CN112521520A - 脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法。该方法包括：对发酵澄清液进行超滤浓缩得到发酵浓缩液，所述发酵浓缩液的体积为所述发酵澄清液体积的1/10～1/3；将所述发酵浓缩液中加入CTAB至终浓度2％～3％搅拌以提取荚膜多糖；使用无机盐解离除去CTAB后醇沉荚膜多糖，离心收集沉淀再用水复溶得到粗多糖溶液；向所述粗多糖溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度0.3％～0.7％，搅拌；加入乙醇和醋酸钠调整至乙醇终浓度为27％～37％、醋酸钠终浓度为0.05mol/L～0.15mol/L，搅拌；以0.2μm～0.4μm孔径的深层滤堆进行过滤，向滤液中加入乙醇以沉淀荚膜多糖。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法。
背景技术
流行性脑脊髓炎是由脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)引起的细菌性脑膜炎(简称流脑)，是急性呼吸道传染病。约10％成人的鼻咽中有脑膜炎球菌的踪迹。流行性脑脊髓炎主要临床表现有发热、头痛、呕吐、皮肤粘膜瘀点、瘀斑及脑膜刺激等等。严重者可能会有败血症性休克和脑膜炎。此病发病急，病死率高，而且各年龄段都有可能发生，主要发生在15岁以下儿童身上。
脑膜炎双球菌有12种不同的血清群，根据它们多糖类荚膜的抗原性结构而分类。其中A群、B群、C群、Y群、W135群和X群引起的病例数占总病例数的95％以上。为了有效控制流行性脑脊髓膜炎A、C、W135和Y群四联流脑多糖疫苗，对成人志愿者免疫后，血清阳转率分别达到92.5％、92.5％、97.5％和95％，免疫效果是肯定的。WHO与1976年制定了单价A群和C群流脑多糖疫苗的制造检定规程，又于1980年进行了修订；补订了W135、Y群流脑多糖疫苗及A和C，A、C、W135和Y群二联和四联多糖菌苗制检规程。
多糖纯化工艺是疫苗生产过程中的主要环节，对疫苗的质量有直接影响。
发明内容
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，包括：
a)对发酵澄清液进行超滤浓缩得到发酵浓缩液，所述发酵浓缩液的体积为所述发酵澄清液体积的1/10～1/3；
b)向所述发酵浓缩液中加入CTAB至终浓度2％～3％(g/ml)，搅拌后，离心收集沉淀；
c)使用无机盐解离除去CTAB后，醇沉荚膜多糖，离心收集沉淀再用水复溶得到粗多糖溶液；
d)向所述粗多糖溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度0.3％～0.7％(g/ml)，搅拌；
e)加入乙醇和醋酸钠调整至乙醇终浓度为27％～37％(v/v)、醋酸钠终浓度为0.05mol/L～0.15mol/L，搅拌后静置；
f)用0.2μm～0.4μm孔径的深层滤堆进行过滤，向滤液中加入乙醇以沉淀荚膜多糖。
根据本发明的另一方面，还涉及如上所述方法制备得到的含脑膜炎球菌荚膜多糖的组合物。
本发明还涉及疫苗，其含有如上所述的组合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中通过将发酵澄清液超滤浓缩，先去除一部分杂质，减小后续除杂操作的压力，同时减小操作体积增加操作便利性；通过向粗制多糖溶液中加入脱氧胆酸钠来去除蛋白质和内毒素，从而取代苯酚抽提步骤，降低操作难度和操作安全风险；然后通过深层过滤对内毒素等杂质进行进一步分离纯化，进而拿到精制流脑多糖，多糖纯化工艺具有多糖产量高、产量稳定、杂质含量低等优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中制备得到的A群脑膜炎球菌荚膜多糖的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例2中制备得到的C群脑膜炎球菌荚膜多糖的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例3中制备得到的Y群脑膜炎球菌荚膜多糖的核磁共振氢谱图；
图4为本发明实施例4中制备得到的W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的核磁共振氢谱图；
