CN108220254A - 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，该方法包括病毒离心初步纯化、PEG6000沉淀法二级纯化、和透析袋透析纯化等步骤。该方法对PEG6000的浓度，沉淀时间，离心力进行优化，最大限度地提高病毒的回收率，以该方法纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒可以满足基本的实验室研究以及疫苗制备需求，相较于现有技术，以本发明制备的产品具有病毒滴度高，完整性好，背景清晰的优点，加之工艺简便，成本较低，因此有很好的推广前景。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法

技术领域

本发明涉及一种病毒纯化方法，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征又称为猪蓝耳病，是目前养猪业中一种严重的病毒性传染病，引起猪严重繁殖障碍和呼吸道疾病。该病毒属于动脉炎病毒科属，是一种不分节段的单股正链RNA病毒，1987年该病首次在美国爆发，目前基本已经遍布所有养猪的国家，对全球的养猪业造成巨大的损失。2006年，我国发生了以高热，高死亡率为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征，世界动物卫生组织已将猪繁殖与呼吸综合征列为必须及时通报的动物疫病之一。目前商品化的蓝耳病毒疫苗主要是由经典株制备的弱毒活疫苗和由变异株制备的灭活苗，此类疫苗的安全性与免疫性受到许多因素的干扰，如病毒活性，病毒滴度，灭活工艺等等。商品化的疫苗如果用细胞培养繁殖的病毒直接制备，极其容易受到细胞碎片，培养基成分以及一些杂质的影响，导致疫苗免疫原性失常，接种后的动物发生过敏反应等情况，所以，提高病毒滴度和抗原纯净度是制备疫苗的必须途径。

目前，现有的蓝耳病毒纯化技术主要包括：(1)Sepharose 4FF凝胶层析纯化，该方法的优点是选用Sepharose 4FF凝胶作为层析介质，其病毒回收率与杂蛋白去除率高，纯化后的病毒免疫原性较好，但方法操作繁琐，成本较为高昂。(2)超速离心法沉淀法，该方法的优点是操作简便，但对仪器要求很高，并且超速离心会影响病毒的完整性，以该方法纯化后的病毒液纯净度也比较差。(3)蔗糖密度梯度离心法，该方法的优点是成本低，在一般实验内较为常用，但高浓度蔗糖的黏稠性和渗透性回对病毒颗粒造成损伤，所以不适用于疫苗的制备.

PEG全称为聚乙二醇，其结构稳定，不易变质，亲水性强，是研究中无免疫原性的理想材料之一，使用PEG沉淀病毒的优点有(1)沉淀效能高，使用极少的PEG就能即可沉淀相当多的生物大分子(2)操作条件温和，不易引起生物大分子的变性(3)沉淀后的有机聚合物容易去除

透析是生物化学实验室最简便常用的分离纯化技术之一，透析袋所用材料是纤维素所制成的半透膜，样品中的生物大分子被截留在袋内，一些盐与小分子物质则通过透析袋内外的浓度梯度，扩散透析至袋外，该方法简便高效，成本较低。

目前，在现有病毒纯化技术中，大多数实验室采用超速离心法以及密度梯度离心法，这两种方法因为过大的离心力和梯度溶液的高渗透性都极易损伤病毒的活性及完整性，近年来，层析技术快速发展，利用凝胶层析柱除去杂质的病毒纯化方法能够有效地避免病毒囊膜结构破坏，但该方法成本较高，步骤繁琐，而本发明所使用的PEG沉淀和透析纯化法都有被报道过可以用于纯化病毒，但鲜有实验室结合使用，只在血液蛋白纯化领域有过相关报道，PEG作为一种水溶性非离子型聚合物，亲水性强，有报道用其纯化鸡流感病毒时，可以大大提高病毒回收率并且保留病毒的完整性及活性，而结合上透析法，又可以去除病毒液中残留的PEG和一些细胞代谢产物，使病毒液的背景更为纯净。在PRRSV纯化方法领域，PEG沉淀和透析纯化法尚无报道。

发明内容

本发明旨在利用PEG沉淀和透析纯化结合的方式提供一种高效简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化法，已解决现有该病毒纯化法操作繁琐，成本较高，纯化效果不佳的问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，该方法通过PEG沉淀法和透析袋纯化法来实现，过程如下：

1)病毒的增殖与制备：复苏和培养Marc-145细胞，用PRRSV感染单层Marc-145细胞，待80％以上细胞发生病变时收获病毒，反复冻融三次，使细胞裂解，将病毒释放入培养液中。

