CN110170048A - 一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法,所述方法步骤如下:1)生产细胞复苏,细胞增殖培养;2)扩增培养;3)加入细胞生长液,细胞使用胰酶进行消化,平行培养;4)细胞表面清洗;5)利用胰酶对于即将接种轮状病毒进行活化;6)将活化的轮状病毒接种到生产细胞,添加培养基培养;7)收获病毒液,离心,取上清液;8)超滤浓缩;9)层析,离子交换;10)甲醛灭活;11)添加氢氧化铝佐剂配制疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗的制备,特别涉及轮状病毒各血清型,利用生物反应器,大规模生产疫苗的方法,更具体地说,本发明涉及采用针对轮状病毒特性的生物反应器病毒培养方法、纯化方法,进而制备单价或多价灭活疫苗的方法,病毒具有较好的交叉保护原性。
技术背景
轮状病毒(Rotavirus,简称RV)属呼肠弧病毒科(Reoviridae),轮状病毒属。病毒体的核心为双股RNA,由11个不连续的RNA节段组成。与RV抗原有关的主要结构蛋白有VP4、VP6、VP7。根据内壳结构蛋白VP6抗原性的不同,目前将RV分为A-G七个群。其中最常见的是A群。A群也是主要引起婴幼儿腹泻的主要病原之一。轮状病毒的外壳结构蛋白VP4、VP7具有抗原活性,刺激机体产生中和抗体。VP7为糖蛋白或G蛋白,依其抗原性不同区分的血清型称为G型,至少有14个G血清型;VP4为蛋白酶敏感蛋白或P蛋白,按其抗原性区分的血清型称为P型,至少有21个P血清型。
轮状病毒感染主要是通过粪-口途径传播,也可以通过空气-飞沫等呼吸道传播,婴幼儿饮用或食用被轮状病毒感染的婴幼儿无论其是否有明显的症状均是主要的传染源,其粪便中可检测到大量轮状病毒的存在。此外,被轮状病毒污染的水或食物等也是传染源之一。轮状病毒主要感染5岁以下的婴幼儿,6月龄-2岁为轮状病毒感染的高峰,其中40%小于1岁。5岁以前,几乎所有的孩子都曾感染过轮状病毒。轮状病毒感染对婴幼儿健康有着密切的影响,在我国轮状病毒感染相关的发病率仍很高,我国每年有1210万例轮状病毒腹泻发生,导致共计350万例轮状病毒感染相关的门诊病例,22万例儿科住院治疗病例,住院时间从2~43d,中位数为7d,由此导致严重的经济负担,熊良恩等对深圳市龙岗区幼儿轮状病毒腹泻经济负责调查显示,平均每名患儿为3415元。此外,轮状病毒腹泻影响儿童的行为如睡眠减少、饮食减少以及情感的变化等,这对父母或看护人员的生活质量也有很大影响。总之,在我国轮状病毒感染导致较高的发病率和死亡率,造成经济负担,如在国家免疫计划中纳入一耐受良好且有效的轮状病毒疫苗,将大大减轻轮状病毒感染导致的疾病负担。
轮状病毒的疫苗主要以口服疫苗为主,其研究始于20世纪70年代中期。Rotashield(惠氏公司研发)为世界上第一个研发成功的多价重配口服活疫苗,该疫苗在美国、芬兰、委内瑞拉等国的试验保护率均较高,可达80%-100%,对于预防严重的轮状病毒腹泻起到了很好的效果。但当该疫苗在美国600000名婴幼儿中接种后,很快就发现有婴幼儿出现肠套叠现象,尤其是在接种第一剂后的3-10天。虽然接种疫苗与肠套叠的相关性存在较大争议,为安全起见,FDA在该疫苗上市仅14个月后就从市场上撤回了该疫苗。随后,Merck公司研制了一种人-牛(WC3)重配口服减毒五价活疫苗RotaTeq。在11个国家70000多名婴幼儿中进行了大规模的III期临床试验,主要关注其对轮状病毒感染的保护效果及肠套叠风险。另一种口服活疫苗Rotarix由葛兰素史克(GSK)公司开发并于2004年在墨西哥和多米尼加获批,该毒株是流行最广泛的G1P血清型,Rotarix疫苗现已获得90多个国家的批准。
