CN110892076A - 一种快速高效纯化血清群x脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的工艺。本发明的荚膜多糖能够用于生产经济的单价荚膜多糖或多糖蛋白轭合物疫苗或多价组合疫苗以及血清群X脑膜炎感染的诊断工具。该工艺采用简单的盐和少量乙醇。该工艺是快速的、经济的并且可规模放大的，且具有高产量的纯化的血清群X脑膜炎奈瑟菌多糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的工艺。本发明的血清群X脑膜炎奈瑟菌细菌荚膜多糖能够用于生产经济的单价荚膜多糖或多糖蛋白轭合物疫苗或多价组合疫苗以及血清群X脑膜炎感染的诊断工具。
背景技术
脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎球菌或Men)是一种好氧的革兰氏阴性菌，其已经在血清学上主要分为A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z13个血清群。该分组系统是基于生物体的荚膜多糖。
WHO官方网站指出，脑膜炎奈瑟菌是世界范围内最常见的细菌性脑膜炎病因之一，是唯一能够引起大规模脑膜炎流行的细菌。据报道，该流行病的发病率高达每10万居民1000例，特别是在撒哈拉以南的非洲地区。
脑膜炎奈瑟菌通过气溶胶或直接接触患者或健康携带者的呼吸道分泌物进行传播。一般来说，地方性疾病主要发生在儿童和青少年人群中，3-12个月的婴儿发病率最高，而年龄较大的儿童和年轻人更容易患流行性疾病。然而，脑膜炎球菌病的快速发展往往导致发病后1-2天内死亡。脑膜炎奈瑟菌感染可以通过接种疫苗进行预防。
在非洲和亚洲，MenA是最普遍的血清群，但在北美则很少/几乎没有。在欧洲和美国，血清群B(MenB)是导致疾病和死亡的主要诱因，其次是血清群MenC和血清群MenW。近几年，撒哈拉以南的非洲地区开始出现MenX疫情。根据Xie O等人的文献(“非洲血清群X脑膜炎球菌疾病的出现：需要疫苗”，疫苗.2013Jun 12；31(27)：2852-6)，血清群X脑膜炎球菌曾被认为是散发性脑膜炎的罕见病因，但在2006-2010年期间，在尼日尔、乌干达、肯尼亚、多哥和布基纳法索都爆发了血清群X脑膜炎，后者的6732例报告病例中发现了至少1300例血清群X脑膜炎。
根据另一份NCBI的出版物，在2006-2009年期间，多哥的702例确诊的细菌性脑膜炎病例中，血清群X脑膜炎球菌占16％。2007年3月，科扎区发生了一次血清群X脑膜炎球菌爆发，血清群X脑膜炎球菌季节性累积发病率为33/100000。在2007-2010年期间，布基纳法索的血清群X脑膜炎球菌发病率占778例确诊细菌性脑膜炎病例的7％，2009至2010年有所增加(分别占所有确诊病例的4％至35％)。2010年，布基纳法索北部和中部地区发生了血清群X脑膜炎球菌流行病；3-4月期间，血清群X脑膜炎球菌的最高地区累积发病率估计为130/100000。
多血清群已经阻碍了脑膜炎球菌疾病通用疫苗的开发。因为迫切需要与这种致命疾病作斗争，第一支脑膜炎多糖疫苗的生产于1978年完成。后来观察到，普通多糖疫苗对2岁以下儿童并不十分有效。这些观察结果导致了进一步的研究，揭示了婴儿的免疫系统还不成熟，不能对普通多糖产生免疫应答。
免疫应答可分为T细胞依赖性(TD)免疫应答和非T细胞依赖性(TI)免疫应答。已知蛋白质和肽通过刺激辅助性T淋巴细胞和产生记忆细胞来诱导TD抗原。相比之下，多糖属于不会诱导T细胞激活并且不形成任何记忆B细胞的TI抗原，这是应对婴儿时的一个主要缺点，因为他们的免疫系统尚未成熟。
因此，有必要将细菌多糖与蛋白质载体轭合从而诱导T细胞依赖性免疫应答，其特征是在婴儿体内的免疫原性增强、保护时间延长并减少脑膜炎球菌鼻咽携带。这一需求是由多糖蛋白轭合物疫苗生产的独创性研究实现的，1999年英国批准了第一种脑膜炎球菌轭合物疫苗。
用于制备疫苗的多糖，特别是抗原荚膜多糖，可以是分别含有一种、两种或多种多糖的单价、二价和多价疫苗。这些用于预防由各种微生物引起的某些疾病或感染的产品在市场上很容易买到。单价或多价多糖基疫苗已使用多年，且已证明在预防诸如肺炎链球菌、脑膜炎球菌或流感嗜血杆菌病等疾病方面有十分重要的作用。然而，目前还没有包含血清群X脑膜炎球菌轭合物的许可疫苗。
纯化的脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的生产是其与载体蛋白的有效结合及其作为轭合物疫苗进行开发的首要条件。脑膜炎奈瑟菌的培养和多糖的纯化成本普遍较高，且由于其涉及一系列的生产和纯化步骤，因此需要的工作时间也较长。
