CN113999825A - 一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法 - Google Patents

一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，所述方法包括澄清步骤，澄清步骤使用连续流离心，于固定离心力为4000~14000g、上样速度为400~1500mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清；与现有腮腺炎减毒活疫苗的澄清方法（滤膜过滤和绢布过滤）相比，所述方法澄清效果更稳定，自动化程度更高，操作更简便，更容易实现无菌操作，有助于降低腮腺炎减毒活疫苗的质量安全风险，并且，所述方法对病毒收获液中残留的细胞碎片的去除效果最佳，对病毒收获液中感染性腮腺炎病毒滴度的影响最小，有助于获得高病毒滴度的腮腺炎减毒活疫苗。

Description

一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法
技术领域
本发明涉及一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒（Mumps virus，MuV）引起的急性传染病，是儿童和青少年期常见的呼吸道传染病。其主要临床症状为腮腺肿痛，有时也会引起诸如病毒性脑炎、睾丸炎、胰腺炎或卵巢炎等急性炎症或者全身性炎症。
MuV主要通过唾液、唾液污染的物品以及空气飞沫传播。流行性腮腺炎属于全球流行传染病中的一种，地区分布非常广泛。腮腺炎的流行和爆发无明显的季节和地域性，且不受气候等因素的影响，但是冬春季的发病人数要多于夏季。现阶段，控制流行性腮腺炎的主要措施是疫苗预防免疫。腮腺炎减毒活疫苗是用于控制流行性腮腺炎的疫苗中的重要产品。在腮腺炎减毒活疫苗大量使用以前，全球各地的腮腺炎疫情泛滥；但是随着腮腺炎减毒活疫苗的广泛使用，腮腺炎的发病率被极大的控制。
腮腺炎减毒活疫苗的制备过程主要包括腮腺炎病毒减毒株的规模化生产（细胞制备+病毒接种+细胞换液+病毒收获）以及腮腺炎病毒减毒株收获液的澄清两个步骤。其中，规模化生产得到高滴度的腮腺炎病毒减毒株收获液是腮腺炎减毒活疫苗批量化制备的前提条件，而应用先进的澄清技术对腮腺炎病毒减毒株收获液进行后处理是提高疫苗效力降低副反应的关键环节，两者都会直接影响到腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量。
现阶段，主要通过转瓶工艺实现腮腺炎病毒减毒株的规模化生产，以及，主要使用过滤工艺（使用多层200目绢布过滤，或者，分别用不同截留量的超滤膜进行二级过滤）实现腮腺炎病毒减毒株收获液的澄清。其中，转瓶工艺存在很多缺陷，例如，单个转瓶的细胞饲养面积有限，规模化生产需要大量转瓶，无菌控制风险更高；受操作手法等因素影响，可能漏液，造成规模化制备方法效果无法保障；厂房所用空间更大，相同体积的收获液，相较于细胞工厂需要更大的空间；转瓶的清洗和灭菌需要大量劳动力，收换液等操作自动化替代难度较大。同时，腮腺炎病毒减毒株收获液的澄清方法也存在很多影响其澄清效果和效率的缺陷，例如，用于过滤的滤膜或者绢布需要灭菌，包扎，工序繁琐，对操作要求较高；受操作手法等因素影响，可能漏液，造成澄清效果无法保障；澄清效果可能受滤膜或者绢布批次差异，不同批次的绢布，其孔径大小存在批间差异，另外滤膜一般为多次使用，需要每次对完整性进行验证；不易进行大规模澄清，使用滤膜和绢布对于单次过滤量要求较高，当单次量过大，同批次先过滤的质量较佳，后续由于杂质的累积，造成滤膜或者绢布的阻塞，影响局部的过滤效果，进而可能造成局部压力过大，破坏病毒的结构。克服上述缺陷对进一步提高腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量十分重要。
发明内容
为解决现有的制备腮腺炎减毒活疫苗的方法存在的问题，本发明提供了一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，所述方法包括澄清步骤；所述澄清步骤为：使用连续流离心，于固定离心力为4000~14000g、上样速度为400~1500mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清。
在本发明的一种实施方式中，所述澄清步骤为：使用连续流离心，于固定离心力为7000~12000g、上样速度为500~1300mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清。
在本发明的一种实施方式中，所述连续流离心的温度为2~8℃。
在本发明的一种实施方式中，澄清步骤前，所述方法还依次包括细胞制备步骤、病毒接种步骤、细胞换液步骤以及病毒收获步骤；
所述细胞制备步骤为：制备鸡胚成纤维细胞悬液；
所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病毒减毒株接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，添加至含有病毒生长液的细胞工厂中进行第一次培养；
所述细胞换液步骤为：第一次培养后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中进行第二次培养；
所述病毒收获步骤为：第二次培养结束后，对细胞工厂中的病毒培养液进行收获，得到腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；所述收获总共为三次或四次，每次收获间隔22~26h。
在本发明的一种实施方式中，所述收获包括如下步骤：
第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；
第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；
第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；
