RU2565811C1 - Штамм энтеровируса а71 типа субгенотипа с4, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов - Google Patents

Abstract

Предложен штамм энтеровируса человека А71 типа субгенотипа С4. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-670. Штамм предназначен для диагностики, изучения эффективности и создания лечебно-профилактических и вакцинных препаратов. Штамм обладает высокой репродуктивной активностью, эффективно реплицируется в клеточной культуре 293 А с развитием выраженного цитопатического действия на питательной среде F12/DMEM с добавлением фетальной сыворотки и гентамицина в течение 1-2 суток культивирования при 37°С. Изобретение позволяет эффективно определять инфекционную активность вирусных препаратов, нарабатывать вирусную биомассу для приготовления диагностических и вакцинных препаратов. 2 ил., 4 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к штамму энтеровируса человека А71 типа, принадлежащего к генотипу С, субгенотипу С4 и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Штамм изолирован от больного человека и является адекватной моделью этой новой энтеровирусной инфекциями, и может быть использован для разработки и усовершенствования методов диагностики энтеровирусной инфекции, изучения эффективности и создания лечебных и профилактических химиотерапевтических и вакцинных препаратов, а также для формирования национальной панели энтеровирусных штаммов.

Заявляемый штамм энтеровируса А71 типа (ЭВ71) является патогенным неполиомиелитным энтеровирусом человека. Этот вирус характеризуется нейропатогенностью и может вызывать крупные вспышки заболеваний, в том числе и с летальными исходами. При этом наибольший риск возникновения больших вспышек заболевания и тяжелого течения нейроинфекции отмечается у детей в возрасте до 5 лет. Основными эндемичными странами по заболеваемости инфекцией, вызванной энтеровирусом А71 типа, являются страны Азиатско-Тихоокеанского региона. Для данного региона характерна циркуляция патогенного субгенотипа С4 (так называемого «азиатского» субгенотипа), вызывающего поражения ЦНС.

Для Российской Федерации энтеровирус А71 типа является относительно новым вирусным патогеном, как и заболевания человека, вызываемые этим вирусным агентом. Исследования показали, что в 2000-2010 годах в России преобладали субгенотипы С1 и С2 ЭВ71, филогенетически наиболее близкие к европейским вариантам вируса. Эти варианты ЭВ71 циркулировали на территории Российской Федерации среди детей дошкольного возраста в течение в последних 5-10 лет. С 2011 года в РФ был зарегистрирован и стал доминировать субгенотип С4, филогенетически схожий с энтеровирусными изолятами, характерными для Китая. Первая большая вспышка заболеваний, вызванных ЭВ71 субгенотипа С4, была зарегистрирована в 2013 году в Ростове-на-Дону. Во время вспышки было зарегистрировано 78 случаев ЭВ71 инфекции, из них 25 детей с тяжелыми поражениями центральной нервной системы, т.к. называемый серозный менингит. Были зарегистрированы летальные случаи. Генетическая диагностика позволила установить, что причиной вспышки нейроинфекции был энтеровирус А71 типа субгенотипа С4. Появление нового генотипа С4 в 2013 году на территории России поставило проблему отсутствия иммунобиологических препаратов для диагностики, профилактики и лечения этого нового генотипа энтеровируса. Также отсутствуют детально изученные штаммы энтнолвируса А71 нового субгенотипа С4, которые можно использовать в качестве эталонных и производственных штаммов для разработки профилактики, диагностики и лечения современных разновидностей энтеровирусной инфекции.

Известен производственный энтеровирусный штамм Suis, который может являться возбудителем энцефаломиелита у свиней (болезнь Тешена) и быть пригодным для изготовления ветеринарных вакцин и диагностических препаратов для домашних животных (патент Украины UA 8892, МПК C12N 7/00, опубл. 15.08.205 г.). Данное изобретение относится только к области ветеринарной вирусологии. Оно не может быть использовано для создания иммунобиологических препаратов для борьбы с инфекционными энтеровирусными заболеваниями человека.