生产和纯化步骤的改进能够促进研发有效且经济可行的轭合物疫苗。
有许多专利和非专利公开描述了多糖的生产和纯化工艺。在一篇非专利文献中，David Bundle等人(“血清群X脑膜炎奈瑟菌的血清群特异性多糖的研究及其分离方法的改进”，生物化学期刊,1974)讨论了脑膜炎奈瑟菌247X菌株中MenX多糖的制备和分离，其中所述菌株在一种化学限定培养基(NCDM)中培养18小时，产量约为20mg/L。另一项公开是US2015/0299750(Pisal Sambhaji Shankar等人)，其涉及使用新型发酵培养基、优化的投料方案(包括添加策略)和改进的无任何色谱法的纯化工艺纯化MenX。该公开的专利申请采用多步骤纯化粗制多糖，纯化工艺耗时长。
目前，用于血清群X脑膜炎奈瑟菌纯化的各种方法都需要相对较长的纯化时间，因此增加了生产成本，并且由于这些方法无法经济、及时地放大规模，使得该工艺在商业上的可行性较低。此外，这些方法还在多个阶段包括易燃溶剂。
本发明的目的是提供一种利用简单的盐(例如柠檬酸三钠和硫酸钠)在较短的时间内以较高的产率纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌细菌多糖的改进工艺，并且需要较少量的易燃溶剂。本发明所述改进的纯化工艺将以较低的成本生产多糖蛋白轭合物疫苗，随后疫苗能够以可负担的价格提供给儿童，特别是发展中国家的儿童。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的工艺。
本发明的另一个目的是提供一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌多糖的工艺，该工艺利用简单的盐沉淀杂质。
本发明的另一个目的是提供一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌多糖的工艺，该工艺使用较少量的易燃溶剂。
本发明的另一个目的是提供一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌多糖的工艺，该工艺简单、经济、省时，且在商业上是可规模放大的。
本发明的另一个目的是提供一种快速高效的纯化工艺，以获得纯化的血清群X脑膜炎奈瑟菌多糖，该多糖可用于生产经济的荚膜多糖或多糖蛋白轭合物单价疫苗或多价组合疫苗以及血清群X脑膜炎球菌感染的诊断工具。
本发明的另一个目的是生产出符合相关质量规范的高产量的优质产品。
发明内容
因此，本发明提供了一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的工艺。由本发明所述工艺获得的所述纯化的血清群X脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖能够用于生产经济的单价荚膜多糖或多糖蛋白轭合物疫苗或多价组合疫苗以及血清群X脑膜炎球菌感染的诊断工具。
所述纯化工艺在显著缩短的时间内提供纯化的血清群X脑膜炎奈瑟菌(也称为MenX)多糖。所述纯化工艺不需要任何色谱步骤。
本发明所述纯化工艺采用简单的盐，例如最佳浓度的柠檬酸三钠和硫酸钠。所述发酵液中的所述粗多糖与简单的盐混合，加入有机溶剂，离心并用100kDa MWCO聚醚砜膜进行超滤，形成杂质减少的溶液。然后用阳离子试剂，优选季铵盐表面活性剂(CTAB)，处理所述杂质减少的溶液，并在室温下进行混合。
对混合后所得到的溶液进行离心，得到沉淀物。用盐和乙醇溶解所述沉淀物并进行培养。将所得到的培养液再次离心，获得沉淀物，该沉淀物溶解于含有盐、去垢剂和乙醇的MQW中，然后进行混合。将所得到的溶液再次离心并收集上清液。
所述收集的上清液经过碳过滤，然后进行浓缩并用Milli Q超纯水(MQW)超滤，最后进行无菌过滤并储存所述纯化的细菌多糖。
因此，所述纯化的多糖通过一种可规模放大的并且经济有效的方法在显著缩短的时间内进行回收。
与现有技术相比，所述工艺具有诸多优点，例如提供了一种稳定且快速的生产满足所需规范的纯化多糖的方法，该方法具有更高的产率并且使用的易燃溶剂最少。另一个优点是该工艺是完全可规模放大的。
本发明所述纯化的细菌多糖能够用于生产经济的单价荚膜多糖或多糖蛋白轭合物疫苗或多价组合疫苗以及血清群X脑膜炎球菌感染的诊断工具。
附图说明
图1描绘了MenX-PS纯化的工艺流程
图2描绘了使用RI检测器纯化的MenX PS的HPLC色谱图
图3描绘了纯化的MenX PS的1H-NMR谱图
具体实施方式