所述第三次培养和第四次培养的时间为22~26h。
在本发明的一种实施方式中，所述收获包括如下步骤：
第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；
第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；
第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第五次培养；
第四次收获：第五次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获、第三次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；
所述第三次培养、第四次培养和第五次培养的时间为22~26h。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次培养的时间为22~26h；所述第二次培养的时间为66~80h。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚剪碎，加入胰酶进行消化后吹打，得到鸡胚成纤维细胞悬液。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，使用剪刀剪成1~3mm3的组织块后，以4~6mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶，于36~38℃下消化15~25min，消化后进行吹打，制备成浓度为1.7~2.5×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液。
在本发明的一种实施方式中，所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病毒减毒株按照0.001~0.01MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒减毒株的细胞悬液以150~250mL/层的添加量加入到细胞工厂中，于33~35℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有150~250mL病毒生长液。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞换液步骤为：第一次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂，每层加液100~200mL，晃动清洗细胞表面后将液体导出；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第二次培养。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次收获步骤为：第二次培养66~80h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第三次培养。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次收获步骤为：第三次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第四次培养。
在本发明的一种实施方式中，所述第三次收获步骤为：第四次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液。
在本发明的一种实施方式中，所述第三次收获步骤为：第四次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第五次培养。
在本发明的一种实施方式中，所述第四次收获步骤为：第五次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获和第三次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液。
本发明还提供了上述制备腮腺炎减毒活疫苗的方法在制备腮腺炎减毒活疫苗中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，所述方法包括澄清步骤，澄清步骤使用连续流离心，于固定离心力为4000~14000g、上样速度为400~1500mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清；与现有腮腺炎减毒活疫苗的澄清方法（滤膜过滤和绢布过滤）相比，所述方法澄清效果更稳定，自动化程度更高，操作更简便，更容易实现无菌操作，有助于降低腮腺炎减毒活疫苗的质量安全风险，并且，所述方法对病毒收获液中残留的细胞碎片的去除效果最佳，对病毒收获液中感染性腮腺炎病毒滴度的影响最小，有助于获得高病毒滴度的腮腺炎减毒活疫苗。
进一步地，所述连续流离心的固定离心力为7000~12000g；此固定离心力下对腮腺炎病毒的病毒收获液进行澄清，可在最大程度去除病毒收获液中颗粒物的同时，不影响病毒收获液的感染性腮腺炎病毒滴度，有助于获得高病毒滴度的腮腺炎减毒活疫苗。
进一步地，所述连续流离心的上样速度为500~1300mL/min；此上样速度下对腮腺炎病毒的病毒收获液进行澄清，可在最大程度去除病毒收获液中颗粒物的同时，不影响病毒收获液的感染性腮腺炎病毒滴度，有助于获得高病毒滴度的腮腺炎减毒活疫苗。
进一步地，澄清步骤前，所述方法还包括腮腺炎病毒减毒株的规模化生产（细胞制备+病毒接种+细胞换液+病毒收获）步骤，所述腮腺炎病毒减毒株的规模化生产步骤以细胞工厂作为腮腺炎病毒规模化制备的载体，并且，所述腮腺炎病毒减毒株的规模化生产步骤通过系统的比较，获得了腮腺炎病毒减毒株培养的最佳收换液组合，所述最佳收换液组合为间隔22~26h对病毒培养液进行收获，总共收获三~四次，前两~三次收获后需将新的细胞维持液注入细胞工厂；所述腮腺炎病毒减毒株的规模化生产步骤具有收获次数多，单次病毒收获液和混合病毒收获液的病毒滴度高，以及，细胞病变稳定等诸多优势，与转瓶工艺相比，所述腮腺炎病毒减毒株的规模化生产步骤得到的病毒收获液在质量和产量上均得到了显著的提高，有助于进一步提高腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量。
