CN103834617B - 人肠道病毒71型c4亚型致死株sd095及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供保藏号为CGMCC NO.6601的人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095及其应用。通过常规病毒分离培养以及动物感染等一系列技术手段获得了鼠适应型致死株，并建立了基于病毒株SD095的动物致死模型。该致死毒株的获得及动物致死模型的建立对于推动我国EV71病毒导致的重症及死亡病例的临床治疗与研究具有重要的意义，对于进一步推进EV71的实验和临床研究、流行病学研究以及新型疫苗开发与评价具有重要的价值。

Description

人肠道病毒71型C4亚型致死株SD095及其应用

技术领域

本发明属于病毒学及免疫学领域，具体地说，涉及人肠道病毒71型C4亚型致死株SD095及其应用。

背景技术

手足口病（Hand,foot and mouth diseases，HFMD）是一种全球范围内广泛流行的粪口传播的疾病，世界上大部分地区均有此病流行的报导。长期以来，轻度的手足口病在世界范围内周期性爆发。该病于1957年在新西兰首次报道，1958年首次分离出柯萨奇病毒，1959年提出手足口病的名称。1969年美国从中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中首次分离出肠道病毒71(Enterovirus 71，EV71)。手足口病流行的间隔期为2-3年，早期的病原体以CoxA16型为主，后来EV71与CoxA16交替出现，成为手足口病的主要病原体。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继爆发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行。1994年英国爆发了Cox A16引起的手足口病。

20世纪90年代后期，EV71在亚太地区的流行呈逐年上升趋势，由此引起的手足口病在东南亚地区广泛流行，感染后常导致患者发生严重的中枢神经系统症状，死亡率较高。1997年马来西亚爆发主要由EV71引起的手足口病，4-6月间共29例病人死亡。1998-2001年手足口病在新加坡大量流行。在我国，1981年上海首次报道HFMD；此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等十几个省市均有该病的报道。1983年天津爆发了CoxA16引起的手足口病，5-10月间发生了7000余病例；经过2年低水平散发后，1986年再次爆发。1995年武汉病毒研究所从手足口病病人中分离出EV71病毒，1998年深圳市卫生防疫站从患者标本中分离出EV71病毒。1998年台湾爆发了大规模的EV71疫情，发病人数估计达150万，其中重症405例，死亡78例，大多为5岁以下的幼儿。我国2000年80,677人感染HFMD，重症感染者291例，死亡41例；2001年出现389例重症感染者，55人死亡。手足口病已经越来越成为威胁国内儿童健康的广泛流行性疾病之一。2007年至今，该病在我国不断流行；山东临沂、青岛和济南、安徽阜阳等地均发生以EV71为主要病原体导致的手足口病的流行。

HFMD为自限性疾病，在婴幼儿中传播，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等致死性并发症。EV71与Cox A16是导致HFMD的两种最主要的病原体；其中EV71占HFMD重症病例的90%左右，占死亡病例的80%左右。EV71属于微小核糖核酸病毒科肠道病毒属，为单股正链RNA，含7000多个核苷酸，包括一个开放阅读框，编码VP1-VP4四个病毒结构蛋白。VP1是主要的衣壳蛋白与病毒中和决定因子，具有最多的型特异性中和位点，负责病毒与靶细胞的结合，决定着病毒的抗原性，其基因序列与病毒血清型具有较高的相关性，根据VP1的全基因序列,将EV71分为A、B和C型3个基因型。

目前用于检测EV71病毒的方法主要有RT-PCR法和荧光定量PCR法。上述方法特异性较好，但是灵敏度差，试验容易发生污染出现假阳性和假阴性结果。同时病毒在传播过程中存在一定核苷酸突变的几率，因此引物设计是个问题。同时试验费用高，需要许多大型仪器设备和熟练的技术人员，操作复杂，检测时间长，不易在我国推广使用。