兰州生物制品研究所研制的口服轮状病毒减毒活疫苗罗特威,采用LLR(Lanzhou lambrotavirus)弱毒株。由于罗威特疫苗未进行大规模的免疫保护效果试验,因此其未得到世界范围的认可,只能在中国范围内使用。
随着基因工程技术的发展,关于轮状病毒的基因工程疫苗也开始被研究者们所关注,目前基因工程疫苗仍在临床前研究阶段。基因工程疫苗的主要研究方向包括病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP)疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗和重组抗原疫苗等,其中最受重视的是VLP疫苗。
目前国内外上市的轮状病毒疫苗均为减毒活疫苗,即通过口服途径进行免疫,但存在病毒毒力返祖、在低收入国家保护率低(低至30%),免疫后造成排毒,在环境中容易引起毒株的重组和变异,尤其在婴儿免疫过程中,诱发肠套叠问题(免疫时间段正处于婴儿肠道发育期),使得研制安全有效的轮状病毒灭活疫苗成为一种趋势。
轮状病毒具有免疫原性的最主要的蛋白为VP4和VP7,在生产疫苗过程中,用胰酶对病毒进行激活,使其更容易在宿主细胞上进行增殖,胰酶在激活病毒的同时,又对宿主细胞造成最小伤害,成为大规模培养的主要技术难点。另外在纯化过程中,如何不破坏病毒结构,又能将疫苗的宿主DNA残留、宿主蛋白残留降到质量标准以下,是大规模生产灭活疫苗的主要瓶颈。
现有采用Vero细胞做为病毒生产基质用于制备疫苗的方法主要有:Vero细胞是目前被批准用于人用疫苗生产的常用细胞基质,其在一定范围(低于150代)安全性被广泛证明和认可。以vero细胞为细胞基质的疫苗,多采用生物反应器进行生产。因目前口服疫苗的毒株都是通过重配或重组而获得的致弱毒株,因此在细胞培养上较为简单。上市的三个口服疫苗,生产工艺各有不同,国内兰州所使用的为牛肾原代细胞培养,英国GSK生产的Rotarix和美国默沙东公司的RotaTeq分别使用vero细胞,但工艺不详。
轮状病毒灭活疫苗多采用具有较好免疫原性、同时传代仍然能保持基因稳定性的毒株,因此相对于口服疫苗的重组致弱毒株,灭活疫苗生产用毒株毒力较强,近年在国际、国内灭活疫苗的研发进程较为缓慢。文献所示全病毒灭活轮状病毒疫苗临床前研究工作,都是在转瓶工艺上生产。已知国内一家灭活轮状病毒疫苗提交临床申请,但就细胞培养工艺仍因病毒滴度的受限,采用转瓶技术进行病毒培养。目前使用生物反应器开展轮状病毒灭活疫苗生产的还属空白。
本发明在现有技术的基础上,提供一种灭活轮状病毒进行分离纯化和灭活后通过肌肉注射进行免疫的疫苗,避免了轮状病毒与胃肠道的接触,规避了消化道免疫可能存在的风险,同时不存在排毒风险,避免了环境中病毒的传播和重组。如果能够研制成功具有良好免疫原性和交叉保护效果的轮状病毒灭活疫苗,将有效降低由于母源抗体、外部环境等引起的不同地区的保护效果差异,且能给予婴幼儿更加安全有效的针对轮状病毒感染的保护,为预防婴幼儿轮状病毒感染引起的腹泻及肠胃炎等提供有效保障。
本发明轮状病毒培养是采用Vero细胞做为病毒生产基质。Vero细胞是WHO准予使用的人用疫苗生产基质,微载体生物反应器工艺取代转瓶培养工艺是目前的趋势,微载体生物反应器培养Vero细胞具有密度高,规模大,费用低,减少污染等特点。当接种病毒后,收获的病毒液具有总量大、批间差异小、病毒液滴度稳定、抗原含量高等优点。
发明内容
本发明为了克服轮状病毒疫苗在生物反应器上大规模培养方法的缺陷,提供一种应用生物反应器工业化生产人用轮状病毒灭活疫苗的方法,其优点是可以繁殖较高病毒滴度的轮状病毒抗原;纯化后的灭活病毒与佐剂混合免疫小鼠,采集小鼠血清,用ELISA方法检测轮状特异性抗体,对于不同轮状病毒毒株(G1、G2、G3、G4、G6、G9)中和滴度最高可达1:2048-1:16384。