附图说明
图1：实施例1-1和对比例1-1~1-2中的病毒收获方案。
图2：实施例1-1和对比例1-1~1-2中病毒收获方案的生长曲线（10层）。
图3：实施例1-2中病毒收获方案的生长曲线（40层）。
图4：不同离心力条件下的可视颗粒物比较。
图5：不同离心力条件下的病毒滴度比较。
图6：不同上样速度澄清的可视颗粒物比较。
图7：不同上样速度澄清的病毒滴度比较。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的缓冲液如下：
PBS缓冲液：先称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
实施例1-1：腮腺炎病毒减毒株的规模化制备
本实施例提供了腮腺炎病毒减毒株的规模化制备方法，所述方法包括如下步骤：
细胞制备：将孵化9~11日龄的鸡胚（购自浙江立华公司），去头去内脏，使用剪刀剪成1.5mm3的组织块后，以5mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶（购自Gibco公司，货号：27250018），于37℃下消化20min，消化后进行吹打，制备成浓度为2.0×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液；
病毒接种：将腮腺炎病毒减毒株（保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于公开号为CN111019910A的专利公开文本中）按照0.001MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒的细胞悬液以200mL/层的添加量加入到细胞工厂（购自Thermo公司，10层）中，于34℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有200mL病毒生长液（所述病毒生长液为购自Gibco公司的货号为259962的BactoTM TC 乳清蛋白水解物）；
细胞换液：第一次培养24h后，将细胞工厂中的病毒生长液导入废液罐中，用0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液清洗细胞工厂，每层加液150mL，晃动清洗细胞表面后将液体导入废液罐，以上操作重复3遍；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第二次培养；
第一次收获：第二次培养72h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第三次培养；
第二次收获：第三次培养24h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第四次培养；
第三次收获：第四次培养24h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第五次培养；
第四次收获：第五次培养24h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获和第三次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液（收获方案见图1中的2#）。
对比例1-1：腮腺炎病毒减毒株的规模化制备
本对比例提供了腮腺炎病毒减毒株的规模化制备方法，所述方法包括如下步骤：
细胞制备：将孵化9~11日龄的鸡胚（购自浙江立华公司），去头去内脏，使用剪刀剪成1.5mm3的组织块后，以5mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶（购自Gibco公司，货号：27250018），于37℃下消化20min，消化后进行吹打，制备成浓度为2.0×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液；
病毒接种：将腮腺炎病毒减毒株（保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于公开号为CN111019910A的专利公开文本中）按照0.001MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒的细胞悬液以200mL/层的添加量加入到细胞工厂（购自Thermo公司，10层，型号为CF10）中，于34℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有200mL病毒生长液（所述病毒生长液为购自Gibco公司的货号为259962的BactoTM TC 乳清蛋白水解物）；
细胞换液：第一次培养24h后，将细胞工厂中的病毒生长液导入废液罐中，用0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液清洗细胞工厂，每层加液150mL，晃动清洗细胞表面后将液体导入废液罐，以上操作重复3遍；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第二次培养；
第一次收获：第二次培养48h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第三次培养；
第二次收获：第三次培养48h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第四次培养；
第三次收获：第四次培养48h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液（收获方案见图1中的1#）。
对比例1-2：腮腺炎病毒减毒株的规模化制备
