CN112094328A

CN112094328A - 一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法

Info

Publication number: CN112094328A
Application number: CN202010994172.0A
Authority: CN
Inventors: 王涓; 聂翔; 吴清平; 丁郁; 张菊梅; 马国祥; 杨小鹃; 曾海燕
Original assignee: South China Agricultural University; Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: South China Agricultural University; Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明提供了一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法，包括以下方法：S1培养空肠弯曲杆菌，获得菌液；S2提取菌液外膜囊泡，获得粗提的外膜囊泡；S3采用Optiprep密度梯度离心法纯化粗提的外膜囊泡。本发明的将超速离心法和Optiprep密度梯度离心法相结合提取纯化空肠弯曲杆菌外膜囊泡，Optiprep梯度离心液浓度为35％的位置回收OMVs。本发明的方法还优化了空肠弯曲杆菌的培养基和培养条件，提高了空肠弯曲杆菌的生长率，这有利于获得更多的OMVs的，增加了OMVs的量。通过本发明的方法制备OMVs减少了杂质纯度更高。

Description

一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法。

背景技术

外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是细菌在生长过程中分泌到细胞外的大小为10-300nm的球形微粒，主要存在于革兰氏阴性菌中。其天然成分主要为脂多糖、磷脂、外膜蛋白、内膜蛋白、DNA/RNA、外毒素等。OMVs表现出了丰富多样的生物学功能。首先细菌OMVs对细菌生物膜形成有一定影响作用，能增强细菌生物膜形成能力及维持生物膜的稳定，为研究生物膜的形成机制提供了新角度和新方向。OMVs是分泌在细菌外膜表面的物质，可作为传递工具，携带和运输细菌的毒力因子，比如蛋白质、脂质、脂多糖及其他的活性物质，并将所带的毒力成分传递给宿主细胞，引起宿主细胞的感染。细胞与细胞之间、细胞与环境之间，OMVs能作为独立的分泌系统，传递细菌DNA/RNA、活性蛋白及小的信号分子，促进细胞间及细胞与外界的交流。同时作为一种新型的载体，能将OMVs进行不同的改造，例如将酶、蛋白质等成分包裹进OMVs，让其传递至宿主细胞体内发挥功能。许多OMVs的相关成分都是毒力因子，与宿主细胞相互作用，有助于破坏宿主细胞，造成免疫细胞的逃逸，入侵宿主细胞使其产生抗药性。

由于OMVs具有免疫原性及佐剂作用，能被哺乳动物细胞摄取，以及具有较强的重组能力，使OMVs成为新型的疫苗研究靶点，这对防治临床病菌的感染具有重要意义。而将OMVs作为一种疫苗，由于其没有生命力且不能复制，因此具有一定的安全性，因而也成为未来疫苗开发的热门研究对象。

OMVs的提取是研究OMVs与细菌生物膜形成、耐药性、毒力及与宿主细胞之间相互作用的基础，而如何获得高产且高纯度的OMVs显得尤为重要。目前对OMVs的提取主要是超速离心法，但其从菌液中分离回收得到的OMVs量太少，不适用于对OMVs量需求大的实验。且超速离心法分离得到的OMVs含有大量鞭毛等一些杂质。

因此，急需一种能够获得大量OMVs的提取和纯化的方法成为本领域亟待解决的技术问题，目前也还没有适用于空肠弯曲杆菌OMVs的提取方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法。本发明将超速离心法和Optiprep密度梯度离心法相结合，解决了空肠弯曲杆菌OMVs提取量少且细胞碎片、鞭毛等杂质大量存在的问题。

为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法，包括以下方法：

S1培养空肠弯曲杆菌，获得菌液；

S2提取菌液外膜囊泡，获得粗提的外膜囊泡；

S3采用Optiprep密度梯度离心法纯化粗提的外膜囊泡。

本发明的提取及纯化方法将超速离心法和Optiprep密度梯度离心法相结合，减少了空肠弯曲杆菌OMVs提取量少且细胞碎片、鞭毛等杂质大量存在的问题。

优选地，步骤1中培养空肠弯曲杆菌的培养基为MH培养基。发明人对比了其他种类的培养基，发现使用MH培养基空肠弯曲杆菌具有更好的生长率，提高了OMVs提取效率。

优选地，所述步骤1中培养空肠弯曲杆菌是在微需氧环境中培养，所述微需氧环境为：5％O₂，10％CO₂，85％N₂。发明人对比了在大气环境中与微需氧环境中空肠弯曲杆菌的生长情况，发现培养空肠弯曲杆菌微需氧环境具有更好的生长速率，有利于OMVs的提取。