本发明的具体技术方案如下:
一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法,所述方法包括以下步骤:
1)生产细胞复苏,在方瓶、转瓶进行细胞增殖培养;
2)将传代的生产细胞从转瓶中消化后,接种至生物反应器中,利用微载体进行扩增培养;
3)转接之前,将微载体和生物反应器经灭菌后,加入细胞生长液,将反应器调制合适参数运转;
3)细胞使用胰酶进行消化,进行逐级放大方式,如10L~40L~70L~150L,或采用10L~40L~70L逐级放大,之后平行3~4个70L进行平行培养;
4)接种病毒前对于微载体细胞用无血清培养基通过灌流方式进行细胞表面清洗;
5)利用一定浓度的胰酶对于即将接种轮状病毒进行活化;
6)将活化的轮状病毒接种到清洗后的生产细胞,孵育吸附后,添加培养基培养;
7)培养3-5d,收获病毒液,反复冻融三次,离心去除微载体,取上清液;
8)对上清液进行超滤浓缩;
9)利用Capto core 700填料进行层析,之后利用Q Sepharose Fast Flow(QFF)进行离子交换,以达到去除杂蛋白的纯化效果;
10)将层析收获液经一定比例甲醛灭活4-6天后,除去甲醛;
11)添加氢氧化铝佐剂配制疫苗。
本发明所述的方法,其中,病毒的接种量为0.001~0.1MOI。
其中,病毒活化方法是/ml胰蛋白酶,37℃水浴, 小时,活化后接种轮状病毒并吸附1~2小时,吸附液所需胰蛋白酶浓度是/ml,病毒维持液所需胰蛋白酶浓度是10~40μg/ml,由于轮状病毒的特性,在反应器微载体接种病毒的过程中的活化、吸附和维持阶段都需要加入胰蛋白酶、CaCl2,用以激活轮状病毒,所以反应器接毒的时候应尽量除去血清,以免影响胰蛋白酶活性。
其中,所述的微载体为Cytodex1,微载体的密度为10~20g/L。
其中,生物反应器的细胞培养采用灌流培养的方式,灌流的速率根据细胞的密度为每天个工作体积,接种病毒后停止灌流直至收获病毒液。
其中,所述的澄清的轮状病毒收获液经截流分子量为的切向流系统进行超滤浓缩倍,得到病毒浓缩液。
其中,轮状病毒浓缩液,通过装填有新型复合填料Capto Core 700的层析柱内,收集流穿峰。
其中,得到的轮状病毒通过加入装填有Q Sepharose Fast Flow填料的层析柱内,收集第一个洗脱峰,此峰为目的蛋白峰。
其中,对得到的抗原蛋白进行甲醛灭活,按甲醛溶液∶样品(V/V)=1∶1600~1∶800的比例加入甲醛溶液,置于双层振荡培养箱内,温度:37±1℃,转速:100~120rpm,灭活2-6天。
其中,将纯化的灭活病毒与佐剂混合免疫试验小鼠,采集动物血清,用微量血清中和试验检测轮状病毒特异性中和抗体,对于不同轮状病毒毒株(G1、G2、G3、G4、G9)中和滴度最高可达1:最低达到1:2048。
本发明的核心内容包括:
病毒激活方式、病毒接种及吸附时间、微载体密度、QFF纯化工艺参数;甲醛灭活浓度及时间等。
细胞培养及病毒增殖、收获:生产细胞的复苏、传代,初期利用转瓶进行细胞增殖培养,当细胞量适于转接相应体积反应器时,开始将微载体和生物反应器灭菌后,加入细胞生长液,调节反应器参数进行微载体运转1天;然后将传代的生产细胞从转瓶消化下来后,转接于微载体生物反应器中扩增培养;其逐级方法方式为10L~40L~70L~150L逐级放大的培养模式,或采用10L~40L~70L逐级放大,之后平行3~4个70L进行平行培养。
当细胞生长3-5天,细胞密度达到,准备接种病毒。接种病毒前清洗细胞表面;使用胰酶活化轮状病毒;接种细胞,通过孵育吸附后,添加培养基培养4-6天,收获病毒液,反复冻融三次,离心去处微载体,收取上清液。