Известен штамм энтеровируса Коксаки В6, который способен селективно инфицировать и лизировать опухолевые клетки человека in vitro (патент РФ №2496873, МПК C12N 7/00, 27.10.2013 г.). Описанный штамм получен посредством проведения серии адаптационных пассажей родительского штамма вируса ЖЭВ-15 Коксаки В6 на высокочувствительной к данному вирусу культуре клеток НЕК293 и неопластической клеточной линии С33А. Данный штамм является непатогенным для человека и создавался с целью разработки на его основе эффективного и безопасного онколитического вирусного препарата для терапии злокачественных новообразований человека.

Известен штамм энтеровируса А71 типа, относящийся с субгенотипу С4 (патент Тайваня № TWI 225095, опубл. 11.12.2004 г.). Штамм получен китайскими исследователями и предполагается для использования исключительно с целью создания кандидатной вакцины против энтеровирусной инфекции. Вирусные штаммы будут использованы для получения вирусной биомассы, которая будет инактивирована β-пропиолактоном. В патенте TWI 225095 для создания инактивированной вакцины предлагается использование штамма энтеровируса 71 типа YN3-4a. Первоначальный вариант штамма neu был получен из образца спинного мозга восьмилетнего ребенка, скончавшегося во время вспышки ЭВ71-инфекции на Тайване в 1998 году. С целью первичной изоляции вируса, образец был культивирован на культуре клеток MRC5. После этого с целью адаптации вируса к культуре клеток Vero вирус прошел до 10 пассажей на этих клетках. В результате многократного пассирования нуклеотидная последовательность штамма YN3-4a имеет гомологию с исходным штаммом neu всего в 95,4%. Наиболее изменчивым при этом оказался 3С регион. Таким образом, штамм YN3-4a является лабораторно адаптированным вариантом энтеровируса 71 типа для культивирования на культуре клеток Vero и его соответствие эпидемиологически значимым энтеровирусам крайне сомнительно.

Однако регион выделения (Азиатско-Тихоокеанский регион) и давность выделения штаммов в полной мере не отражает, и не представляет современные варианты ЭВ71, которые циркулируют в настоящее время, и имеют медицинское значение на территории России. Это также дополнительно подтверждается данными неполной перекрестной нейтрализации с антисыворотками к штаммам YN3-4a и neu5 с другими изолятами энтеровирусов 1997-2000 гг. Дополнительным недостатком для производства вакцин также является сохранение штаммом YN3-4a вирулентности для мышей ICR. При внутрибрюшинном введении небольших доз вируса 10² TCID₅₀ ml^-1 и более мыши погибают.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм энтеровируса А71 типа, относящийся с субгенотипу С4, защищенный патентом Китая CN 103160475, МПК C12N 7/00, опубл. 19.06.2013 г., в котором определены полногеномные нуклеотидные последовательности. Штамм депонирован в Китайской коллекции микроорганизмов (Chinese Culture Collection Management Committee General Microbiology Center (CGMCC)) под №5539. Наработка штамма идет на культуре диплоидных клеток Vero. На его основе создан вакцинный препарат с добавлением адъюванта гидроокиси алюминия, который использован для профилактики энтеровирусной инфекции.

По сравнению с геномом заявляемого энтеровирусного штамма китайские штаммы имеют множество нуклеотидных замен. Последовательность аминокислот в полипротеинах этих штаммов имеет отличия по 22 аминокислотным позициям (таблица 1).

Наличие столь большого количества аминокислотных замен, по сравнению с предлагаемым штаммом, связано с более ранней изоляцией штамма в другом географическом районе мира (Китай). Это позволяет заключить, что данные китайские штаммы (аналог и прототип) существенно отличаются по своей генетической структуре от штаммов энтеровирусов, циркулирующих в настоящее время в России. По этой причине они не могут быть использованы для создания актуальных иммунобиологических препаратов против циркулирующих на территории России современных энтеровирусов генотипа С4.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение штамма ЭВ71 субгенотипа С4, который был бы пригоден для целей диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов, используемых на территории Российской Федерации.

