CN101695570B

CN101695570B - 一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法

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Publication number: CN101695570B
Application number: CN200910236591.1A
Authority: CN
Inventors: 赵忠鹏; 李敏; 高啸; 罗德炎; 刘鑫; 李晓楠; 邢丽; 段越强; 杨鹏辉; 王希良
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2029-11-03
Also published as: CN101695570A

Abstract

本发明公开了一种可预防手足口病的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Cox.A16)的手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法，该疫苗首先选育了手足口病疫苗株；建立并检定疫苗株三级种子批库；培养细胞；接种并增殖病毒；收集病毒悬液；灭活病毒；超滤浓缩并纯化病毒悬液，得疫苗原液；最终配制成单、双价灭活疫苗。本发明单、双价灭活疫苗在预防手足口病方面具有较好的应用前景。

Description

一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种疫苗及其制备方法，特别涉及一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

手足口病是由小RNA病毒科，肠道病毒属病毒引起的，现已成为危害婴幼儿健康和公共卫生安全的重要传染病。手足口病由柯萨奇病毒A4，A5，A9，A10，A16，B2，B5和肠道病毒71等型别的肠道病毒引起，但主要由肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒16型(Cox.A16)引起。本病最普遍的特征是先颊粘膜出疹，然后很快在手和足部出现。感染EV71和Cox.A16所引起的临床症状，如手足口病、疱疹性咽峡炎，在临床上难于区别。感染EV71常常并发严重的神经炎症，包括病毒性脑膜炎，脑炎，以及类似小儿麻痹的瘫痪，引起的肺水肿、肺出血经常导致婴幼儿的快速死亡。Cox.A16是引起心肌炎、心包炎、心肌病及其它严重疾病的重要病原。

EV71病毒是1969年首次从美国加利福尼亚州患有中枢神经系统疾病的婴儿患者的粪便标本中分离出来的。自1974年Schmidt，Lennette，Ho首次报道以来，EV71已在世界范围内引起十多次爆发与流行。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区猖獗，日本、新加坡、马来西亚均有大规模爆发的报道，不仅发病人数多，而且死亡病例多。1998年中国台湾地区EV71大爆发，发病129106例，其中，405例为严重的中枢神经系统感染，死亡78人。2000年，2001年台湾地区又接连爆发手足口病，其中2000年，发病80677例，死亡41人。中国大陆地区于1981年由上海首次报道手足口病，此后，北京、山东、广东等十几个省份均有本病暴发流行的报道。2007年山东临沂等地区发生手足口病流行，发病39606例，死亡14例。2007年，中国内地共报告手足口病病例83344例，死亡17例。2008年3月安徽阜阳等地区开始爆发手足口病，至5月已发病6049例，353例重症病例，死亡22例，同时，自2008年5月2日起，卫生部将手足口病纳入丙类法定传染病管理。2008年全年，中国内地共报告手足口病病例488955例，死亡126例。2009年手足口病疫情仍在中国大陆不断蔓延。

流行病学资料显示，Cox.A16一般和EV71相伴流行，在流行过程中，考虑到Cox.A16多导致无症状感染，可能在流行中所占实际比例更高。台湾地区1998，1999，2000年肠道病毒感染中EV71所占的比例分别为44.4％，2.0％，20.5％，Cox.A16所占的比例分别为18.2％，1.7％，18％。2008年安徽阜阳手足口病疫情发生后，中国疾病预防控制中心在全国范围内病例标本的实验室检测结果显示，在582个手足口病病例阳性标本中，EV71占54.5％，Cox.A16占17.4％。

监测数据显示，EV71和Cox.A16传播流行模式均是大规模爆发后随之几年静止期。由EV71或Cox.A16引起的手足口病反复爆发可能是新的基因型在世界范围内传播所致。对1970-2004年全球EV71分离株的分子流行病学分析显示，EV71病毒分为3个基因型，即A，B，C型，8个基因亚型，即B1-B4和C1-C4亚型。EV71的基因亚型与分离地区和分离时间有一定的关联。对1983-2003年福岛地区(Fukushima，Japan)EV71和Cox.A16分离株的系统发生重建证实，EV71分离株在基因特征上可分为8个不同组群(B1，B2-3，B4，C1，C2，C3，B5，C4)，B1、C-U1、C-U2、C-2、B-4、C-4、B-5分别与1984、1987、1990、1993、1997、2000、2003年与EV71相关手足口病爆发有关；对Cox.A16分离株进行遗传重建显示，Cox.A16分离株形成了3个不同的遗传簇(A，B，C)，A、B、C组群分别和1984-1994年(1985和1991年爆发)，1987-1998(1988和1998年爆发)，1995-2003(1995和2002年爆发)流行相关，且在福岛地区每次手足口病爆发中分离到的EV71和Cox.A16病毒株与日本其它地区和其它国家同期分离到的EV71病毒株属于同一个组群。在中国台湾地区，1998年之前EV71主要流行B1亚型，1998年大爆发期流行的主要亚型是C2亚型，1999-2003年主要流行B4亚型，2004年以后主要流行C4亚型。对1999-2004年中国深圳地区EV71和Cox.A16分离株进行遗传重建分析，表明EV71病毒主要流行C4亚型，Cox.A16病毒主要流行C型。2008年从安徽阜阳轻症病例和重症病例标本中均分离到EV71病毒C4亚型。

