CN116970095A - 一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。该方法包括以下步骤：(1)提供肺炎球菌发酵液，对所述肺炎球球菌发酵液杀菌、离心，收集第一上清液并超滤，得第一超滤液；(2)将中性盐加入第一超滤液，再混入脱氧胆酸钠，以得到混合溶液，并且调节pH至4.5～5.0；而后离心收集第二上清液；所述脱氧胆酸钠与所述第一超滤液的比例为0.4～0.7g:100mL；(3)对第二上清液回调pH至中性，通过钙盐沉淀杂质后，离心收集第三上清液；然后从所述第三上清液中干燥制得肺炎球菌荚膜多糖。本发明的制备方法具有工艺简便、成本低、肺炎球菌荚膜多糖回收率高且易于放大、适于工业化应用等优点。

Description

一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)简称肺炎球菌，是呼吸道感染的首要致病菌。除肺炎外，肺炎球菌还可引起脑膜炎、败血症、菌血症和腹膜炎等侵袭性疾。肺炎链球菌感染是全球范围内引起死亡的重要原因之一。随着抗菌素的大量使用，耐药菌株与日俱增，医学界再次关注疫苗的研发。荚膜多糖是肺炎链球菌的主要毒力因子，研究结果表明肺炎链球菌荚膜多糖疫苗具有良好的免疫原性和安全性。近年来对肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法已有诸多报道和研究，各疫苗厂家和科研机构不断创新，建立或优化荚膜多糖疫苗的纯化工艺。因此，建立一种简便稳定的荚膜多糖纯化工艺，是优化肺炎球菌疫苗生产工艺提高疫苗质量的必然趋势和迫切需求。目前临床上普遍应用的是13价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗、20价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗和23价肺炎球菌多糖疫苗。
按其荚膜多糖的不同，可分为100种血清型，其中约30多个血清型的菌株对人类有致病性，是引起婴幼儿发病和死亡的主要原因之一。不同的血清型肺炎链球菌荚膜多糖的化学性质不同，因此，在生产中常采用针对不同血清型荚膜多糖分别进行纯化的工艺。迄今仍没有一种通用的方法能够纯化23种血清型肺炎链球菌荚膜多糖，特别地，其中一些型别的荚膜多糖更为特殊，荚膜多糖表现出更大的粘度，因此增加了对其纯化的难度且导致回收率普遍较低。
目前，沉淀法和凝胶层析法是制备肺炎球菌荚膜多糖常用的方法，或两者相结合的方法，凝胶层析法所需纯化环境比较温和，因此对多糖破坏性小；缺点是费时费力且每次分离量相对较少，而且在相对分子质量不确定时，适宜凝胶的选择也较为困难。沉淀法多采用乙醇、丙酮及长链季胺盐类作沉淀剂，该方法避免了凝胶层析法的缺点，但纯化环境不够温和，影响因素亦较多且需要大量使用有毒有害试剂。国内对肺炎球菌荚膜多糖的制备工艺中一般沿用传统的酚抽提法，该方法需要较长的离心时间，且苯酚作为一种具有极强腐蚀性的试剂，大量使用对人和环境造成严重的危害。
尽管应用乙醇沉淀法和CTAB沉淀法纯化荚膜多糖避免了丙酮或苯酚等有毒有害化学试剂的大量使用，但当前的工艺普遍存在流程较为复杂且多糖回收率低等问题。
现有技术中，任克明等人(任克明等.“5型肺炎球菌荚膜多糖无乙醇无苯酚纯化工艺的建立”微生物学免疫学进展1(2020):6.)通过脱氧胆酸钠裂解肺炎球菌发酵液后，再次加入脱氧胆酸钠，而后通过透析以及层析工艺回收多糖，但是其层析填料耗材等成本较高，而且需要2次加入脱氧胆酸钠以及透析操作，工艺流程复杂，不适用于工业化应用。
如何开发一种制备工艺简单、安全性高(不使用苯酚、丙酮等有毒有害试剂)、成本较低(不使用核酸酶、蛋白酶、层析填料等成本较高的外源大分子物质和耗材)、回收率高且符合药典标准的肺炎球菌荚膜多糖制备方法是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供肺炎球菌发酵液，对所述肺炎球球菌发酵液杀菌、离心，收集第一上清液并超滤，得第一超滤液；
(2)将中性盐加入第一超滤液，再混入脱氧胆酸钠，以得到混合溶液，并且调节pH至4.5～5.0；而后离心收集第二上清液；
(3)对第二上清液回调pH至中性，通过钙盐沉淀杂质后，离心收集第三上清液；然后从所述第三上清液中干燥制得肺炎球菌荚膜多糖。
在具体实施过程中，所述中性盐包括但不限于选用NaCl、KCl等。
一些实施方案中，控制所述混合溶液的氯离子浓度为0.3～0.7mol/L。
本发明发现，通过控制混合溶液中的氯离子浓度在0.3～0.7mol/L，同时pH为4.5～5.0的条件下，脱氧胆酸钠对蛋白质的吸附沉淀效果达到最优。
一些实施方案中，脱氧胆酸钠与所述第一超滤液的比例为0.4～0.7g:100mL。
