CN102497875A - 抑制空肠弯曲杆菌细菌感染的抗原组合物和方法及该抗原组合物的用途 - Google Patents

抑制空肠弯曲杆菌细菌感染的抗原组合物和方法及该抗原组合物的用途 Download PDF

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Abstract

用于在家禽中和人类中以及其他动物中降低空肠弯曲杆菌(C.jejuni)细菌感染的发生率的方法和组合物，所述组合物被配制为包括空肠弯曲杆菌抗原，且尤其是CadF、FlpA和FkA。抗原可以多肽的形式来提供或通过产生所述抗原的宿主来提供。空肠弯曲杆菌的纤连蛋白结合蛋白也可用来向人类和其他动物递送感兴趣的物质。

Description

抑制空肠弯曲杆菌细菌感染的抗原组合物和方法及该抗原组合物的用途
本公开内容涉及在家禽中和人类中降低空肠弯曲杆菌(C.jejuni)细菌感染的发生率，且更具体地涉及用于在动物中产生针对空肠弯曲杆菌的免疫应答的新颖抗原组合物、疫苗和方法。
背景
下文包括可用于理解本发明的信息。它并不承认本文所提供的任何信息是现有技术或与目前描述的或主张的发明有关，或被明确地引用或隐含地引用的任何出版物或文献是现有技术。
弯曲杆菌(Campylobacter)细菌属是革兰氏阴性的、螺旋形可运动病原菌，包括大量与多种动物(家畜和野生动物)有关的种，常见于鸡、火鸡、牛、羊、马和啮齿类动物。该细菌可通过多种传播途径感染宿主动物，包括通过食物、水和通过与其他动物相接触。普遍的是屠宰场中的肉的污染。人类通过操作或食用家禽产品而频繁地感染空肠弯曲杆菌。人类中的弯曲杆菌感染也超过了沙门氏菌感染的数量(Walker等人，Microbiologicalreviews，50：81-94(1986))。空肠弯曲杆菌是分离的与人类腹泻有关的最常见的弯曲杆菌种。在美国，空肠弯曲杆菌是每年导致2百万至3百万食物传染疾病的病例的原因，且所估计的治疗成本和生产力损失每年为80亿美元(Buzby，J.C.等人(1997)，J.Infect，Dis.176增刊2：S192-197)。由空肠弯曲杆菌导致的腹泻通常发病约2-7天，且是自限性的，但幼儿、老年人和免疫受损个体中的感染常需要抗生素治疗。弯曲杆菌可以在人类中引起肠道感染，且有时导致更严重的疾病如脑膜炎、神经系统并发症、阑尾炎、尿道感染和自发流产(Blaser等人，New Engl，J.Med.，305：1444-1452(1981)，Butzler等人，Clinics in Gastroenterol.，8：737-765(1979)，Schwerer等人，J.Endotox.Res，2：395-403(1995)和Salloway等人，Infect.Immun.64：2945-2949(1996)。空肠弯曲杆菌感染还与格林-巴利综合征(Guillaín-Barrésyndrome)有关(Altos，B.M.(2001)，Clin.Infect，Dis，32：1201-1206)
鉴于与该传染原有关的问题的严重性，非常需要用于在鸟、家禽和人类中抑制和防止空肠弯曲杆菌感染的新颖组合物和方法。本文描述的发明满足了该需要。
概述
本发明的实施方案涉及空肠弯曲杆菌抗原，其可用于在动物中引起针对空肠弯曲杆菌的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是保护性免疫应答，并防止(或明显降低)空肠弯曲杆菌在被施用抗原的动物中定殖或建立感染的能力。虽然任何年龄的动物可受益于抗原性组合物的施用，青年(青少年)、尤其是新生的动物常是疫苗接种的目标。
已将CadF抗原、FlpA抗原和FlaA抗原鉴定为特别有效的抗原。不受任何理论束缚，认为至少部分地暴露于空肠弯曲杆菌的表面上的这些抗原在介导空肠弯曲杆菌附着于动物细胞并由此感染动物细胞中具有作用，并可能是介导空肠弯曲杆菌附着于动物细胞并由此感染动物细胞所必需的。向动物施用这些抗原(完整的蛋白或其免疫学有效的部分)引起动物产生针对这些抗原的抗体。当随后将动物暴露于空肠弯曲杆菌时，抗体与细菌表面上的这些抗原性蛋白结合，而防止或阻遏细菌与细胞结合并感染细胞。
虽然CadF、FlpA和FlaA是单独地或组合地用于针对空肠弯曲杆菌感染的特别有效的抗原，还考虑了对于其常见空肠弯曲杆菌抗体反应的其他抗原的使用，所述其他抗原包括以下的空肠弯曲杆菌蛋白/多肽中的一种或多种：CmeA、CmeC、CjaA、CjaC、CJJ81176_0126或CJJ81176_0126同源物、CJJ81176_0128或CJJ81176_0128同源物、CJJ81176_0164或CJJ81176_0164同源物、CJJ81176_0164或CJJ81176_0164同源物或CJJ81176_0164、CJJ81176JJ586或CJJ81176_0586同源物、CJJ81176_1185或CJJ81176_1185同源物、CJJ81176_1295或CJJ81176_1295同源物、CJJ81176_1525或CJJ81176_1525同源物、FlaB、FlgE2、PEB2、PEB3、PorA、MapA和SdhB，或这些中任一种的一个或多个抗原性片段。
在一些实施方案中，FlpA基于其与人类细胞和纤连蛋白的结合，可用于向人类细胞提供抗原、药剂(pharmaceutical)、药物(drug)(例如，抗癌药物)、毒素等。可类似地使用空肠弯曲杆菌的其他抗原，例如，以与感兴趣的物质的嵌合体或融合产物的形式来使用。
本发明提供了用于防止或治疗空肠弯曲杆菌在动物中定殖的方法。该方法包括以下的步骤：向动物提供1)一种或多种空肠弯曲杆菌多肽；或2)经基因工程以含有并表达编码一种或多种空肠弯曲杆菌多肽的核酸序列的宿主。
本发明还提供了经基因工程化以含有并表达一种或多种空肠弯曲杆菌多肽的核酸序列的宿主。
本发明的另外的实施方案提供了具有来自空肠弯曲杆菌的至少一种异源多肽的内部插入物的经修饰的细菌S-层蛋白。
本发明还提供了用于在动物中产生针对空肠弯曲杆菌的免疫应答的抗原性组合物。所述抗原性组合物包括1)选自由空肠弯曲杆菌CadF、FlaA、FlpA和其抗原性片段组成的组的至少一种第一多肽；和2)不同于所述第一多肽的至少一种第二空肠弯曲杆菌多肽。
本发明还提供了用于向受治疗者递送感兴趣的物质的方法。所述方法包括以下步骤：1)向受治疗者提供含有空肠弯曲杆菌的纤连蛋白结合蛋白和感兴趣的物质的融合产物，其中所述纤连蛋白结合蛋白和所述感兴趣的物质彼此关联(associated with one another)；和2)允许所述融合产物在所述受治疗者的细胞或组织中与纤连蛋白结合。
附图简述
图1A和B显示了Cj S3B-SPF血清针对提取自A，同源菌株(S3B)和B，异源菌株(81-176)的空肠弯曲杆菌外膜蛋白的反应性。x轴的数字表示血清样品的标识号。垂直条柱代表算术平均值，误差线代表三个重复样品的标准偏差。水平线代表从采集自未被空肠弯曲杆菌定殖的对照鸡的9种血清中确定的阴性截断值。
图2.数据代表如从用Cj S3B-SPF血清探针检测的空肠弯曲杆菌同源菌株(S3B)和异源菌株(81-176)的外膜蛋白(OMP)提取物的免疫印迹中确定的，与母体抗体反应的条带的存在(X＝强反应性，O＝弱反应性)或不存在(空白)，以表格形式呈现。
图3显示Cj S3B-SPF混合血清含有降低空肠弯曲杆菌S3B的运动性的抗体但没有降低空肠弯曲杆菌81-176的运动性的抗体。图：A，用空肠弯曲杆菌S3B菌株进行的运动性测定；和B，用空肠弯曲杆菌81-176菌株进行的运动性测定。水平线(白色)表示斑点的直径(即，从细菌区域的中心到边缘)。
图4示出了通过LC/MALDI/TOF-TOF鉴定的空肠弯曲杆菌81-176外膜蛋白。
图5描绘了通过纳升级LC/MS/MS(nano-LC/MS/MS)鉴定的预测的“最适(best-fit)”免疫原性膜相关空肠弯曲杆菌蛋白。
图6显示了与鸡LMH肝细胞癌上皮细胞结合的空肠弯曲杆菌的数量。每个条柱代表与24孔板的每个孔的LMH细胞结合的空肠弯曲杆菌的平均值±标准偏差。星号(*)表示如利用学生t-检验所确定的，空肠弯曲杆菌F38011野生型分离株和同基因突变体之间的统计学显著的差异(P＜0.05)。
图7显示了CadF、PEBl和Cj1279c有利于肉鸡的空肠弯曲杆菌定殖。“N”表示在10只鸡的组中被空肠弯曲杆菌定殖的鸡的数量(检测限103CFU/克盲肠内容物)。条柱表示每组的中值CFU，其是利用组中的所有鸟来确定的。不存在条柱时表示空肠弯曲杆菌的数量低于检测限。
图8显示了Cj1279c(flpA)编码粘附素。每个条柱代表与24-孔板的每个孔中的LMH细胞结合的空肠弯曲杆菌的数量的平均值±标准偏差。星号(*)表示如利用学生t-检验所确定的，空肠弯曲杆菌F38011野生型分离株和同基因突变体之间的统计学显著的差异(P＜0.05)。
图9.空肠弯曲杆菌NCTC 11168菌株中flpA基因的显著特征和其推断的氨基酸序列。空肠弯曲杆菌F38011菌株中的flpA基因是含有总共4个基因的多顺反子操纵子中的第二个基因。NCTC 11168中的flpA基因是1236个核苷酸。FlpA推断的氨基酸序列的检查显示在NCTC 11168菌株、RM1221菌株、81-176菌株、81116菌株和F38011菌株(箭头)中，在三个纤连蛋白3型结构域(Fn3，第40-132位残基、第135-227位残基和第220-407位残基)，和原核膜脂蛋白脂质附着位点(箭头)中几乎没有残基的差异。“a”＝在以上所列的四种空肠弯曲杆菌的序列(SEQ ID NO：50)的一个或多个中不同的残基；“b”＝纤连蛋白，II型结构域(SSF49265，第40至132位残基，第135至227位残基，第220至407位残基)；“c”＝原核膜脂蛋白附着位点。
图10A和B.如通过用FlpA特异性血清进行的免疫印迹分析所判断的，对从空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株和flpA同基因突变体中制备的空肠弯曲杆菌全细胞裂解物(WCL)和外膜蛋白(OMP)提取物中的FlpA的检测。WCL和OMP提取物通过SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺)和免疫印迹分析来解析，如“材料和方法”中所描述。图(A)的左侧的印迹显示了用FlpA特异性血清探针检测的空肠弯曲杆菌WCL的印迹，和图(B)的右侧的印迹显示了用FlpA特异性血清探针检测的空肠弯曲杆菌OMP的印迹。泳道：1，空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株；2，空肠弯曲杆菌flpA突变体；和3，空肠弯曲杆菌flpA(flpA+)补偿菌株。突出显示了FlpA 46kDa蛋白的位置(箭头)。左侧指出了分子量标准的位置(单位为kDa)。
图11.FlpA蛋白含有表面暴露的结构域。利用空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株(图A-C)和flpA同基因突变体(图D-F)进行了间接的免疫荧光显微术，如“材料和方法”中所描述。利用兔FlpA特异性血清孵育空肠弯曲杆菌(图A-F)，然后用Cy2轭合的山羊抗兔第二抗体进行孵育。通过用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色来察看所有细菌。利用NikonEclipse TE2000倒置落射荧光显微镜来察看样本。容易地观察到了用兔α-空肠弯曲杆菌全细胞血清孵育的空肠弯曲杆菌野生型菌株和flpA突变体(未示出)，而仅有用兔FlpA特异性血清孵育的空肠弯曲杆菌野生型菌株被染色。
图12.FlpA促进了空肠弯曲杆菌与人类上皮细胞的结合。用人类INT407上皮细胞和空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株、cadF突变体、flpA突变体和flpA(flpA+)补偿菌株进行体外粘附测定，如“材料和方法”中所描述。包括作为阴性对照的空肠弯曲杆菌cadF突变体，因为文献中已广泛记载CadF是粘附素。数值代表与24孔组织培养盘的每个孔的INT 407细胞结合的活细菌的平均值±标准偏差。星号(*)表示如通过学生t检验所判断的，与INT 407细胞结合的细菌的数量和空肠弯曲杆菌野生型菌株的数量存在统计学差异(P＜0.01)。
图13.利用FlpA特异性血清抑制空肠弯曲杆菌与人类INT 407上皮细胞结合。在接种INT 407细胞之前用FlpA特异性血清或出血前(prebleed)血清的指示稀释液孵育细菌30分钟。如“材料和方法”中所描述的进行粘附测定。数值代表与24孔组织培养盘的每个孔的INT 407细胞结合的活细菌的平均值±标准偏差。星号(*)表示如通过学生t检验所判断的，与INT 407细胞结合的细菌的数量和空肠弯曲杆菌野生型菌株的数量存在统计学差异(P＜0.01)。
图14.FlpA与纤连蛋白的结合是可饱和的。用FlpA-GST蛋白和CadF-GST蛋白的2倍连续稀释液孵育纤连蛋白包被的孔，并如“材料和方法”中所描述的检测所结合的蛋白。包括作为阳性对照的空肠弯曲杆菌CadF蛋白。重复三次检验样品，且每个数据点含有代表性实验的平均值±标准偏差。
图15A和B.CadF和FlpA介导与宿主细胞和Fn的结合。A，利用人类INT 407上皮细胞和空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株、cadF突变体、flpA突变体和cadF flpA双突变体进行体外粘附测定，如“材料和方法”中所描述。数值代表与24孔组织培养盘的每个孔的INT 407细胞结合的活细菌的平均值±标准偏差。星号(*)表示如通过学生t检验所判断的，与INT 407细胞结合的细菌的数量和空肠弯曲杆菌野生型菌株的数量存在统计学差异(P＜0.01)。B，利用活细菌和Fn包被的孔进行空肠弯曲杆菌-Fn结合测定，如“材料和方法”中所描述。结果表示为所结合的细菌相对于空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株的百分比。
图16A-C.用于本研究的Fn和Fn片段的图解：A，全长纤连蛋白(Fn)；B，Fn N-末端结构域(NTD)；C，明胶结合结构域(GBD)。NTD和GBD通过用嗜热菌蛋白酶消化Fn产生。
图17A-C.FlpA蛋白、FlpA结构域和合成的肽的一级结构：A，全长的FlpA，“S”标明了信号肽，B，三个FlpAFN3样重复序列的GST融合蛋白，C，FlpA结构域2(FlpA-D2)的氨基酸序列和7个合成肽P1-P7的氨基酸序列。预测β链二级结构的氨基酸序列用<->和灰色框来表示。
图18A和B.A，FlpA和三个FlpA FN3样结构域(D1、D2和D3)对Fn包被的孔的附着。利用用1μg的Fn过夜包被的孔来进行ELISA。将GST融合蛋白(FlpA全长、FlpA-D1、FLpA-D2和FlpA-D3)的连续稀释液添加到每孔中。用针对GST的第一抗体和第二HR轭合物来检测所结合的FlpA蛋白的量。如材料和方法中所描述的对所有样品重复三次进行操作。B，Fn对包被有FlpA和三个FlpAFN3样结构域的孔的附着。对于ELISA实验，利用FlpA全长、FlpA-D1、FlpA-D2、和FlpA-D3过夜包被孔。将Fn的连续稀释液添加到每孔。用抗Fn的第一抗体和第二HR轭合物检测结合的FlpA蛋白的量。
图19.Fn对于用FlpA肽P1-P5包被的孔的附着。为确定哪种肽与Fn结合，用5种FlpA肽过夜包被ELISA板。在孔中孵育Fn，并如先前进行检测。
图20.FlpA P7(N147-S166)含有FlpA Fn结合结构域。如先前进行ELISA。用FlpA肽包被微量滴定板，并用分光光度法确定结合的Fn的量。
图21.ClustalW序列比对。将FlpA-D2(第135-224位氨基酸)的氨基酸序列与来自Fn的FN3结构域的序列相比较。FlpA-D2与FN31最相似，共有22.9％序列同一性，15.7％保守性置换，和21.7％半保守性置换。
图22A-D.FlpA结合Fn的明胶结合结构域(GBD)中的位点。进行ELISA以确定FlpA是否结合Fn的NTD或GBD。用Fn、GBD、NTD或卵清蛋白(阴性对照)过夜包被微量滴定板。将A，FlpA全长，B，FlpA-D1，C，FLpA-D2，和D，FlpA-D3的连续稀释液添加到孔中并如先前确定所结合的FlpA蛋白的量。
图23示出了空肠弯曲杆菌对肉鸡的定殖。在孵化的第1天和孵化后第4天将乳酸杆菌通过口服填喂(～108CFU)施用于肉鸡。在孵化后第14天通过口服填喂将空肠弯曲杆菌F38011(～108CFU)施用于接受空肠弯曲杆菌攻击的小鸡。在(A)攻击后第7天，使一半的鸡安乐死并进行剖检，并在(B)攻击后第14天，使剩余的鸡安乐死并进行剖检。从每只鸡中切取盲肠，称重，稀释于等体积的MH肉汤中，并彻底消化。将样品进行连续稀释并铺板于Campy Cefex琼脂上以用于计数。
图24A和B显示了抗空肠弯曲杆菌血清抗体。如材料和方法中所描述的，在(A)攻击后第7天和(B)攻击后第14天通过ELISA确定肉鸡中的抗空肠弯曲杆菌血清抗体的水平。用空肠弯曲杆菌全细胞裂解物来包被微量滴定板，并用来自鸡的血清进行孵育。X-轴显示了鸡样品标识号和处理组。每个样本的抗体水平通过白色条柱来表示。空肠弯曲杆菌(灰色)和乳酸杆菌(黑色)的微生物计数显示为CFU/克盲肠内容物。
图25A和B显示了抗α毒素血清抗体。如材料和方法中所描述的，通过ELISA确定(A)攻击后第7天和(B)攻击后第14天肉鸡中的抗产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)α毒素血清抗体的水平。X轴显示了鸡样品标识号和处理组。每个样本的抗体水平通过白色条柱来表示。空肠弯曲杆菌(灰色)和乳酸杆菌(黑色)的微生物计数显示为CFU/克盲肠内容物。
图26显示了从口服接种空肠弯曲杆菌的肉鸡中采集的血清中的抗体的反应性。在用空肠弯曲杆菌81116接种后15天从鸡中采集血液。泳道：1，空肠弯曲杆菌81116全细胞裂解物(wcl)；2，空肠弯曲杆菌81116外膜蛋白(omp)制备物；和3，空肠弯曲杆菌81116wcl。右图中显示的印迹是利用1∶50稀释的鸡血清孵育的。箭头突出显示了已知的蛋白(62kDa＝FlaA，37kDa＝CadF)，迄今发现它们与被检验的每个血清(n＝10)相反应。实心点表示其身份将通过质谱法来确定的蛋白。
图27显示了对空肠弯曲杆菌FlaA纤丝蛋白的分析。将来自26个FlaA蛋白的推断的氨基酸序列进行比对以确定保守区域。阴影示出的是分别具有高于90％氨基酸同一性和50％氨基酸同一性的残基/区域。黑线指示了增高的变异性的区域(即，非保守的，插入或缺失)。彩图下指示的30-mer(SEQ ID NO：3)代表了其中30个残基中的28个为90％以上保守的区域。相对于残基220下游的区域，191-220区域代表了用于掺入乳酸杆菌S层蛋白的良好靶标。
图28显示了瑞士乳杆菌(L.helveticus)SlpA蛋白的亲水性分布图。Y-轴显示的是，对中心位于X-轴上所列的残基数目的19个残基窗口所计算的单位为千卡/摩尔的亲水性。
图29显示了CadF Fn-BD掺入到瑞士乳杆菌S层蛋白中。A图是CBB-R250染色的凝胶。B图是用山羊α-CadF血清探针检测的印迹。泳道：1，从野生型菌株提取的S层蛋白；2，具有野生型slpA等位基因的转化体；3和4，在slpA基因的位点1具有CadF Fn-BD(12mer)的独立的转化体。(箭头)指示了具有CadF Fn-BD的S层。
图30显示了为将定殖接种乳酸杆菌疫苗菌株的鸡与非疫苗接种的鸡的空肠弯曲杆菌的数量相比较而进行的实验设计。在每个实验组中有20只鸟。
图31示出了鸡的空肠弯曲杆菌定殖与重组的新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)的竞争排他。N＝接种后两周在其盲肠中具有可检测数量的空肠弯曲杆菌的(10只中的)鸟的数量。新月柄杆菌CadF/FlaA/PorA是疫苗菌株。
图32示出了抑制鸡的定殖并刺激抗CadF肽(第128-143位氨基酸)的特异性抗体反应的新月柄杆菌CadF/FlaA2/PorA疫苗菌株。
图33A-C.来自8种不同的空肠弯曲杆菌菌株的FlaA序列的比较。
详述
本发明的实施方案提供了免疫原性的空肠弯曲杆菌抗原，其为免疫原性的并可用来在施用抗原的动物中引起针对空肠弯曲杆菌的免疫应答。感兴趣的特定的抗原包括CadF、FlaA和FlpA，以及如本文所描述的(例如，在表1中)其他抗原。
本文所呈现的结果首次显示被良好表征的37kDa纤连蛋白结合蛋白CadF在鸡中是免疫原性的。值得注意的是，在空肠弯曲杆菌S3B菌株和81-176菌株两者中均检测到鸡的空肠弯曲杆菌定殖所必需的CadF蛋白(Ziprin，R.L.，等.(1999)，Avian Dis.43：586-589)。本文所鉴定和提供的CadF的优选的表位包括30-氨基酸序列HYGAGVKFRLSDSLALRLETRDQINFNHAN(第127-156位残基，SEQ IDNO：1)和其能够产生所期望的免疫应答的片段，例如，序列FRLS(SEQ IDNO：2)。
FlpA抗原或其免疫原性的部分还可用于本发明的方法和组合物中。在一个实施方案中，FlpA的免疫原性部分是FlpA的第141-170位残基：FVQAVTNLPNRIKLIWRPHPDFRVDSYIIE(SEQ ID NO：3)。
FlaA抗原或其免疫原性部分还可用于本发明的组合物和方法中。在一个实施方案中，FlaA的免疫原性部分是FlaA的第278-307位残基：INAVKDTTGVEASIDANGQLVLTSADGRGI(SEQ ID NO：4)。
定义
以下或本说明书中其他处未定义的术语应具有其领域公认的含义。
本文所提供的化合物(例如，肽和蛋白)中所用的氨基酸可以是遗传编码的氨基酸、天然存在的非遗传编码的氨基酸、或合成的氨基酸。以上中的任何的L-对映体和D-对映体二者可用于化合物中。以下的缩略语可在本文中使用以用于以下遗传编码的氨基酸(和其残基)：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和缬氨酸(Val，V)。
本发明提供了编码如本文所描述的空肠弯曲杆菌抗原的核酸序列(其可以是基因)，以及作为这些序列的变体的核苷酸序列或与这些序列同源的核苷酸序列。所述多核苷酸通常例如在至少约15、20、30、40、50、或100或更多个连续核苷酸的区域内与相关序列具有至少约70％同源性，且可能表现出至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。如本文所用的，术语“同源性和同源物”还用来指来自遗传相关的但并不相同的生物体(例如，如通过其菌株编号来鉴定的不同的细菌菌株)的相应的多核苷酸或蛋白。这些多核苷酸和多肽可以是相同的，或它们可以，例如，具有序列变异。
同源序列或变体序列通常与本文所公开的序列有至少(或不超过)约1、2、5、10、15、20或更多个突变(其可以是置换、缺失或插入)的不同。关于计算同源性，这些突变可跨越以上所述的区域中的任何一个来测量。同源序列通常以显著高于背景的水平与原始序列选择性地杂交。选择性杂交通常利用中严格度到高严格度的条件(例如，从约50℃到约60℃下，0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠)来实现。
同源性的水平或程度可基于本领域中的任何方法来计算。例如，UWGCG包提供了BESTFIT程序，其可用来计算同源性(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12，第387-395页(1984))。PILEUP算法和BLAST算法可用来计算同源性或比对序列，例如，如Altschul S.F；J Mol Evol 36：290-300(1993)；Altschul，S.F.等人；J Mol Biol 215：403-10(1990)中所描述的。用于进行BLAST分析的软件是可通过美国国立生物技术信息中心可公开获得的。
本发明还包括可与本文所公开的序列互补的核酸序列。互补序列可以是DNA、RNA或其杂合体(hybrid)。术语“互补的”一般指多核苷酸通过碱基配对的天然结合，且可以是完全的或部分的。“可杂交的”和“互补的”是用来指足够的互补性程度，使得在DNA靶标或RNA靶标和多核苷酸之间发生结合，例如优选足以进行预期作用的稳定的结合。
如本领域中的技术人员所理解地，术语“严格条件”指允许多核苷酸之间杂交的条件。例如，严格盐浓度一般将低于约750mM NaCl和75mM柠檬酸钠，优选地低于约500mM NaCl和50mM柠檬酸钠，且更优选地低于约250mM NaCl和25mM柠檬酸钠。严格温度条件一般将包括至少约30℃的温度，更优选地为至少约37℃的温度，且最优选地为至少约42℃的温度。Berger和Kimmel，Methods In Enzymology，卷152：Guide ToMolecular Cloning Techniques(分子克隆技术指南)，San Diego(1987)：Academic Press，Inc.和Sambrook等人.，Molecular Cloning(分子克隆)(1989)：A Laboratory Manual(实验室手册)，第2版.，卷1-卷3，Cold SpringHarbor Laboratory)。
一般，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”指经由肽键连接的两个或多个单独的氨基酸(无论是否天然存在的)的任何聚合物，“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互换地使用。相似地，这些术语涵盖蛋白片段、类似物、衍生物和变体。术语蛋白的“片段”或“部分”指包括少于蛋白的所有氨基酸残基的多肽。蛋白的“结构域”也是片段，且包括赋予活性、功能或结构所通常需要的蛋白的氨基酸残基。在一些实施方案中，本文提供的多肽具有相对于参考氨基酸序列的保守氨基酸置换。本发明包括如本文所描述的空肠弯曲杆菌蛋白(多肽，肽)，以及与所公开的氨基酸序列具有约至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的氨基酸序列变体。更通常地，所述变体序列相对于本文所明确公开的氨基酸序列具有1个和5个之间的(例如，1个、2个、3个、4个或5个)保守氨基酸置换。抗原性片段(或表位，抗原决定簇等)包括能够引起所期望的免疫应答的多肽的任何部分。
对由鸡母体抗体识别的空肠弯曲杆菌蛋白的鉴定
本发明的普通方面涉及通过在动物中促进针对空肠弯曲杆菌的免疫应答而用于减少定殖于动物的空肠弯曲杆菌的数量的方法和组合物。在一些实施方案中，动物是鸟诸如鸡。这直接解决了由通过家禽暴露于空肠弯曲杆菌导致的人类感染，因为预期空肠弯曲杆菌暴露的鸡的数量的减少导致人类对于空肠弯曲杆菌的较少的暴露。
该问题通过首先查看鸡母体抗体来解决。在鸡中，针对空肠弯曲杆菌的抗体的水平在鸡的生命周期中明显变化。在小鸡孵化时，针对空肠弯曲杆菌的母体抗体处于高水平。这些由母体转移到小鸡的母体抗体在小鸡中保持高水平，持续3-4天，此时它们逐渐降低直至在约2-3周龄时变为不可检测。重要地是，空肠弯曲杆菌对小鸡的定殖与这些母体抗体的降低同步。母体抗体保护小鸡不受空肠弯曲杆菌感染的机制不清楚。它们可干扰细菌运动性，通过凝集作用促进清除、阻遏离子/营养物质运输、通过补体介导的杀伤降低生存力，和/或阻遏细菌粘附分子和宿主目的受体之间的相互作用。Stem，NJ.(1990)，Avian Dis.34：595-601)。在小鸡被空肠弯曲杆菌定殖之后，开始产生针对该细菌的抗体。这些抗体可能不足以清除现存的定殖，但小鸡自身的抗体产生开始后，可观察到空肠弯曲杆菌生物体的数量的减少。Shoaf-Sweeney，K.D.等人.(2008)，Appl.Environ，Microbiol.74(22)6867-75。