从EV71感染到出现症状约为3-6天。第一个常见的症状为发烧。在发烧出现后的一到两天，病人常在口中出现疮，手掌、脚底出现皮肤红疹。有些病例，主要是小于3岁的婴幼儿，会出现严重的并发症，短期(2-4天)发烧后突然恶化，并在第12到24小时内死亡。有报告指出猴子可在被EV71感染后14到20天内产生IgM抗体。报告指出病童的快速死亡，通常发生在第7天，是由于他们无法及时产生足够的中和抗体。目前尚无有效的疫苗或药物可防治EV71感染。

EV71和Cox.A16病毒同脊髓灰质炎病毒一样属于小RNA病毒科，肠道病毒属。肠道病毒普遍具有很强的免疫原性，疫苗预防效果好。1954年和1956年脊髓灰质炎病毒灭活疫苗(Salk)和减毒活疫苗(Sabin)相继研究成功，在预防脊髓灰质炎方面取得巨大成就，是全球继消灭天花以后第2种被要求消灭的病种。受到脊髓灰质炎病毒疫苗的启发和鼓舞，研制一种安全、有效的预防手足口病的疫苗是可行的。至今尚未阐明EV71和Cox.A16病毒的分子致病机制，使弱毒活疫苗的研制面临巨大挑战，人们寄希望于灭活疫苗和基因工程疫苗的研制成功。

综观国际上预防脊髓灰质炎的成功经验，用安全、高效、优质的三价(I、II、III型)灭活疫苗对易感人群进行预防接种是多血清型脊髓灰质炎综合防治中最有效的措施之一。在灭活疫苗的研制方面，国际上具有代表性的灭活疫苗标准制造技术已经被建立。我国目前还没有预防EV71和Cox.A16两种病毒的手足口病灭活疫苗。由于近年来亚太地区EV71和Cox.A16引起的手足口病大肆流行，研制出预防EV71和Cox.A16的安全、高效的手足口病疫苗是预防手足口病急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于公开一种可预防手足口病的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Cox.A16)的手足口病单、双价灭活疫苗；本发明的目的还在于公开上述疫苗的制备方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的。

本发明单价灭活疫苗由EV71抗原或Cox.A16抗原与Al(OH)₃佐剂按下述重量百分比含量配制而成：

EV71抗原或Cox.A16抗原 0.0015-0.002重量份

Al(OH)₃佐剂 0.25-0.5重量份。

本发明双价灭活疫苗由EV71抗原和Cox.A16抗原与Al(OH)₃佐剂按下述重量百分比含量配制而成：

EV71抗原和Cox.A16抗原 0.0015-0.002重量份

Al(OH)₃佐剂 0.25-0.5重量份；

其中EV71抗原和Cox.A16抗原的比例为1∶1。

本发明单、双价疫苗的制备方法包括如下步骤：

a，选育手足口病疫苗株；

b，建立并检定疫苗株三级种子批库；

c，培养细胞；

d，在细胞长成致密单层或微载体培养细胞成合适密度时，接种病毒；

e，在细胞中增殖病毒；

f，收集细胞所产生的病毒悬液，澄清过滤，去除细胞残渣；

g，用灭活剂灭活病毒；

h，超滤浓缩后的病毒悬液，通过凝胶过滤层析和离子交换层析纯化病毒液，或者通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒液，得纯化的病毒原液，即抗原；

i，配制及检定单、双价灭活疫苗半成品及成品，测量疫苗的安全性、有效性及稳定性。

其中，b步骤建立并检定疫苗株三级种子批库的方法为：经过噬斑纯化的Vero细胞上的4代毒种原始种子批；验明原始种子批的记录、历史、来源和生物学特性；从原始种子批在Vero细胞上传至第5代为主种子批；主种子批在Vero细胞上继续传代总次数不超过12代制备工作种子批。

c步骤中所用的细胞可以是从ATCC引进获得常规用于增殖肠道病毒的任何细胞，优选Vero细胞系的细胞，由工作Vero细胞库复苏，经传代扩增得到；细胞的培养方法为：将用于疫苗生产的Vero细胞系细胞在15L转瓶内以1∶6比例分种，培养3天后接种肠道病毒；或者在发酵罐内或在WAVE生物反应器中进行，其中，在发酵罐内进行时要使用微载体，使用浓度为1-10g/L，优选3g/L。

