CN114717202B - 一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括病毒释放、病毒澄清、病毒灭活、宿主DNA降解、病毒浓缩和病毒纯化这几个步骤，其中，病毒释放步骤采用压力破碎法破碎宿主细胞，病毒澄清步骤采用连续流离心，病毒纯化步骤采用连续流蔗糖密度梯度离心；所述制备方法在病毒释放步骤采用压力破碎法破碎宿主细胞，与冻融破碎相比，压力破碎步骤简单且可以连续进样，大大缩短操作时间，与超声波破碎相比，压力破碎不易破坏病毒活性且对宿主细胞的破碎效果更好，大大提高病毒收获液的质量，另外，压力破碎能够实现闭环化无菌操作且破碎条件稳定，更有助于实现规模化工业生产。

Description

一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
轮状病毒（Rotavirus，RV）是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科，是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体之一，全球每年感染人数上亿，造成死亡人数数十万。在我国，每年大约有1000万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4，是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。
安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段。目前，通常使用轮状病毒灭活疫苗控制轮状病毒感染。但是，历史上多次发生因疫苗纯度不够影响疫苗的产品质量，导致疫苗在临床使用后产生较大副作用的事件。这促使食品和药物管理局（FDA）、欧洲药品评估机构（EMEA）对降低过敏和自身免疫反应等能副作用水平的安全要求不断增加，对疫苗的纯度、无菌性和安全性等提出了更高的要求。疫苗企业也需要不断努力改进疫苗生产过程中的下游工艺，以对疫苗进行更加严格的精细化生产，进而适应国际上对疫苗的高要求。
轮状病毒灭活疫苗生产的下游工艺主要包括病毒收获后的病毒释放、病毒澄清、宿主DNA降解、病毒灭活、病毒浓缩以及病毒纯化这几个步骤。现阶段，轮状病毒灭活疫苗生产的下游工艺主要存在以下缺陷：
第一，病毒释放步骤常采用反复冻融破碎或超声破碎，其中，反复冻融破碎法冻结和融化均需要较长时间，操作周期长；超声破碎法产生的热量大，容易破环病毒活性，且超声波探头面积需要与处理量成正比，大规模生产过程中等比放大工艺较难实现；
第二，病毒纯化步骤主要使用阴离子交换层析，该工艺需要将病毒澄清液高倍浓缩，浓缩过程剪切力会对病毒结构造成破坏，降低回收率，并且，该工艺的层析效果受杂质、压力、盐浓度等因素影响，层析柱的分离效果效会随着使用次数增加而快速降低，同时，层析柱需要在使用若干次以后重新装填，受操作人员经验和技术等因素影响，每次装柱并不能保证层析柱完全一致，另外，层析液含高浓度盐离子，需要使用透析袋或脱盐柱进行脱盐，在大规模生产过程中，会增加成本，降低回收率。
亟需找到可克服上述缺陷的轮状病毒灭活疫苗生产的下游工艺，以对疫苗进行更加严格的精细化生产，进而适应国际上对疫苗的高要求。
发明内容
为解决现有轮状病毒灭活疫苗的制备方法存在的问题，本发明提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
病毒释放：将轮状病毒的病毒培养液进行宿主细胞破碎，得到病毒收获液；
病毒澄清：将病毒收获液进行澄清，得到病毒澄清液；
病毒灭活：将病毒澄清液进行灭活，得到病毒灭活液；
宿主DNA降解：在病毒灭活液中添加核酸酶和氯化镁对病毒灭活液中的宿主DNA进行降解，得到病毒降解液；
病毒浓缩：将病毒降解液进行浓缩，得到病毒浓缩液；
病毒纯化：将病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗；
或者，所述制备方法包括如下步骤：
病毒释放：将轮状病毒的病毒培养液进行宿主细胞破碎，得到病毒收获液；
病毒澄清：将病毒收获液进行澄清，得到病毒澄清液；
宿主DNA降解：在病毒澄清液中添加核酸酶和氯化镁对病毒澄清液中的宿主DNA进行降解，得到病毒降解液；
病毒灭活：将病毒降解液进行灭活，得到病毒灭活液；
病毒浓缩：将病毒灭活液进行浓缩，得到病毒浓缩液；
病毒纯化：将病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗；
所述细胞破碎采用压力破碎；
所述纯化采用连续流蔗糖密度梯度离心。所述压力破碎是指细胞悬液在破碎仪柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失压的细胞液以极高的流速（1000~1500米/秒）喷出，碰撞在碰撞阀组件之一的冲击环上，细胞在这一系列过程中经历了高速造成的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化，从而造成细胞的破碎。所述连续流蔗糖密度梯度离心是指用一定浓度蔗糖溶液与PBS溶液在离心力的作用下，在离心机转子内形成连续的蔗糖密度梯度，病毒浓缩液从转子底端进入从转子顶端流出，此流经过程中，分子量不同的病毒颗粒与杂质蛋白因沉降系数不同而停留到不同浓度的蔗糖区间内，从而达到纯化效果。
在本发明的一种实施方式中，所述压力破碎的条件为：破碎压力10~60bar、进液流速50~300mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述压力破碎的条件为：破碎压力10bar、进液流速100mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述澄清采用连续流离心；所述连续流离心的条件为：固定离心力8000~12000g、上样速度600~800mL/min、温度2~8℃。