Указанный технический результат достигается получением нового штамма ЭВ71 субгенотипа С4, который был выделен в 2013 г. на территории России (г. Ростов-на-Дону) из фекалий ребенка, госпитализированного в инфекционный стационар с диагнозом энтеровирусная инфекция. Штамм выделен стандартным методом путем заражения культуры клеток 293 А.

Штамм предназначен для изучения эффективности и усовершенствования методов диагностики, создания лечебных и профилактических химиотерапевтических и вакцинных препаратов против энтеровирусной инфекции и может быть включен в состав национальной референс панели штаммов энтеровирусов.

Заявляемый штамм энтеровируса 71 типа субгенотипа С4 депонирован в Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-670 от 25.07.2014 г. и обладает нижеперечисленными характеристиками.

Характеристика заявляемого штамма

Культуральные свойства заявляемого штамма вируса. Полученный новый штамм генотипа С4, энтеровируса А71 обладает комплексом полезных вирусологических свойств. Штамм обладает высокой репродуктивной активностью, эффективно реплицируется в клеточной культуре 293 А с развитием выраженного цитопатического действия на питательной среде F12/DMEM, содержащей 7% FBS и гентамицин в течение 1-2 сут культивирования при 37°C.

Цитопатическое действие начинается через 4-6 часов после заражения клеток и полностью развивается через 24 часа после инфицирования клеточного монослоя. Это позволяет быстро и легко определять инфекционную активность вирусных препаратов при помощи различных методов титрования вирусной инфекционности, быстро нарабатывать вирусную биомассу для приготовления диагностических и вакцинных препаратов, простота культивирования и выход вирусных частиц в культуральную среду обеспечивает легкость очистки вирусной суспензии.

Активность (продуктивность) штамма (с указанием условий культивирования). При размножении путем заражения вирусом культуры клеток 293 А титр вируса в культуральной жидкости через 1-2 сут после заражения 10⁶ ТЦПД₅₀/мл.

Штамм прошел 5 пассажей на культуре клеток 293 А. Штамм хорошо хранится и сохраняет свои полезные свойства в низкотемпературном холодильнике при минус 70°C. Срок хранения вирусного материала до последующего переконтроля составляет 5 лет, не ранее марта 2019 г.

Совокупность культуральных свойств заявляемого штамма энтеровируса А71 субгенотипа С4 позволяет рассматривать его как адекватную природную модель для оценки эффективности и разработки средств диагностики, исследования и создания новых лечебно-профилактических препаратов против серозного менингита энтеровирусной этиологии.

Генетическая идентификация заявляемого штамма ЭВ71 осуществляли методом определения нуклеотидных последовательностей 5′-нетранслируемой области генома и гена VP1 на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130x1 (Applied Biosystems, США) с последующим сравнением полученных нуклеотидных последовательностей с ранее опубликованными в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.gov). Филогенетический анализ проводили методами минимальной эволюции, максимального правдоподобия и присоединения ближайших соседей. Анализ нуклеотидной последовательности генома, филогенетический анализ и определение субгенотипа вирусного штамма осуществляли с помощью специализированных компьютерных программ MEGA 6 и Lasergene 7. Генотипирование полученного штамма Ростов ЭВ71 проводили путем анализа нуклеотидных последовательностей 5′-нетранслируемой области генома и гена VP1. Выбор данных генетических участков определялся тем, что их анализ позволяет с большой достоверностью различать основные варианты энтеровирусов. Для определения и анализа полноразмерной нуклеотидной последовательности генома использовали набор олигонуклеотидных праймеров, специально разработанных для этих целей. Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров проводился с использованием программного обеспечения Vector NTI 9.0.0 и PerlPrimer 1.1.21.