本对比例提供了腮腺炎病毒减毒株的规模化制备方法，所述方法包括如下步骤：
细胞制备：将孵化9~11日龄的鸡胚（购自浙江立华公司），去头去内脏，使用剪刀剪成1.5mm3的组织块后，以5mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶（购自Gibco公司，货号：27250018），于37℃下消化20min，消化后进行吹打，制备成浓度为2.0×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液；
病毒接种：将腮腺炎病毒减毒株（保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于公开号为CN111019910A的专利公开文本中）按照0.001MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒的细胞悬液以200mL/层的添加量加入到细胞工厂（购自Thermo公司，10层）中，于34℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有200mL病毒生长液（所述病毒生长液为购自Gibco公司的货号为259962的BactoTM TC 乳清蛋白水解物）；
细胞换液：第一次培养24h后，将细胞工厂中的病毒生长液导入废液罐中，用0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液清洗细胞工厂，每层加液150mL，晃动清洗细胞表面后将液体导入废液罐，以上操作重复3遍；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第二次培养；
第一次收获：第二次培养72h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第三次培养；
第二次收获：第三次培养48h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液（收获方案见图1中的3#）。
实验例1-1：收获方式对病毒收获液病毒收获总量的影响实验
本实验例提供了收获方式对病毒收获液病毒收获总量的影响实验，实验过程如下：
使用细胞病变法（药典三部）检测实施例1-1和对比例1-1~1-2的经不同收获时间下病毒收获液中的感染性腮腺炎病毒滴度，结果如表1和图2所示。
由表1和图2可知，实施例1-1的收获方案从第四天开始，每天收获一次，共计四次，其中前三次收获的病毒液的病毒滴度都高于6.5 lgCCID50/mL，第一次收获滴度超过了7.0lgCCID50/mL，第四次滴度下降非常迅速；对比例1-1的收获方案从第三天开始，中间间隔一天，共计收获三次，其中第两次收获液的病毒滴度大约7.0 lgCCID50/mL，但是第一次和第三次收获液的滴度下降明显，均小于6.5 lgCCID50/mL，由此可知，实施例1-1明显优于对比例1；对比例1-2的收获方案也是从第四天开始收获，间隔一天，共计收获两次，其中第一次收获的滴度也超过7.0 lgCCID50/mL，第二次收获超过6.5 lgCCID50/mL，两次收获滴度均价高。对比例1-2和实施例1-1的第一次收获和第二次收获滴度相当，但是实施例1-1的收获次数较对比例1-2多两次收获，且收获滴度均高于药典标准，综上，实施例1-1收获方案能够得到更多体积以及更高滴度的收获液，是最佳选择。
表1 不同收获方式对病毒收获液病毒滴度的影响（lgCCID50/mL）
Figure 815318DEST_PATH_IMAGE001
实施例1-2：腮腺炎病毒减毒株的规模化制备
本实施例提供了腮腺炎病毒减毒株的规模化制备方法，所述方法为：
在实施例1-1的基础上，将10层的细胞工厂替换为40层的细胞工厂，并将第一次收获、第二次收获和第三次收获得到的病毒收获液合并，即得病毒收获液。
实验例1-2：收获方式的稳定性实验
本实验例提供了收获方式的稳定性实验，实验过程如下：
使用实施例1-2的规模化制备方法连续生产三批病毒收获液（批号分别为05001，05002和05003），并使用细胞病变法（药典三部）检测三批病毒收获液在不同收获时间下的感染性腮腺炎病毒滴度，结果如图3所示。
由图3可知，尽管使用了规格更大的40层细胞工厂，但是三次病毒收获液的病毒滴度与10层的细胞工厂的数据具有较高的一致性，说明这个工艺具有极好的稳定性，不随着生产规模的扩大而显著下降。同时，对每一批的病毒总量做统计，分别为4.18*1011CCID50，4.49*1011CCID50和7.26*1011CCID50，统计结果表明，三批次生产工艺稳定，均达到较高的产量，可用以疫苗原液的生产中。
对比例1-3：腮腺炎病毒减毒株的规模化制备
本实施例提供了腮腺炎病毒减毒株的规模化制备方法，所述方法包括如下步骤：
细胞制备：将孵化9~11日龄的鸡胚（购自浙江立华公司），去头去内脏，使用剪刀剪成1.5mm3的组织块后，以5mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶（购自Gibco公司，货号：27250018），于37℃下消化20min，消化后进行吹打，制备成浓度为2.0×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液；
细胞接种：将细胞悬液以200mL/瓶的添加量加入到细胞转瓶（购自蜀牛公司）中，于34℃下进行第一次培养；每个细胞转瓶均添加有200mL病毒生长液（所述病毒生长液为购自Gibco公司的货号为259962的BactoTM TC 乳清蛋白水解物）；
病毒接种：第一次培养48h后，将腮腺炎病毒减毒株（保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于公开号为CN111019910A的专利公开文本中）按照0.001MOI的接种量接种至细胞转瓶的细胞悬液中，于34℃下进行第二次培养；