病毒滴定检测:将毒种做10倍系列稀释,取4个稀释度,分别接种MA104细胞,置37℃培养4~6天,冻融三次后判定结果。病毒滴度应不低于1.0×107lgCClD50/ml。
收获液纯化
将收获液进行离心,除去碎片,之后经截流分子量为300KD的切向流系统进行超滤浓缩5~10倍,得到病毒浓缩液;将得到的轮状病毒浓缩液,用20mM PB为缓冲液,以56cm/h的流速将样品加入装填有新型复合填料Capto Core 700的层析柱内,进行凝胶过滤层析,收集流穿峰(附图1)。将层析得到的轮状病毒液,用20mM PB(pH=6.7)作为缓冲液,以4cm/h的流速将样品加入装填有Sepharose Fast Flow填料的层析柱内,上样结束后继续用20mM PB缓冲液(pH=6.7)平衡,待UV280基线稳定后用20mM PB+0.50M NaCl进行洗脱,收集第一个洗脱峰,此峰为目的蛋白峰(附图2)。
将纯化前、经Capto Core 700纯化样品和经Q Sepharose Fast Flow纯化的样品使用聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度检测。分别用12%分离胶和5%浓缩胶进行电泳,检测纯化效果(附图3)。
由附图3可见,经由该纯化工艺纯化的样品,经Capto Core 700纯化后能去除部分杂质,经Q Sepharose Fast Flow纯化后能去除大部分杂质,两步纯化后样品纯度较高,且三层轮状病毒颗粒中的主要病毒蛋白VP2、VP6、VP7均可见。
利用电镜图像观察纯化后轮状病毒颗粒形状。将经该工艺纯化后的样品进行透射电镜观察,见附图4。由附图4可见,经该工艺纯化的轮状病毒能够保留完整的三层病毒颗粒结构。使用天根生化科技有限公司的“RNA提取试剂盒”提取纯化前后轮状病毒样品中的RNA,并通过RNA-PAGE进行病毒的基因组分析,附图5。由附图5,可见,纯化前后轮状病毒的基因组保持稳定,均可见11条基因组,且分布均为4∶2∶3∶2型。
检测纯化后杂蛋白去除率、抗原回收率如下(以10L反应器为例):
原液灭活及成品配制
病毒的灭活:按甲醛溶液∶样品(V/V)=1∶800的比例加入甲醛溶液,使甲醛终浓度为500μg/mL,置于双层振荡培养箱内,温度:37±1℃,转速:110rpm,灭活4天。
超滤除甲醛:用100KD超滤膜包将甲醛灭活液浓缩10倍,补加4倍体积5mmol/L PB+0.85%NaCl溶液超滤3遍,用0.2μm过滤除菌,即为原液。配制:将原液稀释至适当浓度,加入等体积氢氧化铝佐剂,置于2~8℃。
本发明的灭活轮状病毒疫苗的制备方法,所得疫苗各类检测指标如下:
轮状病毒原液检测指标:
蛋白质含量:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)进行检定,制定标准要求蛋白质含量应不低于20μg/ml。
抗原含量:参照《轮状病毒灭活疫苗制造及检定规程》进行检定,制定标准要求抗原含量不低于20000U/ml。
牛血清白蛋白残留量:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)进行检定,制定标准要求牛血清白蛋白残留量应不高于50ng/剂。使用“定量检测牛血清白蛋白酶联免疫试剂盒”按照说明书进行。检测结果为纯化后蛋白中含有12.92ng,低于国家限量标准。
Vero细胞DNA残留量:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)通则107“外源性DNA残留量测定法(DNA探针杂交法)”进行检定,标准要求Vero细胞DNA残留量应不高于100pg/剂。结果见附图6。由附图6可见,经两步纯化后纯化样品中的外源性DNA残留量约为20pg/剂量,低于国家限量标准。