图5为本发明实施例5中制备得到的X群脑膜炎球菌荚膜多糖的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，包括：
a)对发酵澄清液进行超滤浓缩得到发酵浓缩液，所述发酵浓缩液的体积为所述发酵澄清液体积的1/10～1/3；
b)向所述发酵浓缩液中加入CTAB至终浓度2％～3％(g/ml)，搅拌后，离心收集沉淀；
c)使用无机盐解离除去CTAB后，醇沉荚膜多糖，离心收集沉淀再用水复溶得到粗多糖溶液；
d)向所述粗多糖溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度0.3％～0.7％(g/ml)，搅拌；
e)加入乙醇和醋酸钠调整至乙醇终浓度为27％～37％(v/v)、醋酸钠终浓度为0.05mol/L～0.15mol/L，搅拌后静置；
f)用0.2μm～0.4μm孔径的深层滤堆进行过滤，向滤液中加入乙醇以沉淀荚膜多糖。
本发明中通过将发酵澄清液超滤浓缩，先去除一部分杂质，减小后续除杂操作的压力，同时减小操作体积增加操作便利性；通过向粗制多糖溶液中加入脱氧胆酸钠来去除蛋白质和内毒素，从而取代苯酚抽提步骤，降低操作难度和操作安全风险；然后通过深层过滤对内毒素等杂质进行进一步分离纯化，进而拿到精制流脑多糖，拿到的多糖具有产量高，产量稳定，杂质含量低等优势。
在一些实施方式中，所述发酵澄清液可采用公知的方法制备得到，例如在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，将已杀菌的培养液物，离心去菌体后收集上清。
在一些实施方式中，步骤b)中CTAB的终浓度还可以为2.2％、2.4％、2.5％、2.6％、2.8％(g/ml)。
在一些实施方式中，步骤e)中乙醇终浓度还可以为29％、32％、35％(v/v)。
在一些实施方式中，步骤e)中醋酸钠终浓度还可以为0.07mol/L、0.10mol/L、0.13mol/L。
在一些实施方式中，步骤f)后还包括步骤g)：
用水复溶醇沉得到的荚膜多糖，超滤浓缩，收集截留液并将其干燥。
干燥的方法优选冷冻干燥。
在一些实施方式中，所述无机盐为氯化钠。
在一些实施方式中，所述无机盐的终浓度为0.5mol/L～1.5mol/L，例如0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1mol/L、1.1mol/L、1.2mol/L、1.3mol/L、1.4mol/L。
在一些实施方式中，步骤d)中所述搅拌的时间为1.5h～2.5h(还可以为2h)。
在一些实施方式中，步骤e)中所述搅拌的时间为0.5h～1.5h(还可以为1h)，静置的时间为8h～16h(还可以为10h、12h、14h)，在2℃～8℃下进行。
在一些实施方式中，所述超滤浓缩所用滤膜的截留分子量为90k～110k，也可以为95k、105k，优选100k。
在一些实施方式中，所述醇沉所用的乙醇终浓度为65％～85％(v/v)，也可以为67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、77％、80％、83％。
在一些实施方式中，步骤b)中所述搅拌的时间为0.5h～1.5h(还可以为1h)。
在本发明中，孵育、复溶等描述的搅拌时间可以在室温下计算，室温例如18℃～30℃，也可以为20℃、22℃、25℃、27℃；优选在低温下计算，低温例如2℃～8℃，也可以为3℃、4℃、5℃、6℃、7℃。
在一些实施方式中，所述脑膜炎球菌的血清型选自A群、C群、Y群、W135群和X群中的一种或多种。
根据本发明的再一方面，还涉及如上所述方法制备得到的含脑膜炎球菌荚膜多糖的组合物。
本发明还涉及疫苗，其含有如上所述的组合物。
该组合物多糖纯度高，蛋白质、核酸及内毒等杂质含量低。纯度更高，使用更安全。
如前所述，本发明所提供的方法可以不采用传统荚膜多糖纯化工艺中常用的酚类、丙酮等有机试剂，CTAB由浓缩液中加入，用量更少，但提取效率更高。与此同时，最终产品的品质远超过药典的要求，蛋白质、核酸及内毒素等杂质的含量更低，未来使用更加安全，所得产品可应用于疫苗的制备。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1 A群脑膜炎球菌荚膜多糖制备