Анализ нуклеотидной последовательности нового штамма показал, что выделенный изолят энтеровируса относится к роду Enterovirus, семейству Picornaviridae. Вирион пикорновирусов содержит молекулу геномной ssРНК(+) размером около 7400 н.о., которая связана с белком VPg на 5′-конце и полиаденилирована на 3′-конце. Различия нуклеотидной последовательности в области генома VP1 штамма энтеровируса 71 позволяют его генотипировать как субгенотип С4. Выделенный энтеровирус имеет уровень гомологии в 97% по нуклеотидной последовательности и 99% по аминокислотной последовательности в соотношении другими прототипными штаммами энтеровирусов (EV71/GD10-7/2010 (KJ 004558); GDV103 (KC 954663); FY17.08-6/AH/CHN/2008 (JX 678877); FY17.08-5/AH/CHN/2008 (JX 678876); SDLY107 (JX 244186)). Это позволяет заключить, что заявляемый штамм энтеровируса А71, генотипа С4 является оригинальным и новым для территории России.

На фиг. 1 приведена полная нуклеотидная последовательность генома заявляемого штамма ЭВ71. На фиг. 2 представлены филогенетические взаимоотношения российского штамма V-670 (Ростов) ЭВ71 (выделен рамкой) на основе анализа фрагмента гена VP1 энтеровирусов депонированных в GenBank. Обозначение вирусных изолятов: генотип последовательности/номер депонирования в GenBank, страна выделения, год выделения изолята.

Пример 1. Выделение и культивирование заявляемого штамма энтеровируса А71, генотипа С4. Заявляемый штамм вируса выделен из фекалий больного ребенка с диагнозом энтеровирусная инфекция. При получении штамма используют метод инфицирования клеточной культуры 293 А. С этой целью готовят 5% гомогенат клинического материала в растворе Хэнкса с добавлением антибиотиков. Препарат осветляют при помощи низкоскоростного центрифугирования 4000-6000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант стерилизует при помощи фильтрования через мембранный фильтр «Millipor» или аналогичный, с диаметром пор не более 0,22 микрон. Фильтрат используют для инфицирования клеточных монослоев, как описано ниже, для выделения заявляемого штамма вируса. Через 24-48 часов после инфицирования клеток вируссодержащая культуральная жидкость центрифугируется при 1500-2500 об/мин, распределяется в пробирки для заморозки и замораживается при минус 70°C. Набор пробирок, содержащих вирусный материал, рассматривается как исходная музейная панель вирусного материла, содержащая штамм энтеровируса А71, генотипа С4. Инфекционность выделенного вирусного штамма оценивают по цитопатическому действию вируса на культуре клеток 293 А, как описано ниже. Полученный вирусный материал используется для создания музейной закладки заявляемого штамма, его характеризации с целью составления паспорта штамма, депонирования в коллекцию вирусных штаммов, исследованию культуральных, биологических и генетических свойств вирусного изолята.

После размораживания вируссодержащая культуральная жидкость используется для инфицирования новых клеточных монослоев в соотношении 1:10-1:100 и наработки вирусной биомассы для обеспечения создания эталонных, диагностических и вакцинных препаратов против энтеровирусной инфекции.

Накопления вируса в клеточной культуре 293 А для создания иммунобиологических препаратов. Заявляемый штамм ЭВ71 может поддерживаться неопределенно длительное время при пассировании в монослое культуры клеток 293 А. С этой целью монослой клеток 293 А, выращенный в пластиковом матрасе, инфицируют культуральной жидкостью содержащей заявляемый штамм из музейной закладки в разведении 1:100 в течение 1 ч при температуре комнатной температуре. После инкубирования вируссодержащую жидкость удаляют, монослой трижды промывают питательной средой ДМЕМ/F12 с добавлением 80 мкг/мл гентамицина. Затем во флаконы вносят поддерживающую среду ДМЕМ/F12 с добавлением 2% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°C в течение 30 мин, и 80 мкг/мл гентамицина. Флаконы с инфицированной культурой клеток инкубируют в термостате при 37°C. Контроль цитопатического действия вируса проводят методом инвертированной микроскопии клеточной суспензии в культуральных флаконах 24-48 ч. При наличии выраженного цитопатогенного действия (деструкция клеточного монослоя по сравнению с контрольными пробами без энтеровируса) культуральную среду отсасывают и переносят в стерильные центрифужные пробирки соответствующего объема. Образцы вируссодержащей жидкости центруфугируют про 1500-2000 оборотов в минуту для удаления клеточного дебриса в течение 10-15 минут. Супернатант распределяют в стерильные пластиковые пробирки и помещают в низкотемпературный холодильник для хранения как препарат штамма энтеровируса А71, субгенотипа С4. При условии хранения при -70°С переконтроль вирусной закладки проводят раз в 5 лет.