在本发明的一种实施方式中，所述连续流离心的条件为：固定离心力10000g、上样速度700mL/min、温度4℃。
在本发明的一种实施方式中，所述灭活为：按照体积比1：500~2000将β-丙内酯和病毒澄清液混合后，于2~8℃下孵育48~72h；或者，所述灭活为：按照体积比1：500~2000将β-丙内酯和病毒降解液混合后，于2~8℃下孵育48~72h。
在本发明的一种实施方式中，所述灭活为：按照体积比1：1000将β-丙内酯和病毒澄清液混合后，于4℃下孵育60h；或者，所述灭活为：按照体积比1：1000将β-丙内酯和病毒降解液混合后，于4℃下孵育60h。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸酶在病毒灭活液中的添加量为5~100U/mL；或者，所述核酸酶在病毒澄清液中的添加量为5~100U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸酶在病毒灭活液中的添加量为30U/mL；或者，所述核酸酶在病毒澄清液中的添加量为30U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述氯化镁在病毒灭活液中的添加量为0.5~10mM；或者，所述氯化镁在病毒澄清液中的添加量为0.5~10mM。
在本发明的一种实施方式中，所述氯化镁在病毒灭活液中的添加量为2mM；或者，所述氯化镁在病毒澄清液中的添加量为2mM。
在本发明的一种实施方式中，所述降解的条件为：温度20~45℃、时间2~6h。
在本发明的一种实施方式中，所述降解的条件为：温度37℃、时间3h。
在本发明的一种实施方式中，将病毒降解液浓缩至原体积的1/5~1/20。
在本发明的一种实施方式中，所述浓缩为：将病毒降解液浓缩至原体积的1/10。
在本发明的一种实施方式中，所述浓缩为：采用截留分子量100~300KD的超滤系统将病毒降解液浓缩至原体积的1/4~1/6后，加入pH 7.0~7.4、浓度0.005~0.1M的缓冲液稀释至原体积，并再次浓缩至原体积的1/4~1/6，重复此操作4~7次，最后一次浓缩将病毒降解液浓缩至原体积的1/5~1/20。
在本发明的一种实施方式中，所述浓缩为：采用截留分子量300KD的超滤系统将病毒降解液浓缩至原体积的1/5后，加入pH 7.2、浓度0.01M的缓冲液稀释至原体积，并再次浓缩至原体积的1/5，重复此操作5次，最后一次浓缩将病毒降解液浓缩至原体积的1/10。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为PBS缓冲液、MPB缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述连续流蔗糖密度梯度离心的条件为：初始蔗糖水溶液浓度50~80g/100mL、固定离心力20000~40000g、上样速度90~150mL/min、温度4~15℃。
在本发明的一种实施方式中，所述连续流蔗糖密度梯度离心的条件为：初始蔗糖浓度60g/100mL、固定离心力35000g、上样速度100mL/min、温度10℃。
在本发明的一种实施方式中，所述轮状病毒病毒培养液的制备方法包括如下步骤：
宿主细胞制备：将Vero细胞用细胞生长液配置成细胞密度为1.5×106~2.5×106个/mL的细胞悬液后，取1~2L细胞悬液添加至含有8~9L细胞生长液和30~50g微载体的9~11L生物反应器内，于温度36~38℃、pH 7.0~7.4、溶氧45~55%、搅拌速度30~60rpm的条件下培养18~24h；培养结束后，使用细胞生长液对生物反应器内的Vero细胞进行灌流，使得细胞生长液中的葡萄糖含量不低于2g/L，连续灌流110~130h，共灌流9~11L细胞生长液，直至Vero细胞长满微载体；所述细胞生长液由占细胞生长液总体积93~95%的DMEM培养基、占细胞生长液总体积3~5%的牛血清白蛋白、占细胞生长液总体积0.04~0.06%的十万IU/mL硫酸庆大霉素溶液、占细胞生长液总体积0.9~1.1%的3g/100mL L-谷氨酰胺溶液和占细胞生长液总体积0.9~1.1%的7.53g/100mL碳酸氢钠溶液组成；
宿主细胞灌洗：灌流结束后，在生物反应器内导入9~11L灌洗液；导入结束后，关闭生物反应器，使得生物反应器内的微载体自然沉降20~30min；沉降结束后，排出生物反应器内的灌洗液，并在生物反应器内再次导入9~11L灌洗液；再次导入结束后，打开生物反应器5~15min，使得生物反应器内的微载体重新悬浮；重新悬浮结束后，关闭生物反应器，使得生物反应器内的微载体再次自然沉降20~30min；再次自然沉降结束后，排出生物反应器内的灌洗液；以上述过程作为一次完整的灌洗，重复灌洗4~6次；灌洗结束后，在生物反应器内导入9~11L细胞维持液，得到宿主细胞液；所述灌洗液由占灌洗液总体积97.8~98.2%的PBS缓冲液、占灌洗液总体积0.9~1.1%的3g/100mL L-谷氨酰胺溶液和占灌洗液总体积0.9~1.1%的7.53g/100mL碳酸氢钠溶液组成；所述细胞维持液由占细胞维持液总体积97.69~98.11%的DMEM培养基、占细胞维持液总体积0.9~1.1%的3g/100mL L-谷氨酰胺溶液、占细胞维持液总体积0.9~1.1%的7.53g/100mL碳酸氢钠溶液和占细胞维持液总体积0.09~0.11%的0.6g/100mL胰酶溶液组成；
病毒活化：取轮状病毒CDC-9株的病毒液1~3mL，在病毒液中加入终浓度9~11μg/mL的胰酶和终浓度为750~850μg/mL的氯化钙后，于36~38℃水浴锅活化1~3h，得到病毒活化液；
病毒培养：将病毒活化液按照0.001~0.01MOI的接种量接种至宿主细胞液中，于温度36~38℃、pH 7.0~7.4、溶氧45~55%、搅拌速度30~60rpm的条件下培养60~72h，得到轮状病毒的病毒培养液。