Vero细胞蛋白质残留量:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)进行检定,制定标准要求Vero细胞蛋白质残留量应不高于100ng/剂。
病毒灭活验证:参照《轮状病毒灭活疫苗制造及检定规程》,取灭活后的病毒液接种MA104细胞,连续盲传三代,每7天为1代,每代以酶联免疫法检查病毒,制定标准要求盲传三代检定结果均应为阴性。
轮状病毒灭活疫苗成品检测指标:
外观:参照《轮状病毒灭活疫苗制造及检定规程》,制定标准要求成品疫苗外观应为微乳白色混悬液体,久置形成可摇散的沉淀,无异物。渗透压摩尔浓度:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)进行检定,制定标准要求渗透压摩尔浓度应为280mOsmol/kg±65mOsmol/kg。
pH值:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)进行检定,制定标准要求pH应为5.5-6.5。
铝含量:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)进行检定,制定标准要求铝含量应为0.55~0.65mg/ml。
游离甲醛含量:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)进行检定,制定标准要求游离甲醛含量应不高于20μg/ml。
细菌内毒素检查:参照《中华人民共和国药典》(2015年版,三部)进行检定,制定标准要求细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
解离后抗原含量:参照《轮状病毒灭活疫苗制造及检定规程》,采用酶联免疫法检查,解离后轮状病毒抗原含量应不低于4000U/剂。
免疫原性:参照《轮状病毒灭活疫苗制造及检定规程》,腹腔注射6~8周龄Balb/c小鼠,注射剂量为0.5ml/只,免疫针次为3针,免疫程序为第二针次间隔3周,第三针次间隔2周,分别于免疫前和免疫后14天采血,检测血清中和抗体,免疫后抗体4倍阳转率应不低于90%。综合以上结果,采用本发明,利用逐级放大,在生物反应器进行适应轮状病毒其病毒特性的接毒培养;对病毒收获液进行超滤、层析,以及离子交换的纯化方法,可以得到纯度较高,结构完整、免疫原性较好的人源轮状病毒,且病毒的基因组带型较稳定。表明本发明的培养及纯化方法,可以达到较为理想的大规模生产灭活轮状病毒疫苗,且由于操作简便,方便线性放大,适用于工业化规模化生产。
本发明最优选的核心技术方案如下:
病毒激活浓度:10μg/ml 0.25%胰蛋白酶;
病毒接种及吸附时间:病毒活化0.5h后接种细胞,静置吸附2小时后添加培养基;
微载体浓度:20g/L;
灌流体积:第一、二天灌流体积为0.5/天;第三、四天灌流体积为2/天;
收获液冻融次数:3次;
Q Sepharose Fast Flow纯化缓冲液:20mM PB(pH=6.7)缓冲液平衡QFF层析柱后开始上样,上样结束后用20mM PB+0.50M NaCl进行洗脱,收集第一个洗脱峰;
甲醛灭活浓度及时间:按甲醛溶液∶样品(V/V)=1∶800的比例加入甲醛溶液,使甲醛终浓度为500μg/mL,37±1℃灭活4天。
本发明最优选的核心技术方案是经过筛选获得的,筛选过程如下:
病毒激活所所使用的胰酶浓度筛选:分别对病毒活化采用5、10、15、20、25ug/ml0.25%胰蛋白酶,37℃水浴,分别选择0.5、1小时进行活化。后接种轮状病毒并吸附1、2小时,通过不同的组合参数,收集病毒液,测定病毒滴度抗原含量。其中最优的组合为:25μg/ml 0.25%胰蛋白酶0.5小时,吸附2小时,病毒滴度最高。