细胞换液：第二次培养24h后，将细胞转瓶中的病毒生长液导入废液罐中，用0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液清洗细胞转瓶，每个转瓶中加液1000mL，晃动清洗细胞表面后将液体导入废液罐，以上操作重复3遍；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞转瓶中，每个转瓶中加液200mL，于34℃下培养进行第三次培养；
收获：第三次培养72h后，将细胞转瓶中的病毒培养液导出，即得病毒收获液。
实验例1-3：不同规模化制备方法方式对病毒收获液病毒收获总量和总蛋白量的影响实验
本实验例提供了不同规模化制备方法方式对病毒收获液病毒收获总量和总蛋白量的影响实验，实验过程如下：
实验一：使用细胞病变法（药典三部）检测实施例1-1和对比例1-3的病毒收获液中的感染性腮腺炎病毒滴度，结果如表2所示。
实验二：将实施例1-2以及对比例1-3的病毒收获液于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力8000g、上样速度700mL/min、温度4℃进行连续流离心，得到经澄清的实施例1-2以及对比例1-3的病毒收获液；以未经澄清的病毒收获液为空白对照，使用Lowry法（参考药典三部）检测经澄清的实施例1-2以及对比例1-3的病毒收获液中的总蛋白量，结果如表2所示。
由表2可知，相同表面积（20个310cm²转瓶相当于1个CF10(6320cm²)）的培养条件，相较于转瓶培养，细胞工厂收获的病毒的滴度更高，两种收获液的总蛋白量几乎一致，且细胞工厂可获得的病毒收获液更多。综上，在总蛋白相同的情况下，细胞工厂工艺获得的病毒液的滴度更高，则稀释到相同病毒滴度时的总蛋白含量更低，质量更高。同时单次操作可以收获更多的病毒收获液，更好地提高产量，简化操作步骤，降低污染的风险，具备占地空间更小的优势。
表2 不同规模化制备方法方式对病毒收获液各项检测指标的影响
Figure 686322DEST_PATH_IMAGE002
实施例2-1：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力8000g、上样速度700mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实施例2-2：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力7000g、上样速度700mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实施例2-3：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力9000g、上样速度700mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实施例2-4：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力10000g、上样速度700mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实施例2-5：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力12000g、上样速度700mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
对比例2-1：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力4000g、上样速度700mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
对比例2-2：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力6000g、上样速度700mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
对比例2-3：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力14000g、上样速度700mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实验例2-1：离心力对病毒收获液的澄清效果影响实验
本实验例提供了离心力对病毒收获液的澄清效果影响实验，实验过程如下：
实验一：以未经澄清的病毒收获液为空白对照，使用粒度仪（购自奥法美嘉公司，型号为AccuSizer A2000）检测实施例2-1~2-5以及对比例2-1~2-3的经澄清的病毒收获液中的各种粒径颗粒物的绝对数量，结果如图4和表3所示。
实验二：以未经澄清的病毒收获液为空白对照，使用细胞病变法（药典三部）检测实施例1~5以及对比例1~4的经澄清的病毒收获液中的感染性腮腺炎病毒滴度，结果如图5和表3所示。
由图4和表3可知，未经澄清的病毒收获液含有大量颗粒物，其中以10μm直径以内的颗粒物为主；而经过不同离心力澄清的病毒收获液中，各种粒径的颗粒物随着离心力的增加而显著下降，其中14000g和7000~12000g离心力澄清的病毒收获液中10μm以下粒径的颗粒物数量没有显著区别。
由图5和表3可知，对不同离心力条件下病毒收获液中的感染性腮腺炎病毒滴度的测定显示，整体而言，各种离心力条件下，病毒滴度没有特别显著的下降，唯有14000g离心条件下的病毒滴度较其他离心条件下的病毒滴度低0. 25lgCCID50。
综合图1~2和表1的结果，不同离心力下，对残留的细胞碎片，处理效果不一致，其中，7000~14000g除去细胞碎片的结果相当，并明显优于4000~6000g。比较病毒滴度结果，各种离心力条件下的病毒滴度变化不明显，无显著降低，唯有14000g离心力条件下的病毒滴度有轻微下降。因此，7000~12000g是合适离心力选择。
表3 离心力对病毒收获液的澄清效果影响
Figure 43616DEST_PATH_IMAGE003
实施例2-6：病毒收获液的澄清
本实施例提供了一种腮腺炎减毒活疫苗的澄清方法，所述澄清方法为：