本发明提供了一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的工艺。由本发明所述工艺获得的所述纯化的血清群X脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖能够用于生产经济的单价荚膜多糖或多糖蛋白轭合物疫苗或多价组合疫苗以及血清群X脑膜炎球菌感染的诊断工具。
所述纯化工艺在显著缩短的时间内提供纯化的血清群X脑膜炎奈瑟菌(也称为MenX)多糖。所述纯化工艺不需要任何色谱步骤。
本发明的纯化工艺采用简单的盐，例如最佳浓度的柠檬酸三钠和硫酸钠。所述发酵液中的所述粗多糖与简单的盐混合，加入有机溶剂，离心并用100kDa MWCO聚醚砜(PES)膜进行超滤，形成杂质减少的溶液。然后用阳离子试剂，优选季铵盐表面活性剂(CTAB)，处理所述杂质减少的溶液并进行混合。
对所得到的混合物进行离心，得到沉淀物。用盐和乙醇溶解所述沉淀物并进行培养。将所得到的培养液再次离心，获得沉淀物，该沉淀物溶解于含有盐、去垢剂和乙醇的MQW中，然后进行混合。将所得到的溶液再次离心并收集上清液。
所述收集的上清液经过碳过滤，然后进行浓缩并用MQW超滤，最后进行无菌过滤并储存纯化的细菌多糖。
图1显示了MenX的纯化工艺流程。所述快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌细菌多糖的工艺包含以下步骤：
(a)通过添加预定的简单盐溶液和特定浓度的盐干粉来处理血清群X脑膜炎奈瑟菌的发酵液；
(b)向步骤(a)中盐处理后的溶液中加入特定体积的有机溶剂；
(c)将步骤(b)中溶液在室温下混合特定时间；
(d)对步骤(c)的溶液以特定转速(rpm)和预定时间进行离心；
(e)从步骤(d)离心后的溶液中收集上清液；
(f)将步骤(e)中所述上清液浓缩并使用分子量截留膜进行超滤，获得部分纯化的细菌多糖；
(g)在特定条件下用至少一种阳离子去垢剂沉淀步骤(f)中的所述部分纯化的细菌多糖，然后在特定转速(rpm)下离心预定时间，获得第一沉淀物；
(h)将所述第一沉淀物溶解在无机沉淀剂中；
(i)将步骤(h)中溶解后的第一沉淀物在预定的培养条件下在至少一种有机溶剂中混合，以加强沉淀；
(j)将步骤(i)的溶液在特定条件下进行离心，然后收集第二沉淀物；
(k)将所述第二沉淀物溶解于MQW中，并用特定的化学试剂和特定的有机溶剂进行处理，然后在特定条件下进行培养；
(l)将步骤(k)中培养后的溶液在特定离心条件下进行离心，然后收集上清液；
(m)对步骤(l)中所述上清液进行碳过滤，获得碳滤液，直到达到所需的光密度；
(n)使用PES过滤组件对步骤(m)中的所述碳滤液进行过滤，然后在特定条件下进行浓缩和超滤；
(o)使用特定的PES过滤组件对步骤(n)中超滤后的上清液进行过滤，获得纯化的多糖；
(p)在特定条件下储存步骤(o)中的所述纯化的多糖。
所述工艺在147-323mg/L的范围内生产纯化的血清群X脑膜炎奈瑟菌多糖。所述平均收率为200mg/L。所述纯化工艺在24±2小时内完成。
在一个最佳实施例中，加入0.25M柠檬酸三钠、来自2M储存液的25％体积/体积硫酸钠溶液处理所述发酵液，然后加入25％体积/体积无水乙醇。所述溶液在室温(RT,25±2℃)条件下持续混合2小时。所述溶液在10550x g的条件下离心30分钟，收集上清液。浓缩所述上清液并用具有10-12体积MQW的0.1m2 100kDa聚醚砜(PES)膜进行超滤。
所述浓缩并超滤的材料用15％体积/体积的10％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)储存液进行处理，在室温条件下持续混合4小时。在10550x g的条件下离心40分钟，将所述收集的沉淀物溶解于0.15M氯化钙溶液中。溶解后，加入90％体积/体积的无水乙醇，2-8℃过夜培养。在10550x g的条件下离心40分钟，将所述收集的沉淀物溶解于MQW中，并进一步用10％质量/体积的醋酸钠、1.1％质量/体积的脱氧胆酸钠(DOC)和30％体积/体积的无水乙醇处理，2-8℃培养2小时。在10550x g的条件下离心30分钟，用乙醇处理的默克即用型(millistak pod)碳过滤器对所述收集的上清液进行碳过滤，直到260nm的光密度≤0.2。用0.2μ PES过滤组件对所述材料进行过滤。然后，对所述滤液进行浓缩并用具有15-20体积MQW的0.1m2 100kDa PES膜进行超滤，然后用0.2μPES过滤组件进行过滤。所述纯化的MenXPS储存于-20±2℃。
本发明所述纯化工艺在2.5L的发酵规模下的产率约为147-323mg/L纯化的MenXPS。