疫苗作为疾病的有效预防手段，其有效性得到了世界公认。EV71常见毒株均为非致死毒株，在体外只能开展血清学检测，单一的检测手段不能够全面的评价疫苗效果，由非致死株作为抗原获得的抗体疫苗的临床效果不明显，制备出的疫苗质量相对较低。有研究报道（Chen等,2004）使用小鼠适应性EV71通过口服、肌肉接种（i.m.）、腹腔接种(i.p.)和脑内接种(i.c.)等方式感染七日龄小鼠可以模拟EV71感染人和猴所产生的急性麻痹（Chen等,2004;Wang等,2004）。与母本病毒相比，小鼠适应性HEV71感染小鼠时毒力更强，表现为产生更大的空斑和更快的病变速度。这种小鼠适应性病毒株的潜在毒力经检定可能与5’非翻译区（4个核苷酸的改变），VP2衣壳蛋白（3个核苷酸和1个氨基酸发生了改变）和非结构蛋白2C（8个核苷酸和4个氨基酸发生了改变）有关（Wang等,2004）。因此致死毒株筛选和致死动物模型的建立对于疫苗评价、传统疫苗的改进和新型疫苗的开发生产具有重要的意义。

检测病毒抗原常采用ELISA法，该方法灵敏性度高和特异性好，在很多病毒检测中发挥重要作用。EV71抗原ELISA检测关键是有特异性好的抗EV71抗体，以保证检测试剂的特异性，同时抗体需要有稳定来源具有稳定的细胞株，并且抗体需要高效价、高中和活性，以确保检测的抗原为活性表位抗原。高质量抗体的获得需要有稳定高效的病毒抗原作为基础，因此C4亚型致死毒株的筛选鉴定对于制备EV71病毒抗体具有重要的意义，进而对于EV71感染的早期发现，疾病监控，病毒检测，以及疫苗研制过程中病毒抗原表位的检测奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供人肠道病毒71型C4亚型致死株SD095及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的人肠道病毒71型C4亚型（Human enterovirus 71type C4 subgenotype）致死病毒株SD095，于2009年分离自我国山东一例HFMD重症患者体内，并在细胞水平进行接种传代，然后浓缩纯化获得的具有高滴度、高致病性的人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株。该毒株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.6601，保藏日期2012年9月19日。

病毒经浓缩纯化后，对7日龄以下乳鼠进行腹腔注射感染病毒，结果表明，在攻毒后，乳鼠出现不同程度的后肢麻痹，高滴度攻毒组小鼠在攻毒后出现明显的麻痹和瘫痪现象，7-10天内，乳鼠全部死亡。

本发明还提供人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095的基因组。

本发明还提供人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095产生的结构蛋白（包括VP1-VP4）或非结构蛋白。

本发明还提供编码人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095产生的结构蛋白或非结构蛋白的基因。

本发明还提供含有编码人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095产生的结构蛋白或非结构蛋白的基因的载体。

本发明还提供含有编码人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095产生的结构蛋白或非结构蛋白的基因的宿主细胞。

本发明还提供人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095、其产生的结构蛋白（包括VP1-VP4）或非结构蛋白、以及它们的编码基因、含有这些编码基因的载体和含有这些编码基因的宿主细胞在制备预防或治疗肠道病毒71型病毒感染的药物或疫苗中的应用。

本发明还提供人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095的cDNA感染性克隆，其是通过反向遗传操作获得的人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095的cDNA感染性克隆。

本发明还提供含有人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095的cDNA感染性克隆的宿主细胞。

本发明还提供制备人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095的拯救病毒的方法：首先对人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095进行全基因组测序，根据测序结果设计用于构建cDNA克隆的引物和酶切位点，通过引物在基因组cDNA的5’端引入T7启动子，在其3’端引入polyA尾，然后以人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095的基因组为模板，进行RT-PCR反应，得到全长cDNA克隆，酶切线性化后进行体外转录，用体外转录出的RNA转染vero细胞，从而获得拯救病毒。

前述人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095的cDNA感染性克隆在制备抗EV71病毒药物及疫苗中的应用。