优选地，所述步骤2中提取菌液外膜囊泡具体采用以下方法：将经过滤处理的菌液滤液进行浓缩，浓缩后进行超速离心，获得的沉淀即为粗提的外膜囊泡。

优选地，所述超速离心的参数为：4℃，150000×g，离心3h。

优选地，所述浓缩是将经过滤处理的菌液滤液转移至超滤管中，在4℃条件下，3000～5000×g离心20min，重复几次，直至溶液总体积减小。为保证浓缩效果及超滤管损耗小，离心力优选为4700×g。

优选地，所述超滤管截留的分子量为100KDa。本发明在所述过滤除菌后，收集滤液，为提高OMVs的回收率，将所述滤液进行浓缩，因此，选择分子量为100KDa的超滤管。

优选地，所述菌液滤液通过以下方法制备：将菌液在4℃下4000×g离心30min，弃掉菌沉淀，得到的上清液用0.22μm无菌滤头过滤，得到无菌滤液。

优选地，所述步骤3中采用Optiprep密度梯度离心法纯化粗提的外膜囊泡具体步骤如下：首先配制Optiprep梯度离心液用稀释至不同的梯度浓度，将粗提的OMVs提取物加入到超滤管的底部，并由下至上分别加入不同浓度的Optiprep梯度离心液；然后进行超速离心，离心条件为：超速离心机升降速均设置为9，4℃温度下100000×g超速离心16h。

优选地，所述Optiprep梯度离心液梯度浓度分别为：60％、37.5％、35％和32.5％。发明人设置了上述浓度梯度，最终发现在Optiprep梯度离心液浓度为35％的位置回收OMVs。

本发明的有益效果为：本发明的将超速离心法和Optiprep密度梯度离心法相结合提取纯化空肠弯曲杆菌外膜囊泡，Optiprep梯度离心液浓度为35％的位置回收OMVs。本发明的方法还优化了空肠弯曲杆菌的培养基和培养条件，提高了空肠弯曲杆菌的生长率，这有利于获得更多的OMVs的，增加了OMVs的量。通过本发明的方法制备OMVs减少了杂质纯度更高。

附图说明

图1为实施例步骤二粗提的OMVs的透射电镜图。

图2为实施例步骤三Optiprep密度梯度离心纯化后每一层的蛋白电泳图。

图3为实施例步骤三Optiprep密度梯度离心法纯化后第五层样品电镜图。

图4为空肠弯曲杆菌在不同培养基(MH、BH、BHI)中的生长曲线图。

图5为空肠弯曲杆菌在大气环境和微需氧环境下的生长情况以及提取的OMVs的蛋白质浓度。

图6为蔗糖密度梯度离心法纯化后每一层的蛋白电泳图。

图7为蔗糖密度梯度离心法纯化后第十层样品电镜图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

实施例

本实施例提供一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法，包括以下步骤：

步骤一：培养空肠弯曲杆菌

将空肠弯曲杆菌在血平板上活化，42℃，微需氧培养48h，挑取单菌落在血平板上增菌48h，并将血平板上的菌泥转至液体培养基MH，微需氧培养，42℃培养15h左右至OD600值达到1.0。

步骤二：提取OMVs

将培养好菌液转移至50mL无菌离心管中，4℃，4000×g离心30min，除去大部分菌体，上清液用0.22μm的无菌滤头过滤去除大部分细胞碎片，再将滤液转移至截留分子量为100KDa的超滤管中，4℃，4700×g离心20min，重复几次，直至溶液总体积浓缩为32mL左右。浓缩后的样品转移至32mL超滤管中，4℃，150000×g超速离心3h。去掉上清，沉淀用1mL的0.01M的PBS重悬，获得粗提的OMVs。

将粗提的OMVs样品滴加至碳包覆铜网上，滴加2％醋酸双氧铀，PBS洗三次，室温干燥，在电镜下进行检测。电镜图像显示OMVs为50-300nm间的球形囊泡状结构，且粗提的OMVs有很多鞭毛和细胞碎片等杂质，形态如图1所示。