本文鉴定并描述了认为对疫苗的设计和制备有用的由鸡母体抗体所识别的抗原性蛋白。实施例1中描述的研究鉴定了由母体抗体所识别的空肠弯曲杆菌膜相关蛋白，因为从母鸡传递至小鸡的抗体部分地保护小鸡免于弯曲杆菌定殖。对鉴定的蛋白进行进一步表征以评价它们作为空肠弯曲杆菌疫苗候选者的效力。在来自空肠弯曲杆菌81-176的OMP提取物中鉴定了总共60种蛋白，较少蛋白(即，～20种)被鉴定与Cj S3B-SPF血清中的抗体反应。所鉴定的蛋白包括CadF、CmeA、CmeC、CjaA、CjaC、CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、CJJ81176_0164、CJJ811760_586CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaA、FlaB、FlgE2、FlpA、PEB2、PEB3、PorA、MapA和SdhB(参见表1)。
Cj S3B-SPF血清含有与空肠弯曲杆菌S3B和81-176中的鞭毛钩蛋白(FlgE2)和鞭毛FlaA纤丝蛋白(filament protein)和FlaB纤丝蛋白反应的抗体。FlgE2具有89.4kDa的分子量且是空肠弯曲杆菌的运动、鞭毛组装和蛋白分泌所需的(Hendrixson，D.R.，和V.J.DiRita(2003)，Mol.Microbiol.50：687-702；Konkel，M.E.等人(2004)，J.Bacteriol.186：3296-3303)。虽然这些蛋白的预测分子量为约59kDa，已显示根据修饰的水平不同，糖基化使蛋白质量改变高达10％(Thibault，P.等人(2001)，J.Biol.Chem.276：34862-34870)。如通过利用抗空肠弯曲杆菌纤毛蛋白特异性血清进行的免疫印迹分析所判断，观察到了65kDa和63kDa之间的条带。可能地是，该条带代表了FlaA蛋白或FlaB蛋白的糖基化形式，而具有小于60kDa表观分子量的蛋白代表了降解产物。
Cj S3B-SPF血清含有针对空肠弯曲杆菌菌株特异性蛋白以及空肠弯曲杆菌菌株中共有的蛋白进行反应的抗体。例如，40kDa的免疫反应性蛋白，CmeA(第9条带)，在空肠弯曲杆菌S3B和81-176菌株的OMP提取物中被全部Cj S3B-SPF血清所识别，而54kDa蛋白，假定为CmeC，在空肠弯曲杆菌S3B菌株的OMP提取物中被首次识别。共同地，CmeA蛋白、CmeB蛋白和CmeC蛋白构成了参与对宽范围的抗微生物剂和胆汁盐的抗性的抗性结节分化(resistance-nodulation-division，RND)外排泵(Lin，J.，L，O.Michel，和Q.Zhang.(2002)，Antimicrob.Agents Chemother.46：2124-2131；Lin，J.等人(2003)，Infect.lmmun.，71：4250-4259)。CmeB是内膜外排转运蛋白，而CmeA位于周质空间，CmeC形成外膜通道。CmeABC广泛分布于空肠弯曲杆菌分离株中(Lin，J.，L.O.Michel，和Q.Zhang.(2002)，Antimicrob.Agents Chemother.46：2124-2131)，对于来自4种空肠弯曲杆菌菌株(NCTC11168、RM1221、81116和81-176)的每个蛋白的推断的氨基酸的比较显示了每个蛋白的序列在这些菌株中是高度保守的(＞98％相似性)。
鉴定了参与氨基酸转运的两个外膜底物结合蛋白，CjaA(第12条带)和CjaC(第13条带)。已将CjaA表征为假定的ATP结合盒型半胱氨酸转运蛋白中的胞质外溶质受体(Muller，A.等人.(2005)，Mol.Microbiol.57：143-155)，同时已显示CjaC是组氨酸转运所需的(Garvis，S.G.，G.J.Puzon，和M.E.Konkel(1996)，Infect Immun.64：3537-3543)。可能地是，氨基酸转运系统蛋白可作为良好的疫苗组分来发挥作用，因为空肠弯曲杆菌是非糖分解性的并依赖于外源的氨基酸以用于能量产生。发现Cj S3B-SPF血清含有针对空肠弯曲杆菌S3B菌株中的CjaA蛋白和CjaC蛋白反应，但不针对81-176菌株中的CjaA蛋白和CjaC蛋白反应的抗体。Pawelec等人((2000)，FEMS Microbiol.Lett.185：43-49)表明了空肠弯曲杆菌分离株中的cjaA和cjaC二者中的遗传差异，发现在核苷酸水平上具有多达16％的变异。CjaA和CjaC的相关抗原性表面彼此是交叉反应性的。因此，氨基酸序列中小变异可能是导致对空肠弯曲杆菌81-176菌株中的CjaA和CjaC的抗体反应降低或不存在的原因。
实施例1中呈现的结果首次显示了被充分表征的37kDa纤连蛋白结合蛋白CadF在鸡中是免疫原性的。值得注意的是，鸡的空肠弯曲杆菌定殖所必需的CadF蛋白(Ziprin，R.L.，等人(1999)，Avian Dis.43：586-589)在空肠弯曲杆菌S3B菌株和81-176菌株两者中被检测。本文鉴定和提供的CadF的优选的表位包括30-氨基酸序列HYGAGVKFRLSDSLALRLETRDQINFNHAN(第127-156位残基，SEQ IDNO：1)和其能够产生期望的免疫应答的片段。该序列的这种片段或部分包括，例如，能够产生期望的免疫应答的包括至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个或29个连续氨基酸的片段。在一个实施方案中，片段包括至少4个连续氨基酸，例如，序列FRLS(SEQ ID NO：2)。与CadF表位结合的抗体的一个期望的免疫应答是抑制CadF与纤连蛋白结合。另一个期望的免疫应答是充分抑制鸡的弯曲杆菌定殖，其可通过抑制CadF与纤连蛋白的结合来产生。
还发现一些空肠弯曲杆菌OMP是免疫原性的。这些蛋白包括PEB3、MapA和CJJ81176_0586。PEB3的功能是未知的(Pei，Z.H.，等人(1991)，J.Biol.Chem.266：16363-16369)。MapA是已用作区分空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌(C.coli)二者(Stucki，U.等人.(1995)，J.Clin.Microbiol.33：855-859)以及检测和诊断患有空肠弯曲杆菌感染的个体(Campbell，L.K.等人(2006)，Mod.Pathol.19：1042-1046)的鉴定工具的外膜脂蛋白。CJJ81176_0586基于其氨基酸序列已被鉴定为假想的外膜蛋白。表1总结了本发明的不同实施方案中所用的空肠弯曲杆菌抗原。
表1.空肠弯曲杆菌抗原和对应的Genbank登录号的列表
NCTC1116881-176
Figure BDA0000143768750000161
Figure BDA0000143768750000171
*GenBank核苷酸序列基因ID#
**FlgE，aka FlgE2
粘附蛋白的表征和FlpA定殖因子的鉴定
本发明的另一方面是对细菌粘附素蛋白的鉴定和表征，且更具体地是鉴定和表征用于制备针对空肠弯曲杆菌的疫苗的空肠弯曲杆菌的粘附素蛋白。认为细菌对于宿主上皮细胞的粘附对于鸡定殖是关键的，因为细胞粘附可防止细菌经由宿主介导的机械力的清除。进行了研究以评估推定的空肠弯曲杆菌粘附素蛋白编码基因cadF、capA、jlpA、peb1A、porA、Cj1279c(flpA)和Cj1349c的保守性，并且还鉴定空肠弯曲杆菌宿主细胞相互作用中相应蛋白的贡献。实施例2中呈现的结果显示cadF基因、jlpA基因、porA基因、peb1A基因、flpA基因、和Cj1349c基因在分离株之间是保守的，而capA基因的存在是可变的。结果还显示空肠弯曲杆菌CadF蛋白、CapA蛋白、FlpA蛋白和Cj1349c蛋白有利于细菌对鸡LMH肝细胞癌上皮细胞的体外粘附，而CadF、PEB1和FlpA有利于细菌对肉鸡的体内定殖。这些发现中包括首次新颖的显示：FlpA促进空肠弯曲杆菌与宿主细胞的结合并在鸡的空肠弯曲杆菌定殖中具有作用。
利用采集自人类、家禽、牛、猪、羊和犬来源的空肠弯曲杆菌分离株进行实验。如通过MLST所判断的，这些分离株是遗传多样性的。发现分离株包括42种独特的序列类型，其中的4种先前未被鉴定。在空肠弯曲杆菌家畜(即，牛、猪和羊)分离株中鉴定的克隆复合物(clonal complex)包括两种复合物，CC42和CC61，其在先前的研究中已被确定与牛和羊显著相关(Colles，F.ML，等人.(2003)，Microbiol.69：7409-7413；Kwan，P.S.，等人(2008)，Microbiol.74：5130-5138)。并且，在41种家禽分离株中鉴定的11种克隆复合物包括若干家禽相关复合物[即，CC45、CC257和CC354；(Dingle，K.E.等人，(2002)Emerg.Infect.Dis.8：949-955)]。此外，本研究中鉴定的人类分离株的克隆复合物还发现于家禽分离株和家畜分离株中，反之亦然。因此，本研究中未鉴定出人类感染的主要的食用动物来源。
如以上所讨论的，经由点印迹测定对菌株之间的粘附素蛋白谱的遗传分析证明了空肠弯曲杆菌cadF基因、jlpA基因、porA基因、peb1A基因、flpA基因和Cj1349c基因的保守性。虽然点印迹杂交足够严格以检测高度保守的粘附素基因的存在或不存在，其不能检测菌株与菌株的序列差异。然而，推定的粘附素CadF、JlpA、PEB1、Cj1279c和Cj1349的氨基酸序列在空肠弯曲杆菌菌株之间全部是95％以上相同的，且CapA在空肠弯曲杆菌菌株之间是85％以上相同的。这些研究还表明capA基因在采集自人类的空肠弯曲杆菌菌株的40％中不存在，且在采集自动物的空肠弯曲杆菌菌株的39％中不存在。
这是首次通过在单基因背景中在这些基因中产生突变来比较所检查的空肠弯曲杆菌蛋白的功能作用。发现空肠弯曲杆菌CadF蛋白、CapA蛋白、FlpA蛋白和Cj1349c蛋白在细菌对于鸡上皮细胞的体外粘附中具有重要的作用，而JlpA和PEB1未表现出在细胞粘附中具有作用。例如，发现jlpA的插入突变没有导致与鸡LMH细胞的结合的减少。与来自体外结合测定的结果相一致地，jlpA突变体能够以与野生型分离株相当的水平定殖肉鸡。
虽然发现空肠弯曲杆菌peb1A突变体以与野生型分离株相当的水平与鸡LMH细胞结合，该突变体不定殖肉鸡。体外数据表明PEB1未表现出作为粘附素的作用而是在天冬氨酸和谷氨酸转运中具有关键作用。基于计算机模拟分析将CapA蛋白鉴定为推定的自主转运蛋白(autotransporter)。Ashgar等人.(2007.J.Bacteriol.189：1856-1865)报道了capA敲除不能在洛岛红鸡(Rhode Island Red chicken)中定殖和生存。本文描述的研究显示了capA基因在空肠弯曲杆菌分离株之间不是保守的。事实上，本研究中使用的空肠弯曲杆菌家禽分离株中有15种缺少capA基因。还发现当与野生型分离株相比较时，空肠弯曲杆菌capA突变体表现出与鸡LMH上皮细胞的结合的47％的下降，但能与野生型分离株一样有效地定殖肉鸡。该数据与Ashgar等人的数据不一致的原因是未知的。然而，基于这些结果，推断CapA蛋白是肉鸡定殖所不需要的粘附蛋白。
CadF是与胞外基质组分Fn结合的高度保守的37kDa外膜蛋白(Konkel，M.E.等人.(2005)，Mol.Microbiol.57：1022-1035；Konkel，M.E.等人(1997)，Mol.Microbiol.24：953-963；Konkel，M.E.等人1999，J.Clin.Microbiol.37：510-517；Monteville，M.R.，和M.E.Konkel(2002)，InfectImmun 70：6665-6671)。本文呈现的结果显示，空肠弯曲杆菌cadF突变体表现出与鸡LMH细胞结合的41％的降低，且不能有效地定殖肉鸡。因为Fn结合蛋白CadF对于空肠弯曲杆菌宿主细胞粘附是关键的，假想FlpA和Cj1349c可能在宿主细胞附着中具有作用。Cj1349c已被注释为推定的Fn/纤连蛋白结合蛋白。Cj1349c突变体表现出与鸡LMH细胞的结合的14％的降低(P＜0.05)。然而，当与野生型分离株相比较时，用Cj1349c突变体未观察到降低的肉鸡定殖。基于体外实验，Cj1349c可能作为粘附素发挥作用。然而，基于鸡定殖实验，Cj1349c在体内的功能作用是不清楚的。FlpA含有Fn III型结构域。有趣地是，相对于野生型分离株，flpA突变体显示了与鸡LMH上皮细胞结合的39％的降低。此外，flpA突变体不能有效地定殖肉鸡，因为10只肉鸡中仅有2只被定殖。为解决flpA的突变可能具有极化效应的担心，在Cj1278c中生成了突变。Cj1278c突变体相对于野生型分离株没有在与鸡LMH细胞的结合中显示显著的降低。这些数据表明FlpA是参与空肠弯曲杆菌-宿主细胞粘附和鸡定殖的新颖的空肠弯曲杆菌粘附素。
总之，cadF基因、jlpA基因、peb1A基因、porA基因、flpA基因和Cj1349c基因在空肠弯曲杆菌分离株之间是保守的，而capA基因的存在是可变的。CadF蛋白、CapA蛋白、FlpA蛋白和Cj1349c蛋白协助空肠弯曲杆菌与鸡LMH细胞的粘附，其与以下假想相一致：一个以上的蛋白参与空肠弯曲杆菌与宿主上皮细胞的结合。结果表明CadF蛋白和FlpA蛋白在鸡的空肠弯曲杆菌定殖中均具有重要作用。基于体内测定，明显地是，CapA蛋白和Cj1349c蛋白并非空肠弯曲杆菌定殖鸡所必需的，但不能排除它们有利于这一过程的可能性。此外，PEB1蛋白是空肠弯曲杆菌定殖鸡所需要的。该发现可能是由于其参与宿主中的生存所需的氨基酸转运的事实。这些结果已导致确定FlpA(Cj1279c)是新颖的空肠弯曲杆菌粘附素。
在实施例3中，进一步表征了FlpA的结合性质并确定FlpA为微生物表面识别成分粘附基质分子(Microbial Surface Components RecognizingAdhesive Matrix Molecule，MSCRAMM)家族的成员。实验证据显示了空肠弯曲杆菌FlpA是表面暴露的，促进空肠弯曲杆菌与宿主上皮细胞的附着，并具有纤连蛋白(Fn)结合活性。FlpA作为空肠弯曲杆菌中的第二MSCRAMM的鉴定突出了Fn结合在宿主定殖和疾病中的重要性。
此外，在实施例4中，确定了FlpA和Fn粘附的特定位点。利用编码三个FlpA结构域中的每一个的重组蛋白的ELISA表明FlpA-D2含有Fn结合结构域。利用跨越FlpA-D2氨基酸序列的合成肽的阵列，在FlpA-D2中鉴定了具有最大Fn结合活性的7个氨基酸158PHPDFRV164(SEQ ID NO：51)。因为FN3重复参与与Fn的N末端的分子内相互作用，确定了FlpA与从Fn的N末端产生的两个热分解片段——30kDa的N-末端结构域(NTD)和明胶结合结构域(GBD)的结合。FlpA结合Fn明胶结合结构域(GBD)，但不与NTD结合。并且，与GBD结合的FlpA的量与全长Fn是相似的，表明GBD是FlpA粘附于Fn的主要位点。总之，这些数据证明FlpA-D2中的残基158PHPDFRV164介导对Fn的GBD的粘附。
疫苗组合物
本发明提供了疫苗组合物或抗原性(免疫原性)组合物，其包括一种或多种空肠弯曲杆菌抗原(例如，蛋白或多肽)，或其抗原性片段。抗原可以是化学合成的，由重组技术来制备(例如，通过由经基因工程化以含有并表达编码抗原的核酸的生物体来表达)，或分离自空肠弯曲杆菌细菌的培养物。优选的抗原列于例如表1中。表1中的每个序列(氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列)的SEQ ID NO：在与本文共同提交的序列表中提供。在一些实施方案中，抗原是CadF、FlpA和FlaA中的一个或多个，或其一个或多个抗原性片段。抗原性片段包括但不限于如下的30-mer抗原性表位：CadF的第127-156位残基：HYGAGVKFRLSDSLALRLETRDQINFNHAN(SEQ ID NO：1)或在该序列中鉴定的4-mer，FRLS(SEQ ID NO：2)；FlpA的第141-170位残基：FVQAVTNLPNRIKLIWRPHPDFRVDSYIIE(SEQ ID NO：3)和FlaA的第278-307位残基：INAVKDTTGVEASIDANGQLVLTSADGRGI(SEQ ID NO：4)。还可使用这些序列的其他抗原性片段，包括，例如，能够产生所期望的免疫应答的包括至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个或29个连续氨基酸的片段。如本文所描述的这些蛋白和抗原性片段的序列变体也可用于组合物中。抗原可存在于含有相同抗原的多个拷贝的单独的多肽构建体或含有不同抗原的拷贝的单独的多肽构建体(即嵌合的构建体)中。例如，嵌合的多肽可包括CadF、FlpA和FlaA中的至少两个，或其免疫原性片段，例如，如本文以上所描述的三个30mer中的至少两个的一个或多个拷贝，和/或不同的另外的较短序列(例如，FRLS(SEQ ID NO：2))。嵌合体也可包括构建体的抗原之间不同的间隔序列或连接序列。
在一些实施方案中，空肠弯曲杆菌蛋白抗原本身存在于用来对动物进行免疫接种的组合物中。然而，本发明还涵盖包括编码抗原的核酸序列的宿主或载体，和在一些实施方案中，组合物包括这样的宿主。例如，可对不同的细菌宿主和病毒宿主进行基因工程化以含有并表达编码抗原的序列，且然后经基因修饰的细菌或病毒可用来感染动物并在动物中表达抗原。一般，空肠弯曲杆菌抗原对于宿主是异源的，即，空肠弯曲杆菌抗原并非天然(在自然界中)存在于宿主生物体中。宿主生物体可以是减毒的，从而它们自身不会引起任何疾病症状。适宜的细菌载体的例子包括但不限于在乳酸杆菌中复制的各种质粒(如以下所详细讨论的)，比如pAS3和pLBS-GFP-EmR((Bhowmik T，等人.(1993)J Bacteriol.175：6341-4；Mota RM，等人.(2006)BMC Biotechnol.5；6：2))。这种载体一般还包括一种或多种启动子以保证编码抗原的基因的活性转录，且适当时还可包括多个增强子序列、终止信号等以实现序列的适当表达。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原作为嵌合体表达于细菌宿主中，所述嵌合体还包括输出蛋白，其导致抗原被转运到和/或呈递于宿主细菌的表面上。从而抗原易于接近疫苗接受者的免疫系统，并促进或协助引起免疫应答。在一个示例性的实施方案中，输出序列是乳酸杆菌S-蛋白的输出信号和细胞壁锚定序列(即，来自卷曲乳杆菌(L.crispatus)菌株MH315的LbsA S-层蛋白的第1至32位残基[完整的LbsA S-层蛋白氨基酸序列和编码核苷酸序列分别在SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中提供]，来自卷曲乳杆菌菌株MH315的LbsB S-层蛋白的第320-422位残基[完整的LbsB S-层蛋白氨基酸序列和编码核苷酸序列分别在SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中提供])。其它输出序列和锚定序列可以相似的方式来使用，其实例包括但不限于，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌株NCFM SlpA(其氨基酸序列和编码核苷酸序列分别在SEQ ID NO：172和SEQ IDNO：173中提供)，和SlpB(其氨基酸序列和编码核苷酸序列分别在SEQ IDNO：174和SEQ ID NO：175中提供)，和瑞士乳杆菌CNRZ32 SlpA(其氨基酸序列和编码核苷酸序列分别在SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：177中提供)。
抗原或产生抗原的宿主一般在适宜的生理学相容载体中提供给疫苗接受者，其实例包括但不限于标准盐水溶液(例如，在pH7.0-8.0缓冲的)和水(参见，例如，Remingtons Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，Mack Publishing Co.，A.R.Gennaro编辑.1985)。为协助抗原的递送，制剂可包括作为可选的成分的本领域中已知的其他物质，例如，稀释剂、增溶剂或乳化剂、盐类、缓冲剂、赋形剂、渗透增强剂、表面活性剂、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂、湿润剂、脂质、螯合剂等，只要它们不干扰本文所提供的组合物的成分的生物活性。制剂一般是无菌的，除非可能存在宿主生物体。本文所提供的疫苗尤其是细菌疫苗的优选的载体是水。
疫苗接种的方法
本发明的另一方面关于通过施用治疗有效量的本文所描述的抗原在动物中治疗或预防空肠弯曲杆菌细菌菌落形成的方法。并且，空肠弯曲杆菌抗原可与其他抗原(例如，人类传染物诸如HIV、疟疾、肺结核等)组合使用，例如，以嵌合体或融合产物的形式。“治疗有效量”是将引起所期望的反应诸如被免疫接种的动物中的免疫应答的抗原的量。
当位于疫苗接种之后被接种的动物所暴露的活的、潜在感染性的空肠弯曲杆菌中时，一个期望的免疫应答可以是与本文所描述的抗原结合的抗体的生成，例如，通过与CadF表位结合并抑制CadF与纤连蛋白的结合。另一个期望的免疫应答是充分抑制动物鸡的弯曲杆菌定殖，其可通过抑制CadF与纤连蛋白的结合来导致。
在一些实施方案中，动物是鸟，但不必局限于此。其它物种也含有空肠弯曲杆菌，并可如本文所描述的被疫苗接种，包括但不限于宠物、啮齿类动物、不同的野生动物且尤其是用作食物的动物，例如，牛(尤其是小牛)、猪等。可将疫苗施用于鸟，且这些可以是任何类型的(例如，家养的、野生的、受保护的区域诸如动物园和野生动物保护区中的，等等)。然而，疫苗将特别用于接种用作食物来饲养的鸟，鸟诸如鸡、火鸡、鹅、鸭、鸵鸟等，或与人类邻近来饲养的那些鸟(例如，宠物诸如鹦鹉、金丝雀等，或斗鸡用母鸡、公鸡等)。
在一些实施方案中，疫苗被施用给仔畜或幼畜，或甚至施用给非常年幼的动物，例如，新生动物。例如，当动物是鸟时，施用可对小于1个月大的鸟来进行，例如，对于年龄在1天和3周之间的鸟来进行，或对于年龄在1天和2周之间的鸟来进行。在一些实施方案中，在母体抗体在动物中仍具有活性时和当母体抗体减少的时间之间的时间窗内施用疫苗。疫苗制剂可仅施用一次，或可重复施用，例如，持续高达约2天、3天、4天或5天或更多天。
本文所提供的疫苗和免疫制剂一般预期用于免疫鸟尤其是鸡，但并不局限于此。典型的施用途径包括但不限于将抗原和/或产生抗原的宿主添加到被动物摄取的物质通常是水中，但不排除添加到其他食物来源中。在另外的实施方案中，抗原和或产生抗原的宿主作为气溶胶来施用，例如，可将经基因工程化以含有并表达抗原的病毒导入到动物鸡的环境中，例如，作为气溶胶来导入，并经由吸入来进入呼吸道。在另一些实施方案中，且尤其是当关注单独的家养的动物(例如，宠物)时，施用可经由注射来进行，例如，肌内注射，皮下注射等。
当疫苗经由水系统口服施用时，优选地是，当施用疫苗时不存在消毒杀菌剂。为中和生活水源中的氯和某些元素的作用，可将诸如脱脂牛奶的中和剂添加到水中(500ml脱脂牛奶比10升水的比例是适宜的)。例如，在疫苗接种前约30分钟可添加脱脂牛奶。为获得良好的疫苗施用，优选地施用疫苗而使所有动物在1-2小时内饮用加有疫苗的水。这是优选的，因为此时间之后，活疫苗的生存力可能快速地下降。在小于4周龄的肉鸡(aka fryer)或鸟中，这可通过在施用疫苗之前约30分钟禁水以使鸟口渴来实现。在超过4周龄的鸟中，可禁水从约2小时至8小时或过夜(约6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时或更多小时)。对于幼鸟，可禁水约20分钟、45分钟、1小时、90分钟，或高达两小时。因为鸟在进食时饮水，应将疫苗接种定时以与输送道(feed track)中存在的食物同步。可以在当鸟将要饮水时提供水，诸如对于肉鸡在上午时间。可使用光来影响鸟饮水，其中关闭光用来减少饮用和打开光用来刺激鸟走向喂食器和饮水器。疫苗接种后，应向鸟提供非疫苗接种的水(clean water)。
所施用的抗原的剂量在不同情况中可不同，取决于，例如疫苗接种的动物的类型、年龄或品种，所用的特定的抗原、抗原的形式(例如，单独的抗原，或产生抗原的宿主)等。获自细胞培养测定和动物研究的数据可用于配制一系列的使用剂量。特定的剂量和递送方法的指南在文献中提供，且对于本领域中的实践者是可获得的。一般，剂量足以在动物中达到从约0.01mg/kg至约100mg每千克体重的抗原水平。如果施用细菌宿主或病毒宿主，施用足以允许所述宿主定殖宿主的胃肠(GI)道，和/或产生足以在疫苗接受者中引起显著的免疫应答的抗原的量。适宜的量通常将为至少每剂约105cfu，且优选地约106cfu或更多。可使用较大的剂量诸如约107、108、109和高达约1010cfu。这允许(如果需要的话)足够量的细菌或病毒进入肠。以上的细菌或病毒的量可对应于例如，约106至约108cfu每kg动物体重。疫苗中的细菌或病毒的浓度通常至少为约1×106/ml，比如至少约5×106/ml、1×107/ml、1×108/ml、1×109/ml或1×1010/ml。
已报道了用于在家禽中防止疾病的一些疫苗(参见，例如，美国专利第5,294,441号、第5,389,368号、第5,468,485号、第5387,744号和第6,866,847号，其每一个的全部内容在此通过引用并入)，且其中所含的信息可用于疫苗组合物和施用方法。
益生菌
益生菌是活的微生物，当将其以适当的量施用于宿主时，赋予宿主健康益处。可能最常用的益生物种属于乳酸杆菌属。益生施用的一个可能的益生益处是通过竞争排除提高对肠道病原体的抗性(Nava，G.M.，等人，2005 Anim Health Res Rev 6：105-18)。在蛋和家禽工业中使用益生菌以提高性能参数，包括平均蛋重量、体重和饲料转化率(Haghighi，H.R.等人.，(2005)Clin Diagn Lab Immunol 12：1387-92.；Talebi，A.，B.等人.2008，Avian Pathol37：509-12)。
在本发明的另一方面，评估益生生物体以探查是否某些物种对鸡中的空肠弯曲杆菌的定殖具有新颖的和有利的作用。评估了4种益生乳酸杆菌的施用对鸡中的空肠弯曲杆菌的定殖的作用(实施例5)。检查的4种益生乳酸杆菌是乳酸杆菌菌株(嗜酸乳杆菌NCFM、卷曲乳杆菌JCM 5810、鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)ATCC 33199和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CNRZ32)。这些研究中所用的空肠弯曲杆菌菌株是F38011，因为发现其对于乳酸杆菌的抑制最敏感。
为确定施用益生乳酸杆菌对鸡免疫系统的作用，在孵化后第21天和第28天确定了空肠弯曲杆菌的血清抗体(图12)。在属于未用空肠弯曲杆菌攻击的组的鸟或未发现被空肠弯曲杆菌定殖的鸟中未检测到抗空肠弯曲杆菌抗体。在用空肠弯曲杆菌接种后2周在定殖的鸡的血清中检测抗体。针对空肠弯曲杆菌的抗体产生未从盲肠清除该生物体。来自实施例5的结果表明，可能用益生乳酸杆菌菌株进行的免疫调节没有影响空肠弯曲杆菌定殖鸡的胃肠道的能力。
进一步评估了益生乳酸杆菌抑制空肠弯曲杆菌体外生长的能力和这些乳酸杆菌的施用对鸡的空肠弯曲杆菌定殖的作用。结果意想不到地显示了，接受卷曲乳杆菌JCM5810的鸟表现出低的空肠弯曲杆菌定殖率。并且，接受卷曲乳杆菌的鸟具有高的乳酸杆菌从鸡的盲肠的回收率。通过PCR进行的菌株分型确定了回收自鸡的盲肠的乳酸杆菌实际上是卷曲乳杆菌。并且，来自未接受嗜酸乳杆菌、鸡乳杆菌和瑞士乳杆菌的鸡的一些分离株也被阳性鉴定为卷曲乳杆菌。卷曲乳杆菌常分离自鸡并已被鉴定为鸡的消化道中的主要乳酸杆菌物种(Abbas Hilmi，H.T.等人(2007)，Appl EnvironMicrobiol 73：7867-73)。卷曲乳杆菌能够在延长的时间段中保留在鸡的消化道中的事实可能增强该物种的益生能力。并且，当根据卷曲乳杆菌表现出低的空肠弯曲杆菌定殖率的呈现数据考虑该事实时，其提供了该物种可能是开发重组细菌疫苗的良好候选者的证据。