本发明还提供一种用于预防或治疗肠道病毒71型病毒感染的疫苗，其包括以所述病毒株SD095为免疫原制备的抗体。

本发明还提供以人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095为免疫原制备的抗体。

本发明还提供前述抗体在制备用于检测肠道病毒71型病毒感染的诊断试剂及试剂盒中的应用。

本发明还提供含有前述抗体的用于检测肠道病毒71型病毒感染的诊断试剂及含有该诊断试剂的试剂盒。

本发明还提供人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095在评价肠道病毒71型疫苗的安全性、有效性以及保护力方面的应用。

本发明进一步提供根据人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095建立的肠道病毒71型动物致死模型。例如，取感染病毒7天后BALB/c乳鼠骨骼肌，加维持液后研磨，离心收集病毒，测定病毒滴度。将收集得到的病毒再次感染对7日龄以下乳鼠，通过反复试验，建立一个稳定的小鼠致死模型。

本发明还提供前述动物致死模型在肠道病毒71型流行病学、药理学和毒理学研究中的应用。

本发明还提供前述动物致死模型在评价肠道病毒71型疫苗质量中的应用，从而建立一个规范的EV71型疫苗质量评价标准。

另一方面，本发明提供一种利用母源抗体途径对乳鼠进行攻毒保护的方法：通过接种疫苗后再受孕的方式，使新生小鼠获得保护性母传抗体，再进行病毒攻击，可作为评价疫苗保护效果的一种方法。

本发明提供的EV71病毒C4亚型致死毒株SD095以及致死动物模型的建立对于推动我国EV71病毒所致的重症与死亡病例的治疗与研究有重要意义，对进一步推进EV71的临床、流行病学研究以及被动治疗具有极其重要的价值，对于EV71病毒的结构研究、致病机理研究以及其他基础研究具有重要作用。

本发明的优点在于：

1、本发明的EV71病毒C4亚型致死株通过在Vero细胞上传代，可以收获较高滴度和纯度的病毒液。

2、本发明的EV71病毒C4亚型致死株通过腹腔接种(i.p.)的方式感染七日龄小鼠可以模拟EV71感染人和猴所产生的急性麻痹（Chen等,2004;Wang等,2004）。与母本病毒相比，小鼠适应性EV71感染小鼠时毒力更强，表现为产生更大的空斑和更快的病变速度。

3、本发明的EV71病毒C4亚型致死毒株SD095对7日龄以内乳鼠具有明显的致死效应。

4、本发明的EV71病毒C4亚型致死毒株SD095可以对母婴途径获得抗体的7日龄以下乳鼠进行攻毒保护。

5、本发明的EV71病毒C4亚型致死毒株SD095经过感染小鼠获得小鼠适应株。

6、本发明的EV71病毒C4亚型致死毒株SD095感染7日龄以下BALB/c乳鼠建立动物致死模型。

7、本发明的基于EV71病毒C4亚型致死毒株SD095建立的动物致死模型对于研究EV71发病机理、EV71疫苗评价和新型高效疫苗开发具有重要意义。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1人肠道病毒71型C4亚型致死病毒株SD095的获得

1毒株样本采集：在全国HFMD集中爆发地区采集毒株样本，按照《手足口病预防控制指南（2008年版）》规定的程序无菌取得粪便或者咽拭子标本，将标本浸泡于生理盐水中，置-20℃冰箱冻存。

表1 C4基因型EV71毒株样本信息

2毒株分离与传代

病毒分离所用的细胞为129代非洲绿猴肾细胞（Vero）工作种子批（来源于ATCC120代Vero细胞种子），公司自检合格，送中国药品生物制品检定所复检合格（检验报告单号为SH200500128）。来源及传代历史清晰，无外源污染，对EV71敏感。