1.发酵澄清液超滤浓缩
采用100K膜包对发酵澄清液进行超滤浓缩，控制发酵浓缩液体积在发酵澄清液体积的1/5。
2.收集复合多糖沉淀：
向发酵浓缩液中加入10％CTAB至终浓度2.5％；室温搅拌1h，离心收集沉淀。
3.解离复合多糖沉淀：
用1mol/L氯化钠解离沉淀，搅拌至完全溶解。
4.醇沉多糖：
向解离后的多糖溶液中加入无水乙醇至终浓度80％，充分搅拌后，2～8℃静置过夜；
5.收集粗多糖溶液：
离心收集沉淀，用纯化水溶解多糖，室温搅拌至完全溶解；
6.除杂：
向多糖溶液中加入5％DOC至终浓度0.5％；室温搅拌2h；加入无水乙醇至终浓度32％，随即加入醋酸钠溶液至终浓度0.1mol/L；充分搅拌后2～8℃静置过夜。
7.深层过滤(科百特)：
用深层滤堆进行过滤，收集滤过液。
8.醇沉：
加无水乙醇至终浓度70％，离心收集沉淀，用纯化水溶解沉淀，室温搅拌至完全溶解。
9.稀释后超滤：
用100K膜包超滤纯化，收集截留液。
10.冻干：
冷冻干燥，保存。
实施例2 C群脑膜炎球菌荚膜多糖制备
1.发酵澄清液超滤浓缩
采用100K膜包对发酵澄清液进行超滤浓缩，控制发酵浓缩液体积在发酵澄清液体积的1/7。
2.收集复合多糖沉淀：
向发酵浓缩液中加入10％CTAB至终浓度2.1％；室温搅拌1h，离心收集沉淀。
3.解离复合多糖沉淀：
用1.2mol/L氯化钠解离沉淀，搅拌至完全溶解。
4.醇沉多糖：
向解离后的多糖溶液中加入无水乙醇至终浓度65％，充分搅拌后，2～8℃静置过夜；
5.收集粗多糖溶液：
离心收集沉淀，用纯化水溶解多糖，室温搅拌至完全溶解；
6.除杂：
向多糖溶液中加入5％DOC至终浓度0.3％；室温搅拌2h；加入无水乙醇至终浓度28％，随即加入醋酸钠溶液至终浓度0.06mol/L；充分搅拌后2～8℃静置过夜。
7.深层过滤(科百特)：
用深层滤堆进行过滤，收集滤过液。
8.醇沉：
加无水乙醇至终浓度68％，离心收集沉淀，用纯化水溶解沉淀，室温搅拌至完全溶解。
9.稀释后超滤：
用100K膜包超滤纯化，收集截留液。
10.冻干：
冷冻干燥，保存。
实施例3 Y群脑膜炎球菌荚膜多糖制备
1.发酵澄清液超滤浓缩
采用100K膜包对发酵澄清液进行超滤浓缩，控制发酵浓缩液体积在发酵澄清液体积的1/9。
2.收集复合多糖沉淀：
向发酵浓缩液中加入10％CTAB至终浓度2.7％；室温搅拌1h，离心收集沉淀。
3.解离复合多糖沉淀：
用0.8mol/L氯化钠解离沉淀，搅拌至完全溶解。
4.醇沉多糖：
向解离后的多糖溶液中加入无水乙醇至终浓度65％，充分搅拌后，2～8℃静置过夜；
5.收集粗多糖溶液：
离心收集沉淀，用纯化水溶解多糖，室温搅拌至完全溶解；
6.除杂：
向多糖溶液中加入5％DOC至终浓度0.7％；室温搅拌2h；加入无水乙醇至终浓度35％，随即加入醋酸钠溶液至终浓度0.13mol/L；充分搅拌后2～8℃静置过夜。
7.深层过滤(科百特)：
用深层滤堆进行过滤，收集滤过液。
8.醇沉：
加无水乙醇至终浓度72％，离心收集沉淀，用纯化水溶解沉淀，室温搅拌至完全溶解。
9.稀释后超滤：
用100K膜包超滤纯化，收集截留液。
10.冻干：
冷冻干燥，保存。
实施例4 W 135群脑膜炎球菌荚膜多糖制备
1.发酵澄清液超滤浓缩
采用100K膜包对发酵澄清液进行超滤浓缩，控制发酵浓缩液体积在发酵澄清液体积的1/3。
2.收集复合多糖沉淀：
向发酵浓缩液中加入10％CTAB至终浓度2.8％；室温搅拌1h，离心收集沉淀。
3.解离复合多糖沉淀：
用1.4mol/L氯化钠解离沉淀，搅拌至完全溶解。
4.醇沉多糖：
向解离后的多糖溶液中加入无水乙醇至终浓度70％，充分搅拌后，2～8℃静置过夜；
5.收集粗多糖溶液：
离心收集沉淀，用纯化水溶解多糖，室温搅拌至完全溶解；
6.除杂：
向多糖溶液中加入5％DOC至终浓度0.4％；室温搅拌2h；加入无水乙醇至终浓度37％，随即加入醋酸钠溶液至终浓度0.11mol/L；充分搅拌后2～8℃静置过夜。
7.深层过滤(科百特)：
用深层滤堆进行过滤，收集滤过液。
8.醇沉：
加无水乙醇至终浓度74％，离心收集沉淀，用纯化水溶解沉淀，室温搅拌至完全溶解。
9.稀释后超滤：
用100K膜包超滤纯化，收集截留液。
10.冻干：
冷冻干燥，保存。
实施例5 X群脑膜炎球菌荚膜多糖制备
1.发酵澄清液超滤浓缩