因此，通过使用一种可规模放大且经济有效的方法，能够在显著缩短的时间内对所述纯化的多糖进行回收。
与现有技术相比，所述工艺具有诸多优点，例如提供了一种稳定且快速的生产满足所需规范的纯化多糖的方法，该方法具有更高的产率并且使用的易燃溶剂最少。另一个优点是该工艺是完全可规模放大的。
本发明所述纯化的细菌多糖能够用于生产经济的单价荚膜多糖或多糖蛋白轭合物疫苗或多价组合疫苗以及血清群X脑膜炎球菌感染的诊断工具。
所述纯化后的多糖通过一系列已知的分析试验测试来控制所述多糖的质量。表1列出了对每批多糖进行的不同分析以及具有代表性的纯化的MenX多糖批次的结果。
表-1：纯化的MenX分析
| 参数 | 批次1 | 批次2 | 批次3 | 批次4 | 平均值 | SD |
| 磷(％) | 10.3 | 9.73 | 10.3 | 10.1 | 10.1 | 0.3 |
| 分子量(kD) | 456 | 569 | 661 | 554 | 560.0 | 83.9 |
| PS含量(mg/ml) | 1.97 | 0.9 | 0.67 | 0.83 | 1.1 | 0.6 |
| 核酸含量(％) | 1.34 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.9 | 0.3 |
| 蛋白质含量(％) | 0.44 | 0.44 | 0.42 | 0.47 | 0.4 | 0.0 |
| 内毒素(EU/μg) | 7.8 | 7.8 | 7.8 | 7.8 | 7.8 | 0.0 |
| 分子量分布(％) | 93.38 | 99.77 | 99.23 | 98.38 | 97.7 | 2.9 |
| PS产率(mg/L发酵液) | 323 | 152 | 147 | 179 | 200 | 83 |
EU:内毒素单位； SD:标准偏差
图2显示了使用RI检测器的有代表性的纯化的MenX多糖的HPLC-SEC色谱图。所述纯化的多糖的所述HPLC-SEC分析采用TSK 4000-5000PWXL HPLC串联柱进行，并以硝酸钠作为运行缓冲液，使用UV检测器进行监测。HPLC-SEC色谱图中的所述单主峰和其他物理化学分析(表1)证实了所述MenX多糖的纯度达到所需水平。
图3显示了有代表性的纯化的MenX多糖的1H-NMR谱。纯化的MenX多糖的所述1H-NMR以氧化氘(D2O)为溶剂记录在Bruker Avance 500MHz仪上。所述光谱峰证实了所述MenX多糖的特性。所述光谱中2ppm处的峰对应于所述多糖单体结构中所述N-乙酰基(NH-Ac)的CH3取代基的三个质子。5.5ppm处的所述峰代表αH-1端基质子。4.5-3.6ppm处的宽多重峰对应于氨基葡萄糖环上所有的其他质子。所述谱图中没有杂质的主峰，证明了所述多糖的纯度。
Claims (26)
1.一种快速高效纯化血清群X脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的工艺，其中所述工艺包含以下步骤：
(a)通过添加预定的简单盐溶液和特定浓度的盐干粉来处理血清群X脑膜炎奈瑟菌的发酵液；
(b)向步骤(a)中盐处理后的溶液中加入特定体积的有机溶剂；
(c)将步骤(b)中的溶液在室温下混合特定时间；
(d)对步骤(c)的溶液以特定转速(rpm)和预定时间进行离心；
(e)从步骤(d)离心后的溶液中收集上清液；
(f)将步骤(e)中所述上清液浓缩并使用分子量截留膜进行超滤，获得部分纯化的细菌多糖；
(g)在特定条件下用至少一种阳离子去垢剂沉淀步骤(f)中的所述部分纯化的多糖，然后在特定转速(rpm)下离心预定时间，获得第一沉淀物；
(h)将所述第一沉淀物溶解在无机沉淀剂中；
(i)向步骤(h)中溶解后的第一沉淀物中加入至少一种有机溶剂，然后在预定条件下进行培养；
(j)将步骤(i)的溶液在特定条件下进行离心，然后收集第二沉淀物；
(k)将所述第二沉淀物溶解于MQW中，并用特定的化学试剂和特定的有机溶剂进行处理，然后在特定条件下进行培养；
(l)将步骤(k)中培养后的溶液在特定离心条件下进行离心，然后收集上清液；
(m)对步骤(l)中所述上清液进行碳过滤，获得碳滤液，直到达到所需的光密度；
(n)使用PES过滤组件对步骤(m)中的所述碳滤液进行过滤，然后在特定条件下进行浓缩和超滤；
(o)使用特定的PES过滤组件对步骤(n)中超滤后的上清液进行过滤，获得纯化的多糖；
(p)在特定条件下储存步骤(o)中的所述纯化的多糖；
其中所述工艺是经济的、可规模放大的并且在147-323mg/L的发酵液范围内能够生产纯化的血清群X脑膜炎奈瑟菌多糖。