已知所评估的4种乳酸杆菌属物种具有编码S-层蛋白的基因(Avall-Jaaskelainen，S.，和A.Palva.(2005)，FEMS Microbiol Rev29：511-29)。已显示S-层蛋白参与对宿主组织的附着(Doig，P.，L.Emody.和T.J.Trust(1992)，J Biol Chem 267：43-9)和，尤其是已显示分离自家禽的嗜酸乳杆菌的S-层参与与鸟肠上皮细胞的相互作用(Schneitz，C，L.Nuotio，和K.Lounatma(1993)，J Appl Bacteriol 74：290-4)。显示了实施例5中所评估的菌株卷曲乳杆菌JCM 5810的S-层蛋白是菌株附着于鸡结肠中含胶原区域的能力的原因。显示了来自不同的卷曲乳杆菌菌株ZJ001的S-层蛋白抑制鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)附着于HeLa细胞。因此，可能地是，卷曲乳杆菌的S-层蛋白对于鸡胃肠道的定殖和空肠弯曲杆菌定殖的抑制是重要的。
已考虑了用于竞争排除的一些机制，包括天然菌群和益生菌群对病原体附着位点的饱和和阻碍，对必需营养物质的竞争限制了病原体生长的能力，产生拮抗分子包括有机酸、过氧化氢和细菌素，以及调节免疫应答。乳酸杆菌产生大量抗微生物产物，包括细菌素、有机酸和过氧化氢(Barefoot，S.F.，和C.G.Nettles(1993)，J Dairy Sci 76：2366-79)，其可在体外抑制空肠弯曲杆菌和其它病原体。唾液乳杆菌NRRL B-30514先前已被鉴定为具有抗空肠弯曲杆菌活性(Stern，N.J.等人.(2006)，AntimicrobAgents Chemother 50：3111-6)。其细菌素，OR-7，当在饲料中施用时已显示降低鸡中的空肠弯曲杆菌的定殖。对上清液的热处理和对上清液和琼脂平板的胰蛋白酶和蛋白酶K处理未影响所评估的乳酸杆菌菌株对空肠弯曲杆菌的抑制，表明抑制不是由于细菌素的产生而导致。这些数据有力地表明乳酸杆菌产生的有机酸和过氧化氢的组合是在体外抑制空肠弯曲杆菌的原因。
乳酸杆菌细菌疫苗和其他基于宿主的疫苗
本发明的另一方面涉及向鸡施用具有益生性质和疫苗性质的乳酸杆菌菌株。不希望受理论所束缚，认为表现空肠弯曲杆菌表位的乳酸杆菌菌株刺激空肠弯曲杆菌特异性的IgA抗体的产生，导致空肠弯曲杆菌定殖的减少。在实施例5中，检验了乳酸杆菌属的三个种(即，嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌和瑞士乳杆菌)的益生性质，以选择一种作为疫苗来开发。乳酸杆菌属的一些物种合成表面(S)-层蛋白(Avall-Jaaskelainen，S.，和A.Palva(2005)FEMS Microbiol.Rev.29：511-529，Boot，H.J.等人.(1996)，Microbiology.142(Pt 9)：2375-2384)。选择这三种物种是因为它们通常定殖鸡的回肠并合成表面(S)-层蛋白。并且，覆盖细菌的表面的S-层蛋白可以耐受外部表位的掺入(Ashgar，S.S.等人.(2007)，J.Bacteriol.189：1856-1865)。一般，S-层由范围从40kDa至200kDa的一种到三种蛋白组成，且占总细胞蛋白的10-15％。嗜酸乳杆菌ATCC 4365的S-层由两种基因slpA和slpB编码，其彼此位于相反的方向，并由3kb的DNA区域所间隔。卷曲乳杆菌JCM 5810含有2个S-层编码基因，cbsA和cbsB，但仅表达cbsA基因。瑞士乳杆菌含有一个S-层基因，称作slpA。乳酸杆菌属物种的遗传学技术是先进的(Mota，R.M.等人.(2006)，BMC Biotechnol.6：2)，且将相对大的基因区段插入到S-层基因中由此获得外源表位的分泌、细胞表面附着和高密度呈递是可行的(Avall-Jaaskelainen，S.，和A.Palva(2005)FEMS Microbiol.Rev.29：511-529)。
乳酸杆菌对回肠的定殖是期望的，因为消化道的该区段含有参与抗原摄取(antigen sampling)和抗体产生的大量的派伊尔氏淋巴集结(Peyer’spatch)(Vaughn，L.E.等人.(2006)，Avian Dis.50：298-302)。针对空肠弯曲杆菌的粘膜免疫应答导致与细菌的表面结合并防止或抑制其定殖消化道的抗体。为保证可能产生中和抗体的空肠弯曲杆菌蛋白并入到S-层中，鉴定了特异性空肠弯曲杆菌蛋白和在这些蛋白中家禽通常针对其产生抗体的区域。
空肠弯曲杆菌基因也可与不同的病毒宿主或载体(例如，腺病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体等)或其他细菌宿主或载体(例如，大肠杆菌)相组合。这样的宿主可以是减毒的。
重组工程化的S-层蛋白
本发明的另外的实施方案关于具有插入到S-层蛋白的一个或多个抗原性空肠弯曲杆菌抗原性序列的工程化的重组的S-层蛋白。特定的S-层蛋白可经基因工程化以具有插入到S-蛋白的诸如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个抗原性多肽序列。一个实施方案具有插入到S-层蛋白中的来自CadF蛋白、FlaA蛋白和FlpA蛋白中的每个的多肽序列。可将多肽在当表达表面层蛋白时多肽暴露于细菌表面的地方插入。当在表面表达时，异源多肽可更加容易地与另一部分相互作用，例如在另一多肽的配体/受体中(例如，抗体)。可选地，可插入异源肽而使其不在S-蛋白的表面表达，比如邻近细胞壁锚或结合结构域。
已鉴定了嗜酸乳酸杆菌的S-层蛋白的两个主要的结构域(参见Pouwels，PH等人.，(1998)，Int J Food Microbiol.41：155-167；Seegers，JF(2002)20：508-15；美国专利申请第10/500,307号，公布为US20050233408，其全部内容在此通过引用并入)。N末端区域构成该分子的约三分之二，且其参与结晶和组装。该区域组成第1-290位氨基酸并在细胞壁上形成S-层。第二主要结构域由第290-412位氨基酸组成。蛋白的该部分掩埋在S-层中且其构成细胞壁锚。嗜酸乳杆菌S-层蛋白的N末端区域可细分为三部分：第1位至约第114位残基，从约第115位至约第155位残基左右，和从约第160位至约第290位残基。包括从约第115位至约第155位或第160位氨基酸残基的区域显示为暴露在细菌表面的环状区域。该区域是插入异源多肽的优选的位点，包括在从约第100位至第160位的位置，比如从第110位至第150位、从第110位至第140位，优选地从第120位至第140位、从第120位至第130位，或在约第125位插入。不同的氨基酸残基编号方案将应用于乳酸杆菌的替代物种。
抗体
本发明还提供了与本文所描述的蛋白特异性地免疫反应的抗体。因此，本发明的抗体将特异性地识别和结合具有与本文所公开的氨基酸序列或其免疫原性片段相同的或基本上相同的氨基酸序列的多肽。本发明的抗体通常表现至少约107、108、109或1011M-1的特异性结合亲和力。抗体可以是多克隆的或单克隆的，且可以通过本领域中的技术人员熟知的多种方法来准备和纯化。参见，例如，Coligan，Current Protocols in Immunology(现代免疫学实验方案)，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites等人(编辑)BASICAND Clinical Immunology(基础和临床免疫学)(第7版.)Lange MedicalPublications，Los Altos，Calif.，和其中引用的参考文献(“Stites”)；Goding，Monoclonal antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)(第2版)Academic Press，New York，N.Y.(1986)；Kohler和Milstein，1975，Nature 256：495-97；和Harlow和Lane。本发明的抗体可以是任何同种型，例如，IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，且IgG、IgA和IgM是最优选的。本发明的一些单克隆抗体是人源化的抗体、人类抗体或嵌合抗体，且可以是多功能的。参见，例如，Queen，等人.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029(1989)；美国专利第5,563,762号；第5,693,761号；第5,585,089号和第5,530,101号。利用噬菌体展示技术还可产生有用的抗体(参见，例如，Dower等人.，WO 91/17271和McCafferty等人.，WO 92/01047)。利用本领域中熟知的技术可产生单链抗体(参见，例如，Colcher等人.，Ann.NY Acad.Sci.880：263-80(1999)；Reiter，Clin.Cancer Res.2：245-52(1996)；美国专利第4,946,778号；第5,260,203号；第5,455,030号；第5,518,889号；和第5,534,621号)。本发明的抗体具有多种用途，例如，多肽的分离或检测，活性的抑制等。
空肠弯曲杆菌抗原的其他用途
本领域中的技术人员将理解，本文所描述的抗原可用于多种其他应用，包括但不限于：诊断、研究试剂(例如，用于调查研究目的)，等。所有这样的用途意在为本发明所涵盖。
现在参照以下的实验章节描述本发明的多个方面，其将被理解为仅通过示例的方式来提供而非构成对本发明的范围的限制。
实施例1.由鸡母体抗体识别的空肠弯曲杆菌蛋白的鉴定
在先前的研究中，具有针对空肠弯曲杆菌的S3B菌株生成的母体抗体的小鸡提供了防止弯曲杆菌定殖的保护(Sahin等人.，2003.AEM.69：5372)。统称为Cj S3B-SPF血清的血清样品获自先前的研究。通过ELISA所判断，确定了这些血清含有针对空肠弯曲杆菌全细胞裂解物反应的母体抗体。通过空肠弯曲杆菌外膜蛋白提取物的免疫印迹分析并结合质谱法，鉴定了CjS3B-SPF抗体所识别的抗原。该方法导致了由母体抗体所识别的空肠弯曲杆菌蛋白包括鞭毛蛋白和CadF粘附素的鉴定。体外测定显示Cj S3B-SPF血清阻碍了空肠弯曲杆菌S3B同源菌株的运动性，但没有阻碍空肠弯曲杆菌的异源菌株(81-176)的运动性。总之，该实施例提供了一系列空肠弯曲杆菌蛋白，针对所述空肠弯曲杆菌蛋白在母鸡中产生保护性抗体并传递至小鸡。
材料和方法
细菌培养和鸡血清。空肠弯曲杆菌S3B菌株分离自鸡。空肠弯曲杆菌81-176菌株分离自患有腹泻的个体，含有血液和淋巴细胞(Korlath，J.A.，等人.，1985，J.Infect.Dis.152：592-596)。在37℃下在微好氧条件(5％O2，10％CO2，85％N2)下将空肠弯曲杆菌S3B和空肠弯曲杆菌81-176培养于含有5％柠檬酸缓冲的牛血(MH-血)的Mueller Hinton(MH)琼脂平板上。每48小时将细菌继代培养于新鲜的MH-血平板上。
在另外的地方详细描述了血清的生成(Sahin，O.等人.，2003，Appl.Environ.Microbiol.69：5372-5379)。简言之，无特定病原体的白来杭鸡(White Leghorn chicken)获自供应商并进行隔离孵化。通过泄殖腔拭子来检查鸡不存在空肠弯曲杆菌定殖，在22周龄时使其繁殖(breed)，且另外2周之后用空肠弯曲杆菌S3B菌株进行接种。从被接种的母鸡采集受精卵并隔离孵化。总共，从9只两天龄的SPF白来杭鸡中采集血液。从每个血样品收获血清并贮存在-20℃下。获得了25μl至100μl的每个血清样品。贯穿本文，这些血清样品被称作Cj S3B-SPF血清。
空肠弯曲杆菌外膜蛋白的制备。如先前de Melo和Pechère(de Melo，M.A.，和J.C.Pechère，1990，Infect.Immun.58：1749-1756)所描述的进行轻微修改，利用N-十二烷酰-肌氨酸制备外膜蛋白(OMP)。简言之，在微好氧条件下在37℃下在振动下在MH肉汤中过夜培养细菌。收获细菌细胞并将其重悬于含1mM苯甲磺酰氟(Sigma，St.Louis，MO)的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)中。利用Branson超声细胞破碎仪(Branson Sonifier CellDisruptor)(250型；Branson Sonic Power Co.，Danbury，CT)对细菌细胞悬浮液超声5次(每次30秒)，每次脉冲之间在冰上冷却30秒。通过在6,000×g下离心10分钟来去除细胞碎片。通过在4℃下在100,000×g下离心2小时获得粗细胞膜。将所得的沉淀物悬浮于10mM的Tris(pH7.5)，并利用二喹啉甲酸(BCA)测定按照生产商(Pierce，Rockford，IL)的说明确定每个样品的蛋白浓度。将N-十二烷酰肌氨酸(Sigma)以蛋白比去垢剂为1∶4总共(w/w)的比例添加到粗提取物中。在室温下伴随轻微振动孵育样品，持续30分钟。通过在100,000×g下在15℃下离心2小时获得OMP。用50mM Tris(pH 7.5)洗涤沉淀物，将其悬浮液同样的缓冲液中，并贮存于-20℃下。通过二喹啉甲酸BCA测定确定了OMP提取物的蛋白浓度。
酶联免疫吸附测定。进行ELISA以确定Cj S3B-SPF血清的空肠弯曲杆菌特异性IgG抗体的水平。用在包被缓冲液(50mM Na2CO3，51mMNaHCO3，pH 9.6)中稀释至10μg/ml的100μl的卵清白蛋白(阴性对照)、空肠弯曲杆菌S3B全细胞裂解物或81-176全细胞裂解物包被微量滴定板(Corning Incorporated，Corning，NY)。在4℃下孵育18小时之后，用含0.5％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA；Sigma)的磷酸缓冲液(PBS；0.14M NaCl、5mM Na2HPO4 2H2O、1.5mM KH2PO4、19mM KCl，pH 7.4)孵育被包被的平板，在室温下持续2小时以降低抗体的非特异性结合。将Cj S3B-SPF血清样品1∶200稀释于含0.5％BSA的PBS中。将100μl的每种样品添加到孔中重复三份，并在室温下孵育2小时。用洗涤缓冲液[(0.15M NaCl，0.1％(v/v)吐温20，pH 7.4)]洗涤平板3次，并将100l的稀释于含0.5％(w/v)BSA和0.1％(v/v)吐温20的PBS中的轭合于过氧化物酶的兔抗鸡IgG(1∶1000；Sigma)添加至孔中。在室温下孵育1小时之后，用洗涤缓冲液洗涤平板两次并用PBS洗涤两次。将四甲基联苯胺(TMB)底物(Pierce-Endogen)添加到孔中在显影10分钟后用0.18N H2SO4终止反应。用ELx808 Ultra Microplate Reader(BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT)确定490nm处的吸光度(A490)。从适当的血清样品值中减去利用用卵清蛋白孵育的鸡血清获得的吸光度以去除背景信号。对A490值进行学生t检验以确定样品组之间的统计学显著性(P＜0.005)。从未定殖空肠弯曲杆菌的鸡中采集9个血清，并用来利用学生t分布计算阴性截断值。大于阴性截断值的吸光度值被认为是空肠弯曲杆菌特异性抗体阳性的(8)。
SDS-PAGE和免疫印迹分析。将细菌OMP(0.5μg/μl)溶于单一强度电泳样品缓冲液中并煮沸5分钟。如先前由Laemmli(Laemmli，U.K.，1970，Nature.227：680-685)所描述的利用12.5％的聚丙烯酰胺微型胶通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白。用考马斯亮蓝R250(CBB-R250)对分离的蛋白进行染色或将分离的蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon P；Millipore Corporation，Bedford，MA)上。在含0.05％(v/v)吐温20(PBS-T)的PBS中用20％的胎牛血清封闭膜，并用Cj S3B-SPF血清(1∶200稀释)4℃孵育过夜。随后，用PBS-T洗涤印迹三次。用兔抗鸡过氧化物酶轭合的IgG(1∶1000稀释，Sigma)检测结合的抗体。利用山羊抗Cad-F特异性血清(#461)连同兔抗山羊过氧化物酶轭合的IgG(1∶1000，Sigma)检测CadF。利用兔抗空肠弯曲杆菌鞭毛蛋白特异性血清以及山羊抗兔过氧化物酶轭合的IgG(1∶1000，Sigma)检测FlaA鞭毛蛋白和FlaB鞭毛蛋白。用PBS-T洗涤印迹三次并用4-氯-1-萘酚过氧化物酶显色底物(Thermo Scientific，Rockford，IL)按照生产商的说明进行显色。
LC/MALDI/TOF-TOF和数据分析。对OMP提取物进行三氯乙酸(TCA)沉淀并用丙酮洗涤三次。将干燥的沉淀物重悬于25μl的8M尿素、100mM NH4HCO3中并用NH4HCO3将pH调节至7.5-8.0。在37℃下用终浓度为5mM的DTT还原蛋白，持续30分钟，且然后在37℃下在黑暗中用终浓度为25mM的碘乙酰胺进行烷基化，持续30分钟。用100mM的NH4HCO3稀释溶液4倍并添加1μg的胰蛋白酶(测序级别(Sequencegrade)，Promega，Madison，WI)以在37℃下进行过夜消化。用高速真空将消化溶液浓缩至20-30μl的终体积。利用TempoTM LC MALDI系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)准备LC MALDI板。通过自动进样器将5μl的消化液加载到分析柱(Chromolith
Figure BDA0000143768750000341
CapROD RP-18e，100μm×150mm，Merck KGaA，Darmstadt，Germany)上并利用以下的梯度以2μl/分钟的流速进行分离：0-2分钟用5％B，2-25分钟用5-20％B，25-50分钟用20-60％B，50-60分钟用95％B，和60-70分钟用0％B。流动相A是含0.1％三氟乙酸(TFA)的2％的乙腈，流动相B是含0.1％TFA的95％的乙腈。在50％乙腈、0.1％TFA和5mM单磷酸铵的溶液中制备5mg/ml MALDI基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)，并以2μl/分钟的流速来输送。通过Upchurch T连接器(connector)混合LC流出物和基质溶液，且然后在50分钟LC梯度过程中每4秒将混合物点印到空白的MALDI板上(123×81mm)。利用4800MALDI/TOF-TOF质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)获取MS光谱和MS/MS光谱。对每个反射器MS光谱使用1000个激光发射并对于每个MS/MS光谱收集2500个激光发射。选择S/N＞40的前体峰用于MSMS实验，并对于每个点印的MSMS允许25个最强的前体峰，且首先呈递最弱的前体锋。提取S/N＞10的峰，并利用ProteinPilotTM软件(版本2.0.1，修订67476，Applied Biosystems，Foster City，CA)针对空肠弯曲杆菌81-176数据库(从NCBI下载的CJJ81176，1758个ORF)进行搜索。按如下设置搜索参数：酶，胰蛋白酶；Cys烷基化，碘乙酰胺；特殊因子，尿素变性；种类，无；和ID焦点，生物修饰。该报告的蛋白置信度阈截断值为ProtScore 2.0(未用)，且至少一种肽具有99％置信度。完整ProteinPilot结果参见补充数据。通过PSORTb确定蛋白亚细胞定位(http：//www.psort.org/psortb/)。
纳升级-LC/MS/MS(Nano-LC/MS/MS)和数据分析。如先前所描述的进行纳升级-LC/MS/MS(Tang，X.，等人.2005，Anal.Chem.77：311-318)，并用其来鉴定通过用Cj S3B-SPF血清进行免疫印迹所确定的反应性条带。简言之，从已用CBB-R250染色的SDS-12.5％聚丙烯酰胺凝胶中切割代表免疫反应性蛋白的条带。切割条带后，用含50％甲醇和5％乙酸的溶液对每个凝胶块进行脱色。通过过甲酸氧化使凝胶中的蛋白中的二硫键解离。干燥凝胶，并用胰蛋白酶在37℃下过夜消化蛋白。利用与纳升级-HPLC偶联的电喷射离子阱(Esquire HCT，Bruker Daltonics，Billerica，MA)质谱仪进行纳升级-LC/MS/MS分析。利用内部许可程序MASCOT(版本2.1.0，MatrixScience Ltd，London)使用所得数据针对空肠弯曲杆菌81-176基因组数据库进行搜索。自动报告基于可能性的Mowse评分超过其阈值(p＜0.05)的蛋白击中(hit)。利用更严格的MudPIT评分和0.05的离子评分截断值进一步过滤蛋白击中，其去除了期望值(E)＞0.05的所有肽。
运动性测定。为评估抗弯曲杆菌母体抗体的功能属性，如先前所描述的稍作修改进行运动性测定(Konkel，M.E.等人.，2004，J.Bacteriol.186：3296-3303)。在MH-血平板上培养空肠弯曲杆菌S3B菌株和81-176菌株24小时，通过在6,000×g下离心进行收获，并在补充有10％胎牛血清(FBS；HyClone Laboratories，Logan，UT)的最低必需培养基(MEM；Invitrogen)中将其悬浮至OD540＝0.18。在含有来自未接种空肠弯曲杆菌的鸡的血清、混合的Cj S3B-SPF血清或热灭活的Cj S3B-SPF混合血清的相同培养基中1∶100稀释细菌悬浮液。通过在56℃下热处理30分钟灭活补体。混合细菌悬浮液，将10μl的小份点印到含0.4％琼脂的半固体MH培养基的表面。在微好氧条件下在37℃下孵育运动性平板48小时。
结果
从被弯曲杆菌定殖的母鸡孵化的小鸡具有抗空肠弯曲杆菌母体抗体。获得了在先前的研究中产生的9个血清样品(命名为121、123、129、132、135、139、140、144和147)，并命名为Cj S3B-SPF血清。这些血清采集自从用空肠弯曲杆菌S3B菌株接种的母鸡孵化的2天龄SPF白来杭小鸡。为确定每个血清中的空肠弯曲杆菌特异性的IgG母体抗体的水平，对包被有从空肠弯曲杆菌同源菌株(S3B)和异源菌株(81-176)制备的全细胞裂解物(WCL)的孔进行ELISA(图1)。通过计算收获自未被空肠弯曲杆菌定殖的9只鸡的血清(对照血清)的抗体反应性的阴性截断值来确定非特异性抗体反应性。对照血清抗空肠弯曲杆菌S3B菌株的WCL的反应性小于(P＜0.005)对照血清抗空肠弯曲杆菌81-176菌株的WCL的反应性(图1，水平线)。
通过ELISA判断每个Cj S3B-SPF血清含有针对空肠弯曲杆菌S3B菌株和空肠弯曲杆菌81-176菌株的WCL特异性反应的抗体。然而，当与从81-176异源菌株制备的WCL(平均A490 0.463)相比时，观察到了抗S3B同源菌株(平均A490 0.665)的WCL的Cj S3B-SPF反应性的增高(P＜0.005)。与WCL的反应性的差异表明Cj S3B-SPF血清含有与空肠弯曲杆菌S3B菌株独有的抗原反应的抗体或在菌株特异性抗原的氨基酸组成中发生有助于提高血清对特定菌株的反应性的变异。Cj S3B-SPF血清针对来自空肠弯曲杆菌S3B菌株的WCL的反应性与81-176菌株相对比的增加可部分地解释所观察到的空肠弯曲杆菌S3B攻击的小鸡的定殖发生的延迟，和群体中降低的横向传播速率。
外膜蛋白(OMP)的鉴定。用从空肠弯曲杆菌81-176菌株制备的总OMP提取物进行LC/MALDI/TOF-TOF，已对其基因组进行测序，以保证制备物的组成主要是外膜蛋白而非胞质蛋白(图5)。利用LC/MALDI/TOF-TOF数据使用ProteinPilotTM软件作为搜索引擎以进行蛋白鉴定。因为未用的ProtScore(unused ProtScore)是未被较高等级的蛋白解释的蛋白的所有肽证据的测量结果，并且是蛋白证据的可靠指示，我们将未用的评分为2.0设定为至少一个肽具有99％置信度的蛋白鉴定的阈截断值。利用这些标准，利用针对空肠弯曲杆菌81-176数据库(总共1758个ORF)的2944个MS/MS光谱搜索鉴定了60种蛋白(图5)。在鉴定的60种蛋白中，如通过PSORTb所确定的，约32％位于细胞质中。对OMP提取物中所含的蛋白的另外的分析显示，18％被分类为未知的亚细胞定位，50％被鉴定为胞外蛋白、外膜蛋白、周质蛋白、内膜蛋白，或命名为具有信号肽的未知亚细胞定位。
Cj S3B-SPF血清针对同源空肠弯曲杆菌菌株和异源空肠弯曲杆菌菌株的OMP的反应性。为确定Cj S3B-SPF血清中所含的抗体的反应性，通过SDS-PAGE分离OMP提取物，将其转移到PVDF膜，并利用S3B-SPF血清进行免疫印迹分析。如通过免疫印迹分析所判断的，Cj S3B-SPF血清对于来自空肠弯曲杆菌S3B同源菌株和81-176异源菌株的OMP提取物产生了可重复的条带谱(图2A)。OMP提取物的反应性条带范围从16kDa到90kDa。针对空肠弯曲杆菌S3B菌株和81-176菌株产生的代表性条带谱是相似的，但某些条带是特定的菌株独有的。
对印迹的探查显示了S3B-SPF血清含有与菌株特异性蛋白和空肠弯曲杆菌S3B菌株和81-176菌株之间共有的蛋白相反应的抗体。具有90kDa、83kDa、65kDa、60kDa、56kDa、54kDa、42kDa、37kDa、26kDa和20kDa(分别为条带1-6、9、11、14和16，参见图2)的表观分子量的蛋白可与空肠弯曲杆菌S3B同源菌株和81-176异源菌株交叉反应。观察到对空肠弯曲杆菌S3B特异性的免疫反应性蛋白约为32kDa、28kDa、16kDa(分别为条带12、13和17)(图2)。观察到空肠弯曲杆菌81-176独有的免疫反应性蛋白为约50kDa、45kDa、40kDa和23kDa(分别为条带7、8、10和15)(图2)。这些结果表明小鸡具有与定殖母鸡的特定的空肠弯曲杆菌菌株反应的母体抗体和与空肠弯曲杆菌菌株之间共有的蛋白反应的母体抗体。
进行免疫印迹以确定Cj S3B-SPF血清是否含有与CadF蛋白反应的抗体。利用9种Cj S3B-SPF血清中的每一种，在来自空肠弯曲杆菌S3B菌株和81-176菌株的OMP提取物中观察到了反应性条带(条带11)，该反应性条带对应于具有37kDa分子量的蛋白(图2)。利用Cj S3B-SPF在37kDa处观察到的条带具有与利用山羊抗CadF特异性血清进行检测的CadF蛋白相同的相对迁移(图2)。
对由Cj S3B-SPF血清识别的条带的鉴定。使用纳升级-LC/MS/MS来鉴定Cj S3B-SPF血清识别的空肠弯曲杆菌膜相关抗原。通过SDS-PAGE分离来自空肠弯曲杆菌S3B菌株和81-176菌株的OMP提取物，并用CBB-R250进行染色或转移至PVDF膜。用代表性空肠弯曲杆菌S3B特异性血清孵育印迹以鉴定反应性蛋白。鉴定了17个反应性条带；对17个条带中的14个进行纳升级-LC/MS/MS。
将条带1、2、4-10和12-16从凝胶中单独地切割并对其进行胰蛋白酶消化，然后进行纳升级-LC/MS/MS。小心切割与相应的免疫印迹中的反应性条带完全对准的那些蛋白条带。鉴定的蛋白列于表4中。所预测的“最佳适合”蛋白匹配是具有有意义的MASCOT评分且具有对应于SDS-12.5％聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白迁移的分子量的OMP。利用MudPIT评分和0.05的离子评分截断值来建立蛋白匹配的置信度。
通过免疫印迹分析利用蛋白特异性血清鉴定了条带3和11，且基于其表观分子量鉴定了条带17。利用抗空肠弯曲杆菌鞭毛蛋白血清将65kDa蛋白(条带3)鉴定为鞭毛蛋白，且利用抗空肠弯曲杆菌CadF血清将37kDa蛋白(条带11)鉴定为CadF。仅在从空肠弯曲杆菌S3B菌株制备的OMP提取物中检测的16kDa免疫反应性条带(条带17)可能为脂低聚糖(LOS)(Stern，N.J.，和S.Pretanik(2006)，J.Food Prot.69：1034-1039)。