在上述比例的条件下，能够进一步提升脱氧胆酸钠的吸附沉淀效果，而且避免了脱氧胆酸钠使用量过多，后续还需要增加其它去除多余脱氧胆酸钠的操作步骤，有利于缩短制备方法的工艺流程，同时节约生产成本。
一些实施方案中，步骤(3)中，所述钙盐包括CaCl2和乙酸钠；
以所述第二上清液的体积为基准，CaCl2的终浓度为0.05～0.35mol/L、乙酸钠的终浓度为0.4-0.9mol/L。
一些实施方案中，所述钙盐还包括缓冲物质；以所述第二上清液的体积为基准，所述缓冲物质含有终浓度为0.005～0.015mol/L Na2HPO4和0.005～0.015mol/L NaH2PO4。
在上述缓冲体系下，能够保证溶液体系的稳定性，保护肺炎球菌荚膜多糖不受到钙盐沉淀杂质的影响，进一步促进回收率的提升。
一些实施方案中，所述肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，全程不使用有毒有害试剂，所述有毒有害试剂包括：苯酚、丙酮、乙醇中的一种或多种。
一些实施方案中，所述肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，全程不使用外源大分子物质，所述外源大分子物质包括：核酸酶、蛋白酶中的一种或多种。
一些实施方案中，所述肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，全程不使用层析填料及层析设备。
一些实施方案中，所述肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，步骤(1)中，肺炎球菌发酵液肺炎球菌发酵液经杀菌后于2-8℃静置6-12小时，离心收集第一上清液；第一上清液采用5～10倍上清液体积的水进行超滤制得第一超滤液。
一些实施方案中，所述肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，步骤(2)中调节pH至4.5～5.0后，在2～8℃下静置3～16小时，而后离心收集第二上清液。
一些实施方案中，所述肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，步骤(3)中通过钙盐沉淀杂质后调节pH至5.3～5.5，在2～8℃下静置12～16小时，而后离心收集第三上清液。
通过在上述条件下静置能够进一步促进脱氧胆酸钠和所述钙盐的沉淀效果。
一些实施方案中，步骤(3)中用氢氧化钠或氢氧化钾对第二上清液回调pH至中性。
一些实施方案中，所述肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，收集所述第一上清液和/或第二上清液和/或第三上清液后，采用切向流超滤系统对其进行超滤；在所述超滤中，超滤膜的孔径为100KD，采用恒体积补水的方式，待透过端电导率低于10μs/cm时，停止超滤。
在具体实施过程中，若所述第二上清液和/或第三上清液中有小碎屑，在所述超滤前，可采用0.8μm滤膜进行澄清过滤。
在具体实施过程中，包括但不限于采用冰醋酸、磷酸、盐酸对溶液的pH进行调节，优选为冰醋酸。
作为本发明的一种较优的实施方案，包括以下步骤：
(1)提供肺炎球菌发酵液，对所述肺炎球球菌发酵液杀菌、离心，收集第一上清液并超滤，采用5～10倍上清液体积的水进行超滤，得第一超滤液；
(2)将NaCl加入第一超滤液，再混入脱氧胆酸钠，以得到混合溶液，其中，脱氧胆酸钠与第一超滤液的比例为0.4～0.7w/v％，控制所述混合溶液的氯离子浓度为0.3～0.7mol/L，并且采用冰醋酸调节pH至4.5～5.0；在2～8℃下静置3～16小时，而后离心收集第二上清液；
(3)采用氢氧化钠溶液调节pH至中性；向所述第二上清液中加入0.005～0.015mol/L Na2HPO4、0.005～0.015mol/L NaH2PO4、0.05～0.35mol/L CaCl2和0.4-0.9mol/L乙酸钠，采用冰醋酸调节pH至5.3～5.5，于2～8℃静置12～16小时后离心收集第三上清液；然后采用切向流超滤系统通过恒体积补水的方式对其进行超滤，超滤膜的孔径为100KD，待透过端电导率低于10μs/cm时，停止超滤，通过除菌和冻干制得肺炎球菌荚膜多糖。
本领域技术人员可以进一步通过对上述优选方案进行组合，以得到本发明中肺炎球菌荚膜多糖的制备方法的其它较优实施例。
本发明通过在适宜中性盐条件下将脱氧胆酸钠与第一超滤液混合，控制溶液的pH为4.5～5.0，能够高效地发挥脱氧胆酸钠吸附沉淀蛋白质的效果，再通过钙盐沉淀，进一步去除蛋白、核酸等杂质，离心收集上清液，再将上清液进行洗滤，冻干即可获得精制多糖，大幅提升所制备的肺炎球菌荚膜多糖成分的均一度和纯度。通过简单低成本的工艺，能够高效地从肺炎球菌发酵液中制备获得肺炎球菌荚膜多糖，回收率较高，制备过程可全程不使用苯酚、丙酮、乙醇等有毒有害试剂，不使用核酸酶、蛋白酶等成本较高的外源大分子物质，不使用层析填料等成本较高的耗材，获得肺炎球菌荚膜多糖符合中国药典标准。