标本经过处理后，接种在规定的使用代次内的Vero细胞，传代两次，收获病毒液。

3毒株鉴定

依据《手足口病预防控制指南（2008年版）》的建议，采用Real timeRT-PCR的方法对标本的细胞培养物做鉴定以及中和试验，确定分离到的是否是EV71。

RT-PCR：提取细胞培养物总RNA，以其为模板，反转录获得cDNA，采用EV71C4基因型特异性引物：

上游引物：5’-CTATGAAGTTGTGTAAGGAT-3’

下游引物：5’-GCICCIGAYTGITGICCRAA-3’

其中，I代表次黄嘌呤核苷或肌苷；Y代表C或T；R代表A或G。

RT-PCR体系（以总体积50μl计）：

RT-PCR中使用的酶为PrimeScript ⅠStep Enzyme Mix。

RT-PCR反应条件：

对照设置：

A.阴性对照：以灭菌双蒸水代替模板。

B.阳性对照：提取的阳性核酸作为模板RNA。

采用Real-time PCR法鉴定，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。RT-PCR法结果显示SD095样本的细胞培养物为EV71C4亚型阳性，表明上述病毒株为EV71C4亚型毒株。

中和试验：

将EV71阳性血清根据中和抗体滴度稀释至100个中和抗体滴度单位。毒株做10倍系列稀释，与等体积的EV71稀释阳性血清混合，37℃中和2小时，接种Vero细胞。同时将10倍系列稀释的上述病毒与等体积的培养基混合后接种Vero细胞，测定病毒滴度。37℃培养7天，观察并记录细胞病变。中和试验组在病毒稀释到10^-4～10^-6稀释度无病变出现，而对照组病毒稀释到10^-4～10^-8稀释度完全病变，中和指数=10^-4/10^-8=10⁴≥100，SD095病毒能够被EV71特异性抗血清完全中和，结果表明其为EV71。

4 C4亚型致死病毒株SD095的获得

在1-3日龄BALB/c小鼠中进行C4基因亚型的EV71筛选。每株病毒攻击1窝（每窝5-8只）乳鼠，每只小鼠10μl病毒脑腔注射，持续15天观察小鼠死亡情况。鼠脑接种的EV71来源信息见表1。结果表明，分离自2009年山东一个手足口病重症患者编号为SD095的EV71样本，攻毒后6天小鼠致死率为100%，而其他毒株经脑腔攻击无死亡及异常症状。

实施例2人肠道病毒71型C4亚型致死株SD095攻毒保护实验

本发明通过用不同剂量的肠道病毒71型灭活疫苗腹腔免疫亲本雌鼠，对其所生乳鼠用致死剂量病毒腹腔攻毒，观察乳鼠存活率从而评价疫苗保护效果，为确定人用疫苗的免疫剂量及免疫程序提供依据。

培养Vero工作细胞种子，35±2℃培养2-5天后接种EV71病毒种子，病毒接种后，接毒细胞在30±2℃培养10-15天，根据细胞病变情况，收获细胞上清，即得到病毒收获液，经过终浓度为180±30μg/ml的甲醛溶液灭活。然后对灭活液依次采用超滤浓缩、柱层析、梯度离心、超滤、过滤等步骤进行纯化，获得EV71灭活疫苗原液，将原液采用氢氧化铝吸附后制成EV71灭活疫苗（Vero细胞）。

将EV71灭活疫苗（Vero细胞）用铝含量为0.4mg/ml的氢氧化铝佐剂稀释成100、25和6.25U/ml三个浓度，每个浓度免疫BALB/c雌性小鼠，初免后将雌鼠和雄鼠放入同一饲养箱内。初免后14天加强免疫一次。加强免疫后将雌鼠分成每饲养箱一只。同时进行未免疫雌鼠与雄鼠的饲养作为阴性对照。免疫与未免疫母鼠生产的乳鼠出生后3-4天腹腔攻毒，攻毒剂量10LD50/只。攻毒后14天免疫母鼠的乳鼠发病及死亡数量显著低于未免疫母鼠的乳鼠。以上结果表明：SD095对于免疫与未免疫的母鼠的乳鼠具有不同的致死效果，对于免疫小鼠致死明显低于未免疫的母鼠，说明该毒株具有致死效果，同时说明EV71灭活疫苗（Vero细胞）可以产生针对于EV71致死株的保护性抗体，第三还说明，对于母鼠致敏EV71灭活疫苗产仔后乳鼠具有抵抗EV71病毒感染的能力，说明乳鼠体内含有相应的母传抗体。EV71病毒C4亚型致死毒株SD095可以用于EV71疫苗免疫效果的体内评价。