2.根据权利要求1所述工艺，其中所述预定的简单盐溶液和特定浓度的盐干粉是0.25±0.1M柠檬酸三钠和来自2M储存液的25±5％体积/体积硫酸钠溶液。
3.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(b)中的所述有机溶剂是25±5％体积/体积的无水酒精。
4.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(c)中用于所述混合的特定时间是2±0.5小时。
5.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(d)中的所述离心是在10000-11000x g的条件下离心30±5分钟。
6.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(f)中的所述超滤是使用具有10-12体积MQW的100kDa PES膜超滤进行的。
7.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(g)中的所述阳离子去垢剂是15±2％体积/体积的10％CTAB储存液。
8.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(g)中用阳离子去垢剂进行沉淀的所述特定条件是室温4±1小时。
9.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(g)中的所述离心是在10000-11000x g的条件下离心40±10分钟。
10.根据权利要求1所述工艺，其中所述无机沉淀剂是0.15±0.03M的氯化钙溶液。
11.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(i)中的所述至少一种有机溶剂是90±5％体积/体积的无水乙醇。
12.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(i)中的所述培养的所述预定条件是2-8℃下培养过夜。
13.根据权利要求1所述工艺，其中所述离心的特定条件是在10000-11000x g的条件下离心40±10分钟。
14.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(k)中所述特定的化学试剂包括但不限于10±2％质量/体积的乙酸钠和1.1±0.1％质量/体积的脱氧胆酸盐。
15.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(k)中所述特定的有机溶剂为30±5％体积/体积的无水乙醇。
16.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(k)中所述培养的特定条件是2-8℃培养2±0.5小时。
17.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(l)中所述离心的特定条件是在10000-11000xg条件下离心30±5分钟。
18.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(m)中所述碳过滤是用乙醇处理的默克即用型(Millistak Pod)碳过滤器进行的。
19.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(m)中所述所需的光密度是OD260nm小于等于0.2。
20.根据权利要求1所述工艺，其中步骤(n)中所述浓缩和超滤的特定条件是用具有10-20体积MQW的100kDa截留PES膜超滤。
21.根据权利要求1所述工艺，其中所述步骤(o)中的所述特定的PES过滤组件是0.2μPES过滤组件。
22.根据权利要求1所述工艺，其中储存所述纯化的多糖的所述特定条件是-20±2℃。
23.根据权利要求1所述工艺，其中所述工艺符合多糖特定的质量标准。
24.根据权利要求1所述工艺，其中血清群X脑膜炎奈瑟菌的纯化多糖产量达到323mg/L。
25.根据权利要求1所述工艺，其中获得所述血清群X脑膜炎奈瑟菌的纯化多糖的所述工艺在24±2小时内完成。
26.根据权利要求1所述工艺，其中所述纯化的细菌多糖能够用于生产经济的单价荚膜多糖或多糖蛋白轭合物疫苗或多价组合疫苗，以及血清群X脑膜炎感染的诊断工具。
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