作为本发明的一种优选实施方案，肺炎球菌发酵液的原料可选自2型肺炎球菌发酵液、18C型肺炎球菌发酵液、20型肺炎球菌发酵液等。
以上这些型别的肺炎球菌荚膜多糖粘度较大，在采用现有技术对其荚膜多糖进行制备时，存在程序复杂，制备周期长，制备过程使用苯酚、丙酮、乙醇等有毒有害试剂，或使用核酸酶、蛋白酶等成本较高的外源大分子物质，或使用层析填料等成本较高的耗材等缺陷，回收率较低，而本申请的制备方法，在粘度大的型别的肺炎球菌荚膜多糖制备中具有极显著优势，回收率仍然较高。
进一步，本发明还提供了一种制备多价肺炎球菌疫苗的方法，包括：采用上述任一实施方案制得肺炎球菌荚膜多糖，而后将所述肺炎球菌荚膜多糖用于制备多价肺炎球菌疫苗。
作为本发明的一种优选实施方案，所述多价肺炎球菌疫苗为肺炎球菌多糖疫苗或肺炎球菌多糖结合疫苗。
所述肺炎球菌疫苗中含有1型、2型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9V型、9N型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和33F型肺炎球菌血清型中的任意一种或其组合。
由于本发明的制备方法工艺简单且肺炎球菌荚膜多糖回收率高，将其应用于多价肺炎球菌疫苗的制备过程中，能够有效缩短疫苗制备的工艺流程、节约经济成本，适于工业中规模化生产应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的制备方法具有工艺简便、肺炎球菌荚膜多糖回收率高且易于放大、适于工业化应用等优点。尤其在粘度大的型别的肺炎球菌荚膜多糖制备中具有极显著优势，回收率可达58％以上。
(2)采用本发明的方法制备的肺炎球菌荚膜多糖，其免疫原性好且核酸、蛋白等杂质及O-乙酰基、甲基戊糖、糖醛酸、氨基己糖含量等的质量控制指标均符合《中华人民共和国药典》(2020版)标准；可用于肺炎球菌荚膜多糖疫苗和结合疫苗的制备。
(3)本发明的制备方法避免了苯酚、丙酮、乙醇等有毒有害试剂的使用，减小了对人体健康和环境的危害。
(4)本发明的制备方法避免了使用核酸酶、蛋白酶等成本较高的外源大分子物质，避免了使用层析填料等成本较高的耗材，有效降低了制备成本。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。具体包括以下步骤：
(1)将1型肺炎球菌发酵液经过杀菌后于2-8℃静置6～12小时，然后12000g，30～60min离心，收集上清液；上清液用孔径为100KD膜超滤得到超滤浓缩液，超滤所用溶液是纯化水，体积为上清液体积的5倍。
(2)向超滤浓缩液中加入NaCl至浓度为0.3mol/L，待完全溶解后，再加入0.5％(w/v)的脱氧胆酸钠，一边搅拌一边滴加冰醋酸调pH至5.0，充分搅匀后于2～8℃静置3～16小时，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑用0.8μm滤膜澄清过滤。
(3)用氢氧化钠或氢氧化钾将上清液回调pH至中性，然后向得到的料液中加入Na2HPO4终浓度为0.01mol/L和NaH2PO4终浓度为0.01mol/L作为缓冲体系，待完全溶解后，再加入乙酸钠终浓度为0.6mol/L、CaCl2终浓度为0.25mol/L，搅拌至溶解，向料液中滴加冰醋酸调pH至5.3～5.5，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，静置完成后，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑可以用0.8μm滤膜澄清过滤。
(4)将上一步得到的上清液用纯化水超滤，待透过端电导率低于10μs/cm收集多糖溶液，通过除菌过滤后收集多糖溶液。进一步将多糖溶液冻干制得肺炎球菌荚膜多糖。
实施例2
(1)将2型肺炎球菌发酵液经过杀菌后于2-8℃静置6～12小时，然后12000g，30～60min离心，收集上清液；上清液用孔径为100KD膜超滤得到超滤浓缩液，超滤所用溶液是纯化水，体积为上清液体积的5倍。
(2)向超滤浓缩液中加入NaCl至浓度为0.5mol/L，待完全溶解后，再加入0.7％(w/v)的脱氧胆酸钠，一边搅拌一边滴加冰醋酸调pH至5.0，充分搅匀后于2～8℃静置3～16小时，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑用0.8μm滤膜澄清过滤。