微载体使用的密度:选用Cytodex1微载体,分别选用密度为15、20、25g/L,进行微载体Vero细胞贴壁培养,绘制细胞数量的生长曲线,在4天之后,接毒培养,3天后收获病毒液,测定病毒滴度及抗原含量。比较三个微载体浓度,其中20g/L培养的病毒滴度及抗原含量较高。
QFF缓冲液摸索:分别选用15%、35%和50%三种不同洗脱浓度的缓冲液进行洗脱,收集洗脱峰,比较不同洗脱峰的抗原回收率及DNA残留量,结果表明,50%洗脱浓度(即20mMPB+0.50M NaCl溶液)收集的洗脱液抗原回收率最高,DNA残留量最低,基线分离效果最好。甲醛灭活浓度及时间:分别选用1∶1600和1∶800,分别灭活1~7天,对于灭活样品进行灭活验证,同时对于抗原回收率以及免疫原性进行比对,发现1∶800能够在4天彻底灭活,并且不影响抗原的免疫原性。
以下通过对比实验数据进一步说明本发明的有益效果:
附图说明:
附图1:Capto Core 700纯化峰谱图
附图2:Q Sepharose Fast Flow纯化峰谱图
附图3:SDS-PAGE图
从左到右分别为:protein ladder,纯化前,core700纯化后,QFF纯化后
附图4:电镜图片
附图4经本发明所述纯化方法纯化后在电镜下观察病毒颗粒的结构
附图5:核酸稳定性
纯化前后病毒的基因组稳定性鉴定图(左边为纯化前病毒,右边为纯化后病毒)
附图6:外源性DNA残留
纯化前后外源性DNA含量比对图(第一行为国家标准品:1ng/500μl、500pg/500μl、250pg/500μl、100pg/500μl、50pg/500μl、10pg/500μl;第二行及第三行为样品的两个重复:1.纯化前样品(原倍);2.纯化前样品10000倍稀释;3.core 700填料纯化后样品(原倍);4.core 700填料纯化后样品(10倍稀释);5.QFF纯化后样品;6.QFF纯化后样品(10倍);)
具体实施方式:
以下是本发明一个具体的实例,以进一步的阐述本发明,但不能解释为限制本发明的范围。
实施例1
生物反应器:美国NBS公司10L生物反应器
微载体:Cytodex1(通用电器医疗集团生命科学部)
人轮状病毒毒株G1P[8]
培养液配制:
生物反应器DMEM培养液配制:称取DMEM粉剂539.20g、碳酸氢钠148g装入50L带提手大瓶中,加入纯化水定量到4000g,置于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。吸取盐酸16ml加入DMEM培养液中调节pH至7.2±0.1。将配制好的DMEM培养液通过0.2μm颇尔过滤器分别过滤除菌至20L带提手大瓶中。过滤后放置于2-8℃条件下保存。
0.25%胰蛋白酶溶液配制:称取氯化钠80g、碳酸氢钠10g、氯化钾2g、Trypsin粉剂25g、磷酸二氢钾2g、磷酸氢二钠29.4g、EDTA 2g装入10L立瓶中,加入纯化水定量到10000g,置于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解将配制好的胰蛋白酶溶液通过0.2μm囊式滤器过滤除菌至10个1L试剂瓶中。过滤后放置于-20±1℃条件下保存。
细胞培养:分别在10L生物反应器内,按照20g/L浓度加入Cytodex1,水化后,用ph7.2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗3遍,灭菌,加入细胞生长液,接种Vero细胞进行培养;培养的方法参数为:PH7.5温度37℃,溶氧50%、搅拌速度30-100rpm;灌流,每天定时取样观察细胞生长的情况,进行细胞计数,培养4d,细胞密度达到3.5x106/ml.