实施例3基于C4基因型EV71病毒致死株SD095的动物致死模型建立

采用细胞病变法检测C4基因型EV71病毒致死株的病毒感染滴度TCID₅₀，然后根据TCID₅₀的检测结果进行倍比稀释，并对7日龄以下乳鼠进行腹腔免疫，注射滴度分别为1TCID₅₀、0.1TCID₅₀、0.01TCID₅₀和0.001TCID₅₀，注射剂量为50μl。每个滴度免疫10只乳鼠。

免疫后观察7天统计乳鼠致死率，结果显示1TCID₅₀和0.1TCID₅₀实验组在7天内乳鼠全部死亡，致死率为100%；0.01TCID₅₀和0.001TCID₅₀实验组在7天内死亡2只，致死率为20%。

以上结果表明，当采用病毒滴度为0.1TCID₅₀免疫7日龄以下乳鼠时，C4基因型EV71病毒致死株7天内可以导致乳鼠全部死亡，该动物致死模型可以作为EV71疫苗评价新的途径。

本发明提供的EV71病毒C4亚型致死毒株SD095以及致死动物模型的建立，可广泛用于EV71病毒的基础研究、临床研究、流行病学、药理学和毒理学方面的研究，尤其是对于常规EV71疫苗、生物和化学药物评价具有极其重要的价值。目前，已在EV71动物实验中取得了一定的进展，但是仍存在一定问题。在EV71致病机理尚不完全明确的情况下，建立能基本反映病毒感染的模型十分重要，尤其是致死动物模型。该模型能够在接近人体的自然感染途径条件下完成EV71的感染过程，并具有明确的病理学及免疫学指标，能够对EV71疫苗的免疫效果进行评价。以7日龄以下BALB/c乳鼠建立动物致死模型以及基于母婴抗体获得途径建立的攻毒保护方法对于新开发疫苗的保护范围以及保护效果的评价具有重要的意义。本发明对于新型高效EV71疫苗的开发与生产，为确定人用疫苗的剂量及免疫程序提供依据。

实施例4 C4基因型EV71病毒致死株SD095多克隆抗体制备

采用C4基因型EV71病毒致死株SD095制备EV71灭活疫苗（Vero细胞）：培养Vero工作细胞种子，35±2℃培养2-5天后接种SD095病毒种子，病毒接种后，接毒细胞在30±2℃培养10-15天，根据细胞病变情况，收获细胞上清，即得到病毒收获液，经过终浓度为180±30μg/ml的甲醛溶液灭活。然后对灭活液依次采用超滤浓缩、柱层析、梯度离心、超滤、过滤等步骤进行纯化，获得C4基因型EV71病毒致死株SD095的EV71灭活疫苗原液。将该灭活疫苗原液采用弗氏佐剂制备兔多克隆抗体：首免采用弗氏完全佐剂、其后均采用弗氏不完全佐剂。免疫时间为0、2、3、4、5周，免疫剂量为首免8ml随后免疫均为6ml。对兔子进行背部皮下多点免疫。末次免疫后1周采血检测间接ELISA法抗体滴度为10⁶。采取心脏采血收集兔子全部血清。对血清进行体外细胞中和试验，中和抗体效价为1：5120。