(3)用氢氧化钠或氢氧化钾将上清液回调pH至中性，然后向得到的料液中加入Na2HPO4终浓度为0.01mol/L和NaH2PO4终浓度为0.01mol/L作为缓冲体系，待完全溶解后，再加入乙酸钠终浓度为0.6mol/L、CaCl2终浓度为0.25mol/L，搅拌至溶解，向料液中滴加冰醋酸调pH至5.3～5.5，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，静置完成后，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑可以用0.8μm滤膜澄清过滤。
(4)将上一步得到的上清液用纯化水超滤，待透过端电导率低于10μs/cm收集多糖溶液，通过除菌过滤后收集多糖溶液。进一步将多糖溶液冻干制得肺炎球菌荚膜多糖。
实施例3
(1)将7F型肺炎球菌发酵液经过杀菌后于2-8℃静置6～12小时，然后12000g，30～60min离心，收集上清液；上清液用孔径为100KD膜超滤得到超滤浓缩液，超滤所用溶液是纯化水，体积为上清液体积的5倍。
(2)向超滤浓缩液中加入NaCl至浓度为0.3mol/L，待完全溶解后，再加入0.7％(w/v)的脱氧胆酸钠，一边搅拌一边滴加冰醋酸调pH至4.5，充分搅匀后于2～8℃静置3～16小时，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑用0.8μm滤膜澄清过滤。
(3)用氢氧化钠或氢氧化钾将上清液回调pH至中性，然后向得到的料液中加入Na2HPO4终浓度为0.01mol/L和NaH2PO4终浓度为0.01mol/L作为缓冲体系，待完全溶解后，再加入乙酸钠终浓度为0.6mol/L、CaCl2终浓度为0.35mol/L，搅拌至溶解，向料液中滴加冰醋酸调pH至5.3～5.5，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，静置完成后，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑可以用0.8μm滤膜澄清过滤。
(4)将上一步得到的上清液用纯化水超滤，待透过端电导率低于10μs/cm收集多糖溶液，通过除菌过滤后收集多糖溶液。进一步将多糖溶液冻干制得肺炎球菌荚膜多糖。
实施例4
(1)将12F型肺炎球菌发酵液经过杀菌后于2-8℃静置6～12小时，然后12000g，30～60min离心，收集上清液；上清液用孔径为100KD膜超滤得到超滤浓缩液，超滤所用溶液是纯化水，体积为上清液体积的5倍。
(2)向超滤浓缩液中加入NaCl至浓度为0.3mol/L，待完全溶解后，再加入0.5％(w/v)的脱氧胆酸钠，一边搅拌一边滴加冰醋酸调pH至5.0，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑用0.8μm滤膜澄清过滤。
(3)用氢氧化钠或氢氧化钾将上清液回调pH至中性，然后向得到的料液中加入Na2HPO4终浓度为0.01mol/L和NaH2PO4终浓度为0.01mol/L的作为缓冲体系，待完全溶解后，再加入乙酸钠终浓度为0.4mol/L、CaCl2终浓度为0.35mol/L，搅拌至溶解，向料液中滴加冰醋酸调pH至5.3～5.5，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，静置完成后，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑可以用0.8μm滤膜澄清过滤。
(4)将上一步得到的上清液用纯化水超滤，待透过端电导率低于10μs/cm收集多糖溶液，通过除菌过滤后收集多糖溶液。进一步将多糖溶液冻干制得肺炎球菌荚膜多糖。
实施例5
(1)将18C型肺炎球菌发酵液经过杀菌后于2-8℃静置6～12小时，然后12000g，30～60min离心，收集上清液；上清液用孔径为100KD膜超滤得到超滤浓缩液，超滤所用溶液是纯化水，体积为上清液体积的5倍。
(2)向超滤浓缩液中加入NaCl终浓度为0.3mol/L，待完全溶解后，再加入0.7％(w/v)的脱氧胆酸钠，一边搅拌一边滴加冰醋酸调pH至4.5，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑用0.8μm滤膜澄清过滤。
(3)用氢氧化钠或氢氧化钾将上清液回调pH至中性，然后向得到的料液中加入Na2HPO4终浓度为0.01mol/L和NaH2PO4终浓度为0.01mol/L的作为缓冲体系，待完全溶解后，再加入乙酸钠终浓度为0.4mol/L、CaCl2终浓度为0.35mol/L，搅拌至溶解，向料液中滴加冰醋酸调pH至5.3～5.5，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，静置完成后，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑可以用0.8μm滤膜澄清过滤。
(4)将上一步得到的上清液用纯化水超滤，待透过端电导率低于10μs/cm收集多糖溶液，通过除菌过滤后收集多糖溶液。进一步将多糖溶液冻干制得肺炎球菌荚膜多糖。