在本发明的一种实施方式中，所述轮状病毒病毒培养液的制备方法包括如下步骤：
宿主细胞制备：将Vero细胞用细胞生长液配置成细胞密度为1.8×106个/mL的细胞悬液后，取1.5L细胞悬液添加至含有8.5L细胞生长液和40g微载体的10L生物反应器内，于温度37℃、pH 7.2、溶氧50%、搅拌速度45rpm的条件下培养24h；培养结束后，使用细胞生长液对生物反应器内的Vero细胞进行灌流，使得细胞生长液中的葡萄糖含量不低于2g/L，连续灌流120h，共灌流10L细胞生长液，直至Vero细胞长满微载体表面；所述细胞生长液由占细胞生长液总体积93.95%的DMEM培养基、占细胞生长液总体积4%的牛血清白蛋白、占细胞生长液总体积0.05%的十万IU/mL硫酸庆大霉素溶液、占细胞生长液总体积1%的3g/100mLL-谷氨酰胺水溶液和占细胞生长液总体积1%的7.53g/100mL碳酸氢钠水溶液组成；
宿主细胞灌洗：灌流结束后，在生物反应器内导入10L灌洗液；导入结束后，关闭生物反应器，使得生物反应器内的微载体自然沉降15min；沉降结束后，排出生物反应器内的灌洗液，并在生物反应器内再次导入10L灌洗液；再次导入结束后，打开生物反应器10min，使得生物反应器内的微载体重新悬浮；重新悬浮结束后，关闭生物反应器，使得生物反应器内的微载体再次自然沉降25min；再次自然沉降结束后，排出生物反应器内的灌洗液；以上述过程作为一次完整的灌洗，重复灌洗6次；灌洗结束后，在生物反应器内导入10L细胞维持液，得到宿主细胞液；所述灌洗液由占灌洗液总体积98%的PBS缓冲液、占灌洗液总体积1%的3g/100mL L-谷氨酰胺水溶液和占灌洗液总体积1%的7.53g/100mL碳酸氢钠水溶液组成；所述细胞维持液由占细胞维持液总体积97.9%的DMEM培养基、占细胞维持液总体积1%的3g/100mL L-谷氨酰胺水溶液、占细胞维持液总体积1%的7.53g/100mL碳酸氢钠水溶液和占细胞维持液总体积0.1%的0.6g/100mL胰酶水溶液组成；
病毒活化：取轮状病毒CDC-9株的病毒液2mL，在病毒液中加入终浓度10μg/mL的胰酶和终浓度为800μg/mL的氯化钙后，于37℃水浴锅活化2h，得到病毒活化液；
病毒培养：将病毒活化液按照0.001MOI的接种量接种至宿主细胞液中，于温度37℃、pH 7.2、溶氧50%、搅拌速度45rpm的条件下培养72h，得到轮状病毒的病毒培养液。
在本发明的一种实施方式中，病毒释放前，所述方法还包括微载体分离步骤；所述微载体分离为：将轮状病毒的病毒培养液进行过滤，得到去除微载体的病毒培养液。
在本发明的一种实施方式中，所述分离为：采用滤网进行过滤；所述滤网的孔径为100~120μm。
在本发明的一种实施方式中，所述分离为：采用滤网进行过滤；所述滤网的孔径为106μm。
本发明还提供了一种轮状病毒灭活疫苗，所述轮状病毒灭活疫苗由上述制备方法制得。
本发明还提供了上述制备方法在制备轮状病毒灭活疫苗中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括病毒释放、病毒澄清、病毒灭活、宿主DNA降解、病毒浓缩以及病毒纯化这几个步骤，其中，病毒释放步骤采用压力破碎法破碎宿主细胞，病毒纯化步骤采用连续流蔗糖密度梯度离心；所述制备方法在病毒释放步骤采用压力破碎法破碎宿主细胞，与冻融破碎相比，压力破碎步骤简单且可以连续进样，大大缩短操作时间，与超声波破碎相比，压力破碎不易破坏病毒活性且对宿主细胞的破碎效果更好，大大提高病毒收获液的质量，另外，压力破碎能够实现闭环化无菌操作且破碎条件稳定，更有助于实现规模化工业生产；所述制备方法在纯化步骤采用连续流蔗糖密度梯度离心，连续流蔗糖密度梯度离心能够实现直接对得到病毒浓缩液的连续上样纯化，避免了得到病毒浓缩液的高倍浓缩过程，既可以节省浓缩时间，还能减少病毒粒子在高倍浓缩过程中因剪切力而造成的病毒结构破坏；所述制备方法将宿主DNA降解步骤设于病毒澄清步骤和病毒灭活步骤之间，或者，设于病毒灭活步骤与病毒浓缩步骤之间，有效提高了宿主DNA的降解效果，将宿主DNA降解步骤设于病毒灭活步骤与病毒浓缩步骤之间时，还能同时发挥水解β-丙内酯的作用，更节省时间。
进一步地，所述压力破碎的破碎压力为10~60bar；此破碎压力可在最大程度释放宿主细胞中病毒的同时，有效避免宿主蛋白以可溶形式存在病毒分离液中，对后续的病毒澄清造成影响。
进一步地，所述制备方法在病毒澄清步骤采用连续流离心；所述连续流离心的固定离心力为8000~12000g；此固定离心力可以在不影响病毒滴度的情况下有效去除病毒收获液中的颗粒物，澄清效果好。
进一步地，所述连续流蔗糖密度梯度离心的初始蔗糖水溶液浓度为60g/100mL；此初始蔗糖水溶液浓度可有效收集轮状病毒浓缩液中的病毒，且使得轮状病毒浓缩液中各项杂质的去除率均大于99%，抗原回收率高达42.19%。
进一步地，所述降解的条件为：温度37℃、时间4h；此降解条件有利于提高核酸酶对宿主DNA和β-丙内酯的降解效果，以及，有助于保证批次间的稳定性。
2、本发明的制备方法将轮状病毒的病毒培养液经微载体分离后再进行宿主细胞破碎处理；所述微载体分离步骤可有效避免微载体在此过程中发生破碎，进而防止向病毒液中引入葡聚糖颗粒等微载体结构成分形成的杂质，给病毒澄清、纯化造成压力，并且，所述微载体分离步骤可有效避免纯化后还未除去的葡聚糖颗粒等微载体结构成分形成的杂质对轮状病毒灭活疫苗的安全性造成风险。
进一步地，所述微载体分离步骤为采用孔径为106μm的滤网进行过滤；现有的微载体分离步骤是在生物反应器内让微载体自然沉降，沉降后收集上层上清液，此操作不能完全将病毒液收集，且收集到的病毒分离液中会混有部分微微载体，与现有的微载体分离步骤相比，所述微载体分离步骤能够将微载体和宿主细胞有效分离，有助于提高病毒收获液的病毒滴度，进而有助于提高轮状病毒灭活疫苗的质量。
附图说明
图1：不同冻融次数下破碎得到的病毒收获液的病毒滴度。