实施例5 C4基因型EV71病毒致死株SD095多克隆抗体保护性研究

将C4基因型EV71病毒致死株SD095多克隆抗体根据中和抗体效价1:5120进行1:100、1:400、1:1600、1:3200稀释，将稀释后的多克隆抗体与C4基因型EV71病毒致死株SD095病毒等体积混合，37℃温浴2小时后腹腔免疫3-4天的乳鼠，攻毒剂量10LD50/只，同时以无多克隆抗体的生理盐水与病毒混合物作为对照，采用相同方式免疫乳鼠。攻毒后观察14天，未进行病毒中和的乳鼠全部死亡，与1:100、1:400、1:1600、1:3200稀释多克隆抗体中和后的病毒免疫的乳鼠存活率分别：100%、100%、70%、30%。结果表明，C4基因型EV71病毒致死株SD095制备的多克隆抗体具有中和EV71C4基因型致死株的效果，中和后的病毒免疫乳鼠保护乳鼠不发病。结果表明，SD095可以产生具有预防 EV71感染的抗体。

实施例6 C4基因型EV71病毒致死株SD095多克隆抗体治疗性研究

采用10LD50/只的C4基因型EV71病毒致死株SD095病毒攻击乳鼠，然后将C4基因型EV71病毒致死株SD095多克隆抗体根据中和抗体效价1:5120进行1：100、1:400、1:1600、1:3200稀释。乳鼠攻毒30分钟内采用上述稀释的多克隆抗体腹腔免疫小鼠，同时以无多克隆抗体的生理盐水作为对照，采用相同方式免疫乳鼠。被动免疫抗体后，观察10天。结果：生理盐水对照组乳鼠全部死亡，乳鼠攻毒后腹腔注射1:100、1:400、1:1600、1:3200稀释的多克隆抗体的乳鼠存活率分别：100%、100%、50%、20%。该结果表明，C4基因型EV71病毒致死株SD095制备的多克隆抗体具有被动免疫保护的效果，小鼠在免疫病毒被动感染后采用主动注射C4基因型EV71病毒致死株SD095病毒多克隆抗体的方式，可以保护乳鼠不发病。因此SD095具有治疗EV71病毒感染的作用。

实施例7 C4基因型EV71病毒致死株SD095多克隆抗体在诊断方面的应用

采用亲和层析法纯化实施例4中制备的C4基因型EV71病毒致死株SD095病毒的兔多克隆抗体，然后采用改良的高碘酸钠法对纯化抗体进行辣根过氧化物酶标记。并采用单克隆抗体HD6（购自北京科兴生物制品有限公司）作为包被物，辣根过氧化物酶标记的C4基因型EV71病毒致死株SD095兔多克隆抗体为酶标记物，建立EV71抗原含量检测方法。

单抗1:1000倍稀释，酶标记抗体1:5000倍稀释时，对于蛋白浓度10ng/ml的EV71灭活疫苗原液具有检出效果。该方法的检测灵敏度高于目前采用的兔多抗包被HD6单抗标酶的EV71抗原含量检测方法的灵敏度（25ng/ml）。采用该检测试剂检测EV71急性期病人咽拭子，以阴性血清OD均值的2.1倍为阈值判为阳性，则样品检测结果为阳性。表明C4基因型EV71病毒致死株SD095病毒制备的兔多克隆抗体可以用于检测肠道病毒71型病毒感染的诊断试剂及试剂盒的制备。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.人肠道病毒71型C4亚型(Human enterovirus 71 type C4 subgenotype)致死病毒株SD095，其保藏号为CGMCC NO.6601。

2.权利要求1所述病毒株SD095在制备预防或治疗肠道病毒71型病毒感染的药物或疫苗中的应用。

3.一种用于预防或治疗肠道病毒71型病毒感染的疫苗，其包括以权利要求1所述病毒株SD095为免疫原制备的抗体。

4.以权利要求1所述的病毒株SD095为免疫原制备的抗体。

5.权利要求4所述抗体在制备用于检测肠道病毒71型病毒感染的诊断试剂及试剂盒中的应用。

6.含有权利要求4所述抗体的用于检测肠道病毒71型病毒感染的诊断试剂。

7.含有权利要求6所述诊断试剂的试剂盒。