2)将该病毒液初步离心，除去细胞碎片及部分杂质，获得初级纯化病毒液

3)以1∶1的比例将PEG6000/NaCl混合液加入到步骤2)的初级纯化病毒液中，使用混合仪混匀震荡一定时间

4)将步骤3)混匀后的病毒液放入低温离心机中离心，离心后弃上清，沉淀加入无菌0.1M的PBS，震荡重悬

5)将步骤4)中的病毒重悬液再次放入冷冻离心机，离心除去沉淀，取上清，获得二级纯化病毒液

6)将步骤5)中的二级纯化病毒液滴加入透析袋，将透析袋放置于透析液中，用磁力搅拌器透析一定时间，每隔两个小时换一次透析液，最终获得病毒纯化液成品。

7)将上述制备的病毒纯化液成品放置于-20℃保存

上述的猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，属于三步纯化法，第一步通过离心将病毒原液中的一些细胞碎片及杂质去除，第二步加入PEG6000，混合离心后使病毒沉淀，第三步将沉淀的病毒重悬后加入透析袋内进行透析纯化，去除PEG沉淀下来的蛋白小分子，有机聚合物和一些细胞代谢产生的杂质。

上述猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法中，步骤1)所述的冻存温度优选为-80℃，步骤2)所述的离心温度优选为4℃，步骤2)所述的离心力优选为10000g，离心时间优选为30min，步骤3)所述的PEG6000浓度优选为14％，NaCl浓度优选为6％，步骤4)所述的离心力优选为10000g，时间优选为30min，步骤5)所述的离心力优选为8000g，时间优选为15min，步骤6)所述的透析袋规格优选为100kd，透析时间优选为6小时

上述制备的病毒纯化液检测方法如下：

1)对纯化后的病毒液进行TCID50病毒滴度测试，以检测该纯化方法的有效性

2)对纯化后的病毒进行电镜观察，以检测病毒的浓度及完整性

3)对个样品进行PCR检测，检测该纯化方法的病毒回收率

以上对本发明的发明内容进行了详细说明。本发明的纯化方法综合采用了PEG沉淀法和透析纯化法，减少了纯化步骤，降低了成本，同时最大限度的增大了病毒回收效率。以本发明制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化液，满足科研需求，同时可用于疫苗的制备，市场前景广阔。

附图说明

图1是该发明制备的病毒纯化液电镜照片

图2是该发明制备的病毒纯化液PCR电泳图；其中M是MarkerDL2000，1是病毒原液，2是PEG沉淀后上清，3是PEG沉淀重悬液，4是PRRSV纯化液，5是PEG沉淀杂质重悬液，6、7是空白对照。

具体实施方式

一、材料与设备

1)PRRSV商品化疫苗株JXA1-R株、Marc-145细胞株均由江苏省扬州大学兽医学院天然免疫信号、免疫与感染研究室

2)IMDM培养基，胎牛血清均采购自Gibco公司

3)PEG6000采购自德国MERCK公司，透析袋采购自Spectrum公司

4)PBS(10X)采购自江苏碧云天生物技术有限公司

5)冷冻离心机购自eppendorf公司，超净台，CO2细胞培养箱，HulaMixer均购自ThermoFisher公司

二、实验方法

1)病毒的增殖与制备：

1、将冻存的Marc-145细胞放置于37℃水浴箱中快速解冻放入细胞瓶中，并加入6mL有10％胎牛血清的IMDM培养基(37℃预热1h)，在37℃的CO2细胞培养箱中培养6h后，观察贴壁情况，情况良好时，吸出原培养液，用1xPBS清洗一次后，加入新的培养液，每日观察

2、显微镜观察细胞贴壁情况达到90％以上时，进行细胞传代，并将冻存的PRRSV疫苗株融解后接种至培养好的单层Marc-145细胞，加入细胞维持液进行病毒的增殖感染

3、当观察到细胞CPE程度明显，大量细胞圆缩，脱落，变形时，用细胞刮将细胞刮落，混匀分装至冻存管中，反复冻融三次，收集病毒原液。

2)初步离心，将步骤1)收集的病毒原液加入离心管，放入冷冻离心机中，以10000g离心力离心30min，除去细胞碎片及部分杂质，获得初级纯化病毒液

3)PEG沉淀，将含有14％PEG6000和6％NaCl的混合液通过0.22μm的滤器进行除菌，并以1∶1的比例加入到步骤2)的初级纯化病毒液中，混合后放置于Hulamixer上混匀震荡2h，使病毒充分凝集沉淀

4)沉淀分离，将步骤3)经过PEG沉淀后的病毒液放入冷冻离心机中，在4℃下以10000g离心力离心30min，离心管壁可见白色贴壁沉淀，采样后弃去上清，沉淀加入无菌的1xPBS，震荡重悬，可见游离的白色杂质

5)将步骤4)中的病毒重悬液再次放入冷冻离心机，4℃下，以8000g离心力离心15min，采样后弃去沉淀，采集上清，获得二级纯化病毒液

6)将步骤5)中的二级纯化病毒液滴加入透析袋，将透析袋放置于配好的1xPBS透析液中，用磁力搅拌器搅拌透析液，每隔两个小时换一次透析液，透析6h后，最终获得病毒纯化液成品。