图2：不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液的病毒滴度。
图3：不同破碎功率下破碎得到的病毒收获液的病毒滴度。
图4：不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液中宿主细胞的结构完整性。
图5：不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液的病毒滴度。
图6：不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液的蛋白含量。
图7：不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液的宿主蛋白含量。
图8：经不同破碎方法处理的病毒收获液中微载体的完整性。
图9：不同离心力下离心得到的病毒澄清液的病毒滴度。
图10：不同离心力下离心得到的病毒澄清液的可视颗粒物含量。
图11：轮状病毒管式蔗糖密度梯度离心不同浓度蔗糖界面样品分布范围。
图12：轮状病毒管式蔗糖密度梯度离心不同浓度蔗糖界面样品SDS-PAGE凝胶电泳分析结果。
图13：轮状病毒管式蔗糖密度梯度离心不同浓度蔗糖界面样品Western Blot结果。
图14：连续流蔗糖浓度梯度。
图15：轮状病毒连续流蔗糖密度梯度离心分管收集样品SDS-PAGE检测结果。
图16：核酸酶的终浓度对宿主DNA降解效果的影响。
图17：孵育时间对核酸酶降解宿主DNA效果的影响。
图18：核酸酶降解时机对宿主DNA降解效果的影响。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的轮状病毒病毒培养液的制备方法包括如下步骤：
宿主细胞制备：将Vero细胞（购自ATCC）用细胞生长液配置成细胞密度为1.8×106个/mL的细胞悬液后，取1.5L细胞悬液添加至含有8.5L细胞生长液和40g微载体（Cytodex-1，购自GE公司）的10L生物反应器（购自百帕斯公司）内，于温度37℃、pH 7.2、溶氧50%、搅拌速度45rpm的条件下培养24h；培养结束后，使用细胞生长液对生物反应器内的Vero细胞进行灌流，使得细胞生长液中的葡萄糖含量不低于2g/L，连续灌流120h，共灌流10L细胞生长液，直至Vero细胞长满微载体；所述细胞生长液由占细胞生长液总体积93.95%的DMEM培养基（购自Gibco公司）、占细胞生长液总体积4%的牛血清白蛋白（购自兰州荣晔生物公司）、占细胞生长液总体积0.05%的十万IU/mL硫酸庆大霉素溶液（购自福建福抗药业有限公司）、占细胞生长液总体积1%的3g/100mL L-谷氨酰胺（购自无锡美迪生物有限公司）水溶液和占细胞生长液总体积1%的7.53g/100mL碳酸氢钠（购自湖南九典宏阳有限公司）水溶液组成；
宿主细胞灌洗：灌流结束后，在生物反应器内导入10L灌洗液；导入结束后，关闭生物反应器，使得生物反应器内的微载体自然沉降15min；沉降结束后，排出生物反应器内的灌洗液，并在生物反应器内再次导入10L灌洗液；再次导入结束后，打开生物反应器10min，使得生物反应器内的微载体重新悬浮；重新悬浮结束后，关闭生物反应器，使得生物反应器内的微载体再次自然沉降25min；再次自然沉降结束后，排出生物反应器内的灌洗液；以上述过程作为一次完整的灌洗，重复灌洗6次；灌洗结束后，在生物反应器内导入10L细胞维持液，得到宿主细胞液；所述灌洗液由占灌洗液总体积98%的PBS缓冲液、占灌洗液总体积1%的3g/100mL L-谷氨酰胺水溶液和占灌洗液总体积1%的7.53g/100mL碳酸氢钠水溶液组成；所述细胞维持液由占细胞维持液总体积97.9%的DMEM培养基、占细胞维持液总体积1%的3g/100mL L-谷氨酰胺水溶液、占细胞维持液总体积1%的7.53g/100mL碳酸氢钠水溶液和占细胞维持液总体积0.1%的0.6g/100mL胰酶（购自上海雅心生物公司）水溶液组成；
病毒活化：取轮状病毒CDC-9株的病毒液（购自美国CDC）2mL，在病毒液中加入终浓度10μg/mL的胰酶和终浓度为800μg/mL的氯化钙（购自湖南新绿方药业有限公司）后，于37℃水浴锅活化2h，得到病毒活化液；
病毒培养：将病毒活化液按照0.001MOI的接种量接种至宿主细胞液中，于温度37℃、pH 7.2、溶氧50%、搅拌速度45rpm的条件下培养72h，得到轮状病毒的病毒培养液。
下述实施例中涉及的缓冲液及其配置方法如下：
PBS缓冲液：先称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至7.2，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.01M、pH 7.2的PBS缓冲液。
实施例1：一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法
本实施例提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
载体分离：采用孔径为106μm的滤网（购自百帕斯公司）对生物反应器内的病毒培养液进行过滤，去除微载体，得到的病毒分离液；
病毒释放：采用压力破碎仪（购自永联生物科技(上海)有限公司，型号为UR-96），于破碎压力10bar、进液流速100mL/min下对病毒分离液中的宿主细胞进行破碎，使得轮状病毒从宿主细胞中释放，得到病毒收获液；
病毒澄清：采用高速冷冻离心机（购自日立公司，型号为CR22N），于固定离心力10000g、上样速度700mL/min、温度4℃下对病毒收获液进行连续流离心，去除病毒收获液中的细胞碎片和不溶性蛋白，得到病毒澄清液；
病毒灭活：按照体积比1：1000将β-丙内酯（购自SERVA公司）和病毒澄清液混合后，于4℃下孵育60h，对病毒澄清液中的轮状病毒进行灭活，得到病毒灭活液；