空肠弯曲杆菌81-176独有的Cj S3B-SPF条带是鞭毛蛋白。如通过纳升级LC/MS/MS所判断的，发现许多条带含有与FlaA序列或FlaB序列匹配的肽(图4)。该发现引出了这样的可能性：因为鞭毛蛋白蛋白亚基的存在，特定的条带可能是免疫反应性的。为确定这些条带的反应性是否是由于鞭毛蛋白亚基或不同于鞭毛蛋白的另一蛋白导致的，用抗空肠弯曲杆菌鞭毛蛋白血清对空肠弯曲杆菌S3B OMP提取物和81-176OMP提取物进行探针检测。如所预期的，65kDa蛋白(条带3)与抗空肠弯曲杆菌鞭毛蛋白血清反应。并且，在来自空肠弯曲杆菌菌株81-176的OMP提取物中检测到50kDa(条带7)、45kDa(条带8)、40kDa(条带)、和23kDa(条带15)的蛋白，而在空肠弯曲杆菌S3B菌株的OMP提取物中未检测到。50kDa、45kDa、40kDa和23kDa的免疫反应性条带是空肠弯曲杆菌81-176OMP提取物独有的(即，在空肠弯曲杆菌S3B OMP提取物中未检测到)。通过纳升级LC/MS/MS确定了空肠弯曲杆菌81-176OMP提取物中的50kDa、45kDa、40kDa和23kDa的条带为FlaA或FlaB。
空肠弯曲杆菌S3B特异性抗体抑制同源菌株的运动性，但不抑制异源菌株的运动性。用Cj S3B-SPF血清与空肠弯曲杆菌S3B(图3A)和81-176菌株(图3B)进行运动性测定。当与利用收获自未被空肠弯曲杆菌定殖的鸟的对照血清的相同菌株相比较时，与空肠弯曲杆菌81-176菌株相对比，仅空肠弯曲杆菌S3B菌株表现了运动性的降低。该观察对于Cj S3B-SPF热灭活的血清以及Cj S3B-SPF未处理的血清二者是成立的，表明运动性的降低是由于抗体与细菌的结合导致的，而非由于补体的作用所导致。
实施例2.空肠弯曲杆菌推定的粘附素的检查和鸡定殖所需的、命名为FlpA的新型蛋白的鉴定
鸡的空肠弯曲杆菌定殖可能取决于命名为粘附素的多种表面暴露的蛋白。推定的空肠弯曲杆菌粘附素包括CadF、CapA、JlpA、MOMP、PEB1、Cj1279c和Cj1349c。通过多位点序列分型(MLST)检查回收自人类、家禽、牛、猪、羊和犬来源的97种空肠弯曲杆菌分离株的遗传亲缘关系，并通过点印迹杂交确定其推定的粘附素编码基因谱。为评估每种蛋白在细菌-宿主细胞粘附中的单独的贡献，通过插入诱变来破坏编码推定的粘附素的空肠弯曲杆菌基因。通过利用鸡LMH肝细胞癌上皮细胞进行体外细胞粘附测定并利用肉鸡进行体内定殖测定来判断每个突变体的表型。MLST分析表明本研究中所用的空肠弯曲杆菌分离株是遗传多样性的。点印迹杂交显示，除capA之外，编码推定的粘附素的空肠弯曲杆菌基因在分离株之中是保守的。发现空肠弯曲杆菌CadF蛋白、CapA蛋白、Cj1279c蛋白和Cj1349c蛋白在对于鸡上皮细胞的细菌体外粘附中具有重要作用，而确定了CadF、PEB1和Cj1279c在细菌的肉鸡体内定殖中具有重要作用。总之，数据表明Cj1279c是新颖的粘附素。因为Cj1279c具有纤连蛋白III型结构域，该蛋白被命名为FlpA，表示纤连蛋白样蛋白A(Fibronectin-likeprotein A)。
材料和方法
细菌菌株和生长条件。从人类临床病例、家禽、牛、猪(porcine/swine)、羊和犬来源获得了97个空肠弯曲杆菌分离株(数据未显示)。所有人类分离株获自具有弯曲菌病的临床体征的个体。空肠弯曲杆菌F38011分离自患有血性腹泻的个体。我们使用了总共43个人类菌株(F38011、81-176、81116、M129、H1、H2、H4-7、H9-24、H26-32和H34-43)、41个家禽菌株(RM1221、Turkey、S1、S2B、USDA02-833L、A2a、A5a、A18a、D34a、G11a、Iowa 2、Iowa 4-9、Iowa 11-13、Iowa 15、Iowa 21-26、Iowa 33-36、Iowa 39、Iowa 42、Iowa 44、Iowa 77-81和Iowa 83)、5个牛菌株(C913、C973、C1086、C1129和C1144)、5个猪菌株(93-55、93-58、93-338、93-343和92-1578)、2个羊菌株(ov48和ov112)和1个犬菌株(can1979858)。在补充有5％柠檬酸盐牛血的Mueller-Hinton琼脂板(MH-血琼脂板)上在微好氧条件下(5％O2、10％CO2、85％％N2)在37℃下培养空肠弯曲杆菌分离株。每48小时将空肠弯曲杆菌菌株继代培养至新鲜平板。如以下所描述的生成空肠弯曲杆菌F38011 cadF(卡那霉素抗性，KanR)、capA(四环素抗性，TetR)、jlpA(KanR)、peb1A(KanR)、Cj1278c(TetR)、Cj1279c(KanR)和Cj1349c(KanR)突变体。当需要时，用以下浓度的抗生素补充生长培养基：卡那霉素，50μg/ml(Sigma，St.Louis，MO)和四环素，2.0μg/ml(Sigma)。
运动性测定。利用补充有0.4％选择琼脂(Select agar)(Invitrogen，Carlsbad，CA)的MH培养基确定运动性。简言之，将10μl的MH肉汤中的每种细菌悬浮液添加到琼脂的表面并在微好氧条件下在37℃下孵育平板。48小时孵育之后，通过测量细菌迁移区域的直径来确定运动性。
多位点序列分型。利用酚氯仿提取从空肠弯曲杆菌分离株中分离基因组DNA。简言之，在MH血琼脂平板上培养细菌，并在5ml的磷酸缓冲盐水溶液(PBS)中收获。在37℃下用500μl的10％的十二烷基硫酸钠(SDS)和5μl的蛋白酶K(20mg/ml)孵育1小时之后，进行三次酚和异戊醇氯仿提取(24份氯仿和1份异戊醇)，每次保留水层。向水层添加等体积的冷的异丙醇和250μl的2.5M醋酸钠，然后在-20℃下孵育5分钟。通过在11,600×g下离心15分钟来沉淀DNA。用70％的乙醇洗涤沉淀物，在11,600×g下离心15分钟，将沉淀物重悬于无菌水中，并用核糖核酸酶在37℃下处理1小时。用OD260/OD280比率确定DNA纯度，并利用NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE)确定浓度。
利用别处描述的引物(26)对空肠弯曲杆菌管家基因天冬氨酸酶A(aspA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、柠檬酸合酶(gltA)、丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)、磷酸葡糖变位酶(pgm)、转酮酶(tkt)和ATP合酶α亚基(uncA)进行扩增并测序。在含50pmol的每种引物、1×MasterAmp PCR缓冲液(Epicentre，Madison，WI)、1×MasterAmp PCR增强剂(Epicentre)、2.5mM MgCl2和250μM(每种)dNTP的50μl反应体积中用约50ng的基因组DNA和1U的Taq聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)进行PCR。利用以下的扩增参数扩增基因：94℃ 30秒，53℃ 30秒，和72℃2分钟(30个循环)。通过琼脂糖凝胶电泳确证扩增子，并在BioRobot 8000工作站(Qiagen，Valencia，CA)上进行纯化。使用ABI BigDye终止剂循环测序试剂盒(ABI BigDye terminator cycle sequencing kit)(版本3.1；AppliedBiosystems，Foster City，CA)和标准实验方案，在Tetrad热循环仪(Bio-Rad，Hercules，CA)上进行循环测序反应。利用DyeEx 96平板(Qiagen)纯化循环测序延伸产物。使用POP-7聚合物和ABI数据采集和测序分析软件，在ABI PRISM 3730 DNA分析仪(Applied Biosystems)上进行DNA测序。利用Seqman Pro(版本7.2；DNASTAR，Madison，WI)对核苷酸序列进行比对和分析。利用MLSTparser3(Miller等人，未发表)分配等位基因类型和序列类型；新颖的等位基因类型和序列类型提交至PubMLST空肠弯曲杆菌/大肠弯曲杆菌数据库(http://pubmlst.org/campylobacter/)。
点印迹杂交。本研究中检查的空肠弯曲杆菌推定的粘附素编码基因是porA、cadF、capA、jlpA、peb1A、Cj1279c和Cj1349c。来自空肠弯曲杆菌NCTC 11168的每个基因的序列获自在线资源(网址为sanger.ac.uk/Projects/C_jejuni/)。按以下描述生成基因特异性探针。利用表2中所列的引物通过PCR扩增每个基因的内部片段。用空肠弯曲杆菌NCTC 11168染色体DNA作为模板利用高保真Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行扩增。利用以下参数扩增基因：94℃ 2分钟(1个循环)；94℃ 45秒，60℃(每循环-1℃)30秒，70℃ 1.5分钟(10个循环)；94℃45秒，50℃ 30秒，70℃ 1.5分钟(25个循环)；70℃ 8分钟(1个循环)。根据生产商的说明(Original TA Cloning Kit，Invitrogen)将扩增的PCR片段连接到载体pCR2.1中并将其电穿孔进入到大肠杆菌InvαF′中。利用切口平移试剂盒(Nick Translation Kit)根据生产商的说明(Roche AppliedScience，Indianapolis，IN)对纯化的质粒进行切口平移。利用Schleicher和Schuell Minifold II Slot-Blotter(Jencons，United Kingdom)将通过如以上所描述的酚氯仿提取分离的100ng的空肠弯曲杆菌基因组DNA真空转移到基因筛查膜(PerkinElmer，Waltham，MA)上。将脱嘌呤溶液(0.25M HCl)添加到每个狭缝，持续4分钟，然后添加变性溶液(1.5M NaOH和0.5NaCl)持续3分钟、添加中和溶液(1.0M Tris和1.5M NaCl，pH 8.0)持续3分钟、以及添加20×SSC(3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠)持续20分钟。利用基因连接UV室(Gene Linker UV Chamber)根据生产商的说明(Bio-Rad，Hercules，CA)交联DNA至膜。用100μl已预热至50℃的杂交溶液[5ml甲酰胺，2ml 5×P缓冲液(1.0％BSA、1.0％聚乙烯吡咯烷酮，1.0％Ficoll、0.5％焦磷酸钠、5.0％SDS和250mM Tris pH 7.5)，2ml 50％硫酸葡聚糖，和0.58g NaCl]中的变性的鲑鱼精DNA在室温下封闭每个膜15分钟。通过在95℃下加热15分钟使放射性标记的探针变性，在冰上冷却15分钟，并将其添加至杂交溶液中。在杂交孵育器(Robbins Scientific，Hudson，NH)中在35℃下在杂交溶液中孵育膜过夜。在25℃下用2×SSC洗涤膜两次，持续10分钟，并在35℃下用2×SSC和1％SDS溶液洗涤两次，持续20分钟。在-80℃下用Kodak BioMax MR胶片进行放射自显影，持续约2小时。
空肠弯曲杆菌cadF、jlpA、peb1A、Cj1279c和Cj1349c自杀载体的生成。从pCR2.1多克隆位点(MCS)中移去用作点印迹杂交的探针的PCR扩增子，并将其连接到pBSK-Kan2中。pBSK-Kan2载体与pBlueScript(Invitrogen)除了原始的卡那霉素盒被在空肠弯曲杆菌和大肠杆菌二者中均起作用的一种所替代(Labigne-Roussel，A.等人.(1987)，Campylobacterjejuni.J.Bacteriol.169：5320-5323)之外是相同的。通过DNA测序确证所得的pBSK-Kan2载体(pMEK252-pMEK256)，并将其电穿孔到大肠杆菌InvαF′电感受态细胞中。
空肠弯曲杆菌capA和Cj1278c自杀载体的生成。利用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)和表2中所列的引物通过PCR扩增空肠弯曲杆菌capA和Cj1278c的上游和下游DNA区域。使用空肠弯曲杆菌NCTC 11168染色体DNA来扩增capA侧翼DNA区域，而将空肠弯曲杆菌F38011染色体DNA用于Cj1278c侧翼区域。反应条件为：94℃ 2分钟(1个循环)；94℃ 45秒，，63℃(每循环-1℃)30秒，70℃ 4分钟(8个循环)；94℃ 45秒，50℃ 30秒，70℃ 4分钟(25个循环)；70℃ 8分钟(1个循环)。将两个侧翼区域单独地克隆到pCR2.1中。此后，将一个片段克隆到具有另一片段的pCR2.1载体中，并将四环素抗性盒插入到两个侧翼区域之间。然后将所得的片段转移到pBSK-Kan2的MCS中。通过DNA测序验证突变构建体。
空肠弯曲杆菌F38011突变体的生成。在微好氧条件下在37℃下在振荡下在MH肉汤中对空肠弯曲杆菌F38011进行过夜培养，至最终OD540为1.0。在6,000×g下离心200ml的培养物5分钟以沉淀细胞。在无菌水中洗涤细胞一次，并在10％甘油中洗涤一次，并重悬于350μl的10％的甘油中。将约2μg的CsCl浓缩的自杀载体与50μl的电感受态空肠弯曲杆菌混合，并在2.50kV下进行脉冲。立即将细胞悬浮于200μl的MH肉汤中，并在MH血琼脂板上铺板。在微好氧环境中在37℃下过夜孵育之后，用一半的生长物在含有适当的抗生素(50μg/ml卡那霉素或2μg/ml四环素)的MH血平板上划线。48小时孵育之后，利用基因特异性引物通过PCR筛选分离的菌落。利用基因特异性引物证实每个空肠弯曲杆菌突变体，且在空肠弯曲杆菌capA和Cj1278c突变体的情况下通过对DNA侧翼区域进行测序来验证。在使用前评估每个空肠弯曲杆菌突变体的运动性。
组织培养。鸡LMH肝细胞癌细胞(ATCC CRL-2117)获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。将LMH细胞的原种培养物培养于包被有含0.1％明胶的补充有10％胎牛血清(FBS；HyClone Laboratories，Logan，UT)的Waymouth氏MB 752/1培养基的摇瓶中。在37℃下在潮湿的5％CO2孵育器中维持细胞。
空肠弯曲杆菌-LMH结合测定。接种LMH细胞至3.0×105个细胞/ml的细胞密度，在37℃下在潮湿的5％CO2孵育器中孵育细胞24小时。用补充有1％FBS的最低必需培养基(MEM；Invitrogen)洗涤细胞一次，并用约3.0×107CFU细菌接种。然后在600×g下对每个平板离心5分钟以促进细菌-宿主细胞接触，并在37℃下孵育30分钟。为定量细胞粘附，用PBS将用空肠弯曲杆菌接种的细胞洗涤三次，并用含0.1％(v/v)Triton X-100(Calbiochem，La Jolla，CA)的PBS的溶液裂解细胞。制备10倍连续稀释的样品并铺板于MH血琼脂平板上以确定粘附细菌的数量。所记录的值代表来自三个重复孔的平均计数±标准偏差。
表2.诱变的目标基因
Figure BDA0000143768750000441
a基因编号来自来自空肠弯曲杆菌NCTC11168的基因组序列。
b表示用来扩增用于生成自杀载体(基因敲除)和用于点印迹杂交的探针的DNA片段的引物。
c表示用来扩增用于构建载体以经由双交换事件来生成突变体(即，capA和Cj1278c)的DNA片段的引物；将两个片段克隆到pBSK-Kan2中，并通过插入四环素抗性盒来进行破坏。
鸡定殖实验。以下所描述的所有实验和程序遵照华盛顿州立大学的实验动物管理与使用委员会批准的实验方案(IACUC实验方案#3248)进行。获得了总共80只一周龄的小鸡，分成8组，并置于铁丝网上的隔离室中(Horsfall Bauer隔离器(Horsfall Bauer isolator))。无限制地提供水和商业上的仔鸡饲料。每个分离器装备有两个可移动金属盘。在处置之前采集粪便物并进行高压灭菌。通过口服填喂0.5ml的细菌悬浮液(～107细菌)来对小鸡接种空肠弯曲杆菌；在接种鸟之前将空肠弯曲杆菌F38011菌株在42℃下在Bolton氏肉汤中培养16小时。将10只小鸡的一组作为未接种的对照组。用空肠弯曲杆菌F38011接种剩余的小鸡组：1)野生型菌株；2)cadF突变体；3)capA突变体；4)jlpA突变体；5)peb1A突变体；6)Cj1279c突变体；和7)Cj1349c突变体。在接种小鸡之后，对剩余的细菌悬浮液进行连续稀释，并铺板到Campy-Cefex琼脂上(30)以确证每个接种物的CFU。
使小鸡在接种后(DPI)7天安乐死并剖检。从每个小鸡中剖取盲肠、称重、1∶10稀释于Bolton氏肉汤培养基中，并彻底消化。为进行计数，制备了盲肠内容物的10倍连续稀释液，并将其铺板于Campy-Cefex琼脂板上。在37℃下在微好氧环境中孵育平板，并在72小时孵育之后计数CFU。用空肠弯曲杆菌cadF和capA特异性引物(表2)进行PCR来证实被计数的菌落为空肠弯曲杆菌。
结果
本研究中所用的空肠弯曲杆菌是遗传多样性的。
多位点序列分型(MLST)常用于空肠弯曲杆菌分离株的分子分型(Dingle，K.E.等人(2001)，J.Clin.Microbiol.39：14-23；Levesque，S.等人(2008)，J.Clin.Microbiol.46：3404-3411)。采集来自人类、家禽、牛、猪、羊和犬来源的总共97个分离株，并通过MLST评估他们的遗传亲缘。空肠弯曲杆菌分离株包括45个序列类型(数据未示出)。84个分离株被指定为18个克隆群(clonal complex，CC)之一。具有最大数目的分离株的克隆群是CC 21、CC 48和CC 45，其分别包括19个分离株、10个分离株和10个分离株。总共2个人类分离株和11个动物分离株不属于MLST数据库中的CC。我们还比较了每个分离株的等位基因谱或序列类型(ST)。最常见的ST是ST-21，由分离株H2、H10、H12、Iowa 11、Iowa 13、Iowa 15、Iowa 35和C1129所代表。第二常见的ST是ST-50，由分离株H6、H34、H36、H37、H40、S1和93-58所代表。一些ST包括3至5个分离株，而27个ST由单独的分离株所代表。用4种人类分离株F38011、H11、H14和H30和一种家禽分离株USDA02-833L生成了新鉴定的ST。总共在7个基因座中鉴定了105个等位基因，并报道了新型pgm等位基因(pgm431)。基于MLST分析，我们推断该研究中使用的空肠弯曲杆菌菌株是遗传多样性的。
除capA外的粘附素编码基因在空肠弯曲杆菌菌株之间是保守的。通过点印迹杂交联合基因特异性探针确定了编码空肠弯曲杆菌菌株中推定的粘附素的基因的存在。这些基因的必要特征列于表3中。在所检验的每个空肠弯曲杆菌菌株中检测到了7个推定的粘附素编码基因中的6个，即cadF、jlpA、peb1A、porA、Cj1279c和Cj1349c(未示出)，表明这些基因在空肠弯曲杆菌中是保守的。7个推定的粘附素编码基因之一capA在所测定的菌株之间不是保守的。空肠弯曲杆菌capA在47个人类分离株中的17个(40％)中是不存在的，且在54个动物分离株中的21个(39％)中是不存在的。capA的存在或不存在常与特定的ST相关联。包括20个分离株的ST50、ST48和ST21全都具有capA，而包括15个分离株的ST464、459、61和45缺少capA。
表3.编码推定的粘附素的空肠弯曲杆菌基因
Figure BDA0000143768750000481
a利用NMPDR确定了推定的操纵子中的基因
b推定的信号肽切割位点
c推定的脂蛋白信号肽切割位点
CadF、CapA、Cj1279c和Cj1349c有利于空肠弯曲杆菌对鸡LMH细胞的粘附。为确定推定的粘附素在促进空肠弯曲杆菌与培养的鸡上皮细胞的结合中的作用，利用空肠弯曲杆菌突变体和鸡LMH肝细胞癌上皮细胞进行了体外粘附测定(图6)。未尝试porA基因中的突变，因为由于其关键的结构活性和孔活性，推测该基因的突变是致死的(Amako，K.等人(1996)，Microbiol.Immunol.40：749-754)。所生成的全部空肠弯曲杆菌突变体(即，cadF、capA、jlpA、peb1A、Cj1279c和Cj1349c)是有活力的(未示出)。选择LMH细胞系用于这些实验，因为其是研究者可容易获得的唯一的鸡上皮细胞系。虽然LMH细胞来源于肝，先前的空肠弯曲杆菌粘附研究表明了利用LMH上皮细胞和人类INT 407上皮细胞的相似的细菌-宿主细胞粘附效率(16，23)。jlpA和peb1A中的突变对空肠弯曲杆菌与LMH细胞的结合的能力具有极少影响。相比之下，当与空肠弯曲杆菌野生型菌株比较时，观察到了空肠弯曲杆菌cadF、capA、Cj1279c和Cj1349c突变体与LMH细胞的结合的显著降低(P＜0.05)。此外，对空肠弯曲杆菌分离株进行了基于MLST的基因匹配(H 11和H 14；Iowa 80和Iowa 81)，并检验了细胞粘附；H11分离株和Iowa 81分离株含有capA但H14和Iowa 80分离株不含。缺少capA的菌株相对于具有该基因的菌株显示了与LMH细胞结合的显著降低(P＜0.05)(未示出)。
CadF、PEB1和Cj1279c有利于肉鸡的空肠弯曲杆菌定殖。为确定每种推定的粘附素在鸡定殖中的相对重要性，用定义的空肠弯曲杆菌突变体接种一周龄的小鸡。将80只小鸡分组，每组包括10只小鸡(图7)。在接种后7天安乐死全部小鸡，并确定每克盲肠物质的空肠弯曲杆菌的数目。从任何未接种的小鸡中未回收到空肠弯曲杆菌。如通过与野生型相比较所判断的，capA基因、jlpA基因和Cj1349c基因对空肠弯曲杆菌定殖小鸡的能力具有极少影响。相比之下，空肠弯曲杆菌cadF、peb1A和Cj1279c突变体表现出其定殖小鸡的能力显著受损，因为接种空肠弯曲杆菌cadF突变体和Cj1279c突变体的10只鸡中仅2只被定殖。接种空肠弯曲杆菌peb1A突变体的10只鸡均未被定殖。
Cj1279c是有效细胞粘附和鸡定殖所需。对Cj1279c的计算机模拟分析显示了该基因位于由13个基因组成的推定的操纵子中(网址位于www.microbesonline.org)。Cj1279c基因位于编码推定的核糖体假尿苷合酶的Cj1280c的下游，并位于参与包括细胞分裂和新陈代谢的多种功能的11个空肠弯曲杆菌基因的上游。为减少对极性效应的担心，对Cj1279c下游的Cj1278c基因进行突变。利用鸡LMH细胞进行的粘附测定表明观察到的Cj1279c突变体的表型并非极性效应所导致，因为相对于野生型菌株利用Cj1278c突变体观察到的结合没有差异(图8)。虽然观察到一个实验与另一实验在与鸡LMH细胞结合的空肠弯曲杆菌的数目上具有差异(图6和8)，这些结果似乎由于MOI的变动所引起。无论如何，在所进行的所有实验中，当与野生型菌株相比较时，空肠弯曲杆菌cadF突变体和Cj1279c突变体一致地表现了细胞结合的降低。因为Cj1279c先前未被表征，我们提出其为新颖的粘附素。如上所述，Cj1279c突变体表现对鸡LMH细胞的粘附和鸡的定殖的降低。基于这些发现和Cj1279c含有Fn III型结构域的事实，从此将Cj1279c基因称作“flpA”，代表纤连蛋白样蛋白A。
实施例3空肠弯曲杆菌FlpA结合纤连蛋白且是最大的宿主细胞粘附所需
该研究的目的是表征FlpA的结合性质，并确定该蛋白是否是微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)家族的成员。实验证据显示空肠弯曲杆菌FlpA是表面暴露的，促进细菌与宿主上皮细胞的结合，并具有Fn结合活性。还进行测定以确定CadF和FlpA是否协同作用以促进空肠弯曲杆菌与宿主细胞和Fn的结合。将FlpA鉴定为空肠弯曲杆菌中的第二MSCRAMM突出显示了Fn结合在宿主定殖和疾病中的重要性。
材料和方法
细菌菌株.在微好氧条件下(5％O2，10％CO2，85％N2)在37℃下在补充有5％牛血的Mueller Hinton琼脂平板(MH-血琼脂)上培养所有空肠弯曲杆菌菌株。每24至48小时将菌株传代至新鲜平板。从患有弯曲菌病的个体中回收空肠弯曲杆菌F38011菌株。如以下所描述的生成空肠弯曲杆菌F38011 flpA突变体(四环素抗性，TetR)和cadF flpA突变体(KanR，TetR)。如别处所描述的生成空肠弯曲杆菌F38011 cadF(卡那霉素抗性，KanR)突变体(5)。当需要时，用氯霉素(Chl，8μg/ml)，卡那霉素(Kan，50μl/ml)，四环素(Tet，2μg/ml)或头孢哌酮(Cef，30μg/ml)补充生长培养基。在需氧环境下在37℃下将大肠杆菌XL1-Blue MRF′(TetR，Stratagene，Garden Grove，CA)、大肠杆菌BL21(Novagen，Madison，WI)和大肠杆菌LMG194(链霉素，SmR和TetR，Invitrogen，Carlsbad，CA)培养于Luria-Bertani(LB)琼脂板上或LB肉汤中。当需要时，对生长培养基补充氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)，卡那霉素(50μg/ml)，四环素(12.5μg/ml)，或氯霉素(20μg/ml)。
flpA操纵子的分析在MH肉汤中将空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株培养至指数期中期，并利用RiboPure-细菌试剂盒(Ambion，Austin，TX)根据生产商的说明提取总细胞RNA。通过用11单位的RQ1无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶在37℃下处理30分钟而降解基因组DNA。利用随机六聚体引物和利用ThermoScript逆转录酶(RT)PCR系统(Invitrogen)根据生产商的说明从500ng的RNA合成cDNA。作为阴性对照，在无RT酶的情况下进行RT-PCR反应。在不同的天进行两次独立的RNA提取反应和cDNA合成反应。
表4列出了本研究中所用的全部引物。利用1μl的1∶10稀释的cDNA作为模板，在25μl的总体积中进行PCR以确定与flpA共转录的基因。作为阳性对照，利用空肠弯曲杆菌F38011基因组DNA作为模板进行反应。利用Tap DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)在以下的参数下扩增DNA片段：94℃ 4分钟，1个循环；94℃ 45秒，60℃ 30秒(-1℃每循环)，和70℃ 2分钟，10个循环；94℃ 45秒，50℃ 30秒，和70℃ 2分钟，25个循环。利用以下的引物对扩增了跨越基因Cj1280c、flpA、Cj1278c、Cj1277c、Cj1276c和Cj1275c之间的连接的PCR产物：MEK2386和MEK2387，MEK2388和MEK2389，MEK2412和MEK2411，MEK2420和MEK2421，和MEK2422和MEK2423。通过在1％的琼脂糖凝胶中电泳来分析所得的PCR扩增子。
表4.本研究中所用的引物
Figure BDA0000143768750000521
a下划线为限制性核酸内切酶切割位点。
空肠弯曲杆菌F38011 flpA和cadF flpA突变体的生成。利用具有flpA基因的破坏的拷贝的自杀载体通过同源重组生成空肠弯曲杆菌F38011的flpA基因的突变。利用HiFi Taq(Invitrogen)连同含有BamHI和SstII限制性位点的引物MEK1672和MEK1671 PCR扩增flpA基因的5′侧翼区，并连接到pCR2.1(Invitrogen)中。利用含有SstII和BamHI限制性位点的引物MEK1673和MEK1674PCR扩增flpA基因的3′侧翼区，并连接到pCR2.1(Invitrogen)中。用SstII和BamHI限制性酶对3′片段进行限制性酶切，凝胶纯化，并与pCR2.1载体中的5′片段连接。用SstII消化所得的载体，并插入赋予Tet抗性的tetO基因。然后用BamHI消化该载体以释放含有5′和3′flpA侧翼片段以及tetO基因的片段，随后将其连接到自杀载体pBSK(Stratagene，La Jolla，CA)中。pBSK载体先前已经修饰而包括编码Kan抗性的aphA-3基因盒。将该载体电穿孔至空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株和空肠弯曲杆菌F38011 cadF突变体中，挑选Tet抗性的菌落。利用flpA基因特异性引物通过PCR证实空肠弯曲杆菌flpA突变体。