实施例6
(1)将20型肺炎球菌发酵液经过杀菌后于2-8℃静置6～12小时，然后12000g，30～60min离心，收集上清液；上清液用孔径为100KD膜超滤得到超滤浓缩液，超滤所用溶液是纯化水，体积为上清液体积的5倍。
(2)向超滤浓缩液中加入NaCl终浓度为0.7mol/L，待完全溶解后，再加入0.5％(w/v)的脱氧胆酸钠，一边搅拌一边滴加冰醋酸调pH至4.5，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑用0.8μm滤膜澄清过滤。
(3)用氢氧化钠或氢氧化钾将上清液回调pH至中性，然后向得到的料液中加入Na2HPO4终浓度为0.01mol/L和NaH2PO4终浓度为0.01mol/L的作为缓冲体系，待完全溶解后，再加入乙酸钠终浓度为0.9mol/L、CaCl2终浓度为0.15mol/L，搅拌至溶解，向料液中滴加冰醋酸调pH至5.3～5.5，充分搅匀后于2～8℃静置12～16小时，静置完成后，然后12000g，30min离心，收集上清液，弃沉淀，上清液中如果有小碎屑可以用0.8μm滤膜澄清过滤。
(4)将上一步得到的上清液用纯化水超滤，待透过端电导率低于10μs/cm收集多糖溶液，通过除菌过滤后收集多糖溶液。进一步将多糖溶液冻干制得肺炎球菌荚膜多糖。
实施例7
本实施例提供了一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。具体步骤仅与实施例2不同的是，步骤(3)中加入CaCl2的终浓度为0.05mol/L。
实施例8
本实施例提供了一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。具体步骤仅与实施例5不同的是，步骤(3)中加入CaCl2的终浓度为0.10mol/L。
实施例9
本实施例提供了一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。具体步骤仅与实施例5不同的是，步骤(2)中采用脱氧胆酸钠浓度为0.4％。
对比例1
本对比例提供了一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。具体步骤仅与实施例2不同的是，步骤(2)中采用脱氧胆酸钠浓度为0.2％。
对比例2
本对比例提供了一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。具体步骤仅与实施例2不同的是，步骤(2)中采用冰醋酸料液调pH5.7。
对比例3
本对比例提供了一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。具体步骤仅与实施例5不同的是，步骤(2)中采用冰醋酸料液调pH4.0。
试验例
对实施例和对比例中制备的肺炎球菌荚膜多糖进行检定。
其中，回收率的计算：精制多糖总糖/发酵液中多糖总糖。
其中荚膜多糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中速率比浊法(3.3.2)进行；蛋白含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中(通则0731)进行；核酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中(通则0401)进行；总氮含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中(通则0704)进行；磷含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中(通则3103)进行；糖醛酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中(通则0401)进行；O-乙酰基含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中(通则3117)进行；甲基戊糖含量的检定《中华人民共和国药典》2020版三部中(通则0401)进行；氨基己糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中(通则0401)进行；荚膜多糖分子大小的测定依据《中华人民共和国药典》2020版三部3.1.2.10中第一法进行。检定结果见表1～表12。
表1实施例1的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-1-22105001 71-1-22106012 71-1-22107021
回收率％ (/) 68.91 67.96 65.03
蛋白 (≤2％) 0.25 0.32 0.29