宿主DNA降解：在病毒灭活液中添加核酸酶（购自Merck KGaA公司）和氯化镁，使得病毒灭活液中核酸酶和氯化镁的终浓度分别为30U/mL和2mM后，于37℃下孵育4h，对病毒灭活液中的宿主DNA以及β-丙内酯进行降解，得到病毒降解液；
病毒浓缩：采用截留分子量300kD的超滤系统（购自密理博公司，型号为JMCDSPCONS），将病毒降解液浓缩至原体积的1/5后，加入PBS缓冲液稀释至原体积，并再次浓缩至原体积的1/5，重复此操作5次，最后一次浓缩将病毒降解液浓缩至原体积的1/10，得到病毒浓缩液；
病毒纯化：采用连续流超速离心机（购自ALFA WASSERMANN公司，型号为eKII），于初始蔗糖水溶液浓度60%（m/v，g/100mL）、固定离心力35000g、上样速度100mL/min、温度10℃下对病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗。
实施例2：一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法
本实施例提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述制备方法为：
在实施例1的基础上，将破碎压力替换为20bar。
实施例3：一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法
本实施例提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述制备方法为：
在实施例1的基础上，将破碎压力替换为60bar。
实验例1：细胞破碎方法对细胞破碎效果的影响
本实验例提供了细胞破碎方法及条件对细胞破碎效果的影响实验，实验过程如下：
实验一：在实施例1的基础上，将病毒释放步骤替换为：采用液氮（-196℃）和37℃恒温水浴锅（购自上海恒一精密仪器有限公司）对病毒分离液分别冻融1、2、3、4、5次，对病毒分离液中的宿主细胞进行破碎，使得轮状病毒从宿主细胞中释放，得到不同冻融次数下破碎得到的病毒收获液，其中，液氮处理20s，37℃恒温水浴锅处理90s。使用酶联免疫斑点法检测不同冻融次数下破碎得到的病毒收获液的病毒滴度，检测结果见图1。
实验二：在实施例1的基础上，将病毒释放步骤替换为：采用压力破碎仪（购自永联生物科技(上海)有限公司），分别于破碎压力10、30、60、90、120、200bar下对病毒分离液中的宿主细胞进行破碎，使得轮状病毒从宿主细胞中释放，得到不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液。使用酶联免疫斑点法检测不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液的病毒滴度，检测结果见图2。
实验三：在实施例1的基础上，将病毒释放步骤替换为：采用超声破碎仪（购自上海沪析实业有限公司），分别于超声功率60、120、240、480、720、960、1200W下对病毒分离液中的宿主细胞破碎60s，使得轮状病毒从宿主细胞中释放，得到不同破碎功率下破碎得到的病毒收获液。使用酶联免疫斑点法检测不同破碎功率下破碎得到的病毒收获液的病毒滴度，结果如图3所示。
实验一、二、三中所使用的酶联免疫斑点法参见文献：Paul H, Journal ofImmunological Methods 1982: 48:293。
由图1可知，随着冻融次数增加，宿主细胞破裂促进病毒释放，冻融2次和3次，病毒滴度均达到最高，随着冻融次数增加到4次和5次，病毒释放量不再增加，反复冻融对活病毒结构造成破环，导致病毒滴度逐渐下降，说明要使病毒充分释放，需要冻融2~3次，反复冻融操作繁琐，冻结和融化时间均需要较长时间，时间成本高。
由图2可知，在10~60bar破碎压力内，病毒滴度随着破碎压力先增大后降低，压力大于60bar后，随着破碎压力增大，病毒滴度不再发生明显变化，说明压力大于60bar后，病毒的释放和活病毒的破损达到平衡，因此，10~60bar为最佳破碎压力。
由图3可知，超声功率为60W时病毒滴度达到最高（7.83lgFFU/mL），但仍显著低于冻融破碎（8.0lgFFU/mL）和压力破碎（8.336lgFFU/mL）的最高水平，说明超声处理对宿主细胞的破碎效果不如冻融破碎和压力破碎，同时，随着超声功率增大，病毒滴度降低，说明超声处理对活病毒损坏作用较大，采用超声破碎容易影响病毒活性，另外，超声波探头面积需要与处理量成正比，大规模生产过程中等比放大工艺较难实现。
综合图1~3的结果，与冻融破碎相比，压力破碎步骤简单且可以连续进样，大大缩短操作时间，与超声波破碎相比，压力破碎不易破坏病毒活性且对宿主细胞的破碎效果更好，大大提高病毒收获液的质量，另外，压力破碎能够实现闭环化无菌操作且破碎条件稳定，更有助于实现规模化工业生产，因此，宜采用压力破碎对病毒分离液进行破碎处理，同时，应以10~60bar作为合适的破碎压力范围。
实验例2：压力破碎条件对细胞破碎效果的影响
本实验例提供了压力破碎条件及条件对细胞破碎效果的影响实验，实验过程如下：
在实施例1的基础上，将病毒释放步骤替换为：采用压力破碎仪（购自永联生物科技(上海)有限公司），控制进液流速为100mL/min，分别于破碎压力0、10、20、30、40、60bar下对病毒分离液中的宿主细胞进行破碎，得到不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液。使用电子显微镜观察不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液中宿主细胞的结构完整性，结果如图4所示。使用酶联免疫斑点法（参见文献：Paul H, Journal of Immunological Methods1982: 48:293）检测不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液的病毒滴度，结果如图5所示。使用Lowry法（参见《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0731 第二法）检测不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液的蛋白质含量，结果如图6所示。使用酶联免疫吸附法（Elisa法，参见《中华人民共和国药典》2020年版四部通则3429）检测不同破碎压力下破碎得到的病毒收获液的Vero细胞蛋白质含量，结果如图7所示。