空肠弯曲杆菌flpA突变体的补偿。利用HiFi Taq和具有NdeI限制性酶和KpnI限制性酶的引物MEK1681和MEK1883从空肠弯曲杆菌F38011基因组DNA PCR扩增flpA ORF连同0bp上游序列和15bp下游序列。利用含有BamHI限制性酶和NdeI限制性酶的引物MEK1687和MEK1688从空肠弯曲杆菌NCTC11168扩增metK启动子序列。利用BamHI位点和KpnI位点将metK启动子-flpA基因产物克隆到pRY111穿梭载体的MCS中。通过DNA测序验证pRY111中的metK启动子-flpA，并将所得的载体电穿孔到用于接合到空肠弯曲杆菌F38011flpA突变体中的大肠杆菌S17-1λ-pir中。利用对培养于补充有卡那霉素的MH肉汤中的空肠弯曲杆菌F38011 flpA突变体和培养于补充有氯霉素的LB肉汤中的含有pRY111metK启动子-flpA构建体的大肠杆菌S17-1λ-pir进行过夜培养来进行接合。通过在6,000×g下离心2分钟来沉淀细菌(1OD540单位的等价物)，并弃去上清液。将大肠杆菌S17-1λ-pir沉淀物重悬于500μl的MH肉汤中并与空肠弯曲杆菌F38011 flpA突变体沉淀物合并。再次沉淀细胞，并弃去上清液。然后将合并的沉淀物点到MH血琼脂平板上并在微需氧环境中在37℃下孵育14小时。然后将接合点(conjugation spot)在补充有氯霉素和头孢哌酮的MH血琼脂平板上划线，并孵育48小时。选择分离的转化体并通过PCR验证空肠弯曲杆菌flpA突变体中的重组载体的存在。将补偿的flpA突变体命名为空肠弯曲杆菌flpA(flpA+)补偿菌株。
flpA-pET24b、flpA-pBADA和flpA-pGST重组载体的构建。利用来自Novagen的pET表达系统生成重组的组氨酸标签的FlpA蛋白。利用含有BamHI和XhoI限制性酶的基因特异性引物MEK1679和MEK1680PCR扩增flpA基因的片段，并利用标准分子生物技术将其克隆到pET24b(KanR)载体中。将重组的质粒，flpA-pET24b导入到大肠杆菌BL21(DE3)中。利用TALON金属亲和树脂(TALON Metal Affinity Resin)(Clontech，Mountain View，CA)根据生产商的说明纯化His标签的FlpA蛋白。
为确定FlpA是否协助大肠杆菌结合上皮细胞，我们利用pBAD表达载体在大肠杆菌中表达了flpA基因。pBAD/Myc-HisA载体(AmpR)，从此称作pBADA，获自Invitrogen。利用含有NcoI和KpnI限制性酶的基因特异性引物MEK1765和MEK1766PCR扩增flpA基因的片段，并利用标准分子生物技术将其克隆到pBADA载体中。将重组的质粒1279c pBADA导入到大肠杆菌LMG194中。按照供应商所描述，通过添加L-阿拉伯糖来诱导大肠杆菌LMG194中flpA基因的表达。
利用纯化的GST标签的FlpA蛋白通过ELISA确定FlpA结合Fn的能力。利用含有BamHI和XhoI限制性酶的基因特异性引物MEK1765和MEK1766PCR扩增flpA基因的片段，并利用标准分子生物技术将其克隆到pGEX-5x-1载体中。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和树脂(GEHealthcare/Amersham)根据生产商的说明纯化FlpA-GST蛋白。利用引物MEK2522和MEK2523将cadF基因片段克隆到pGEX-5x-1载体中。如关于FlpA所描述的纯化GST标签的CadF蛋白。
CjFlpA特异性血清的生成。利用TiterMaxGold(CyRx Corporation，Norcross，GA)中的500μg纯化的His标签的FlpA蛋白对雌性新西兰白兔(New Zealand White rabbit)进行皮下注射和肌内注射。在初次注射后4周和6周时施用两次加强注射，每次注射含于弗氏不完全佐剂(Sigma)中的50μg的蛋白。在全部免疫之前、和第二次加强注射之后7天采集血液。利用标准实验室方法制备血清，并贮存于-80℃。利用由位于华盛顿州立大学的实验动物管理与使用委员会批准的实验方案(IACUC实验方案#2433)在新西兰白兔中生成了FlpA特异性抗体。
外膜蛋白提取物。如通过de Melo和Pechère(2)所描述的进行修改，利用N-十二烷酰-肌氨酸提取空肠弯曲杆菌外膜蛋白(OMP)。在微好氧条件下在MH肉汤中过夜培养空肠弯曲杆菌，通过离心进行沉淀，并悬浮于含有1mM苯甲基磺酰氟(Sigma，St.Louis，MO)、10μg/ml脱氧核糖核酸酶I(DNA酶I，Sigma)和10μg/ml核糖核酸酶A(RNA酶，Fermentas，Glen Burnie，MD)的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)中。利用Branson超声细胞破碎仪(Branson Sonifier Cell Disruptor)(型号250；Branson SonicPower Co.，Danbury，CT)对细菌细胞悬浮液超声5次持续30秒，每两次超声之间具有30秒的冰上冷却期。通过两次连续的离心除去细胞碎片，每次离心在6,000×g下持续10分钟。通过在4℃下在100,000×g下离心2小时来获得粗膜提取物。将所得沉淀物悬浮于10mM Tris(pH 7.5)中，并如生产商的说明书中(Pierce，Rockford，IL)所描述的利用二喹啉甲酸(BCA)确定每个样品的蛋白浓度。以1∶4(w/w)的蛋白比去垢剂比率将N-十二烷酰-肌氨酸(Sigma)添加到粗提取物中。在室温下在轻微晃动下孵育样品30分钟，并在4℃下在100,000×g下离心2小时。用50mM Tris(pH 7.5)洗涤沉淀物，并将其悬浮于相同的缓冲液中，并贮存在-20℃下。通过BCA测定确定OMP提取物的蛋白浓度。
SDS-PAGE和免疫印迹分析。将空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株和突变体的全细胞裂解物(0.1OD540单位的等价物)溶于单一强度电泳样品缓冲液中并在95℃下孵育5分钟。利用通过Laemmli(7)所描述的不连续系统在SDS-12.5％聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白。电泳后，用考马斯亮蓝R-250(CBB R-250，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)染色蛋白。为进行免疫印迹分析，将蛋白电泳转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon P；Millipore Corporation，Bedford，MA)上。通过用在含9％脱脂奶粉的磷酸缓冲盐水-吐温[含有0.01％吐温20(v/v)的PBS(20mM磷酸钠和150mM氯化钠，pH7.5)]中1∶500稀释的α-FlpA血清在4℃下过夜孵育膜来进行免疫印迹。在用PBS-吐温洗涤三次之后，添加作为第二抗体的于PBS-吐温中1∶5000稀释的HRP-轭合的山羊α-兔IgG(全分子)并在室温下孵育1小时。用PBS-吐温洗涤两次和用PBS最终洗涤后，利用Kodak BioMax MR胶片和Western Lightning化学发光剂(Western LightningChemiluminescence)(PerkinElmer，Boston，MA)根据生产商的说明来显色印迹。
间接免疫荧光测定。将空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株和flpA突变体从MH血琼脂平板中收获到PBS中，并在玻璃显微镜载玻片上空气干燥20μl的细菌悬浮液。将空气干燥的样品快速通过火焰的上方并将PBS添加到载玻片表面上。用在含0.75％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中1∶20稀释的兔α-空肠弯曲杆菌全细胞多克隆血清(抗血清1622)(6)、兔α-FlpA血清或兔出血前血清在潮湿的室中在37℃下孵育细菌45分钟。用PBS洗涤载玻片三次且然后用1∶100稀释的Cy2-轭合的AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)在潮湿的室中在37℃下孵育45分钟。孵育后，用PBS洗涤样品10次，并将其置于具有含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，VECTASHIELD，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)的固定介质的玻璃载玻片上，并利用Nikon Eclipse TE2000倒置荧光显微镜察看。使用结合DNA的荧光染色DAPI来显现所有细菌。利用成像软件MetaMorph版本5捕捉图像并利用Adobe Photoshop 3.0.4进行处理。
组织培养。在补充有10％胎牛血清(FBS；HyClone Laboratories，Logan，UT)和5％L-谷氨酰胺(1.8mM)的最低必需培养基(MEM，Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)中维持INT 407人类肠上皮细胞(ATCC CCL6；美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)。在潮湿的、5％CO2培养箱中在37℃下培养细胞，且每48小时至72小时进行传代。
细菌宿主细胞粘附测定。用INT 407细胞(1.5×105细胞/孔)接种24孔组织培养盘的每个孔，并在潮湿的、5％CO2培养箱中在37℃下进行孵育。用适当的培养基洗涤细胞并用约5×107CFU的不同的空肠弯曲杆菌菌株接种细胞。通过在600×g下离心5分钟来促进细胞宿主细胞接触。为确定与INT 407细胞粘附的细菌的存活数目，在潮湿的、5％CO2培养箱中在37℃下孵育盘30分钟。该孵育期后，用PBS洗涤上皮细胞三次以去除未粘附的细菌。然后用含0.1％(v/v)Triton X-100的PBS溶液裂解上皮细胞。连续稀释悬浮液，并通过计数MH-血琼脂平板上所得的菌落来确定存活的粘附细菌的数目。所记录的值代表来自三个重复孔的平均计数±标准偏差。
为确定抗FlpA的抗体是否降低了空肠弯曲杆菌与INT 407细胞的结合，将不同稀释的FlpA特异性的血清和出血前血清添加到含约5×107CFU的细菌悬浮液中。然后在微好氧条件下(5％O2，10％CO2，85％N2)在37℃下孵育细菌悬浮液30分钟。如以上所描述的进行结合测定。
还用含有flpA-pBADA的大肠杆菌LMG194和含有无DNA插入物的pBADA的大肠杆菌LMG194进行结合(粘附)测定。为进行这些测定，在补充有氨苄青霉素的LB肉汤中在37℃下过夜孵育细菌。次日早上，用250μl过夜培养物接种5ml含氨苄青霉素的LB肉汤，并在37℃下在振荡下孵育90分钟。通过添加L-阿拉伯糖诱导flpA的表达；将0.0002％的L-阿拉伯糖添加到所有培养物中，持续2小时。基于检查相对FlpA蛋白水平相比时间和细菌存活率的预实验来确定添加到细菌培养物中的L-阿拉伯糖的量。如以上关于空肠弯曲杆菌菌株所描述的进行粘附测定，不同地是用约2×107CFU的每种大肠杆菌分离株来接种INT 407细胞
ELISA。用1μg的血浆纤连蛋白(Fn)(Sigma，St.Louis，MO)在4℃下过夜包被96孔平板的孔或用BSA包被孔作为阴性对照。第二天用洗涤缓冲液[含0.005％吐温20(v/v)的PBS]洗涤孔，并用1％BSA在25℃下封闭1小时，并用洗涤缓冲液洗涤一次。为确定每种蛋白的Fn结合活性，在PBS中制备FlpA-GST蛋白和CadF-GST蛋白的2倍连续稀释，将其添加到孔中，在25℃下孵育90分钟。将CadF-GST蛋白用作Fn结合亲和力的阳性对照。在用洗涤缓冲液洗涤孔三次之后，将在孵育缓冲液中1∶1000稀释的兔抗GST抗体(Sigma)添加到孔中并在25℃下孵育平板90分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤孔三次，将在PBS中稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗GST抗体(Sigma)的1∶5000稀释物添加到孔中并在25℃下孵育平板90分钟。洗涤孔，并通过添加TMB底物溶液(Thermo Scientific，Rockford，IL)检测结合的抗体。通过在492nm处的比色检测来定量结合。
空肠弯曲杆菌-Fn结合测定。用0.05M Tris缓冲盐水，pH7.5(Sigma)中的1mg/ml的Fn溶液包被96孔平底平板(Costar，Corning，NY)的孔，在4℃下过夜。为进行对照，还用含1％BSA的PBS包被孔。从过夜平板培养物中收获空肠弯曲杆菌F38011野生型、flpA突变体、cadF突变体和cadF flpA突变体，并重悬于PBS中使OD540为0.150(约108CFU)。用PBS洗涤孔，并将100μl的细菌悬浮液添加到每个孔，在37℃下5％CO2下孵育1小时。用PBS洗涤孔三次并通过添加0.25％胰蛋白酶(Gibco，Invitrogen)来去除粘附的细菌。为计数粘附的细菌的数目，将胰蛋白酶悬浮液的连续稀释铺板于MH-血琼脂上。
结果
flpA ORF和其编码的蛋白的显著特征
对来自4种空肠弯曲杆菌测序的菌株(即，NCTC 11168、RM1221、81-176和811116)的flpA基因和预测的操纵子结构的分析显示了保守的特征(图9)。4种空肠弯曲杆菌测序的菌株中的flp侧翼的基因的顺序是相同的(即，Cj1280c、Cj1279c(flpA)、Cj1278c、Cj1277c和Cj1276c)。除对flpA的计算机模拟分析之外，关于该基因所在的操纵子结构知之甚少。为确定flpA所在的操纵子中的基因的数目，利用基因特异性引物实验首先进行PCR以确定空肠弯曲杆菌F38011临床菌株中的基因顺序。PCR片段的大小与从NCTC 11168基因组分析中预测的相一致，表明空肠弯曲杆菌F38011菌株可能与以上所示的4种空肠弯曲杆菌菌株具有相同的基因顺序(即，Cj1280c、Cj1279c(flpA)、Cj1278c、Cj1277c和Cj1276c)。然后利用基因特异性引物进行RT-PCR分析以用实验确定flpA操纵子中的基因的数目。在空肠弯曲杆菌F38011菌株中，flpA是由Cj1280c、Cj1279c(flpA)、Cj1278c和Cj1277c组成的操纵子中的第二个基因。
空肠弯曲杆菌NCTC 11168中的flpA基因是1236个核苷酸。来自空肠弯曲杆菌NCTC 11168(Cj 1279c)的ORF以串联的两个AUG密码子起始，随后是AAA密码子(赖氨酸(K)残基)，且以UAG终止密码子来终止。来自空肠弯曲杆菌NCTC 11168的flpA ORF与来自其他测序的菌株的flpAORF的注释的一个差异是在来自空肠弯曲杆菌菌株RM1221、81-176和81116的ORF中，ORF起始于单一的AUG密码子，随后是AAA密码子。所有空肠弯曲杆菌测序的菌株中的提出的甲硫氨酸起始密码子之前为典型的Shine-Dalgarno序列(AGGA)。来自空肠弯曲杆菌NCTC 11168的ORF为411个氨基酸，并预测其合成具有46,124Da的计算分子量的蛋白(表2)。对FlpA推断的氨基酸序列的计算机模拟分析进一步显示了4种空肠弯曲杆菌菌株(即，NCTC 11168、RM1221、81-176和811116)之间在氨基酸水平上，蛋白具有大于99％的同一性(表2)。除来自NCTC 11168的FlpA的氨基末端的一个额外的甲硫氨酸之外，在4种菌株的完整的推断的氨基酸序列中仅11个残基不同。空肠弯曲杆菌F38011菌株中的flpA基因的核苷酸序列与空肠弯曲杆菌NCTC 11168菌株的相同，除了碱基882处的单一的沉默核苷酸差异(即，菌株F38011中的C相对于菌株11168中的T)。对空肠弯曲杆菌NCTC 11168FlpA预测的氨基酸序列的检查鉴定了第18-21位残基处的L-S-A-C基序，其与原核脂蛋白信号共有序列[LVI][ASTVI][GAS][C]相匹配(图10)。该共有序列发现于脂蛋白信号肽的C末端，称作脂盒(lipobox)。恒定的Cys残基是脂质修饰的，可能被插入到了脂双层的一个片层中。FlpA推断的氨基酸序列也含有Fn III型结构域。
FlpA是具有表面暴露的结构域的膜相关蛋白
如“材料和方法”中所描述的生成了空肠弯曲杆菌flpA突变体，且显示其具有与空肠弯曲杆菌野生型菌株相似的生长速率(未示出)。为确定FlpA的细胞定位，从空肠弯曲杆菌野生型菌株、flpA突变体和flpA(flpA+)补偿菌株中制备了外膜蛋白(OMP)提取物，并通过SDS-PAGE连同利用FlpA特异性血清的免疫印迹分析进行分析。在空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株和flpA(flpA+)补偿菌株的WCL提取物中容易观察到具有46kDa的分子量的条带，但在同基因的flpA敲除中未观察到(图10)。与FlpA是膜相关蛋白的想法相一致地，如通过其氨基末端前导序列所表明的，在空肠弯曲杆菌F38011野生型菌株和flpA(flpA+)补偿菌株的OMP提取物中也观察到了46kDa的免疫反应性条带。
为确定FlpA蛋白的结构域是否是表面暴露的，用FlpA特异性血清孵育空肠弯曲杆菌，并进行间接免疫荧光显微术。用兔α-空肠弯曲杆菌全细胞血清孵育所有细菌以用于阳性对照。用兔α-空肠弯曲杆菌全细胞血清或兔FlpA特异性血清孵育细菌之后，用Cy2轭合的山羊抗兔第二抗体进行孵育和检查。兔α-空肠弯曲杆菌全细胞血清染色了野生型细菌和flpA突变体细菌二者(未示出)。相比之下，兔FlpA特异性血清仅染色了野生型细菌(图11)。总之，这些结果显示FlpA是具有表面暴露的结构域的膜相关蛋白。
FlpA促进空肠弯曲杆菌与人类上皮细胞的结合
先前的研究表明FlpA在肉鸡的空肠弯曲杆菌定殖中具有作用，因为接种空肠弯曲杆菌flpA突变体的10只鸡中仅有2只被定殖(3)。基于该初始研究，利用人类INT 407细胞和空肠弯曲杆菌野生型菌株、cadF突变体、flpA突变体和flpA(flpA+)补偿菌株进行体外粘附测定(图12)。在这些测定中包括作为阴性对照的空肠弯曲杆菌cadF突变体(5)。在30∶1的感染复数时，空肠弯曲杆菌flpA突变体与空肠弯曲杆菌野生型菌株相比较显示了对INT 407细胞粘附的62％的降低。相比较地，空肠弯曲杆菌cadF突变体当与空肠弯曲杆菌野生型菌株相比较时显示了对INT 407细胞的粘附的72％的降低。空肠弯曲杆菌flpA突变体的结合的降低被判断为特异性的，因为具有metK启动子驱动的基因的野生型拷贝的突变体的反向补偿恢复了生物体与INT 407细胞的结合。为减少对极性效应的担心并为了进一步表明空肠弯曲杆菌flpA突变体所表现的表型是由于FlpA蛋白的存在所导致，我们检验了空肠弯曲杆菌与INT 407细胞的结合是否能够用FlpA特异性血清来阻止(图13)。FlpA特异性血清以剂量依赖方式降低了空肠弯曲杆菌与INT 407细胞的结合，在1∶12.5稀释血清时达到77％抑制的最大值。相比之下，在用兔出血前血清处理的空肠弯曲杆菌与INT407细胞的结合中未观察到统计学意义的差异。总之，这些发现表明FlpA调节对上皮细胞的粘附。
FlpA促进大肠杆菌与人类上皮细胞的结合
虽然当与野生型菌株相比较时空肠弯曲杆菌flpA突变体表现出与INT407细胞结合的降低，且FlpA特异性血清阻遏了粘附，但仍存在可能：其它蛋白可以间接作用以增强FlpA的粘附性质。为确定FlpA是否足以促进细菌与上皮细胞的结合，用表达flpA的大肠杆菌进行粘附测定。更具体地，我们检验了具有含flpA的pBADA质粒的大肠杆菌LMG194菌株(大肠杆菌flpA-pBADA)和含无DNA插入的pBADA的大肠杆菌LMG194菌株的结合性质。在这些测定之前，进行实验以确定足以诱导flpA表达的L-阿拉伯糖的最低浓度和时间。如通过SDS-PAGE所判断的，在已在含0.0002％L-阿拉伯糖的培养基中培养2小时的大肠杆菌flpA-pBADA菌株的全细胞裂解物中容易察看到46kDa条带(未示出)。在大肠杆菌flpA-pBADA分离株与INT 407细胞的结合[(1.1±0.2)×106]相对于含有空pBADA载体的大肠杆菌的结合[(4.13±1.1)×105]中观察到统计学上显著的差异。该发现进一步表明FlpA是粘附素。
FlpA结合纤连蛋白
每个Fn单体具有250kDa的分子量，并含有I型、II型和III型重复单元。FlpA的序列分析显示了与Fn III型(Fn III)结构域具有相似性的至少三个结构域的存在(参见图9)。Fn III结构域介导Fn-Fn相互作用(图9)。在存在Fn III型结构域的基础上，进行ELISA以确定FlpA是否具有Fn结合活性。将空肠弯曲杆菌CadF蛋白包括在这些测定中作为阳性对照，因为其Fn结合活性是被广泛报道的(4，5)。作为阴性对照，用BSA包被孔。此外，我们评估了单独的GST的结合。如通过ELISA所判断的，FlpA-GST标签蛋白和CadF-GST标签蛋白二者的Fn结合活性是明显的(图14)。证明了这些相互作用的特异性，因为在5μg至10μg之间的浓度时，结合是剂量依赖的且是可饱和的。然而，在所用的条件下，与Fn结合的CadF多于FlpA，表明这两种蛋白对Fn具有不同的亲和力。单独的GST未表现出显著的Fn结合亲和力；在一系列浓度范围中得到了0.1的背景吸光度值(未示出)。此外，所有GST融合蛋白对BSA包被的孔仅表现了低水平的非特异性结合。使用GST重组蛋白的原因是为了减少使用不同的抗体检测结合的蛋白的担心。利用FlpA和CadF特异性抗体还验证了FlpA和CadF的Fn结合活性(未示出)。基于这些结果，我们推断FlpA具有Fn结合活性。
CadF和FlpA是空肠弯曲杆菌结合宿主细胞和Fn所需
基于以上显示的数据，FlpA是MSCRAMM家族成员。为确定是否FlpA和CadF与宿主细胞和Fn的结合是相互独立的，用空肠弯曲杆菌野生型菌株、空肠弯曲杆菌cadF突变体、空肠弯曲杆菌flpA突变体和空肠弯曲杆菌cadF flpA双突变体进行了空肠弯曲杆菌宿主细胞粘附测定和Fn结合测定(图15)。当与野生型菌株相比较时，每个空肠弯曲杆菌突变体(即，cadF、flpA和cadF flpA)表现了与INT 407细胞和Fn包被的孔的结合的统计学显著的降低(图16)。此外，当与单独的空肠弯曲杆菌cadF突变体和flpA突变体相比较时，空肠弯曲杆菌cadF flpA双突变体表现出了与INT407细胞和Fn包被的孔的结合的相似的降低。总之，这些数据表明需要FlpA和CadF二者来协助空肠弯曲杆菌与Fn和宿主细胞的最大结合。
讨论
FlpA是MSCRAMM家族的成员
先前的研究表明空肠弯曲杆菌与胃肠细胞和胞外基质组分的粘附对于宿主定殖和随后的疾病是关键的。更具体地，当与野生型菌株相比较时空肠弯曲杆菌cadF突变体显示了对人类INT 407肠细胞的粘附的显著降低(8)。与cadF相似，对Cj1279c(flpA)的破坏导致了空肠弯曲杆菌突变体当与野生型菌株相比较时与鸡LMH肝细胞癌上皮细胞结合的能力和有效定殖肉鸡的能力受损(3)。基于蛋白的推断的氨基酸序列具有Fn III型结构域的事实，由Cj1279c基因编码的产物称作FlpA，代表纤连蛋白样蛋白A。如通过SDS-PAGE连同利用FlpA特异性的血清进行的免疫印迹分析所判断的，我们在此推断FlpA是与外膜组分相关的，且如通过免疫荧光显微术所判断的，FlpA是表面暴露的。基于以下实验发现我们还推断FlpA作为粘附素发挥作用：1)当与野生型菌株相比较时，空肠弯曲杆菌flpA突变体菌株与INT 407上皮细胞的结合显著降低；2)针对FlpA生成的兔多克隆血清以剂量依赖方式阻遏了空肠弯曲杆菌对INT 407的粘附；和3)当与含有空载体的大肠杆菌相比较时，大肠杆菌中flpA的表达显著提高了细菌与INT 407细胞的结合。最终，我们认为FlpA是MSCRAMM家族的成员，因为如通过ELISA所表明的，其以剂量依赖的和可饱和的方式结合Fn。基于体外测定和体内测定的总和，我们推断FlpA是新颖的空肠弯曲杆菌粘附素。
FlpA是推定的外膜脂蛋白
虽然该研究的最初重点是为证明FlpA的粘附性质，然而多个观察表明FlpA与空肠弯曲杆菌外膜相关。我们利用FlpA特异性血清在从空肠弯曲杆菌F38011制备的OMP提取物中看到了46kDa条带。并且，46kDa条带出现于从空肠弯曲杆菌flpA(flpA+)补偿菌株制备的OMP提取物中。值得注意的是，先前通过LC/MALDI/TOF-TOF在空肠弯曲杆菌81-176OMP提取物中检测了FlpA蛋白(即，CJJ81176-1295)(1，10)。如通过利用FlpA特异抗体进行的免疫荧光显微术所判断的，我们还发现FlpA暴露于细菌的表面。与该想法一致的是，FlpA的结构域是表面暴露的，用于免疫荧光测定的FlpA特异性抗体降低了空肠弯曲杆菌以剂量依赖方式对INT 407细胞的粘附。
对FlpA的氨基末端的探查表明了脂蛋白信号共有序列的存在。虽然确定地证明蛋白为脂修饰的蛋白的一些实验方法是可获得的，从其推定的氨基酸序列的探查，鉴定脂蛋白的推测性证据是明显的。脂蛋白的氨基末端信号序列的特征为氨基末端的带阳性电荷的残基、疏水性核心区域和在信号的羧基端具有不变的半胱氨酸残基的脂盒的三联结构(tripartitestructure)。FlpA推定的氨基序列含有这些关键特征中的每一种。原核脂蛋白信号共有序列的存在有力表明了FlpA是脂蛋白。
CadF和FlpA与纤连蛋白结合的模型
进行粘附测定以确定FlpA在空肠弯曲杆菌与人类INT 407上皮细胞的结合中的作用。当与空肠弯曲杆菌野生型菌株相比较时，空肠弯曲杆菌flpA突变体显示对INT 407细胞的粘附的62％的降低。相比较地，空肠弯曲杆菌cadF突变体显示对于INT 407细胞的粘附的72％的降低。由于两种蛋白均表现了Fn结合活性，检验了空肠弯曲杆菌cadF flpa突变体与空肠弯曲杆菌flpA突变体或空肠弯曲杆菌cadF突变体相比表现出对INT 407细胞的结合的更多的降低。发现空肠弯曲杆菌cadF flpA双突变体的结合的降低与单独的空肠弯曲杆菌cadF突变体或flpA突变体难以区分。随后，通过ELISA检验了纯化的FlpA和CadF对于Fn包被的孔的竞争性结合。然而，未鉴定两种蛋白竞争Fn结合所处的条件。基于这些数据，似乎可能的是，CadF结合Fn的一部分，且FlpA结合另一部分，且两种相互作用均是宿主细胞和Fn紧密连接所需的。无论这些相互作用的特异性如何，值得注意的是空肠弯曲杆菌具有至少两个Fn结合蛋白(即，MSCRAMM)。
总结
在该实施例中，提供了证明FlpA促进空肠弯曲杆菌与宿主上皮细胞的结合并具有Fn结合活性的实验证据。对FlpA以及CadF的鉴定和表征突出显示了空肠弯曲杆菌与Fn的结合对于宿主定殖和疾病的潜在重要性。实施例3的参考文献
1.Cordwell，S.J.，A.C.Len，R.G.Touma，N.E.Scott，L.Falconer，D.Jones，A.Connolly，B.Crossett，和S.P.Djordjevic.2008.Identification ofmembrane-associated proteins from Campylobacter jejuni strains usingcomplementary proteomics technologies(利用互补蛋白质组技术从空肠弯曲杆菌菌株中鉴定膜相关蛋白)。Proteomics.8：122-139.