Инфекционную активность вирусного препарата определяют по развитию ЦПД на культуре клеток 293 А. С этой целью клеточные монослои выращивают в 96 луночных планшетах для культур клеток с использованием культуральной среды ДМЕМ/F12 с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина в CO₂ инкубаторе при концентрации CO₂ в пределах 4,5-5,0% по объему и температуре 37°C. Клеточные монослои в лунках планшет (не менее 4-6 лунок на разведение) инфицируют десятикратными разведениями вирусной суспензии, как описано выше. После инкубирования, промывания в лунки вносят поддерживающую среду с 2% сыворотки и помещают в CO₂ инкубатор. Через 48 ч проводят учет образования ЦПД при визуальном просмотре лунок в инвертированном микроскопе и рассчитывают 50% инфекционный титр вирусной суспензии общепринятым способом.

Пример 2. Генотипирование и определение полной нуклеотидной последовательности генома заявляемого штамма ЭВ71.

Генотипирование полученного штамма ЭВ71 проводят путем анализа нуклеотидных последовательностей 5′-нетранслируемой области генома и гена VP1. Для амплификации последовательности 5′-нетранслируемой области генома и гена VP1 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют следующие олигонуклеотидные праймеры (табл. 2)

Вирусспецифическую РНК выделяют из образцов культуральной среды клеток инфицированных заявляемым штаммом. Вирусоспецифическую ДНК получают методом обратной транскрипции вирусной РНК и используют для последующей амплификации методом полимеразной цепной реакции. Определение нуклеотидных последовательностей проводят автоматически на приборе ABI PRISM 3130x1 (Applied Biosystems, США). По определенным нуклеотидным последовательностям 5-нетранслируемой области генома и гена VP1 была установлена принадлежность заявляемого штамма ЭВ71 к энтеровирусу А71 типа.

После установления генотипа штамма, были рассчитаны праймеры на весь геном ЭВ71 и проведено определение полной нуклеотидной последовательности геномной РНК штамма ЭВ71. Набор олигонуклеотидных праймеров для определения полноразмерной нуклеотидной последовательности генома представлен в таблице 3.

После проведения ПЦР с использованием вирусоспецифических праймеров образцы очищали с использованием набора Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System производства «Promega» (США) и секвенировали по прямой и обратной цепи ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей проводилось на автоматическом секвенаторе ABI 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Все последовательности были определены дважды в независимых экспериментах. Полная нуклеотидная последовательность генома заявляемого штамма V-670 (Ростов) ЭВ71 представлена на фиг. 1.

Филогенетический анализ энтеровирусных штаммов по нуклеотидной последовательности полных геномов представлен на фиг. 2 и показал, что заявляемый штамм ЭВ71 не имеет аналогов и является новым штаммом энтеровирусов А71 в пределах генотипа С4.