由图4可知，破碎压力为10bar以上时，足够能将宿主细胞破碎以释放轮状病毒。
由图5可知，随着破碎压力增大，病毒收获液的病毒滴度增加，30bar时病毒滴度达到最大值，随后病毒滴度逐渐下降。
由图6~7可知，随着破碎压力增大，病毒收获液中总蛋白含量增大，宿主蛋白含量先减少，后增多，说明随着破碎压力进一步增大，宿主蛋白以可溶形式存在病毒分离液中，离心澄清不能将宿主蛋白除去，所以宿主蛋白含量逐渐升高。
综合图4~7的结果，宜采用10~60bar的破碎压力对病毒分离液进行破碎处理，同时，应以30bar作为最佳破碎压力。
实验例3：微载体分离对轮状病毒灭活疫苗制备的影响
本实验例提供了微载体分离对轮状病毒灭活疫苗制备的影响实验，实验过程如下：
在实验例1的基础上，不经载体分离，直接将轮状病毒的病毒培养液进行实验二和实验三的破碎处理，得到经不同破碎方法处理的病毒收获液。使用电子显微镜观察经不同破碎方法处理的病毒收获液中微载体的完整性，结果如图8所示。
由图8可知，不同破碎方法都会不同程度的影响微载体的完整性，造成一定风险。将病毒培养液经载体分离后再进行破碎处理可有效避免微载体在此过程中发生破碎，进而防止向病毒液中引入葡聚糖颗粒等微载体结构成分形成的杂质，给病毒澄清、纯化造成压力，并且，可有效避免纯化后还未除去的葡聚糖颗粒等微载体结构成分形成的杂质对轮状病毒灭活疫苗的安全性造成风险。
实验例4：离心条件对澄清效果的影响
本实验例提供了离心条件对澄清效果的影响实验，实验过程如下：
在实施例1的基础上，将病毒澄清步骤替换为：采用离心机（购自日立公司，型号为CR22N），分别于离心力0、6000、8000、10000、12000、14000g下对病毒收获液离心3min，去除病毒收获液中的细胞碎片和不溶性蛋白，得到不同离心力下离心得到的病毒澄清液。使用酶联免疫斑点法检测不同离心力下离心得到的病毒澄清液的病毒滴度，结果如图9所示。使用台盼蓝对不同离心力下离心得到的病毒澄清液染色（将台盼蓝和病毒澄清液按照体积比1：100混合后，于室温25℃下孵育20min）后，使用电子显微镜检观察不同离心力下离心得到的病毒澄清液的可视颗粒物含量，结果如图10所示。
由图9可知，在12000g离心力范围内，病毒滴度差异不显著，说明12000g以内的离心力不会破环轮状病毒结构完整性。
由图10可知，8000g及以上离心力处理样品后，病毒澄清液中仅存在少量镜下可视颗粒物。
综合图9~10的结果，采用8000~12000g离心3min可以在不影响病毒滴度的情况下有效去除病毒收获液中的颗粒物。
实验例5：离心条件对纯化效果的影响
本实验例提供了离心条件对纯化效果的影响实验，实验过程如下：
实验一：在实施例1的基础上，将病毒纯化步骤替换为：采用管式蔗糖密度梯度离心对病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗，其中，管式蔗糖密度梯度离心为：使用10mL注射器从38mL离心管的管底依次加入20%（m/v，g/100mL）蔗糖水溶液4mL、30%蔗糖水溶液6mL、40%蔗糖水溶液10mL、50%蔗糖水溶液9mL、60%蔗糖水溶液5mL制备蔗糖梯度，然后在离心管最上层加入病毒浓缩液4.5mL，再将离心管用超速冷冻离心机（购自贝克曼库尔特公司），于32Ti转子、转速30000rpm（离心力153700g）下离心4h，对病毒浓缩液进行纯化，离心结束后，对样品在不同浓度蔗糖界面分布情况进行拍照，结果如图11所示。分别用移液枪吸取三个界面的样品，混匀后分别取50μL，加入10μL Loading Buffer，100℃沸水浴10min后在15孔SDS-PAGE凝胶上样，每孔上样12μL，电压100V进行电泳100min，对不同蔗糖浓度界面样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图12所示，图12中，从左到右依次为标准蛋白Marker、纯化前病毒浓缩液、0~30%蔗糖界面样品、30~40%蔗糖界面样品、40~50%蔗糖界面样品。对不同蔗糖浓度界面样品进行Western Blot，结果如图13所示，Western Blot中，一抗用1：2000兔抗VP6（购自金斯瑞公司）37℃、35rpm下孵育2h，二抗用1：3000 HRP-羊抗兔37℃、35rpm下孵育1h。
实验二：在实验一的基础上，使用连续流超高速离心机（购自ALFA WASSERMANN公司，K3 Super G转子，体积3200mL）对轮状病毒浓缩液进行连续流蔗糖密度梯度离心，其中，所述连续流蔗糖密度梯度离心为：用60%（m/v，g/100mL）蔗糖水溶液作为初始糖浓度制备连续蔗糖浓度梯度，转速设置为35000rpm，上样流速设置为100mL/min，将病毒浓缩液上样，上样结束后，，收样，并用糖度仪（购自ATAGO公司，型号为RX-000i）检测。收集样品的蔗糖浓度梯度趋势如图14所示。为了确定病毒在分管收集样品中的分布范围，使用SDS-PAGE检测20、25、30、35、40、45、50样品中蛋白分布情况，结果如图15所示。