步骤三：纯化粗提的OMVs

将Optiprep梯度离心液用50mmol/L Hepes-150mmol/LNaCl稀释至以下浓度:60％、37.5％、35％和32.5％。将粗提的1mL OMVs提取物加入到6mL超滤管的底部，并由下至上分别加入1mL 60％、1mL 37.5％、2mL 35％、1mL 32.5％的Optiprep梯度离心液，超速离心机升降速均设置为9，4℃温度下100000×g超速离心16h，离心完成后将离心液从上而下十等分体积取出，进行SDS-PAGE蛋白电泳实验，观察蛋白质条带，蛋白电泳图见图2。因为蛋白质条带的存在只是说明样品中可能含有OMVs，因此需要将有条带的样品吸取50μL在电镜下观察，电镜图片显示Optiprep密度梯度离心在第五层回收的OMVs量最多且纯度更高，如图3所示，Optiprep密度梯度离心回收率高，纯度也高。因此纯化OMVs采用Optiprep密度梯度离心，且在密度为35％左右的位置被回收。

对比例

对比例1、2比较了不同液体培养基中的生长情况，对比例1中采用BHI培养基空肠弯曲杆菌，对比例2采用布氏肉汤BH培养空肠弯曲杆菌。结果如图4所示，发现使用对比例1、对比例2中的培养基培养的空肠弯曲杆菌其生长情况不如实施例1中的MH培养基。

对比例3比较了菌液在大气环境的生长情况以及提取的OMVs的蛋白质浓度，结果如图5所示，与实施例1中在微需氧环境下培养空肠弯曲杆菌其生长情况以及提取的OMVs的蛋白质浓度较对比例3效果更好。

对比例4比较了使用蔗糖密度梯度纯化空肠弯曲杆菌OMVs的效果，具体操作如下：将蔗糖用50mmol/L Hepes-150mmol/LNacl稀释至以下浓度:60％、37.5％、35％和32.5％。将步骤三粗提的1mL OMVs提取物加入到6mL超滤管的底部，并由下至上加入1mL 60％、1mL37.5％、2mL 35％、1mL 32.5％的Optiprep试剂，超速离心机升降速均设置为9，4℃温度下100000×g超速离心16h，离心完成后将离心液从上而下十等分体积取出，进行SDS-PAGE蛋白电泳实验，观察蛋白质条带，蛋白电泳图见图6。

蔗糖密度梯度离心条带最多的第一层和第十层回收的OMVs量均很少且有杂质。如图7所示，因此，两种纯化方法相比而言，Optiprep密度梯度离心回收率更高，纯度也更高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法，其特征在于，包括以下方法：

S1培养空肠弯曲杆菌，获得菌液；

S2提取菌液外膜囊泡，获得粗提的外膜囊泡；

S3采用Optiprep密度梯度离心法纯化粗提的外膜囊泡。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中培养空肠弯曲杆菌的培养基为MH培养基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中培养空肠弯曲杆菌是在微需氧环境中培养，所述微需氧环境为：5％O₂，10％CO₂，85％N₂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中提取菌液外膜囊泡具体采用以下方法：将经过滤处理的菌液滤液进行浓缩，浓缩后进行超速离心，获得的沉淀即为粗提的外膜囊泡。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超速离心的参数为：4℃，150000×g，离心3h。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述浓缩是将经过滤处理的菌液滤液转移至超滤管中，在4℃条件下，3000～5000×g离心20min，重复几次，直至溶液总体积减小。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述超滤管截留的分子量为100KDa。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌液滤液通过以下方法制备：将菌液在4℃下4000×g离心30min，弃掉菌沉淀，得到的上清液用0.22μm无菌滤头过滤，得到无菌滤液。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中采用Optiprep密度梯度离心法纯化粗提的外膜囊泡具体步骤如下：首先配制Optiprep梯度离心液用稀释至不同的梯度浓度，将粗提的OMVs提取物加入到超滤管的底部，并由下至上分别加入不同浓度的Optiprep梯度离心液；然后进行超速离心，离心条件为：超速离心机升降速均设置为9，4℃温度下100000×g超速离心16h。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Optiprep梯度离心液梯度浓度分别为：60％、37.5％、35％和32.5％。