采用100K膜包对发酵澄清液进行超滤浓缩，控制发酵浓缩液体积在发酵澄清液体积的1/3。
2.收集复合多糖沉淀：
向发酵浓缩液中加入10％CTAB至终浓度2.5％；室温搅拌1h，离心收集沉淀。
3.解离复合多糖沉淀：
用1.4mol/L氯化钠解离沉淀，搅拌至完全溶解。
4.醇沉多糖：
向解离后的多糖溶液中加入无水乙醇至终浓度75％，充分搅拌后，2～8℃静置过夜；
5.收集粗多糖溶液：
离心收集沉淀，用纯化水溶解多糖，室温搅拌至完全溶解；
6.除杂：
向多糖溶液中加入5％DOC至终浓度0.4％；室温搅拌2h；加入无水乙醇至终浓度37％，随即加入醋酸钠溶液至终浓度0.11mol/L；充分搅拌后2～8℃静置过夜。
7.深层过滤(科百特)：
用深层滤堆进行过滤，收集滤过液。
8.醇沉：
加无水乙醇至终浓度74％，离心收集沉淀，用纯化水溶解沉淀，室温搅拌至完全溶解。
9.稀释后超滤：
用100K膜包超滤纯化，收集截留液。
10.冻干：
冷冻干燥，保存。
根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求对实施例1～4制备得到的脑膜炎球菌荚膜多糖进行检定。见表1。
表一 精制多糖检测结果
从鉴定结果可知，本发明制备得到不同血清群的脑膜炎球菌荚膜多糖制备，其蛋白质、核酸、内毒素含量低，多糖表达量可在0.6g/L发酵液。
实施例1～5所制备的得到的荚膜多糖的核磁共振氢谱图依次如图1～图5所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，包括：
a)对发酵澄清液进行超滤浓缩得到发酵浓缩液，所述发酵浓缩液的体积为所述发酵澄清液体积的1/10～1/3；
b)向所述发酵浓缩液中加入CTAB至终浓度2％～3％(g/ml)，搅拌后，离心收集沉淀；
c)使用无机盐解离除去CTAB后，醇沉荚膜多糖，离心收集沉淀再用水复溶得到粗多糖溶液；
d)向所述粗多糖溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度0.3％～0.7％(g/ml)，搅拌；
e)加入乙醇和醋酸钠调整至乙醇终浓度为27％～37％(v/v)、醋酸钠终浓度为0.05mol/L～0.15mol/L，搅拌后静置；
f)用0.2μm～0.4μm孔径的深层滤堆进行过滤，向滤液中加入乙醇以沉淀荚膜多糖。
2.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，步骤f)后还包括步骤g)：
用水复溶醇沉得到的荚膜多糖，超滤浓缩，收集截留液并将其干燥。
3.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述无机盐为氯化钠，终浓度为0.5mol/L～1.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，步骤d)中所述搅拌的时间为1.5h～2.5h。
5.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，步骤e)中所述搅拌的时间为0.5h～1.5h，静置时间为8h～16h，在2℃～8℃下进行。
6.根据权利要求1～5任一项所述的脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩所用滤膜的截留分子量为90k～110k。
7.根据权利要求1～5任一项所述的脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述醇沉所用的乙醇终浓度为65％～85％(v/v)。
8.根据权利要求1～5任一项所述的脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述搅拌的时间为0.5h～1.5h，在搅拌下进行。
9.根据权利要求1～5任一项所述的脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌的血清型选自A群、C群、Y群、W135群和X群中的一种或多种。
10.权利要求1～9任一项所述方法制备得到的含脑膜炎球菌荚膜多糖的组合物。
11.疫苗，其含有权利要求10所述的组合物。
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