将25~45样品合并后混匀，检测轮状病毒抗原含量（采用ELISA法，参见文献：《中华人民共和国药典》2020年版 四部通则3429，所用ELISA试剂盒购自迪信泰公司）、蛋白质含量（采用lowry法，参见文献：《中华人民共和国药典》2020年版 四部通则0731 第二法）、Vero细胞蛋白质含量（采用ELISA法，参见文献：《中华人民共和国药典》2020年版 四部通则3429，所用ELISA试剂盒购自上海小天鹅衣诺科技有限公司）、宿主DNA含量（采用荧光定量PCR法，参见文献：《中华人民共和国药典》2020年版 四部通则3407第三法，所用荧光定量PCR试剂盒购自湖州申科生物技术有限公司试剂盒购自湖州申科生物技术有限公司）、牛血清白蛋白残留量（采用ELISA法，参见文献：《中华人民共和国药典》2020年版 四部通则3411，所用ELISA试剂盒购自无锡博生医用生物技术开发有限公司）、胰酶残留量（采用ELISA法，参见文献：《中华人民共和国药典》2020年版 四部通则3411，所用ELISA试剂盒购自上海雅心生物技术有限公司）、硫酸庆大霉素残留量（采用ELISA法，参见文献：《中华人民共和国药典》2020年版 四部通则3429，所用ELISA试剂盒购自北京勤邦生物技术有限公司），评估纯化前后杂质去除率以及抗原回收率，结果如表1所示，表1中，NA是指未检出。
由图11可知，病毒浓缩液经管式蔗糖密度梯度离心以后，可见三条蛋白带，分别位于0~30%、30~40%、40~50%蔗糖交界面。
由图12可知，蔗糖密度梯度离心对病毒浓缩液有显著纯化效果，0~30%蔗糖界面样品包含10~250kD蛋白，其中，50~75kD分子量的蛋白含量最多，说明0~30%蔗糖之间主要分布的是宿主蛋白等杂蛋白，30~40%蔗糖界面、40~50%蔗糖界面能看到明显的轮状病毒特征条带（VP1:125kD；VP2:102kD；VP3/VP4：87~88kD；VP6:45kD；VP7:34/38kD），说明蔗糖密度梯度离心时，轮状病毒主要位于30~50%蔗糖浓度范围内。
由图13可知，0~30%蔗糖含有微量VP6蛋白，30~40%蔗糖含有大量VP6蛋白，40~50%含有少量VP6蛋白，进一步佐证轮状病毒主要位于30~50%蔗糖浓度范围内。
由图14可知，蔗糖浓度梯度从60%（m/v，g/100mL）降低至0%。
由图15可知，25~45管内样品蛋白分布跟轮状病毒阳性样品蛋白分布一致，可看到明显的轮状病毒特征条带，说明连续流蔗糖密度梯度离心后，轮状病毒主要分布在25~45管之间的蔗糖浓度区间内，结合图14可以确定轮状病毒主要分布在55.58~25.79%（m/v，g/100mL）之间的蔗糖区间内。流穿液未检出病毒特征条带，说明在上样过程中，病毒均进入蔗糖中，未出现流穿现象。
由表1可知，连续流蔗糖密度梯度离心对轮状病毒浓缩液进行纯化后，各项杂质去除率均大于99%，抗原回收率为42.19%。
表1 轮状病毒连续流蔗糖密度梯度离心样品杂质残留去除率及抗原回收率
Figure 411923DEST_PATH_IMAGE001
实验例6：降解条件对宿主DNA降解效果的影响
本实验例提供了降解条件对宿主DNA降解效果的影响实验，实验过程如下：
实验一：在实施例1的基础上，将宿主DNA降解步骤替换为：在病毒灭活液中添加氯化镁，使得病毒灭活液中氯化镁的终浓度为2mM后，继续添加核酸酶，使得病毒灭活液中核酸酶的终浓度分别为0、10、20、40U/mL，于37℃下孵育4h，对病毒灭活液中的宿主DNA以及β-丙内酯进行降解，得到不同核酸酶使用浓度下得到的病毒降解液。使用Vero细胞宿主DNA荧光定量PCR检测试剂盒（购自湖州申科公司）检测不同核酸酶使用浓度下得到的病毒降解液中宿主DNA的残留情况，结果如图16所示。
实验二：在实施例1的基础上，将宿主DNA降解步骤替换为：在病毒灭活液中添加核酸酶和氯化镁，使得病毒灭活液中核酸酶和氯化镁的终浓度分别为10U/mL和2mM后，于37℃下分别孵育0.5、1.0、2.0、4.0h，对病毒灭活液中的宿主DNA以及β-丙内酯进行降解，得到不同核酸酶使用时间下得到的病毒降解液。使用Vero细胞宿主DNA荧光定量PCR检测试剂盒（购自湖州申科公司）检测不同核酸酶使用时间下得到的病毒降解液中宿主DNA的残留情况，结果如图17所示。
由图16可知，孵育4h，10、20、40U/mL的核酸酶对宿主DNA的降解效果相当，从节省成本以及保证降解效果充分的角度考虑，选择30U/mL。
由图17可知，30U/mL核酸酶孵育2h、4h效果相当，为了保证批次间的稳定性，适当延长时间，以3h为宜。
实验例7：降解时机对宿主DNA降解效果的影响
本实验例提供了降解时机对宿主DNA降解效果的影响实验，实验过程如下：
在实施例1的基础上，将宿主DNA降解步骤替换为：在灭活步骤前进行、在纯化步骤前进行。使用Vero细胞宿主DNA荧光定量PCR检测试剂盒（购自湖州申科公司）分别检测不同核酸酶使用时机下得到的病毒降解液中宿主DNA的残留情况，结果如图18所示。
由图18可知，宿主DNA降解在灭活步骤前进行和在浓缩步骤前进行对宿主DNA的降解效果相当，但在纯化步骤前进行会显著降低宿主DNA的降解效果。在此基础上，结合整个工艺流程，考虑到β-丙内酯需要37℃水解，因此，在浓缩步骤所得病毒灭活液中加入核酸酶降解，与β-丙内酯水解同时进行，更节省时间。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
病毒释放：将轮状病毒的病毒培养液进行宿主细胞破碎，得到病毒收获液；
病毒澄清：将病毒收获液进行澄清，得到病毒澄清液；
病毒灭活：将病毒澄清液进行灭活，得到病毒灭活液；
宿主DNA降解：在病毒灭活液中添加核酸酶和氯化镁对病毒灭活液中的宿主DNA进行降解，得到病毒降解液；
病毒浓缩：将病毒降解液进行浓缩，得到病毒浓缩液；
病毒纯化：将病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗；
或者，所述制备方法包括如下步骤：
病毒释放：将轮状病毒的病毒培养液进行宿主细胞破碎，得到病毒收获液；
病毒澄清：将病毒收获液进行澄清，得到病毒澄清液；