2.de Melo，M.A.，和J.C.Pechere.1990.Identofocation of Campylobacterjejuni surface proteins that bind to eucaryotic cells in vitro(体外鉴定与真核细胞结合的空肠弯曲杆菌蛋白)。Infect.Immun.58：1749-1756.
3.Flanagan，R.C.，J.M.Neal-McKinney，A.S.Dhillon，W.G.Miller，和M.E.Konkel.2009.Examination of Campylobacter jejuni putative adhesinsleads to the identification of a new protein，designated FlpA，required forchicken colonization(空肠弯曲杆菌推定的粘附素的检查导致命名为FlpA的鸡定殖所需的新型蛋白的鉴定)。Infect.Immun.77：2399-2407.
4.Konkel，M.E.，J.E.Christensen，A.M.Keech，M.R.Monteville，J.D.Klena，和S.G.Garvis.2005.Identification of a fibronectin-binding domainwithin the Campylobacter jejuni CadF protein(空肠弯曲杆菌CadF蛋白中的纤连蛋白结合结构域的鉴定)。Mol.Microbiol.57：1022-1035.
5.Konkel，M.E.，S.G.Garvis，S.L.Tipton，D.E.Anderson，Jr.，和W.Cieplak，Jr.1997.Identification and molecular cloning of a gene encoding afibronectin-binding protein(CadF)from Campylobacter jejuni(编码来自空肠弯曲杆菌的纤连蛋白结合蛋白(CadF)的基因的鉴定和分子克隆)。Mol.Microbiol.24：953-963.
6.Konkel，M.E.，D.J.Mead，和W.Cieplak，Jr.1993.Kinetic andantigenic characterization of altered protein synthesis by Campylobacter jejuniduring cultivation with human epithelial cells(在与人类上皮细胞共同培养过程中由空肠弯曲杆菌进行的改变的蛋白合成的动力学和抗原性表征)。J.Infect.Dis.168：948-954.
7.Laemmli，U.K.1970.Cleavage of structural proteins during theassembly ofthe head of bacteriophage T4(噬菌体T4的头部组装过程中结构蛋白的裂解)。Nature.227：680-685.
8.Monteville，M.R.，J.E.Yoon，和M.E.Konkel.2003.Maximaladherence and invasion of INT 407 cells by Campylobacter jejuni requires theCadF outer-membrane protein and microfilament reorganization(空肠弯曲杆菌对INT 407细胞的最大粘附和侵入需要CadF外膜蛋白和微丝重构)。Microbiology.149：153-165.
9.Pankov，R.，和K.M.Yamada.2002.Fibronectin at a glance(纤连蛋白简介)。J Cell Sci 115：3861-3863.
10.Shoaf-Sweeney，K.D.，C.L.Larson，X.Tang，和M.E.Konkel.2008.Identification of Campylobacter j ejuni proteins recognized by maternalantibodies of chickens(由鸡的母体抗体识别的空肠弯曲杆菌蛋白的鉴定)。Appl.Environ.Microbiol.74：6867-6875.
实施例4.FlpA纤连蛋白结合结构域的表征
在该研究中，使用了酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定FlpA和Fn粘附的位点。使用编码三种FlpA结构域中的每一种的重组蛋白的ELISA证明了FlpA-D2含有Fn结合结构域。利用跨越FlpA-D2氨基酸序列的一系列合成的肽，鉴定了FlpA-D2中具有最大Fn结合活性的7个氨基酸158PHPDFRV164(SEQ ID NO：51)。由于FN3重复参与与Fn的N末端的分子内相互作用，确定了FlpA顶部结合从Fn的N末端形成的两个热分解片段——30kDa N末端结构域(NTD)和明胶结合结构域(GBD)。FlpA结合Fn明胶结合结构域(GBD)，但不结合NTD。而且，GBD和全长Fn结合的FlpA的量是相似的，表明GBD是FlpA与Fn粘附的主要位点。总之，这些数据表明FlpA-D2中的残基158PHPDFRV164介导对Fn的GBD的粘附。
材料和方法
细菌菌株/质粒在37℃下在好氧条件下在Luría-Bertaní(LB)琼脂平板上或在LB肉汤中维持大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，Garden Grove，CA)和BL21DE3(Novagen，Madison，WI)。将含有pGEX-5X-1(GEHealthcare)和pET-24b(Novagen)的菌株培养于分别补充有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的培养基中。利用如先前描述的(Konkel等人，2010)标准分子生物学技术构建和表达重组的N末端谷胱甘肽S转移酶(GST)标签蛋白和C末端6X-组氨酸(His)标签蛋白。使用以下的引物组来克隆用于表达的编码每个重组肽的DNA片段：FlpA-His，MEK1679和MEK1680；FlpA-GST(全长)，MEK1691和MEK1692；FlpA-D1-GST，MEK1691和MEK2494；FlpA-D2-GST，MEK2495和MEK2496；FlpA-D3-GST，MEK2497和MEK1692(表5)。
表5.用于表达重组蛋白的引物
Figure BDA0000143768750000661
蛋白纯化在37℃下在补充有适当的抗生素的1L肉汤培养物中在需氧环境下培养具有pGEX-5x-1表达载体和pET24b表达载体的大肠杆菌至OD540＝0.6，并在22℃下用1mM异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)过夜诱导。通过在4℃下在6,000×g下离心15分钟来收获细胞，将其重悬于冰冷的20mM NaPi、150mM NaCl、pH 7.4的缓冲液(PBS)中并在冰中通过超声进行裂解。通过离心使裂解物澄清，并对其应用适当的亲和树脂以进行纯化。在琼脂糖4B GST亲和树脂(GE Healthcare/Amersham)上根据生产商的说明纯化GST融合体。利用TALON树脂手册中的天然蛋白纯化方案在TALON金属亲和树脂(TALON Metal Affinity Resin)(Clontech，Mountain View，CA)上纯化His标签融合体。将含有期望的重组蛋白的级分混合，在25mM Tris pH 7.5或PBS中透析，并利用Amicon/Millipore浓缩器(Millipore，Bedford，MA)浓缩。
肽合成 通过华盛顿州立大学(Pullman，WA.)的分子生物学学院生物分析和生物技术实验室在Applied Biosystems 431A肽合成仪上利用由生产商提供的说明(Applied Biosystems，Foster City，CA.)利用标准N-9-芴基甲氧羰基化学合成所有FlpA肽和CadF肽。
用GST融合蛋白进行ELISA人类血浆纤连蛋白(Fn)和来自人类Fn的30kDa蛋白水解片段和40kDa蛋白水解片段购自Sigma(St.Louis，MO.)。用20mM NaPi、150mM NaCl、pH 7.4(PBS)中的40nM的Fn或Fn片段(Sigma)在4℃下过夜包被Costar 96孔聚苯乙烯平板(Corning，NY)。用PBS，0.01％pH 7.4(PBST)洗涤平板一次且然后用PBS，1％BSA(级分V(fraction V)，Sigma)进行封闭。在用封闭溶液孵育平板时，在PBS中制备FlpA-GST、FlpA-D1-GST、FlpA-D2-GST和FlpA-D3-GST的连续稀释液以产生范围从1000nM至7.815nM的浓度。在用PBST洗涤孔之后，以三个重复添加GST融合蛋白样品并在振荡下孵育2小时。用PBST洗涤孔三次并添加GST抗体(1∶1000于PBS中，Sigma)，持续2小时。洗涤孔并添加1∶5000稀释于PBS中的对兔IgG特异性的辣根过氧化酶抗体(α-R-HRP，Sigma)，持续1.5小时。洗涤孔并利用TMB底物试剂盒(ThermoScientific，IL)根据生产商的说明进行显色。通过测量450nm处的吸光度(A450nm)用分光光度法定量结合。所有样品以三个重复进行测定，且除非另外指明在室温下进行实验。每次ELISA实验利用新鲜的试剂在不同的天重复三次进行以确保重复性。从记录于用Fn蛋白而非GST融合蛋白包被的孔的吸光度的测量结果中减去样品吸光度以用于第一抗体和第二抗体的非特异性结合的对照。利用学生t-检验确定统计学显著性。
Fn结合ELISA.为研究Fn对于FlpA的结合，用250nM的含FlpA-GST、FlpA-D1-GST、FlpA-D2-GST和FlpA-D3-GST的PBS溶液在4℃下过夜包被96孔平板。为用FlpA合成肽或CadF合成肽包被平板，使用了2.5μM的浓度。用PBST，0.1％BSA(PBST-BSA)洗涤平板并用PBS1％BSA封闭1小时。在含0.02％BSA的PBS中制备Fn的连续稀释液而使浓度范围从20μg/ml至9.8μg/ml。用PBS-BSA洗涤平板并添加Fn溶液，且在振荡下孵育2小时。充分洗涤平板并添加1∶1000稀释于PBS 0.02％BSA的Fn抗体(Sigma)，持续1小时。另一洗涤步骤之后，添加α-R-HRP并如先前显色ELISA。
结果：
FlpA结构域2含有Fn结合结构域
FlpA与人类纤连蛋白(Fn)结合并介导空肠弯曲杆菌对Fn包被的表面和上皮细胞的粘附(Konkel等人2010)。对FlpA氨基酸序列的生物信息分析表明FlpA含有类似于Fn 3型(FN3)重复的三个结构域：FlpA-D1、FlpA-D2和FlpA-D3(Konkel等人2010)。为确定三个FlpA FN3样结构域中哪一个具有Fn结合结构域，我们将每个FlpA结构域克隆到pGEX表达载体中，并产生了三种GST融合蛋白：FlpA-D1-GST(第35-132位氨基酸)、FlpA-D2-GST(第135-226位氨基酸)和FlpA-D3-GST(第232-410位氨基酸)(参见图17)。GST标签为两种目的而起作用：1)GST融合蛋白的纯化，和2)用单一抗体检测四种GST融合蛋白。在包被Fn的孔中孵育FlpA-D1-GST、FlpA-D2-GST和FlpA-D3-GST融合蛋白的连续稀释液(图18A)。通过如材料和方法中所描述的测量每个样品的吸光度来确定结合的GST融合蛋白的相对量。将全长FlpA-GST(第35-410位氨基酸)蛋白用作阳性对照。在三个FlpA结构域融合蛋白中，仅与Fn包被的孔结合的FlpA-D2-GST(第135-226位氨基酸)与全长FlpA-GST蛋白(第35-410位氨基酸)的量相似。FlpA-D2-GST蛋白和FlpA-GST蛋白的结合是剂量依赖的和可饱和的。与Fn包被的孔结合的FlpA-D1-GST和FlpA-D3-GST的量显著少于FlpA-GST蛋白和FlpA-D2-GST蛋白。这些数据表明FlpA-D2含有FlpA Fn结合结构域。
为确证FlpA-D2含有Fn结合结构域，进行了第二种ELISA，其中用FlpA-GST、FlpA-D1-GST、FlpA-D2-GST和FlpA-D3-GST包被孔。添加Fn的连续稀释液，记录结合的Fn的量(图18B)。结合用FlpA-GST和FlpA-D2-GST包被的孔的Fn显著高于结合用FlpA-D1-GST和FlpA-D3-GST包被的孔的Fn。同样，Fn和FlpA-D2-GST之间的相互作用是剂量依赖的和可饱和的，表明了特异性。Fn与具有FlpA-D1-GST和FlpA-D3-GST的孔的结合是最小的。总之，这些数据表明FlpAFn结合结构域存在于FlpA-D2(第135-226位氨基酸)中。
FlpA氨基酸N150-F179具有最大Fn结合活性
除FlpA之外，空肠弯曲杆菌具有称作CadF的另一Fn结合蛋白。在先前的研究中，利用一系列合成肽，将CadF Fn结合结构域定位于4个氨基酸FRLS(CadF第134-137位氨基酸)(Konkel等人，2005)。利用相似的方法鉴定了FlpA结合Fn所需的氨基酸。合成了具有跨越FlpA-D2序列的15个氨基酸重叠的5种30mer的肽：P1 R135-V164、P2 N150-F179、P3 D165-I194、P4 K180-I209和P5 D195-V224(图17)。与先前的ELISA相似，用5种FlpA-D2肽中的每一种包被微量滴定板，并向孔中添加Fn的连续稀释液。用分光光度法确定每个肽结合的Fn的量(图19)。将一种具有FRLS结构域(FRLS+，第125-140位氨基酸)和一种无FRLS结构域(FRLS-，第118-133位氨基酸)的两种限定的CadF肽分别用作阳性对照和阴性对照。与P1肽和P2肽结合的Fn的量显著高于其它三种FlpA-D2肽和CadF FRLS-肽。与全长FlpA蛋白和FlpA-D2蛋白一样，Fn对于用P1(R135-V164)和P2(N150-F179)包被的孔的粘附是剂量依赖的和可饱和的。这些数据显示FlpA-D2(R135-F179)的氨基末端具有FlpA Fn结合结构域。
用FlpA肽进行的重复ELISA实验显示P1(R135-V164)和P2(N150-F179)一致地具有对于Fn的可比的亲和力。该观察表明FlpA-D2中的结合位点(氨基酸)的空间分布的两种可能性：1)FlpA-D2Fn结合位点位于P1和P2的重叠区域，对应于N150-164，或2)P1和P2各自具有负责Fn结合的独特的残基，表明Fn结合结构域的氨基酸序列延长于重叠的区域之外，并可能是非连续的。为评估这些可能性中的第一种，合成了另外的FlpA-D2肽，并进行了ELISA。
氨基酸P159-V164是最大Fn结合所需
Fn FN3重复包括以由可弯曲的环连接的两个反向平行β-片层排列的7个β链(Dickinson等人，1994)。预测二级结构FlpA-D2含有与非β-链区域交替的β-链区域(图17)。预测对应于FlpA-D2的部分的P1和P2的重叠区域(N150-V164)在N末端含有起始于N147处的非β-链区域，其在C末端方向邻近β-链，且随后为第二非β-链区域，终止于S166(图17)。基于二级结构预测，我们合成了包括N147-S166的第六肽(P6)。将用P6包被的孔结合的Fn与用P1和P2肽包被的孔结合的Fn相比较，并将用P5包被的孔作为阴性对照(图20)。P6结合的Fn的量与P1和P2相当，这表明P6(N147-S166)具有对于最大Fn结合关键的残基。
来自利用P1至P5的起始ELISA的数据(图19)表明Fn不结合P3(D165-I194)，这表明FlpA Fn结合所需的氨基酸未怎么延伸超越P6的C末端(V164)。为确定Fn结合结构域的N末端边界，合成了第7种肽。同样，使用了二级结构预测来选择第7种肽的序列。Schwarz-Linek等人2003(Schwarz-Linek等人，2003)利用合成肽表明来自产脓链球菌的SfbI中的串联β-链与Fn的N末端FN1重复的三链的β片层相互作用。因此，设计了第7种肽P7(F141-R157)跨越两个预测的β-链和一个非β-链区(图17)。然而，与用P7包被的孔结合的Fn最少，与阴性对照肽FlpA P5和CadF FRLS结合的Fn的量相似(数据未示出)，且显著少于与P1和P2结合的Fn。这些数据表明FlpA Fn结合结构域的N末端边界未显著延伸超越P158，且FlpA氨基酸P158-V164包括FlpAFn结合结构域的核心。目前正在进行高分辨率结构研究以进一步表征FlpA和Fn之间的相互作用的精确细节。
FlpA结合Fn的明胶/胶原相互作用结构域
利用ClustalW进行的FlpA-D2和FN31-15的氨基酸序列比对显示了FlpA-D2大部分与FN31准确匹配(22.9％序列同一性)(图21)。FN31结合位于朝向N末端Fn的FN1重复和FN2重复(Mao和Schwarzbauer，2005)。用嗜热菌蛋白酶消化Fn产生了保留其生理活性的Fn的限定的片段(图16)(Pankov和Yamada，2002)。产生了Fn嗜热菌蛋白酶片段之一，命名为N末端结构域(NTD)，大小为～30kDa，且包括FN11-5。另一40kDa的片段含有由FN16-9和FN21，2组成的明胶/胶原相互作用结构域(GBD)(图16)。为确定FlpA是否结合Fn NTD，用全长Fn、30kDa NTD片段和40kDa GBDFn片段包被了ELISA平板。有趣地是，全长FlpA和FlpA-D2二者结合的40kDa GBD片段的量与全长Fn相似，而与用30kDa NTD和卵清蛋白包被的孔的结合是最少的(图22)。与先前的测定一样，FlpA-D1-GST和FlpA-D3-GST不结合Fn或Fn GBD。这些数据表明FlpA-D2结合GBD中的Fn上的位点。
讨论
FlpA Fn结合位点的鉴定
进行本研究以进一步表征FlpA和Fn之间的相互作用。FlpA包括类似于来自Fn的FN3重复的三个结构域(D1、D2和D3)(图19和20)(Konkel等人，2010)。为确定Fn所结合的结构域，我们将每个FlpA结构域作为与GST标签融合的重组蛋白来分别表达。进行了一系列的ELISA来确定三个FlpA结构域中与Fn结合的结构域。FlpA-D2是表现出显著的Fn结合的唯一的FlpA结构域，而FlpA-D1和FlpA-D3的结合是最小的。并且，FlpA-D2和全长FlpA结合的Fn的量是相似的——表明主要的Fn结合位点位于FlpA-D2中。用CadF进行的先前的研究在ELISA实验中使用了一套组的合成肽而将CadF Fn结合结构域定位于134FRLS137(Konkel等人，2005)。我们使用了相似的方法来确定结合Fn的FlpA-D2中的残基。合成了具有跨越FlpA-D2氨基酸序列的15个氨基酸重叠的5个30mer的肽，并评估了其Fn结合活性(图17)。FlpA肽P1(R135-164)和P2(N150-F179)结合Fn的量与阳性对照肽(CadF FRLS+)相当。FlpA P1和P2结合Fn的量是难以区分的，因此我们检验了是否Fn结合结构域由P1和P2之间共有的对应于N150-V164的氨基酸组成。预测FlpA二级结构含有β-链，其与非β-链区域交替。FlpA二级结构的这些特征与Fn中的FN3重复的结构一致，后者包括排列成两个反向平行的β-片层的7个β-链(Dickinson等人，1994，Mao和Schwarzbauer，2005)。预测P1和P2共有的序列(N150-V164)在两个低序(非β-链)区之间含有单一的β-链区域。用其他Fn结合MSCRAMM进行的先前的研究发现无序的区域介导对于Fn的粘附(Schwarz-Linek等人，2004)。因此，设计了跨越FlpAN147-S166的P6，其覆盖中间的β-链和两个低序的序列。与FlpAP6结合的Fn的量与P1和P2结合的Fn的量相当。此外，我们发现对于包括在N末端至P158方向和C末端至V164方向的残基的肽，Fn结合是最小的。该观察表明FlpA Fn结合结构域的核心包括158PHPDFRV164。
FlpA结合Fn的GBD
Fn是包括FN1重复、FN2重复和FN3重复的嵌合蛋白。Fn的N末端区域包括FN1重复和FN2重复，而C末端主要包括FN3重复和新的FN1重复(图16)(Pankov和Yamada，2002)。血浆FN是可溶的并维持由N末端FN1重复和C末端FN3重复之间的相互作用来稳定的球状结构。例如，FN31结合Fn的由FN11-6组成的N末端结构域。还认为FN1重复和FN3重复之间的相互作用防止细胞表面受体对FN3结构域上的表位的识别(Mao和Schwarzbauer，2005，Pankov和Yamada，2002)。例如，在血浆中，Fn对RGD序列的接近是受限的。这防止了参与Fn组装到ECM中和细胞骨架重排的α5β1-整联蛋白依赖的信号传递(Mao和Schwarzbauer，2005，Pierschbacher和Ruoslahti，1984)。
由于FlpA含有推定的FN3结构域，我们检验查看是否FlpA结合Fn的N末端。用嗜热菌蛋白酶消化Fn产生了维持其生物活性的被充分表征的Fn片段。产生了包括Fn的N末端的两个片段：包括FN11-5的命名为N末端结构域(NTD)的～30kDa片段；和包括FN16-9和FN21，2的命名为明胶结合结构域(GBD)的～40kDa片段(图16)(Pankov和Yamada，2002)。在ELISA中，GBD结合的FlpA的水平与全长Fn相当，而NTD结合的FlpA是最少的。进行了ITC实验以确定FlpA-Fn相互作用的亲和力。
FlpA对空肠弯曲杆菌致病的影响
我们实验室中先前的研究证实FlpA是空肠弯曲杆菌粘附宿主组织所需(Flanagan等人，2009，Konkel等人，2010)。宿主细胞粘附是空肠弯曲杆菌侵入的先决条件，而侵入与急性疾病的发展相关(Babakhani等人，1993，Konkel等人，2001)。CadF介导的空肠弯曲杆菌对Fn的粘附是最大侵入效率所需。空肠弯曲杆菌cadF突变体的侵入的降低超出了可由单独降低的粘附解释的程度(Monteville等人，2003)。该结果可通过如下观察来解释：空肠弯曲杆菌对上皮细胞的侵入与桩蛋白的磷酸化和Rac1和Cdc42的激活同时发生(Krause-Gruszczynska等人，2007，Monteville等人，2003)。桩蛋白、Rac1和Cdc42是与宿主细胞局部复合物(FC)相关的蛋白。FC包括整联蛋白受体、衔接蛋白和信号传递蛋白。为响应于Fn-整联蛋白接合，FC在整联蛋白受体的胞质尾区上组装(Gilcrease，2007，Small和Kaverina，2003)。桩蛋白是FC组装过程中首先募集的蛋白之一，在那里其被FC相关激酶FAK和Src磷酸化。FC介导的信号传递也可通过一些下游效应物激活Rho GTP酶，Rac1和Cdc42。激活的Rac1和Cdc42控制分别称作片状伪足和丝足的基于肌动蛋白的膜突起的形成(Broussard等人，2008，Ridley，2006，Small和Kaverina，2003)。在空肠弯曲杆菌感染过程中观察到的桩蛋白的瞬时磷酸化和Rac1和Cdc42的激活依赖于CadF对于Fn的粘附。此外，在内化之前空肠弯曲杆菌定位于肌动蛋白突起(Krause-Gruszczynska等人，2007，Monteville等人，2003)。这些观察支持了空肠弯曲杆菌侵入的模型，其中细菌对Fn的粘附刺激用于细菌内化所需的细胞骨架重排的宿主细胞信号传递。
FlpA结合Fn-GBD对空肠弯曲杆菌内化的FC依赖的模型具有一些潜在的影响。FlpA对Fn-GBD的粘附可能破坏Fn的N末端和C末端之间的分子内相互作用以暴露参与Fn原纤维组装、细胞表面受体激活或CadF粘附的Fn结构域。利用FN缺失(-/-)的小鼠胚胎成纤维细胞已大量研究了血浆Fn组装到ECM。发现血浆Fn组装到ECM是细胞依赖的过程，其在具有活性整联蛋白受体特征的专门的细胞表面位点起始。细胞表面组装位点的展示受细胞对C末端FN3重复(即，FN310 RGD)的粘附的刺激。与细胞表面组装位点相关的活化的整联蛋白受体识别并结合Fn的N末端FN1和FN2，其导致血浆Fn的结构的构象改变并掺入到ECM中(Mao和Schwarzbauer，2005，Xu等人，2009)。FC形成于原纤维组装的位点，所述位点包括α5β1-整联蛋白受体、FAK、黏着斑蛋白和桩蛋白，并将新形成的原纤维连接于肌动蛋白细胞骨架(Mao和Schwarzbauer，2005)。因此，如果FlpA对Fn的粘附促进了Fn原纤维组装，则将使宿主细胞FC组分接近空肠弯曲杆菌粘附的位点并使其参与细菌内化。可选地，FlpA可诱导Fn的构象改变以促进CadF对Fn的粘附并促进FC依赖的侵入过程。目前正在进行实验以确定在溶液中FlpA是否改变CadF对Fn的亲和力。
FlpA在Fn结合MSCRAMM中是独特的
最为充分表征的Fn-结合MSCRAMM属于产脓链球菌产生的蛋白(SfbI)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生的蛋白(FnBPA)和布氏疏螺旋体(Borrelia Burgdorferi)产生的蛋白(BBK32)的总称为FnBP(代表Fn结合蛋白)的组(Schwarz-Linek等人，2004)。对FnBP的分析已鉴定了保守的Fn结合结构域。FnBP具有通过串联β-拉链机制结合Fn的NTD的C末端串联重复。在该机制中，FnBP的结构无序的Fn结合重复形成短反向平行β-链，其与连续的FN1模块的三链的β片层相互作用，导致与Fn的NTD的高亲和力结合(Schwarz-Linek等人，2003)。Talay等人(2000)评估了SfbI的串联重复和间隔子的作用(Talay等人，2000)。SfbI的C末端重复足以赋予细菌粘附，而侵入依赖于结合Fn的GBD的间隔子结构域的粘附。有趣地是，SfbI重复对Fn NTD的粘附是SfbI间隔子结构域与Fn的结合所需要的(Ozeri等人，1996，Talay等人，2000)。
FlpA是推定的脂蛋白，包括三个FN3样结构域。FlpA和Fn之间相互作用的首要位点位于FlpA-D2和Fn的GBD中。158PHPDFRV164序列位于FlpA-D2的被预测为低序的且邻近β-链的区域。该FlpAFN结合结构域的推定的无序结构与来自SfbI的Fn结合重复的无序结构相一致，其可能表明如SfbI一样，在结合Fn后，FlpA的Fn结合结构域经历了无序到有序的转变(Schwarz-Linek等人，2004)。然而，FlpA-D2未表现出具有FnBP的C末端重复结构域特征。与Fn NTD结合的FnBP的串联重复和与FnGBD结合的FnBBP的上游间隔子结构域，形成跨越～60氨基酸的跨度(Schwarz-Linek等人，2004)。在该研究中鉴定的FlpA Fn结合结构域由相对短的肽(158PHPDFRV164)组成，其不与任何FnBP Fn结合结构域共有序列同一性。在无详细的结构信息的情况下，难以确定参与FlpA粘附的精确的残基，但该研究的结果表明我们已鉴定了包括FlpAFn结合位点的核心的关键残基。
总之，FlpA是由三个FN3重复组成的新颖的MSCRAMM，其结合Fn的GBD中的位点。目前进行研究以：1)表征FlpA的结构，2)确定FlpA、CadF和Fn之间相互作用的亲和力，和3)评估FlpA-Fn相互作用对CadF对于Fn的粘附的影响。
实施例4的参考文献
Babakhani FK，Bradley GA和Joens LA.Newborn piglet model forcampylobacteriosis(弯曲菌病的新生小猪模型)。Infect Immun.1993；61(8)：3466-75.PMCID：PMC281024.