核酸 (≤2％) 0.03 0.05 0.03
总氮 (3.5～6％) 4.72 4.67 4.83
磷含量 (0～1.5％) 0.46 0.42 0.48
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.15) 0.06 0.05 0.06
糖醛酸 (≥45％) 50.9 51.5 51.3
O-乙酰基 (≥1.8) 5.35 5.47 5.62
表2实施例2的回收率和质量控制指标
表3实施例3的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-7F-22107004 71-7F-22107006 71-7F-22107007
回收率％ (/) 65.83 69.25 67.86
蛋白 (≤5％) 0.75 0.82 0.87
核酸 (≤2％) 0.09 0.08 0.10
总氮 (1.5～4.0％) 2.47 2.83 2.68
磷含量 (0～1.0％) 0.38 0.40 0.38
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.20) 0.03 0.04 0.04
甲基戊糖 (≥13％) 18.6 17.3 17.8
表4实施例4的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-12F-22109003 71-12F-22109004 71-12F-22109005
回收率％ (/) 61.31 58.46 60.32
蛋白 (≤3％) 0.28 0.33 0.31
核酸 (≤2％) 0.06 0.05 0.05
总氮 (3.0～5.0％) 3.72 3.89 3.83
磷含量 (0～1.0％) 0.19 0.18 0.19
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.25) 0.08 0.05 0.09
氨基己糖 (≥25％) 28.5 27.8 28.9
表5实施例5的回收率和质量控制指标
表6实施例6的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-20-22110010 71-20-22110012 71-20-22110013
回收率％ (/) 65.21 64.67 66.38
蛋白 (≤2％) 0.51 0.43 0.47
核酸 (≤2％) 0.02 0.03 0.01
总氮 (0.5～2.5％) 1.08 1.01 1.02
磷含量 (1.5～4.0％) 2.43 2.51 2.58
分子量大小(KD) CL-2B(≤0.60) 0.38 0.40 0.39
氨基己糖 (≥12％) 13.2 13.6 13.5
表7实施例7的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-2-22109013 71-2-22109014
回收率％ (/) 63.42 65.21
蛋白 (≤2％) 1.87 1.73
核酸 (≤2％) 1.62 1.45
总氮 (0～1％) 0.92 0.85
磷含量 (0～1.0％) 0.76 0.69
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.15) 0.05 0.08
糖醛酸 (≥15％) 17.6 16.8
甲基戊糖 (≥38％) 39.3 39.8
表8实施例8的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-18C-22110018 71-18C-22110020
回收率％ (/) 58.98 60.32
蛋白 (≤3％) 1.86 2.05
核酸 (≤2％) 0.89 0.97
总氮 (0～1.0％) 0.73 0.89
磷含量 (2.4～4.5％) 4.01 3.93
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.15) 0.05 0.04
甲基戊糖 (≥14％) 16.1 15.6
表9实施例9的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-18C-22109010 71-18C-22109013
回收率％ (/) 59.85 62.87
蛋白 (≤3％) 2.76 2.83
核酸 (≤2％) 1.48 1.56
总氮 (0～1.0％) 0.58 0.69
磷含量 (2.4～4.5％) 3.97 4.18
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.15) 0.06 0.04
甲基戊糖 (≥14％) 16.8 17.1