宿主DNA降解：在病毒澄清液中添加核酸酶和氯化镁对病毒澄清液中的宿主DNA进行降解，得到病毒降解液；
病毒灭活：将病毒降解液进行灭活，得到病毒灭活液；
病毒浓缩：将病毒灭活液进行浓缩，得到病毒浓缩液；
病毒纯化：将病毒浓缩液进行纯化，得到轮状病毒灭活疫苗；
所述破碎采用压力破碎；所述压力破碎的条件为：破碎压力10~60bar、进液流速50~300mL/min；
所述纯化采用连续流蔗糖密度梯度离心；所述连续流蔗糖密度梯度离心的条件为：初始蔗糖溶液浓度60g/100mL、固定离心力20000~40000g、上样速度90~150mL/min、温度4~15℃；
所述澄清采用连续流离心；所述连续流离心的条件为：固定离心力8000~12000g、上样速度600~800mL/min、温度2~8℃；
所述降解的条件为：温度37℃、时间4h；
病毒释放前，所述方法还包括微载体分离步骤；所述微载体分离为：将轮状病毒的病毒培养液进行过滤，得到去除微载体的病毒培养液；
所述分离为：采用滤网进行过滤；所述滤网的孔径为106μm。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭活为：按照体积比1：500~2000将β-丙内酯和病毒澄清液混合后，于2~8℃下孵育48~72h；或者，所述灭活为：按照体积比1：500~2000将β-丙内酯和病毒降解液混合后，于2~8℃下孵育48~72h。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸酶在病毒灭活液中的添加量为5~100U/mL；或者，所述核酸酶在病毒澄清液中的添加量为5~100U/mL。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氯化镁在病毒灭活液中的添加量为0.5~10mM；或者，所述氯化镁在病毒澄清液中的添加量为0.5~10mM。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将病毒降解液浓缩至原体积的1/5~1/20。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩为：采用截留分子量100~300KD的超滤系统将病毒降解液浓缩至原体积的1/4~1/6后，加入pH 7.0~7.4、浓度0.005~0.1M的缓冲液稀释至原体积，并再次浓缩至原体积的1/4~1/6，重复此操作4~7次，最后一次浓缩将病毒降解液浓缩至原体积的1/5~1/20。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液、MPB缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述轮状病毒的病毒培养液的制备方法包括如下步骤：
宿主细胞制备：将Vero细胞用细胞生长液配置成细胞密度为1.5×106~2.5×106个/mL的细胞悬液后，取1~2L细胞悬液添加至含有8~9L细胞生长液和30~50g微载体的9~11L生物反应器内，于温度36~38℃、pH 7.0~7.4、溶氧45~55%、搅拌速度30~60rpm的条件下培养18~24h；培养结束后，使用细胞生长液对生物反应器内的Vero细胞进行灌流，使得细胞生长液中的葡萄糖含量不低于2g/L，连续灌流110~130h，共灌流9~11L细胞生长液，直至Vero细胞长满微载体；所述细胞生长液由占细胞生长液总体积93~95%的DMEM培养基、占细胞生长液总体积3~5%的牛血清白蛋白、占细胞生长液总体积0.04~0.06%的十万IU/mL硫酸庆大霉素溶液、占细胞生长液总体积0.9~1.1%的3g/100mL L-谷氨酰胺溶液和占细胞生长液总体积0.9~1.1%的7.53g/100mL碳酸氢钠溶液组成；
宿主细胞灌洗：灌流结束后，在生物反应器内导入9~11L灌洗液；导入结束后，关闭生物反应器，使得生物反应器内的微载体自然沉降20~30min；沉降结束后，排出生物反应器内的灌洗液，并在生物反应器内再次导入9~11L灌洗液；再次导入结束后，打开生物反应器5~15min，使得生物反应器内的微载体重新悬浮；重新悬浮结束后，关闭生物反应器，使得生物反应器内的微载体再次自然沉降20~30min；再次自然沉降结束后，排出生物反应器内的灌洗液；以上述过程作为一次完整的灌洗，重复灌洗4~6次；灌洗结束后，在生物反应器内导入9~11L细胞维持液，得到宿主细胞液；所述灌洗液由占灌洗液总体积97.8~98.2%的PBS缓冲液、占灌洗液总体积0.9~1.1%的3g/100mL L-谷氨酰胺溶液和占灌洗液总体积0.9~1.1%的7.53g/100mL碳酸氢钠溶液组成；所述细胞维持液由占细胞维持液总体积97.69~98.11%的DMEM培养基、占细胞维持液总体积0.9~1.1%的3g/100mL L-谷氨酰胺溶液、占细胞维持液总体积0.9~1.1%的7.53g/100mL碳酸氢钠溶液和占细胞维持液总体积0.09~0.11%的0.6g/100mL胰酶溶液组成；
病毒活化：取轮状病毒CDC-9株的病毒液1~3mL，在病毒液中加入终浓度9~11μg/mL的胰酶和终浓度为750~850μg/mL的氯化钙后，于36~38℃水浴锅活化1~3h，得到病毒活化液；
病毒培养：将病毒活化液按照0.001~0.01MOI的接种量接种至宿主细胞液中，于温度36~38℃、pH 7.0~7.4、溶氧45~55%、搅拌速度30~60rpm的条件下培养60~72h，得到轮状病毒的病毒培养液。
9.一种轮状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述轮状病毒灭活疫苗由权利要求1~8任一项所述的制备方法制得。
10.权利要求1~8任一项所述的制备方法在制备轮状病毒灭活疫苗中的应用。
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