Наиболее близкие по нуклеотидной последовательности штаммы, к заявляемому штамму ЭВ71, являются штаммы, депонированные в GenBank под номерами FJ 713137 (Китай - 2009), FJ 556875 (Тайланд - 2009), CQ 279369 (Китай - 2008). Штамм FJ 713137 (Китай - 2009) имеет 32 аминокислотные замены, штамм FJ 556875 (Тайланд - 2009) имеет 54 нуклеотидные и 2 аминокислотные замены в гене белка VP1 (полная последовательность генома не известна). Штамм CQ 279369 (Китай - 2008) имеет в геноме 22 аминокислотные замены, причем только ген белка VP1 имеет 56 нуклеотидных замен и 2 аминокислотные замены. Множественные аминокислотные замены в вирусных белках и множественные нуклеотидные замены в вирусных геномах говорят о значительных генетических отличиях этих штаммов от заявляемого штамма. Это не позволяет рассматривать вышеуказанные аналоги как адекватные референс штаммы в отношении современных энтеровирусов 71 типа, циркулирующих в последние годы на территории России.

Пример 3. Использование заявляемого штамма для поиска новых противовирусных препаратов.

Возможность использования заявляемого штамма ЭВ71 для поиска новых антивирусных препаратов была исследована с использованием новых экспериментальных антивирусных препаратов на основе чаги и гумата калия. Для этого использовали препарат заявляемого штамма ЭВ71, приготовленный как описано в примере №1 данной заявки. Набор экспериментальных антивирусных препаратов был любезно предоставлен проф. Тепляковой Т.П., который описан в патенте РФ №2480227.

Оценку противовирусной активности соединений проводили на культуре клеток 293 А в 96-луночных планшетах. Антивирусную активность соединений в отношении заявляемого штамма ЭВ71 определяли посредством регистрации ингибирования вирус индуцированного цитопатического эффекта в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов (конечные концентрации в лунках микропланшет с клеточным монослоем 100, 25, 10 и 0 мкг/мл). После добавления к клеткам исследуемых соединений в вышеуказанных концентрациях проводили инфицирование клеток стандартной дозой энтеровируса. После инкубации клеток в планшетах в течение 72 часов при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂ ,клетки фиксировали 5% раствором глутарового альдегида. Цитопатический эффект визуализировали окрашиванием клеток 0.1% раствором кристаллического фиолетового и регистрировали спектрофотометрически при 570 нм. Результаты, представленные в таблице 4, показывают, что заявляемый штамм может с успехом быть использован для скрининга антивирусных препаратов на культуре клеток, причем учет результатов (развитие ЦПД) можно проводить уже через 24 часа. Таким образом, применение заявляемого штамма вируса может обеспечить быстрое и эффективное тестирование антивирусной активности экспериментальных и лекарственных препаратов.

Таким образом, заявляемый штамм ЭВ71 имеет охарактеризованную генетическую структуру, что характеризует заявляемый штамм как генетически однородный препарат.

Известная генетическая структура препарата предполагает возможность полного генетического контроля этого штамма в процессе его использования для разработки препаратов для диагностики, изучения эффективности и создания лечебно-профилактических и вакцинных препаратов. Важно также отметить, что генетическая структура заявляемого штамма ЭВ71 представлена новым генетическим субтипом С4, который характерен и актуален для современной эпидемиологической ситуации серозными менингитами в РФ и представляет современные изоляты энтеровирусов патогенные для человека.

Заявляемый штамм может быть использован при разработке национальной панели генетически и биологически характеризованных энтеровирусных штаммов, имеющих эпидемиологическую значимость на территории России для стандартизации оценки эффективности разрабатываемых вакцинных препаратов. Заявляемый штамм обеспечивает быструю и эффективную оценку эффективности противовирусных препаратов, что позволит проводить стандартизованную адекватную оценку перспективных противовирусных препаратов для лечения энтеровирусной инфекции. Также он может использоваться в качестве продуцента антигенов и генетического материала, входящих в диагностические наборы и тест-системы необходимых для производства иммунологических и генетических тест-систем для диагностики энтеровирусной инфекции у человека.

Claims (1)

1. Штамм энтеровируса А71 типа субгенотипа C4, используемый для диагностики, изучения эффективности и создания лечебно-профилактических и вакцинных препаратов и депонированный в Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-670.

Images