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶，于37℃下消化10~30min，消化后进行吹打，得到原代鸡胚成纤维细胞。
13.一种病毒鸡胚成纤维细胞适应株的培养方法，其特征在于，所述方法为：使用权利要求1~10任一项所述的病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法对病毒野生株进行适应，得到病毒鸡胚成纤维细胞适应株。
14.如权利要求11所述的培养方法，其特征在于，所述病毒为麻疹病毒。
15.如权利要求12所述的培养方法，其特征在于，所述麻疹病毒为A基因型麻疹病毒、B1-3基因型麻疹病毒、C1-2基因型麻疹病毒、D1-11基因型麻疹病毒、E基因型麻疹病毒、F基因型麻疹病毒、G1-3基因型麻疹病毒或H1-2基因型麻疹病毒。
16.权利要求1~10任一项所述的病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法或权利要求11~13任一项所述的病毒鸡胚成纤维细胞适应株的培养方法在制备病毒鸡胚成纤维细胞适应株中的应用。
17.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述病毒为麻疹病毒。
18.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述麻疹病毒为A基因型麻疹病毒、B1-3基因型麻疹病毒、C1-2基因型麻疹病毒、D1-11基因型麻疹病毒、E基因型麻疹病毒、F基因型麻疹病毒、G1-3基因型麻疹病毒或H1-2基因型麻疹病毒。
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