7)将上述制备的病毒纯化液成品放置于-20℃保存

纯化效率检测：

以上述制备的PRRSV纯化液，PEG沉淀上清，PEG沉淀杂质作为实验材料，进行如下实验：

1、电镜观察

将PRRSV纯化液滴加至铜网上，用磷钨酸染色30s后进行电镜观察，如图1，可清晰观察到视野内病毒颗粒数量很多，结构完整。

2、PCR检测：

将病毒原液、PRRSV纯化液、步骤(4)中的收集的上清液和重悬后的PEG白色沉淀进行PCR鉴定，检测纯化的效率。根据PRRSV商品化疫苗株JXA1-R(GenBank no.DQ355796)的序列，利用Primier 5.0软件设计该基因的特异性引物，上游引物(F)：5＇-ATCGCCCAACAAAACCAGTC-3＇(SEQ ID No.1)；下游引物(R)：5＇-TGCGTCGGCAAACTAAACTC-3＇(SEQ ID No.2)，扩增产物的长度为128bp。PCR反应体系具体如下：

配制总体积为25μL的PCR反应体系

PCR反应程序：94℃ 5min，95℃30s，64℃30s，72℃45s，72℃10min，共计30个循环，12℃50min。

PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：配置1.5％的琼脂糖凝胶，电泳参数为电压120V，时间为30min。

如图2，PEG纯化后的病毒液与病毒原液条带亮度相差度不大，而上清条带几乎没有，说明PEG纯化病毒的回收率很高，PEG纯化病毒液中出现的沉淀大多为杂质，其中病毒含量极少，可用离心方式去除。

3、TCID50测试：

1)、在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10^-1～10^-10。

2)、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μL。

3)、在每孔加入细胞悬液100μL，使细胞量达到2～3×10⁵个/mL。

4)、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。(100μL生长液+100μL细胞悬液)

5)、逐日观察并记录结果，观察5-7天。如表1，病毒在稀释了10⁸倍后，才有孔出现没有CPE的情况，稀释了10¹⁰倍后，所有孔才没有CPE的情况，经计算后，TCID50为10^-8.25/0.1mL，病毒滴度极高。

表1.不同病毒液稀释度的细胞CPE情况表

病毒液稀释度	出现CPE的孔数	出现CPE孔的比率
			10-1	8	8/8＝1
10-2	8	8/8＝1
			10-3	8	8/8＝1
10-4	8	8/8＝1
			10-5	8	8/8＝1
10-6	8	8/8＝1
			10-7	7	7/8＝0.875
10-8	5	5/8＝0.625
			10-9	2	2/8＝0.25
10-10	0	0/8＝0

lgTCID50＝L-D(S-0.5)

L：最高稀释度的对数

D：稀释度对数之间的差

S：阳性孔比率总和

lgTCID50＝-1-1×(7.75-0.5)

＝-8.25

TCID50＝10^-8.25/0.1mL

三、结论

从电镜观察，PCR检测以及病毒滴度测试结果可以看出，PEG沉淀法配合透析纯化法，相较于背景技术中的猪繁殖与呼吸综合征病毒的Sepharose 4FF凝胶层析纯化法，纯化成本低，操作简易，相较于超速离心法沉淀法和蔗糖密度梯度离心法，本方法可以更好得保留病毒的完整性和活性，并且不需要使用价格高昂的超速离心机，只需使用廉价的国产高速离心机即可。综上所述，该发明操作简易，成本较低，建立了一种高效，简便，温和的猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，具有极好的市场前景。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学镇江高新技术研究院

<120> 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcgcccaac aaaaccagtc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcgtcggca aactaaactc 20

Claims (7)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，其特征在于使用PEG6000沉淀法与透析袋，并包括以下步骤：

1)将在Marc-145细胞中培养的病毒冻融三次，使细胞裂解，将病毒释放入培养液中；

2)将该病毒液初步离心，除去细胞碎片及部分杂质，获得初级纯化病毒液；

3)以1∶1的比例将PEG6000/NaCl混合液加入到步骤2)的初级纯化病毒液中，使用混合仪混匀震荡一定时间；

4)将步骤3)混匀后的病毒液放入低温离心机中离心，离心后弃上清，沉淀加入无菌0.1M的PBS，震荡重悬；

5)将步骤4)中的病毒重悬液再次放入冷冻离心机，离心除去沉淀，取上清，获得二级纯化病毒液；

6)将步骤5)中的二级纯化病毒液滴加入透析袋，将透析袋放置于透析液中，用磁力搅拌器透析一定时间，每隔两个小时换一次透析液，最终获得病毒纯化液成品。

2.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，其特征在于步骤1)所述的病毒需放置于冻存盒在-80℃环境中冻存，融解温度为室温。

3.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，其特征在于步骤2)所述的离心力为10000g，离心时间为30min 。

4.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，

其特征在于步骤3)所述的PEG6000/NaCl混合液浓度分别为14％和6％。

5.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒纯化方法，

其特征在于步骤4)所述的低温离心机温度为4℃，离心力为10000g，时间为30min。

6.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒纯化方法，其特征在于步骤5)所述的离心温度为4℃，离心力为8000g，时间为15min 。

7.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，其特征在于步骤6)的透析袋规格为100kd，透析液为0.1MPBS。