表10对比例1的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-2-22108007 71-2-22108008
回收率％ (/) 69.87 65.36
蛋白 (≤2％) 1.90 2.01
核酸 (≤2％) 1.11 1.23
总氮 (0～1％) 1.96 1.89
磷含量 (0～1.0％) 0.65 0.72
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.15) 0.07 0.08
糖醛酸 (≥15％) 17.4 16.1
甲基戊糖 (≥38％) 40.8 39.7
表11对比例2的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-2-22108010 71-2-22109012
回收率％ (/) 60.13 59.84
蛋白 (≤2％) 2.23 2.15
核酸 (≤2％) 1.03 1.67
总氮 (0～1％) 1.26 1.19
磷含量 (0～1.0％) 0.71 0.88
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.15) 0.06 0.05
糖醛酸 (≥15％) 17.4 16.1
甲基戊糖 (≥38％) 39.5 38.9
表12对比例3的回收率和质量控制指标
检测项 (中国药典标准) 71-18C-22109014 71-18C-22110017
回收率％ (/) 52.45 51.16
蛋白 (≤3％) 2.11 2.97
核酸 (≤2％) 1.02 0.91
总氮 (0～1.0％) 0.57 1.01
磷含量 (2.4～4.5％) 3.15 2.89
分子量大小(KD) CL-4B(≤0.15) 0.04 0.07
甲基戊糖 (≥14％) 15.3 16.1
由检定结果可见，采用本发明的制备方法，肺炎球菌荚膜多糖的回收率较高，各项质量指标均符合中国药典标准的要求。
而对比例所制备的肺炎球菌荚膜多糖，其蛋白、总氮含量不能达到中国药典标准或回收率较低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供肺炎球菌发酵液，对所述肺炎球球菌发酵液杀菌、离心，收集第一上清液并超滤，得第一超滤液；
(2)将中性盐加入第一超滤液，再混入脱氧胆酸钠，以得到混合溶液，并且调节pH至4.5～5.0；而后离心收集第二上清液；
(3)对第二上清液回调pH至中性，通过钙盐沉淀杂质后，离心收集第三上清液；然后从所述第三上清液中干燥制得肺炎球菌荚膜多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱氧胆酸钠与所述第一超滤液的比例为0.4～0.7g:100mL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，控制所述混合溶液的氯离子浓度为0.3～0.7mol/L。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述钙盐包括CaCl2和乙酸钠；
以所述第二上清液的体积为基准，CaCl2的终浓度为0.05～0.35mol/L、乙酸钠的终浓度为0.4-0.9mol/L。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述钙盐还包括缓冲物质；以所述第二上清液的体积为基准，所述缓冲物质含有终浓度为0.005～0.015mol/L Na2HPO4和0.005～0.015mol/L NaH2PO4。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，全程不使用有毒有害试剂，所述有毒有害试剂包括：苯酚、丙酮、乙醇中的一种或多种。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，全程不使用外源大分子物质，所述外源大分子物质包括：核酸酶、蛋白酶中的一种或多种。
8.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，全程不使用层析填料及层析设备。
9.一种制备多价肺炎球菌疫苗的方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1～8中任一项所述的制备方法制得肺炎球菌荚膜多糖，而后将所述肺炎球菌荚膜多糖用于制备多价肺炎球菌疫苗。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述多价肺炎球菌疫苗为肺炎球菌多糖疫苗或肺炎球菌多糖结合疫苗。
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