取病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力8000g、上样速度500mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实施例2-7：病毒收获液的澄清
本实施例提供了一种腮腺炎减毒活疫苗的澄清方法，所述澄清方法为：
取病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力8000g、上样速度900mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实施例2-8：病毒收获液的澄清
本实施例提供了一种腮腺炎减毒活疫苗的澄清方法，所述澄清方法为：
取病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力8000g、上样速度1100mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实施例2-9：病毒收获液的澄清
本实施例提供了一种腮腺炎减毒活疫苗的澄清方法，所述澄清方法为：
取病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力8000g、上样速度1300mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
对比例2-4：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力8000g、上样速度400mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
对比例2-5：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），固定离心力8000g、上样速度1500mL/min、温度4℃对病毒收获液进行连续流离心，得到经澄清的病毒收获液。
实验例2-2：上样速度对病毒收获液的澄清效果影响实验
本实验例提供了上样速度对病毒收获液的澄清效果影响实验，实验过程如下：
实验一：以未经澄清的病毒收获液为空白对照，使用粒度仪（购自奥法美嘉公司，型号为AccuSizer A2000）检测实施例2-1、2-6~2-9以及对比例2-4~2-5的经澄清的病毒收获液中的各种粒径颗粒物的绝对数量，结果如图6和表4所示。
实验二：以未经澄清的病毒收获液为空白对照，使用细胞病变法（药典三部）检测实施例2-1、2-6~2-9以及对比例2-4~2-5的经澄清的病毒收获液中的感染性腮腺炎病毒滴度，结果如图7和表4所示。
由图6~7和表4可知，统计了10μm粒径以内的颗粒物总数，发现澄清液中的颗粒物和上样速度成正比。上样速度介于500~1300mL/min之间，病毒的滴度都没有显著区别，上样速度过高或过低时，病毒的滴度略有下降。同时考虑到，当上样速度过低时，会严重影响到澄清的时间，增加时间成本。因此，综合考虑上样速度选择500~1300mL/min为宜。
表4 上样速度对病毒收获液的澄清效果影响
Figure 630455DEST_PATH_IMAGE004
对比例2-6：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，先使用蠕动泵泵入装有绢布（购自Minipore公司）的过滤装置中进行过滤，再通过蠕动泵泵入至装有孔径为1.2μm的滤膜（购自Minipore公司）的过滤装置中进行过滤，得到经澄清的病毒收获液。
对比例2-7：病毒收获液的澄清
本实施例提供了病毒收获液的澄清方法，所述澄清方法为：
取实施例1-1制得的病毒收获液10L，于500rpm下搅拌20min后，先使用蠕动泵泵入装有孔径为10μm的滤膜（购自Minipore公司）的过滤装置中进行过滤，再通过蠕动泵泵入至装有孔径为1.2μm的滤膜（购自Minipore公司）的过滤装置中进行过滤，得到经澄清的病毒收获液。
实验例2-3：不同澄清方式对各项检测指标的影响实验
本实验例提供了不同澄清方式对各项检测指标的影响实验，实验过程如下：
实验一：以未经澄清的病毒收获液为空白对照，使用粒度仪（购自奥法美嘉公司，型号为AccuSizer A2000）检测实施例2-1以及对比例2-6~2-7的经澄清的病毒收获液中的各种粒径颗粒物的绝对数量，结果如表5所示。
实验二：以未经澄清的病毒收获液为空白对照，使用细胞病变法（参考药典三部）检测实施例2-1以及对比例2-6~2-7的经澄清的病毒收获液中的感染性腮腺炎病毒滴度，结果如表5所示。
由表5可知，不同澄清方式中，对残留的细胞碎片的去除效果不一致，绢布搭配1.2μm的滤器，去除效果最差，离心力8000g的连续流去除效果最好；比较病毒滴度，离心前后，病毒的滴度变化不明显，无显著降低，10μm搭配1.2μm的多级过滤，病毒的滴度有轻微下降。综上，实施例2-1的连续流离心为最合适的澄清方式。
表5 不同澄清方式对各项检测指标的影响
Figure 181522DEST_PATH_IMAGE005
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (18)

1.一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括澄清步骤；所述澄清步骤为：使用连续流离心，于固定离心力为4000~14000g、上样速度为400~1500mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述澄清步骤为：使用连续流离心，于固定离心力为7000~12000g、上样速度为500~1300mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述连续流离心的温度为2~8℃。
4.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，澄清步骤前，所述方法还依次包括细胞制备步骤、病毒接种步骤、细胞换液步骤以及病毒收获步骤；