病毒活化:将-80℃冻存的轮状病毒工作种子放于室温融化30-60分钟后,置于水中速融,待完全溶解后使用。每毫升轮状病毒种子液加入0.25%Trypsin 4ul,使病毒种子液Trypsin终浓度为10ug/ml,置于电热恒温水浴锅中37±0.1℃激活60分钟。
接毒及病毒增殖:通过出液管将生物反应器中的细胞生长液排至4L后停止生物反应器搅拌,待生物反应器中微载体沉降至罐底后,通过收液管将生物反应器中的细胞生长液全部排出,用蠕动泵加入DMEM培养液至2L,设置搅拌速度为80-90rpm重悬微载体,重悬后搅拌速度调整为40rpm,用蠕动泵补加DMEM培养液至6L,加入0.25%Trypsin 36ml,使DMEM培养液Trypsin终浓度为15μg/ml,作用30分钟;通过出液管将生物反应器中的细胞培养液排至4L后停止生物反应器搅拌,待生物反应器中微载体沉降至罐底后,通过收液管将生物反应器中的细胞培养液全部排出,用蠕动泵补加DMEM培养液至4L,设置搅拌速度为80-90rpm重悬微载体,重悬后搅拌速度调整为40rpm,用蠕动泵补加DMEM培养液至4L;加入激活后的病毒液和0.25%Trypsin 64ml吸附2小时,补加DMEM培养液至8L,使DMEM培养液Trypsin终浓度为10ug/ml。
病毒冻融、澄清将冻存于-20℃的轮状病毒收获液于室温条件下水浴融化,反复冻融3次,第三次融化后置于2-8℃备用。在洁净工作台内将冻融三次后的轮状病毒收获液分装至离心杯中,并用托盘天平两两配平,使用高速冷冻离心机进行离心,选用的转头型号为F10S-6x500y,安装好转头后设置离心参数为4℃,9000rpm,20分钟,点击“ROTOR”键进入转头选择界面,设置转头编号为47,点击“ENTER”键确认设置,然后点击“START”键开始离心,离心后收集上清,将所有轮状病毒收获液上清混合在一起,收集于15L立瓶中备用。
收获液纯化将收获液进行离心,除去碎片,之后经截流分子量为300KD的切向流系统进行超滤浓缩5~10倍,得到病毒浓缩液;将得到的轮状病毒浓缩液,用20mM PB(pH=6.7)作为缓冲液,以56cm/h的流速将样品加入装填有新型复合填料Capto Core700的层析柱内,进行凝胶过滤层析,收集流穿峰。将层析得到的轮状病毒液,用20mM PB(pH=6.7)作为缓冲液,以4cm/h的流速将样品加入装填有Q Sepharose Fast Flow填料的层析柱内,上样结束后继续用20mM PB缓冲液平衡,待UV280基线稳定后用20mM PB+0.50M NaCl进行洗脱,收集第一个洗脱峰,此峰为目的蛋白峰。
将纯化前、经Capto Core 700纯化样品和经Q Sepharose Fast Flow纯化的样品使用聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度检测。分别用12%分离胶和5%浓缩胶进行电泳,检测纯化效果(附图3)。
原液灭活及成品配制
病毒的灭活:按甲醛溶液∶样品(V/V)=1∶800的比例加入甲醛溶液,使甲醛终浓度为500μg/mL,置于双层振荡培养箱内,温度:37℃,转速:110rpm,灭活4天。
超滤除甲醛:将进液管路及回收液管路放入甲醛灭活收获液内,废液管放入废液瓶,设定转速为2档开始键进行浓缩,将甲醛灭活收获液浓缩10倍后,将废液管路用止血钳夹住,进液管放入5mmol/L PB+0.85%NaCl缓冲液内补加至浓缩液的5倍体积,打开止血钳,将进液管放入浓缩液内进行超滤,反复3次后,收获原液,用0.2μm一次性滤器液进行过滤除菌
配制:将试剂瓶中样品加入5mmol/L PB+0.85%NaCl缓冲液,稀释至适当浓度,混匀。按氢氧化铝佐剂:稀释后样品1∶1的比例量取氢氧化铝佐剂,与稀释后原液混匀,置于2~8℃。
轮状病毒原液质量检定结果
依据质量标准,对轮状病毒原液进行检定,结果如下表所示:
轮状病毒原液质量标准及检定结果
轮状病毒原液各项指标均符合暂行质量标准要求,符合预期。
轮状病毒成品各项检测指标:
依据质量标准,对轮状病毒成品进行检定,结果如下表所示:
轮状病毒中和抗体效价:腹腔注射6~8周龄Balb/c小鼠,注射剂量为0.5ml/只,免疫针次为3针,免疫程序为第二针次间隔3周,第三针次间隔2周,分别于免疫前和免疫后14天采血,检测血清中和抗体,免疫后抗体4倍阳转率应不低于90%。