Broussard JA，Webb DJ和Kaverina I.Asymmetric focal adhesiondisassembly in motile cells(游动细胞中的不对称的粘着斑分解)。Curr OpinCell Biol.2008；20(1)：85-90.
Dickinson CD，Gay DA，Parello J，Ruoslahti E和Ely KR.Crystals of thecell-binding module of fibronectin obtained from a series of recombinantfragments differing in length(获自长度不同的一系列重组片段的纤连蛋白的细胞结合模块的晶体)。J Mol Biol.1994；238(1)：123-7.
Flanagan RC，Neal-McKinney JM，Dhillon AS，Miller WG和Konkel ME.Examination of Campylobacter jejuni putative adhesins leads to theidentification of a new protein，designated FlpA，required for chickencolonization(空肠弯曲杆菌推定的粘附素的检查导致命名为FlpA的鸡定殖所需的新型蛋白的鉴定)。Infect Immun.2009；77(6)：2399-407.
Gilcrease MZ.Integrin signaling in epithelial cells(上皮细胞中的整联蛋白信号传递)。Cancer Lett.2007；247(1)：1-25.
Konkel ME，Larson CL和Flanagan RC.Campylobacter jejuni FlpA bindsfibronectin and is required for maximal host cell adherence(空肠弯曲杆菌FlpA结合纤连蛋白且是最大的宿主细胞粘附所需)。J Bacteriol.2010，192(1)：68-76.PMCID：PMC2798237.
Konkel ME，Monteville MR，Rivera-Amill V和Joens LA.Thepathogenesis of Campylobacter jejuni-mediated enteritis(空肠弯曲杆菌介导的肠炎的病理)。Curr Issues Intest Microbiol.2001；2(2)：55-71.
Konkel ME，Christensen JE，Keech AM，Monteville MR，Klena JD和Garvis SG.Identification of a fibronectin-binding domain within theCampylobacter jejuni CadF protein(空肠弯曲杆菌CadF蛋白中的纤连蛋白结合结构域的鉴定)。Mol Microbiol.2005；57(4)：1022-35.
Krause-Gruszczynska M，Rohde M，Hartig R等人Role of the small RhoGTPases Rac1 and Cdc42 in host cell invasion of Campylobacter jejuni(小型Rho GTP酶Rac1和Cdc42癌空肠弯曲杆菌的宿主细胞侵入中的作用)。Cell Microbiol.2007；9(10)：2431-44.
Mao Y和Schwarzbauer JE.Fibronectin fibrillogenesis，a cell-mediatedmatrix assembly process(纤连蛋白微纤维形成，细胞介导的基质组装过程)。Matrix Biol.2005；24(6)：389-99.
Monteville MR，Yoon JE和Konkel ME.Maximal adherence and invasionof INT 407 cells by Campylobacter jejuni requires the CadF outer-membraneprotein and microfilament reorganization(空肠弯曲杆菌对INT 407细胞的最大粘附和侵入需要CadF外膜蛋白和微丝重构)。Microbiology.2003；149(Pt1)：153-65.
Ozeri V，Tovi A，Burstein I，Natanson-Yaron S，Caparon MG，Yamada KM，Akiyama SK，Vlodavsky I和Hanski E.A two-domain mechanism for group Astreptococcal adherence through protein F to the extracellular matrix(A组链球菌通过蛋白F粘附胞外基质的两结构域机制)。EMBO J.1996；15(5)：989-98.PMCID：PMC449993.
Pankov R和Yamada KM.Fibronectin at a glance(纤连蛋白简介)。JCell Sci.2002；115(Pt 20)：3861-3.
Pierschbacher MD和Ruoslahti E.Variants of the cell recognition site offibronectin that retain attachment-promoting activity(保留粘附促进活性的纤连蛋白的细胞识别位点的变体)。Proc Natl Acad Sci U S A.1984；81(19)：5985-8.PMCID：PMC391843.
Ridley AJ.Rho GTPases and actin dynamics in membrane protrusions andvesicle trafficking(膜突起和小囊泡运输中的Rho GTP酶和肌动蛋白动力学)。Trends Cell Biol.2006；16(10)：522-9.
Schwarz-Linek U，Werner JM，Pickford AR等人Pathogenic bacteriaattach to human fibronectin through a tandem beta-zipper(病原性细菌通过串联β-拉链与人类纤连蛋白结合)。Nature.2003；423(6936)：177-81.
Schwarz-Linek U，Hook M和Potts JR.The molecular basis offibronectin-mediated bacterial adherence to host cells(纤连蛋白介导的对宿主细胞的细菌粘附的分子基础)。Mol Microbiol.2004；52(3)：631-41.
Small JV和Kaverina I.Microtubules meet substrate adhesions to arrangecell polarity(微管经历底物粘附以安排细胞极性)。Curr Opin Cell Biol.2003；15(1)：40-7.
Talay SR，Zock A，Rohde M，Molinari G，Oggioni M，Pozzi G，GuzmanCA和Chhatwal GS.Co-operative binding of human fibronectin to Sfbl proteintriggers streptococcal invasion into respiratory epithelial cells(人类纤连蛋白与Sfb1蛋白的协作结合触发了链球菌对呼吸道上皮细胞的侵入)。CellMicrobiol.2000；2(6)：521-35.
Xu J，Bae E，Zhang Q，Annis DS，Erickson HP和Mosher DF.Display ofcell surface sites for fibronectin assembly is modulated by cell adherence to(1)F3and C-terminal modules of fibronectin(用于纤连蛋白组装的细胞表面位点的展示受对于纤连蛋白的(1)F3和C末端模块的细胞粘附的调节)。PLoS One.2009；4(1)：e4113.PMCID：PMC2606026.
实施例5.乳酸杆菌对空肠弯曲杆菌在商业肉鸡中的定殖的影响
在该实施例中，评估了4种乳酸杆菌菌株(嗜酸乳杆菌NCFM、卷曲乳杆菌JCM 5810、鸡乳杆菌ATCC 33199和瑞士乳杆菌CNRZ32)对空肠弯曲杆菌在商业肉鸡中的定殖的影响。还评估了导致竞争排他的可能机制，包括拮抗性代谢物的产生、抗体反应的调节和盲肠微生物丛的操作。
材料和方法
细菌菌株和生长条件本研究中所用的细菌菌株列于表6中。在37℃下在微好氧条件下(85％氮气，10％CO2，5％氧气)在Mueller-Hinton(MH)(Difco Inc.，Detroit，MI)肉汤中或在补充有5％含柠檬酸盐牛血的MH琼脂平板(MHB琼脂平板)上培养空肠弯曲杆菌菌株。每24小时至48小时将培养物传代至新鲜平板上。在鸡中接种之前确定空肠弯曲杆菌培养物的运动性。在微好氧条件下，在37℃下乳酸杆菌菌株在deMan，Rogosa和Sharpe(MRS)肉汤(Difco)或MRS琼脂平板上静态增殖。
表6.本研究中所用的细菌菌株
Figure BDA0000143768750000781
1日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganisms)
2美国典型培养物保藏中心
3法国国家畜牧研究中心(Centre national de Recherche Zootechnique)
生长曲线分析.将来自过夜培养物中的乳酸杆菌菌株以1％接种到MRS肉汤中。利用BioscreenC分析仪(Growth Curves USA，Inc.，Piscataway，NJ)通过O.D.600监测生长。通过利用Prism 5.0(Graphpad软件，Inc.，La Jolla，CA)对于经修改的Gompertz模型拟合生长曲线而确定最大生长速率(μm)(Zwietering，M.H.等人(1990)Appl Environ Microbiol 56：1875-1881)。
空肠弯曲杆菌抑制测定 利用点印培养物(spotted culture)和上清液评估乳酸杆菌对空肠弯曲杆菌培养物的抑制。对于点印培养，将乳酸杆菌的过夜培养物点印到补充有0.1％吐温80(Fisher Scientific，Hampton，NH)(BHI-T)的脑心浸液琼脂(Difco)上，并在微好氧条件下过夜培养，随后，用熔融的MH软琼脂(0.75％琼脂)覆盖平板，以1％接种在MH肉汤中标准化至O.D.540的过夜的空肠弯曲杆菌培养物。在微好氧条件下在37℃下孵育平板24小时。通过测量乳酸杆菌培养物周围的抑制区域来评估抑制，并表示为以mm为单位的抑制区域比生长区域的比率。为确定细菌素是否有助于抑制，在用空肠弯曲杆菌覆盖之前，用蛋白酶K(20μg/μl)(Invitrogen，Carlsbad，CA)或胰蛋白酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(10μg/μl)处理平板。为确定过氧化物酶是否有助于抑制，在覆盖之前用过氧化氢酶(10μg/μl)(Sigma)处理平板。
将来自乳酸杆菌培养物的上清液煮沸6分钟，用6N NaOH(Fisher)中和至pH 7，用过氧化氢酶进行处理，或不进行处理。随后对上清液进行过滤灭菌(0.22μM)并点印到以1％接种过夜空肠弯曲杆菌培养物的固化的MH软琼脂上并孵育过夜。
抗生素抗性乳酸杆菌菌株的选择 为生成用于进一步测定的抗生素抗性的乳酸杆菌菌株，在含渐增浓度的链霉素(Sigma)的MRS肉汤中进行0.01％的连续转移。选择抗200μg/μl链霉素的培养物用于进一步分析。
肉鸡将总共200只新近孵化的小鸡细分为10组，每组20只小鸡；然后将小鸡置于金属丝网上的隔离室中(Horsfall-Bauer隔离器)。无限制提供水和商业小鸡仔鸡饲料。采集粪便物并在处理之前高压灭菌。所有动物研究利用华盛顿州立大学的实验动物管理与使用委员会批准的实验方案(IACUC；实验方案#3248)进行。
细菌培养物和鸡接种 在37℃下在MRS中静态培养乳酸杆菌培养物，持续18小时。在接种之前在37℃下在MH肉汤中培养空肠弯曲杆菌F3801118小时。将20只鸡的一组作为未接种的对照组。对剩余的9组小鸡按照以下进行接种：组2和组6，嗜酸乳杆菌NCFM-Str；组3和组7，卷曲乳杆菌JCM5810-Str；组4和组8，鸡乳杆菌ATCC 33199-Str；组5&9，瑞士乳杆菌CNRZ32-Str；和组10，新月柄杆菌。组10施用新月柄杆菌，一种非益生菌细菌，作为处理对照以证明空肠弯曲杆菌定殖的任何降低是由益生菌乳酸杆菌特异性地引起的(即，空肠弯曲杆菌定殖的阳性对照，下文中称为空肠弯曲杆菌对照)。在孵化后第1天和第4天通过用0.5ml细菌悬浮液(～108CFU)进行口服填喂而施用乳酸杆菌或柄杆菌。在孵化后14天时，通过用0.5ml细菌悬浮液(～108CFU)进行口服填喂而施用空肠弯曲杆菌F38011。在每次接种后，将剩余的细菌悬浮液连续稀释于适当的培养基上以确证每个剂量中的CFU的数目。
细菌计数 在本研究的第21天使每组中一半的鸡安乐死并进行剖检，和在本研究的第28天将剩余的鸡安乐死并进行剖检。从每个鸡中切取盲肠和肠。称重样品，稀释于等体积(w/v)的MH中，并彻底消化。在MRS和MH肉汤中连续稀释样品，以分别进行乳酸杆菌和空肠弯曲的计数。将MRS稀释物铺板于补充200μg/ml链霉素的Rogosa SL(Difco)琼脂平板上以用于乳酸杆菌的计数，而将MH稀释物铺板于Campy Cefex(Difco)琼脂平板上以用于计数。在37℃下在微好氧条件下孵育平板并在孵育96小时之后计数CFU。为确证回收的乳酸杆菌的身份，利用表面层蛋白特异性引物(表7)对从用于计数乳酸杆菌的平板中分离的菌落的培养物进行PCR。
16S rDNA克隆文库的构建.利用UltraClean Fecal DNA试剂盒(MoBio Laboratories，Inc，Carlsbad，CA)从盲肠内容物中分离总DNA。利用三组引物：8F和1492R(A组)、8F和1522R(B组)、8F和926R(C组)(表5)，如先前所描述的(Lu，J.等人(2003)，Appl Environ Microbiol69：6816-24)利用PCR Super Mix High Fidelity(Invitrogen)扩增16S rRNA基因。混合PCR产物并利用QiaQuick PCR净化试剂盒(QiaQuick PCRclean-up kit，Qiagen，Valencia，CA)纯化。将纯化的产物连接到pCR2.1(Invitrogen)并化学转化到感受态大肠杆菌TOP10F′中。通过利用X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)筛选克隆的β-半乳糖苷酶的α-互补(Ausubel，F.M.等人(2007)，CurrentProtocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)。John Wiley andSons，Inc.，New York，NY)。
表7.本研究中所用的引物
Figure BDA0000143768750000811
DNA测序和序列分析.利用M13F(-20)引物和M13R(-27)引物在Functional Biosciences，Inc.(Madison，WI)对构建的文库进行测序。利用核糖体数据库计划(RDP)管线工具(网址位于rdp.cme.msu.edu)(Cole，J.R.等人(2009)，Nucleic Acids Res 37：D141-5)对所得序列进行处理和比对。利用RDP分类器(Wang，Q.等人，2007，Appl Environ Microbiol73：5261-7)对比对的序列进行分类学上的分类。在RapidOTU服务器上(网址位于genome.jouy.inra.fr/rapidotu)利用DOTUR(Schloss，P.D.，和J.Handelsman，2005，Appl Environ Microbiol 71：1501-6)将序列指定为1％序列不相似性的操作分类单位(OTU)。还使用DOTUR生成了8个文库的Shannon-Weaver(H’)和Simpson(D)多样性指数。如先前所描述的(Krebs，C.J.(1989)，Ecological Methodology.Harper & Row，Publishers，Inc.，NewYork，NY)计算均匀性(E)。利用RDP文库比较(Cole，J.R.等人，2009，Nucleic Acids Res 37：D141-5)来比较文库。
在小鸡血清中检测抗空肠弯曲杆菌抗体 ELISA平板是用稀释于PBS中的100μl的2μg/ml的空肠弯曲杆菌F38011全细胞裂解物包被的平板。在4℃下过夜孵育平板之后，用PBST洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温20)洗涤孔两次并用150μl的PBS，0.05％吐温20和0.25％明胶(PBST-G)在25℃下封闭2小时。洗涤平板三次。在PBST-G中1∶200稀释小鸡血清，并以三个重复添加100μl的每种血清样品。在25℃下孵育2小时之后，洗涤孔三次，并添加1∶5000稀释于PBST-G中的100μl的抗鸡IgG抗体辣根过氧化物酶轭合物，在25℃下持续2小时。用PBS洗涤孔三次，并将50μl的四甲基联苯胺(TMB)底物(Pierce-Endogen)添加到孔中。显色10分钟之后用0.18N H2SO4终止反应。用ELx808Ultra Microplate Reader(BioTekInstruments，Inc.，Winooski，VT)在492nm处确定孔内的490nm处的吸光度(A490)。
结果
乳酸杆菌在体外抑制空肠弯曲杆菌生长 作出生长曲线以表征嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、鸡乳杆菌和瑞士乳杆菌在MRS上生长的能力(图22)。确定μm如下：嗜酸乳杆菌，0.281±0.002每小时；卷曲乳杆菌，0.308±0.003每小时；鸡乳杆菌，0.276±0.002每小时；和瑞士乳杆菌，0.265±0.002每小时；其并非显著不同。
评估了乳酸杆菌在体外抑制空肠弯曲杆菌生长的能力。所检验的所有乳酸杆菌菌株的点印培养物表现出抑制空肠弯曲杆菌F38011，而其抑制其他空肠弯曲杆菌菌株的生长的能力是可变。将乳酸杆菌的过夜培养物点印在BHI-T上，并使其在37℃下过夜生长。将空肠弯曲杆菌的过夜培养物标准化至O.D.540＝1.0并以1％接种到10ml的MH软琼脂中、覆盖、并在37℃下孵育24小时。不处理来自乳酸杆菌的过夜培养物的上清液，用6.25NNaOH中和，或煮沸6分钟。不处理来自乳酸杆菌的过夜培养物的上清液，或用过氧化氢酶处理1小时。对所有的上清液进行过滤灭菌(0.22μm)并点印在以1％接种空肠弯曲杆菌的20ml MH软琼脂上。所用的乳酸杆菌菌株如下所示：(A)嗜酸乳杆菌，(B)卷曲乳杆菌，(C)鸡乳杆菌和(D)瑞士乳杆菌。所用的抑制区域(I)和生长区域(G)显示于表8中。嗜酸乳杆菌和卷曲乳杆菌能够有效抑制所检验的所有空肠弯曲杆菌菌株的生长，而鸡乳杆菌和瑞士乳杆菌仅能够有效地抑制空肠弯曲杆菌F38011。此外，空肠弯曲杆菌F38011似乎是对乳酸杆菌在体外的抑制最敏感的菌株。
表8.乳酸杆菌对空肠弯曲杆菌的抑制*
Figure BDA0000143768750000831
*表示为抑制区域(mm)/生长区域(mm)的比率
a误差代表三个重复测量结果的一个标准偏差(one standard deviation)
为确定乳酸杆菌产生的细菌素是否参与抑制空肠弯曲杆菌，用胰蛋白酶和蛋白酶K处理乳酸杆菌培养物点印的平板，然后用空肠弯曲杆菌覆盖。蛋白酶处理均未降低空肠弯曲杆菌的抑制(未示出)，表明抑制不是由于蛋白成分产生所导致，且因此不是由于细菌素的产生所导致。此外，对上清液的热处理没有影响抑制，确证了乳酸杆菌产生的细菌素不是导致空肠弯曲杆菌的抑制的原因。为确定有机酸或过氧化氢的产生是否有助于这些乳酸杆菌的抑制能力，分别用NaOH将乳酸杆菌培养物的上清液中和至pH7，或用过氧化氢酶进行处理。用NaOH中和消除了抑制。用过氧化氢酶处理上清液也降低了对空肠弯曲杆菌的抑制，表明由乳酸杆菌产生的过氧化物有助于抑制。这些数据表明乳酸杆菌培养物在体外抑制空肠弯曲杆菌的生长的能力至少部分归因于有机酸和过氧化氢的产生。
乳酸杆菌降低了鸡的空肠弯曲杆菌定殖在孵化当日和孵化后4天向商业肉鸡施用作为潜在的竞争排除生物体的乳酸杆菌。为评估这些乳酸杆菌的有效性，在孵化后14天用空肠弯曲杆菌F38011攻击鸡。在接种空肠弯曲杆菌后7天使一半的鸡安乐死，并进行剖检。在接种空肠弯曲杆菌后14天使剩余的鸡安乐死，并进行剖检。计数存在于每个鸡的盲肠中的空肠弯曲杆菌(图23)。图23中示出的实验按以下进行。在孵化后第1天和第4天通过口服填喂向肉鸡施用乳酸杆菌(～108CFU/ml)。在孵化后第14天通过口服填喂向接受空肠弯曲杆菌攻击的鸡施用空肠弯曲杆菌F38011。在(A)孵化后第21天使一半的鸡安乐死并进行剖检，且在(B)孵化后第28天使剩余的鸡安乐死并进行剖检。从每只鸡解剖盲肠、称重，并稀释于等体积的MH肉汤中，并彻底消化。对样品进行连续稀释并铺板于Campy Cefex琼脂上以进行计数。在未受攻击的鸟的盲肠中未检测到空肠弯曲杆菌，表明防范过程(containment procedure)是有效的。在接受嗜酸乳杆菌的受攻击的鸟中，在攻击后7天和14天均在9只鸟中的7只中检测到了空肠弯曲杆菌。从攻击后7天到14天，空肠弯曲杆菌对施用鸡乳杆菌和瑞士乳杆菌的鸡的定殖出现下降。接受鸡乳杆菌和瑞士乳杆菌的鸟的定殖分别从9只中的9只减少到9只中的5只，和从9只中的7只减少到9只中的3只。在攻击后7天和14天，接受卷曲乳杆菌的鸡均具有低的空肠弯曲杆菌定殖率。
还确定了所施用的乳酸杆菌菌株对鸡的定殖(表7)。接受瑞士乳杆菌的鸡表现出乳酸杆菌的最高定殖率(94.4％)，次之是接受卷曲乳杆菌的鸟(90％)、接受嗜酸乳杆菌的鸟(72.5％)，和接受鸡乳杆菌的鸟(51.7％)。在施用嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌和瑞士乳杆菌的鸡中，与未施用嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌和瑞士乳杆菌的鸡相比，当用空肠弯曲杆菌攻击时在更多的鸟中回收了乳酸杆菌。
使用利用菌株特异性引物的PCR(图5)来确定所回收的推定的乳酸杆菌是否是向鸡施用的相同菌株(数据未示出)。选择来自每个组的10个分离株用于该分析。在所有所检验的组中，仅施用卷曲乳杆菌JCM5810的那些组对于施用的物种是阳性的。并且，来自其他组的一些推定的乳酸杆菌分离株也被阳性鉴定为卷曲乳杆菌，如表9中所示。
表9.乳酸杆菌的盲肠定殖*
Figure BDA0000143768750000851
*显示了其中检测出乳酸杆菌的盲肠样品的百分比
16S rDNA微生物组分析.选择接受不同处理的样本以用于通过16SrDNA测序进行的盲肠微生物组分析(表10)。利用RDP分类器对16S rDNA进行分类。在747个16S rDNA克隆中，644个(86％)被分类为硬壁菌门(Firmicutes)，94个(13％)被分类为拟杆菌门(Bacteroidetes)，8个(1％)是无类别的，和单一的克隆被分类为变形杆菌(Proteobacteria)。硬壁菌门是占优势的门，梭菌属是占文库中的全部克隆的64％的所有样本的主要的纲。同时，在来自接受卷曲乳杆菌、鸡乳杆菌和瑞士乳杆菌的组的样本中鉴定了分类为乳酸杆菌的克隆，乳酸杆菌仅从接受卷曲乳杆菌的样品中明显鉴定。单一的变形杆菌克隆被鉴定为属于沙门氏菌属，并发现于接受鸡乳杆菌和空肠弯曲杆菌攻击的样本中。没有克隆被分类为属于弯曲杆菌属。革兰氏阳性菌群在所有样本中占优势而无论其是否用乳酸杆菌处理。虽然存在从拟杆菌门到硬壁菌门的一些转移，除所鉴定的乳酸杆菌克隆的增加的数目之外，正常菌群是占优势的，而无论是否进行处理，且优势菌群未受微生物处理的破坏。
表10.选择用于盲肠微生物组分析的样本的特征
Figure BDA0000143768750000861
a计数显示为盲肠或回肠内容物的CFU/gm
b空肠弯曲杆菌定殖的阳性对照，仅接受空肠弯曲
杆菌
cND——未检测的，检测限是1×103CFU/gm
血清抗体的确定.通过ELISA确定孵化后21天和28天血清中抗空肠弯曲杆菌抗体的水平(图24)。在攻击后14天在受攻击的鸟中检测到了抗空肠弯曲杆菌抗体，而在攻击后7天未检测到，且在天然的鸡的血清中未检测到抗空肠弯曲杆菌抗体。在接受卷曲乳杆菌的受攻击的鸟中，在最少的鸟中检测到了抗空肠弯曲杆菌抗体。这与它们的定殖水平相一致。并且，所施用的乳酸杆菌的菌株没有表现出影响抗空肠弯曲杆菌抗体的水平。还确定了鸡血清中存在的针对产气荚膜梭状芽孢杆菌的天然抗体(图25)。除施用乳酸杆菌菌株的之外，未检测到显著的量的抗体，且抗体没有表现出受到影响。
实施例6.使用益生菌乳酸杆菌菌株作为口服疫苗以减少鸡中的空肠弯曲杆菌
编码乳酸杆菌细菌的S层蛋白的基因(slp4)的操作
以下的数据与用来检验是否可将表位插入S层蛋白的表面暴露的位点的克隆实验有关。利用基因特异性引物通过PCR扩增来自瑞士乳杆菌CNRZ32的slpA基因，并利用Original TA Cloning试剂盒(Invitrogen)将其克隆到pCR 2.1载体中。未包括启动子和起始密码子以防止slpA基因在大肠杆菌中的表达，其是毒性的(Avall-Jaaskelainen，S.等人(2002)Appl.Environ.Microbiol.68：5943-5951)。利用其5′末端各自含有来自CadF的Fn-BD的36个碱基对序列的一半的引物扩增含有slpA基因片段的完整的pCR 2.1载体。PCR产物的平末端连接产生了期望的slpA修饰的构建体，其具有框内插入的CadF表位。对修饰的slpA构建体进行序列确证后，将其从pCR 2.1载体中消化并连接到穿梭载体pSA3中。该载体具有温度敏感型的复制起始点，其允许在37℃而非44℃下在LAB中复制(Christensen，J.E.，和J.L.Steele(2003)；J.Bacteriol.185：3297-3306；Dao，M.L.，和J.J.Ferretti(1985)；Appl.Environ.Microbiol.49：115-119)。电穿孔后，通过利用补充有500ng/ml红霉素(ERY)和0.75％琼脂的MRS的倾倒平板方法在37℃下恢复含有重组pSA3载体的瑞士乳杆菌分离株。将转化子悬浮于MRS肉汤中，在MRS+ERY50平板上铺板，并在44℃下进行孵育。因为pSA3不能在44℃下进行复制，回收的仅有的菌落含有具有掺入到染色体中的修饰slpA基因的pSA3质粒。为促进质粒的切割，每天在MRS肉汤中在37℃下进行单交叉分离株的继代培养，进行20天。然后将肉汤培养物铺板于含有10ng/ml ERY的MRS琼脂平板上。该抗生素浓度是抑制性的但非致死的，导致去除了pSA3的分离株表现为针尖样菌落，而含有pSA3载体的分离株的直径为2-3厘米。通过PCR扩增和修饰的slpA基因的测序确证了含有具有CadF Fn-BD的修饰的slpA的分离株。
含有空肠弯曲杆菌保护抗体的血清的采集/生成 分析了两组鸟的免疫反应。第一组代表从位于两个农场的种鸡中采集的血清样品，第二组代表用弯曲杆菌提取物或全细菌免疫的鸡。该第一次实验具有三个鸡组：1)未被免疫的，非空肠弯曲杆菌攻击的；2)未被免疫的，空肠弯曲杆菌攻击的；和3)通过皮下(SubQ)注射用空肠弯曲杆菌全细胞裂解物(wcl)免疫的，空肠弯曲杆菌攻击的。将wcl与获自商业家禽生产商的佐剂(佐剂在我们将不会与他人共享公司名称或佐剂的配方/组成的协议下获得)混合。在孵化后5天免疫鸡(初次免疫)，并在孵化后12天再次免疫(加强免疫)。在19天龄时，使组1、组2和组3中的一半鸡(n＝10)安乐死并采集血液以评价抗体反应，而通过用106CFU的空肠弯曲杆菌进行口服填喂对组2和组3中的剩余的鸡(n＝10)进行攻击。在26天龄时，使鸡安乐死并确定每克肠和回肠内容物的空肠弯曲杆菌的数目，并将其与未接受先前免疫的鸡相比较。对鸡的免疫导致了鸡的空肠弯曲杆菌定殖的整体降低。
进行第二次实验以比较和对比两种不同的免疫策略。如上所述，通过用空肠弯曲杆菌wcl进行SubQ注射来免疫组1和组2。然而，如通过组3和组4所代表的，通过口服施用福尔马林固定的空肠弯曲杆菌来免疫总共40只鸡。如通过Rice等人(1997)Vaccine.15：1922-1932)和Black等人(1987)Infect.Immun.55：1116-1120)所描述的对细菌进行福尔马林固定。组5和组6用作未免疫的对照，其中仅组6用空肠弯曲杆菌攻击。组2和组4中空肠弯曲杆菌的载量小于组6的鸡(未免疫的，空肠弯曲杆菌攻击的)中的载量。获得了含有防范空肠弯曲杆菌的抗体的血清。
确定针对其生成抗体的空肠弯曲杆菌蛋白 利用以下的方案分析获自用空肠弯曲杆菌wcl(SubQ)和福尔马林固定的空肠弯曲杆菌免疫(口服施用)的小鸡以及未被疫苗接种的种鸡的血清。首先，通过SDS-PAGE分离空肠弯曲杆菌wcl和外膜蛋白(omp)制备物，并将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜。洗涤膜并用稀释于含有0.01％吐温20和9％奶粉的PBS(pH 7.4)中的鸡血清进行孵育。用α-鸡IgM或α-鸡IgG辣根过氧化物酶轭合物检测结合的免疫球蛋白。将4-氯-1-萘酚用作发色底物。期望的结果的实例显示于图26中。通过联合SDS-PAGE、免疫印迹和纳升级-LC/MS/MS/离子阱分析鉴定了鸡针对其生成保护性抗体的空肠弯曲杆菌外膜蛋白的身份。
选择用于掺入到乳酸杆菌S层蛋白中的表位使用两种方法来选择将掺入到乳酸杆菌的S层中的蛋白的区域(即，残基)。一种方法根据确定鸡中生成的抗体的特异性/反应性，第二种方法利用分子生物学方法来确定蛋白的保守区。理想地，掺入到S层中的残基是高度免疫原性的并是性质保守的。
免疫印迹和酶联免疫吸附测定(ELISA)。通过对蛋白片段进行免疫印迹分析鉴定了蛋白中抗体结合的区域。通过在表达系统(即，pET24b，His标签)中表达不同的基因区段或通过酶消化生成蛋白片段。还可利用LC/MS/MS/离子阱分析确定消化的片段的身份。通过ELISA进行蛋白免疫反应性区域的精细绘图。作为实例，本文描述了用FlaA纤丝蛋白进行的程序。订购了跨越期望的蛋白区域的FlaA来源的合成肽，寡聚体(30mer)。每个连续的寡聚体将以10个残基与前面的寡聚体重叠。使用寡聚体来包被微量滴定板的孔。作为阳性对照，用His标签的重组蛋白包被孔。在用PBS/0.5％BSA(重量/体积)封闭后，添加两倍连续稀释(1∶50至1∶6400)的鸡血清，并在25℃下孵育90分钟。用1X PBS-吐温洗涤孔三次并用α-鸡IgG/IgM-HR抗体孵育90分钟。利用实验室建立的方案对平板进行显色。该方法将确定针对其生成抗体的蛋白中的区域。