所述细胞制备步骤为：制备鸡胚成纤维细胞悬液；
所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病毒减毒株接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，添加至含有病毒生长液的细胞工厂中进行第一次培养；
所述细胞换液步骤为：第一次培养后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中进行第二次培养；
所述病毒收获步骤为：第二次培养结束后，对细胞工厂中的病毒培养液进行收获，得到腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；所述收获总共为三次或四次，每次收获间隔22~26h。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述收获包括如下步骤：
第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；
第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；
第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；
所述第三次培养和第四次培养的时间为22~26h。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述收获包括如下步骤：
第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；
第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；
第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第五次培养；
第四次收获：第五次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获、第三次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；
所述第三次培养、第四次培养和第五次培养的时间为22~26h。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一次培养的时间为22~26h；所述第二次培养的时间为66~80h。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚剪碎，加入胰酶进行消化后吹打，得到鸡胚成纤维细胞悬液。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，使用剪刀剪成1~3mm3的组织块后，以4~6mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶，于36~38℃下消化15~25min，消化后进行吹打，制备成浓度为1.7~2.5×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病毒减毒株按照0.001~0.01MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒减毒株的细胞悬液以150~250mL/层的添加量加入到细胞工厂中，于33~35℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有150~250mL病毒生长液。
11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞换液步骤为：第一次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂，每层加液100~200mL，晃动清洗细胞表面后将液体导出；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第二次培养。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
13.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述第一次收获步骤为：第二次培养66~80h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第三次培养。
14.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述第二次收获步骤为：第三次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第四次培养。
15.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第三次收获步骤为：第四次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液。
16.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第三次收获步骤为：第四次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第五次培养。
17.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第四次收获步骤为：第五次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获和第三次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液。
18.权利要求1~17任一项所述的制备腮腺炎减毒活疫苗的方法在制备腮腺炎减毒活疫苗中的应用。
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