小鼠免疫后,血清中抗体对不同毒株的免疫原性如下表所示:
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Claims (10)
1.一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)生产细胞复苏,在方瓶、转瓶进行细胞增殖培养;
2)将传代的生产细胞从转瓶中消化后,接至生物反应器中,利用微载体进行扩增培养;
3)转接之前,将微载体和生物反应器经灭菌后,加入细胞生长液,将反应器调置合适参数运转;
3)细胞使用胰酶进行消化,进行逐级放大方式,如10L~40L~70L~150L,或采用10L~40L~70L逐级放大,之后平行3~4个70L进行平行培养;
4)接种病毒前对于微载体细胞用无血清培养基通过灌流方式进行细胞表面清洗;
5)利用一定浓度的胰酶对于即将接种轮状病毒进行活化;
6)将活化的轮状病毒接种到清洗后的生产细胞,孵育吸附后,添加培养基培养;
7)培养3-5d,收获病毒液,反复冻融三次,离心去处微载体,取上清液;
8)对上清液进行超滤浓缩;
9)利用Core700填料进行层析,之后利用QFF进行离子交换,以达到去除杂蛋白的纯化效果;
10)将层析收获液经一定比例甲醛灭活4-6天后,除去甲醛;
11)添加氢氧化铝佐剂配制疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:病毒的接种量为0.001~0.1MOI。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:病毒活化方法是5~20μg/ml0.25%胰蛋白酶,37℃水浴,0.5~1小时,活化后接种轮状病毒并吸附1~2小时,吸附液所需0.25%胰蛋白酶浓度是5~20μg/ml,病毒维持液所需0.25%胰蛋白酶浓度是10~40μg/ml,由于轮状病毒的特性,在反应器微载体接种病毒的过程中的活化、吸附和维持阶段都需要加入0.25%胰蛋白酶、CaCl2,用以激活轮状病毒,所以反应器接毒的时候应尽量除去血清,以免影响胰蛋白酶活性。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的微载体为Cytodex1,微载体的密度为10~20g/L。
5.根据权利要求1~4所述的方法,其特征在于:生物反应器的细胞培养采用灌流培养的方式,灌流的速率根据细胞的密度为每天0.5~4个工作体积,接种病毒后停止灌流直至收获病毒液。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的澄清的轮状病毒收获液经截流分子量为300~500KD的切向流系统进行超滤浓缩5~10倍,得到病毒浓缩液。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:轮状病毒浓缩液,通过装填有新型复合填料Capto Core 700的层析柱内,收集流穿峰。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:得到的轮状病毒通过加入装填有QSepharose Fast Flow填料的层析柱内,收集第一个洗脱峰,此峰为目的蛋白峰。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:对得到的抗原蛋白进行甲醛灭活,按甲醛溶液:样品(V/V)=1:1600~1:800的比例加入甲醛溶液,置于双层振荡培养箱内,温度:37℃,转速:110rpm,灭活2-6天。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:将纯化的灭活病毒与佐剂混合免疫试验小鼠,采集动物血清,用ELISA方法检测来轮状病毒特异性中和抗体,对于不同轮状病毒毒株(G1、G2、G3、G4、G6、G9)中和滴度最高可达16384,最低达到1:2024。
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GR01 | Patent grant | ||
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