分子方法 4种空肠弯曲杆菌基因组序列目前是可获得的。并且，NCBI数据库含有关于任何给定的空肠弯曲杆菌蛋白的大量条目(entry)。对于感兴趣的蛋白，比对序列以鉴定在氨基酸水平上具有95％以上同一性的区域。作为实例，图27中显示了生成的数据的类型。在优选的实施方案中，具有高度免疫原性且性质保守的表位(残基)掺入到S层中。
合成含有来自空肠弯曲杆菌抗原的表位的重组S层蛋白的乳酸杆菌的菌株的构建 以下描述了利用瑞士乳杆菌作为模型的示例性的克隆策略。三个乳酸杆菌属物种之间的差异是，S层蛋白是由对单独的物种独特的基因合成的(Avall-Jaaskelainen，S.，和A.Palva(2005)FEMS Microbiol.Rev.29：511-529；Boot，H.J.等人(1996)，Microbiology.142(Pt 9)：2375-2384)。因为嗜酸乳杆菌具有编码S层的两种基因，需要修饰两种基因或在两种基因的一种中产生敲除。然而，方法是根据选择的乳酸杆菌的物种和菌株来定制的。图28显示了瑞士乳杆菌SlpA蛋白的亲水性分布图。较低的(较负性的)亲水值与蛋白的亲水性区域相关，该亲水性区域可能为溶剂暴露的，而较高的(较正性的)亲水值表示了较不可能为暴露溶剂的更为疏水的区域。4种推定的溶剂暴露的插入位点位于第104位、第259位、第333位和第370位残基。在位点I，残基104处插入CadF 12mer将提高亲水值，但值仍将小于-10Kcal/mol。因此，基于膜蛋白疏水性预测工具MembraneProtein Explorer(http://blanco.biomol.uci.edu/mpex/)的结果(图18)，我们已选择了瑞士乳杆菌SlpA S层蛋白中的4个推定的表位插入位点。这些位点中的每一个位于紧接亲水峰的下游，因为这些区域最可能是溶剂暴露的。插入位点没有直接位于亲水峰处，因为这可能导致区域更加疏水。单独地和组合地检验了4种插入位点以确定表位的表面展示的最有效位点。
为证明该方法的可行性，将编码由GCTGGTGTTAAGTTTCGTTTATCAGATTCACTTGCT，(SEQ ID NO：167)编码的来自CadF的第130-141位残基＝AGVKFRLSDSLA(SEQ IDNO：166)的Fn结合结构域(Fn-BD)的36个碱基对的DNA片段插入到位于瑞士乳杆菌CNRZ32的slpA基因的靶位点1中(图28和图29)。使用相似的方案来将其它空肠弯曲杆菌表位克隆到S层蛋白中。在表位跨越较大区域时(即，30个残基，90个核苷酸)，在S层基因的期望的位置处插入限制性位点。利用含有结合到5′端的限制性位点的基因特异性引物对表位进行PCR扩增，用适当的酶进行消化，且然后连接到S层基因中。插入到slpA基因中的所有表位是与编码序列在框内的，且为在乳酸杆菌中有效表达而经密码子偏好优化。
分析修饰的乳酸杆菌菌株中的表面层 将CadF表位单独地插入到4个插入位点中的每一个中，并检查重组的S层的表位的表面展示和适当的构象。在确证在4个位点处的插入将不会导致改变的S层的构象之后将其他空肠弯曲杆菌表位插入到S层基因中。
检查S层蛋白的空肠弯曲杆菌表位合成 使用ELISA来确证空肠弯曲杆菌表位(即，CadF Fn-BD)掺入到S层中。检验了全细胞LAB和纯化的S层蛋白(野生型和重组的)二者。如先前所描述利用6M LiCl从乳酸杆菌细菌的培养物中提取S层蛋白(Johnson-Henry，K.C.等人(2007)Cell.Microbiol.9：356-367)。在用野生型和重组乳酸杆菌和纯化的S层蛋白的悬浮液包被的微量滴定孔中进行ELISA。在S-层-CadF Fn-BD的情况下，用α-CadF抗体在25℃下孵育平板90分钟。如先前所描述的检测结合的α-CadF抗体。
确定重组的S层合成的水平 为确定修饰的乳酸杆菌菌株中的S层合成的水平，对来自野生型菌株和重组菌株的S层提取物进行纯化，并进行SDS-PAGE。简言之，将乳酸杆菌野生型菌株和重组菌株培养至相等的密度，并提取S层(Johnson-Henry，K.C.等人(2007)Cell.Microbiol.9：356-367)。对等体积的提取的蛋白进行蛋白定量测定(即，二喹啉甲酸测定)和SDS-PAGE。通过用考马斯亮蓝R-250进行染色来查看蛋白条带。利用在有限范围的蛋白浓度下的光密度法扫描来确定每个样品中的S层蛋白的量。还将通过显微镜术来检查修饰的乳酸杆菌细菌和纯化的重组的S层蛋白以分别确定表位的导入是否导致了细菌或蛋白的形态或构象上的改变。如通过Johnson-Henry等人所描述的对纯化的S层提取物进行扫描电子显微术以确定S层蛋白是否将自动聚集为特征性的片层和螺旋。如Avall-Jaaskelainen等人((2002)Appl.Environ.Microbiol.68：5943-5951)中所描述的进行乳酸杆菌细菌的透射电子显微术分析。将细菌置于聚乙烯醇缩甲醛树脂包被的网格中，用1％的磷钨酸(PTA，pH7.0)进行染色，并检查S层蛋白中的形态不规则性。
空肠弯曲杆菌表位表面展示的评估 通过免疫荧光(IF)显微术确定S层蛋白中的空肠弯曲杆菌表位的表面展示。如果我们不具有针对特异性的空肠弯曲杆菌蛋白反应性的抗体，则通过用从空肠弯曲杆菌或从具有重组质粒的大肠杆菌中纯化的蛋白免疫兔来生成所述抗体。IF显微术用活细菌来进行，所述活细菌首先用抗肠弯曲杆菌特异性的抗体进行孵育，且然后用轭合于异硫氰酸荧光素的α-兔IgG进行孵育。利用UV显微镜来察看细菌。
确定乳酸杆菌疫苗菌株预防和降低空肠弯曲杆菌定殖的效率和是否生成针对空肠弯曲杆菌表位的免疫应答。目的是将由母体抗体提供的保护性反应与响应于修饰的乳酸杆菌菌株生成的新产生的空肠弯曲杆菌特异性IgA抗体的保护性反应联系起来。用展示三个空肠弯曲杆菌表位的乳酸杆菌的菌株来接种鸡，所述三个空肠弯曲杆菌表位包括CadF蛋白、FlaA蛋白和FlpA蛋白的部分。如图30中所示，在第5天用修饰的乳酸杆菌菌株接种鸡，其将使母体抗体的水平开始下降。采集血液，并筛查血清的α-弯曲杆菌IgG抗体和IgM抗体。还将提取IgA抗体。简言之，将提取溶液(含0.05％吐温20、0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、0.05mg/ml EDTA和0.35mg/ml苯甲磺酰氟的PBS)与肠灌洗物相混合并在4℃下振荡2小时。在4℃下离心30分钟之后(20,000×g)，收获上清液并贮存于-20℃下。通过ELISA和免疫印迹分析检测α-弯曲杆菌抗体。
用含有抗原性表位的空肠弯曲杆菌蛋白(通过His-标签纯化)以及空肠弯曲杆菌wcl进行ELISA。连续稀释鸡血清，并将其添加到用wcl和纯化的蛋白包被的微量滴定孔中，并在25℃下孵育90分钟以允许抗体与空肠弯曲杆菌蛋白结合。在用PBS洗涤孔两次之后，将与辣根过氧化酶轭合的α-鸡IgG、IgM和IgA抗体添加到孔中并在25℃下孵育90分钟。如先前所描述的检测结合的抗体。使用免疫印迹分析来确证ELISA的结果。对ELISA中所用的同样的wcl和纯化的空肠弯曲杆菌蛋白用鸡血清进行探针检测。通过SDS-12.5％PAGE分离蛋白，并转移到PVDF膜上。在PBS中洗涤膜三次，并用含20％胎牛血清在含0.01％吐温20的PBS pH7.4中1∶100稀释的每种血清进行孵育。利用与HR轭合的α-鸡抗体(IgG、IgM和IgA)检测结合的抗体。
定殖用乳酸杆菌疫苗菌株接种的鸡与未接种疫苗的鸡的空肠弯曲杆菌数目的比较。如图30中所描述的实验的部分，将定殖用乳酸杆菌疫苗菌株接种的鸡与未接种疫苗的鸡的空肠弯曲杆菌数目相比较。在用修饰的乳酸杆菌菌株接种一周之后，用低剂量的空肠弯曲杆菌(103cfu)和高剂量的空肠弯曲杆菌(106cfu)攻击鸡。在空肠弯曲杆菌攻击一周之后，使鸡安乐死。计数鸟的消化道中的空肠弯曲杆菌，并相互比较。重组的(修饰的)乳酸杆菌菌株以与乳酸杆菌野生型菌株相当的密度定殖鸡的消化道。在回肠内容物中回收的修饰的乳酸杆菌菌株为～1×107CFU/g，而在盲肠内容物中为～1×105CFU/g(Wise，M.G.，和G.R.Siragusa(2007)J.Appl.Microbiol.102：1138-1149)。如果修饰的乳酸杆菌菌株不能存活于鸡中，最可能因为已针对空肠弯曲杆菌表位生成了抗体。为发生这种情况，届时将已产生针对生物体反应性的抗体，其有效地减少定殖鸡的盲肠的弯曲杆菌数目。使用了低空肠弯曲杆菌攻击剂量和高空肠弯曲杆菌攻击剂量，因为鸡在天然环境中暴露的剂量是未知的；同样，如果提高攻击剂量超过免疫系统有效应答的能力，许多疫苗将失败。虽然本文中没有描述，进行了另外的实验以确定细菌(接种物)的数目和递送的日期是否将影响LAB定殖的效率。最终，用最少的10个遗传差异的空肠弯曲杆菌菌株检验修饰的乳酸杆菌菌株在鸡中降低弯曲杆菌生物体的微生物量的效力。所有实验以阶段式进行，其中每个实验的设计和进行基于前面实验的结果。在一周时间范围内可能不会生成空肠弯曲杆菌中和抗体(图30)，因而修改了实验设计。首先，修饰的LAB是较早施用的(即，在孵化后第2天、第3天和第4天)。虽然该策略可能导致大部分的修饰的LAB从回肠中清除，但一些细菌可能存活且消化道中的细菌的数目将随母体抗体水平的降低而增高。第二，在较晚的时期(孵化后第14天、第16天、第18天和第21天)用空肠弯曲杆菌攻击鸡。任一种修饰将有效地延伸鸡接受修饰的乳酸杆菌菌株和空肠弯曲杆菌攻击之间的时间。目的是为了在3周龄之前生成针对空肠弯曲杆菌的抗体反应，在3周龄时大部分的鸡被定殖。
实施例7：鸡的空肠弯曲杆菌定殖与表达空肠弯曲杆菌抗原的重组的新月柄杆菌的竞争排他
该实验的目的是为了通过添加i)CadF纤连蛋白结合结构域，ii)PorA保守表位，和iii)保守的鞭毛蛋白结构域来修饰新月柄杆菌的表面层。在孵化当日和孵化后4天通过口服填喂0.5ml的细菌悬浮液(～108CFU)来施用弯曲杆菌(全细菌细胞)。在孵化后14天，通过口服填喂0.5ml细菌悬浮液(～108CFU)向小鸡施用空肠弯曲杆菌F38011。在该研究的第21天(接种后1周)使每组中一半的鸡安乐死并进行剖检，在第28天(接种后2周)使剩余的鸡安乐死并进行剖检。
材料和方法
细菌菌株、生长条件、质粒和试剂
将大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen，Carlsbad，CA)在37℃下培养于Luria Broth(1％胰蛋白胨，0.5％NaCl，0.5％酵母提取物)中。新月柄杆菌菌株JS 4022(Nomellini J.F.等人.2007S-layer mediated display of theIgG-binding domain of Streptococcal Protein G on the surface of Caulobactercrescentus-Development of an immuno-active reagent(S层介导链球菌蛋白G在新月柄杆菌的表面上的展示——免疫活性剂的开发).Appl.And EnvirMicrob.73：3245-3253)在30℃下在液体蛋白胨-酵母提取物(0.2％蛋白胨，0.1％酵母提取物、0.01％CaCl2、0.02％MgSO4)中增殖。为在固体培养基上生长，添加1.3％(重量/体积)的琼脂。需要时，培养基含有20g/ml(大肠杆菌)或2g/ml(新月柄杆菌)的氯霉素(CM)。如先前描述的进行新月柄杆菌的电穿孔(Gilchrist，A.，和J.Smit.1991.Transformation offreshwater and marine caulobacters by electroporation(通过电穿孔转化新鲜的水和海洋柄杆菌).J.Bacteriol.173：921-925.)。利用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAEX II gel extraction kit)(QIAGEN)从琼脂糖凝胶中回收片段。利用QIAprep小型质粒分离试剂盒(QIAprep miniprep plasmid isolation kit)(QIAGEN)分离质粒DNA，并通过GENEART AG(Regensburg Germany)构建用来构建30个肽表位的DNA区段。
表位为：
CadF(HYGAGVKFRLSDSLALRLETRDQINFNHAN)(SEQ ID NO：1)；
FlaA2(INAVKDTTGVEASIDANGQLVLTSADGRGI)(SEQ ID NO：4)；和
PorA(YGAAAVGSYDLAGGQFNPQLWLAYWDQVAF)(SEQ ID NO：153)。
顶部链DNA区段为
CadF：5’AGATCTACTAGTCACTACGGCGCCGGCGTCAAGTTCCGCCTGTCGGACTCGCTGGCCCTGCGCCTGGAGACCCGCGACCAGATCAACTTCAACCACGCCAACGCTAGCGCTGCAG 3’(SEQ ID NO：154)；
FlaA2：5’AGATCTACTAGTATCAACGCCGTGAAGGACACCACCGGCGTCGAGGCGTCGATCGACGCCAACGGCCAGCTGGTCCTGACGTCGGCCGACGGCCGGGGTATCGCTAGCGCTGCAG 3’(SEQ ID NO：155)；
PorA：5’AGATCTACTAGTTATGGCGCCGCCGCCGTCGGCTCGTATGACCTGGCCGGCGGCCAGTTCAACCCGCAGCTGTGGCTGGCCTACTGGGACCAGGTCGCCTTCGCTAGCGCTGCAG 3’(SEQ ID NO：156)。
利用5’端的BglII位点和SpeI位点和3’端的NheI位点和PstI位点对区段进行工程化。限制性位点排列允许利用BglII/PstI将区段作为单独的表位定向地克隆到p4ARsaA(723)/GSCC中，或可按所需将区段多聚化(Nomellini J.F.等人.2007S-layer mediated display of the IgG-bindingdomain of Streptococcal Protein G on the surface of Caulobacter crescentus-Development of an immuno-active reagent(S层介导链球菌蛋白G在新月柄杆菌的表面上的展示——免疫活性剂的开发).Appl.And Envir.Microb.73：3245-3253.AEM ref)。多聚化导致p4ARsaA(723)/CadF/FlaA2/PorA克隆。
ELISA
用稀释于PBS中1μg的CadF肽，第128-142位氨基酸(即，10μg/ml溶液中的100μl)包被ELISA平板。在4℃下过夜孵育之后，用PBST洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温20)洗涤孔两次，并用150μl的PBS、0.05％吐温20和0.25％明胶(PBST-G)在25℃下封闭2小时。洗涤平板三次。在PBST-G中1∶50和1∶200稀释小鸡血清，并以三个重复添加100μl的每种血清样品。在25℃下孵育2小时之后，洗涤孔三次，并添加1∶5000稀释于PBST-G中的100μl的抗鸡IgG抗体辣根过氧化物酶轭合物(Sigma)，在25℃下持续2小时。用PBS洗涤孔三次，并将50μl的四甲基联苯胺(TMB)底物(Pierce-Endogen)添加到孔中。显色10分钟后用0.18N H2SO4终止反应。用ELx808 Ultra Microplate Reader(Bio Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT)在492nm处确定孔内的吸光度(A490)。图36和37总结了来自该实验的结果。接受新月柄杆菌CadF/FlaA/PorA菌株的10只鸟中仅4只被定殖，而接受新月柄杆菌野生型菌株的10只鸟中仅9只被定殖。由于接受疫苗菌株的10只鸟中仅4只被定殖的事实，图31中总结的新月柄杆菌CadF/FlaA/PorA菌株的中值菌落形成单位低于可检测的水平。进行的Elisa测定显示新月柄杆菌CadF/FlaA2/PorA疫苗菌株刺激针对CadF肽的特异性抗体反应(图32)。图32的数据在表11中以表格形式呈现。
图11.鸡的空肠弯曲杆菌定殖与重组新月柄杆菌的竞争排除
总之，该实验显示新月柄杆菌的S层可经遗传修饰而包括多个空肠弯曲杆菌表位。为此，已生成了减少肉鸡的盲肠中的空肠弯曲杆菌的载量的新月柄杆菌疫苗菌株。
实施例8.来自一些空肠弯曲杆菌菌株的FlaA序列的比较分析
将来自一些空肠弯曲杆菌菌株的FlaA蛋白的序列进行比较并产生共有序列(参见图33A-C)。如可见的，蛋白中的某些结构域或区域是高度保守的。选择高度保守的区域作为疫苗抗原以提供针对最大量的空肠弯曲杆菌菌株的保护。预测这些残基是暴露于表面的，且对于保护性抗体是可及的。基于这些结果，鉴定了高度保守的30个氨基酸的肽(FlaA的第278-307位氨基酸：INAVKDTTGVEASIDANGQLVLTSADGRGI(SEQ ID NO：4))。该30mer代表用于本发明的候选抗原序列。
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本文所描述的特定的方法和组合物代表优选的实施方案，且是示例性的，而不意在限制本发明的范围。本领域中的其他技术人员考虑本说明书后会想到其它目的、方面和实施方案，其包括在如权利要求的范围所限定的本发明的精神内。对本文所公开的本发明的多种替换和修改对于本领域的技术人员将是明显的而不脱离本发明的精神和范围。
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Claims (34)

1.一种在动物中预防或治疗空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)定殖的方法，所述方法包括以下步骤：
向所述动物提供
一种或多种空肠弯曲杆菌多肽；或
经基因工程化以含有并表达编码一种或多种空肠弯曲杆菌多肽的核酸序列的宿主。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种空肠弯曲杆菌多肽选自由以下组成的组：CadF、FlpA、FlaA、CmeA、CmeC、CjaA、CjaC、CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、CJJ81176_0164、CJJ81176_0586、CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaB、FlgE2、PEB2、PEB3、PorA、MapA、SdhB和其抗原片段。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种空肠弯曲杆菌多肽选自由CadF、FlpA、FlaA和其抗原片段组成的组。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种抗原片段选自由如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中列出的多肽序列组成的组。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述动物是鸟。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述鸟是鸡。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主是细菌宿主细胞或病毒。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述宿主是减毒的。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述细菌宿主细胞是乳酸杆菌(Lactobacillus)。
10.如权利要求9所述的方法，其中将所述编码一种或多种空肠弯曲杆菌多肽的核酸序列插入到所述乳酸杆菌的S-层蛋白中。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述提供的步骤包括在所述动物的饮用水中提供所述一种或多种空肠弯曲杆菌多肽；或所述经基因工程化以含有并表达编码一种或多种空肠弯曲杆菌多肽的核酸序列的宿主。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述提供的步骤包括提供作为气溶胶的所述一种或多种空肠弯曲杆菌多肽；或所述经基因工程化以含有并表达编码一种或多种空肠弯曲杆菌多肽的核酸序列的宿主细胞。
13.一种宿主，所述宿主经基因工程化以含有并表达编码一种或多种空肠弯曲杆菌多肽的核酸序列。
14.如权利要求13所述的宿主，其中所述一种或多种空肠弯曲杆菌多肽选自由以下组成的组：CadF、FlpA、FlaA、CmeA、CmeC、CjaA、CjaC、CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、CJJ81176_0164、CJJ81176_0586、CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaB、FlgE2、PEB2、PEB3、PorA、MapA、SdhB和其抗原片段。
15.如权利要求14所述的宿主，其中所述一种或多种空肠弯曲杆菌多肽选自由CadF、FlpA、FlaA和其抗原片段组成的组。
16.如权利要求15所述的宿主，其中所述一种或多种抗原片段选自由如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中列出的多肽序列组成的组。
17.如权利要求13所述的宿主，其中所述宿主是细菌宿主细胞或病毒。
18.如权利要求13所述的宿主，其中所述宿主是减毒的。
19.如权利要求17所述的宿主，其中所述细菌宿主细胞是乳酸杆菌。
20.如权利要求19所述的宿主，其中将所述编码一种或多种空肠弯曲杆菌多肽的核酸序列插入到所述乳酸杆菌的S-层蛋白中。
21.一种经修饰的细菌S-层蛋白，所述经修饰的细菌S-层蛋白具有来自空肠弯曲杆菌细菌的至少一种异源多肽的内部插入物。
22.如权利要求21所述的经修饰的细菌S-层蛋白，其中所述至少一种异源多肽选自由以下组成的组：CadF、CmeA、CmeC、CjaA、CjaC、CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、CJJ81176_0164、CJJ81176_0586、CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaA、FlaB、FlpA、FlgE2、PEB2、PEB3、PorA、MapA、SdhB和一种或多种其抗原片段。
23.如权利要求21所述的经修饰的细菌S-层蛋白，其中所述经修饰的细菌S-层蛋白来自选自乳酸杆菌属(Lactobacillus)和柄杆菌属(Caulobacter)的细菌属。
24.一种用于在动物中产生针对空肠弯曲杆菌的免疫应答的抗原组合物，所述抗原组合物包括，
至少一种第一多肽，所述第一多肽选自由空肠弯曲杆菌CadF、FlaA、FlpA和其抗原片段组成的组；和
至少一种第二空肠弯曲杆菌多肽，所述第二空肠弯曲杆菌多肽不同于所述第一多肽。
25.如权利要求24所述的抗原组合物，其中所述第二空肠弯曲杆菌多肽选自由以下组成的组：CadF、FlaA、FlpA、CmeA、CmeC、CjaA、CjaC、CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、CJJ81176_0164、CJJ81176_0586、CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaB、FlgE2、PEB2、PEB3、PorA、MapA、SdhB和其抗原片段。
26.如权利要求24所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中列出的一种或多种多肽序列。
27.如权利要求24所述的抗原组合物，所述抗原组合物还包括佐剂。
28.如权利要求24所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物为向鸟施用而配制。
29.如权利要求24所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物为口服施用而配制。
30.如权利要求24所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物为向鸡口服施用而配制。
31.如权利要求24所述的抗原组合物，其中所述第一多肽和所述第二空肠弯曲杆菌多肽是重组的或合成的，并抑制所述动物的空肠弯曲杆菌定殖。
32.一种用于向受治疗者递送感兴趣的物质的方法，所述方法包括以下的步骤：
向所述受治疗者提供含有空肠弯曲杆菌的纤连蛋白结合蛋白和感兴趣的物质的融合产物，其中所述纤连蛋白结合蛋白和所述感兴趣的物质彼此关联；和
允许所述融合产物在所述受治疗者的细胞或组织中结合纤连蛋白。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述纤连蛋白结合蛋白是FlpA。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述感兴趣的物质是一种或多种人类传染物的多肽抗原。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110903359A (zh) * 2019-12-23 2020-03-24 杭州贤至生物科技有限公司 一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN112094328A (zh) * 2020-09-21 2020-12-18 华南农业大学 一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法
CN113144182A (zh) * 2021-04-22 2021-07-23 成都亿妙生物科技有限公司 一种幽门螺杆菌口服缓释疫苗及其制备与应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180120136A1 (en) * 2016-10-27 2018-05-03 General Electric Company Time-varying flow estimation for virtual flow metering applications

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6156546A (en) * 1997-05-16 2000-12-05 Washington State University Research Foundation Identification and molecular cloning of a gene encoding a fibronectin binding protein (CadF) from Campylobacter coli and Campylobacter jejuni
WO2005049641A2 (en) * 2003-11-21 2005-06-02 Ace Biosciences A/S Surface-located campylobacter jejuni polypeptides
US20070249553A1 (en) * 2004-10-26 2007-10-25 The Secretary Of State For Environment, Food & Rural Affairs Vaccine And Nucleic Acids Capable Of Protecting Poultry Against Colonisation By Campylobacter

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050106159A1 (en) * 2003-08-12 2005-05-19 Thompson Stuart A. Campylobacter jejuni outer membrane protein immunogenic composition

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6156546A (en) * 1997-05-16 2000-12-05 Washington State University Research Foundation Identification and molecular cloning of a gene encoding a fibronectin binding protein (CadF) from Campylobacter coli and Campylobacter jejuni
WO2005049641A2 (en) * 2003-11-21 2005-06-02 Ace Biosciences A/S Surface-located campylobacter jejuni polypeptides
US20070249553A1 (en) * 2004-10-26 2007-10-25 The Secretary Of State For Environment, Food & Rural Affairs Vaccine And Nucleic Acids Capable Of Protecting Poultry Against Colonisation By Campylobacter

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110903359A (zh) * 2019-12-23 2020-03-24 杭州贤至生物科技有限公司 一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN110903359B (zh) * 2019-12-23 2021-09-17 杭州贤至生物科技有限公司 一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN112094328A (zh) * 2020-09-21 2020-12-18 华南农业大学 一种空肠弯曲杆菌外膜囊泡的提取及纯化方法
CN113144182A (zh) * 2021-04-22 2021-07-23 成都亿妙生物科技有限公司 一种幽门螺杆菌口服缓释疫苗及其制备与应用
CN113144182B (zh) * 2021-04-22 2023-03-10 成都欧林生物科技股份有限公司 一种幽门螺杆菌口服缓释疫苗及其制备与应用

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