d步骤中微载体培养细胞成合适密度是指细胞密度达到3×10⁶/ml时接种病毒；以任何合适的感染复数接种病毒，优选感染复数(MOI)为0.001-0.01。

e步骤中增值病毒的用于细胞生长的培养基为常规培养基，如：199，MEM，可以购买；或者按照已公开的配方配制；优选无血清培养基或者培养基中应尽可能少地加入蛋白，例如：血清浓度低于2％，人血清白蛋白浓度低于0.1％；接种病毒后，按照常规方式培养细胞，优选在含5％CO₂的培养箱中于34-35℃培养细胞48-72小时。

f步骤的具体方法为：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，收获病毒，通过滤器澄清过滤，优选滤器孔径为0.45μm。

g步骤中灭活病毒可使用WHO规定的灭活剂和灭活条件：采用甲醛作为灭活剂，优选使用浓度1∶4000，灭活温度37℃，灭活时间为3天；或采用β-丙内酯作为灭活剂，按1∶4000在2～8℃灭活2天。

h步骤中超滤浓缩时使用的超滤膜的截留分子量优选200-300KD，浓缩倍数优选50-100倍。

h步骤中病毒液纯化的具体步骤为：

凝胶过滤层析和离子交换层析纯化：进行凝胶过滤层析，介质采用合适的凝胶过滤介质，如：德国Merk公司生产的Fractolgel，平衡液优选pH6.5-7.5的PBS；再进行离子交换层析，优选使用弱阴离子交换介质，例如：Merck公司生产的Fractogel EMD DEAE，缓冲盐溶液优选磷酸盐缓冲系统，平衡缓冲液优选盐浓度范围0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.06-0.12M的氯化钠；洗脱缓冲液优选盐浓度0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.2-0.4M的氯化钠；

或蔗糖密度梯度离心纯化：优选使用不连续蔗糖密度梯度为15％、30％和65％，30000g超速离心3小时后，收集15-35％蔗糖界面上的乳白色条带；

经过上述纯化后，细胞残余DNA含量低于100pg/ml，残余牛血清含量低于50ng/ml，得纯化的EV71灭活病毒原液或Cox.A16灭活病毒原液，即EV71抗原或Cox.A16抗原。

i步骤中的疫苗半成品和成品是指将上述灭活病毒原液配制成药学接受的载体：标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂，增溶剂；或配制成便于缓释的剂型，或添加铝盐吸附佐剂，或注射剂型；优选将上述纯化的EV71灭活病毒原液或Cox.A16灭活病毒原液，按常规比例混合制备成单价或双价的形式；或将由本发明制得的疫苗与本领域中的一种或多种疫苗制成联合疫苗。

其中，本发明疫苗的使用剂量为：

单价：一人份为0.5ml，含已灭活的EV71抗原或Cox.A16抗原1.5-2μg，Al(OH)₃佐剂0.25-0.5mg；

双价：一人份为0.5ml，含已灭活的EV71抗原和Cox.A16抗原共1.5-2μg，其中EV71抗原和Cox.A16抗原的比例为1∶1，Al(OH)₃佐剂0.25-0.5mg。

附图说明：

图1：病毒EV71以MOI＝0.1感染vero细胞的生长动力学；

图2：病毒Cox.A16以MOI＝0.1感染vero细胞的生长动力学；

图3：病毒EV71以MOI＝0.1感染Vero细胞的生长稳定性分析；

图4：病毒Cox.A16以MOI＝0.1感染Vero细胞的生长稳定性分析；

图5：手足口病病毒噬斑形态，左图为中性红，右图为结晶紫染色结果(400×)。

下述实验例或实施例进一步说明但不限于本发明。

具体实施方式

实施例1：制备本发明手足口病灭活疫苗

1、肠道病毒EV71和Cox.A16毒株检定

(1)病毒效价(Viral titration)测定

采用Reed&Muench方法进行测定，以能造成超过50％的Vero细胞株呈现典型肠道病毒细胞病变现象的最高病毒稀释倍数作为病毒效价值(TCID₅₀)：

以不含胎牛血清之199培养基为稀释液，对待测病毒株作十倍连续稀释，所得不同稀释倍数(1-10¹⁰)的病毒株每种稀释倍数接种96孔组织培养板中单层Vero细胞株(2×10⁴细胞/孔)8个复孔，并接种同样体积的199培养基为阴性对照。于含有2％胎牛血清的199培养基、5％CO₂及37℃培养环境下共同培养。培养后，以显微镜观察Vero细胞株于感染病毒株后所呈现典型肠道病毒细胞病变现象的结果，培养至细胞培养板中Vero细胞株产生之典型肠道病毒细胞病变现象不再增加时，采用Reed&Muench方法，计算病毒效价值。一般共同培养到第7天，判定EV71的TCID₅₀效价＝10^7.8，Cox.A16效价＝10^7.5。

(2)病毒生长分析

将单层Vero细胞株培养于含有2％胎牛血清的199培养基的24孔组织培养板中(10⁵细胞/孔)，分别以0.1MOI之病毒株在37℃下共同培养1小时。

以500μL含有2％胎牛血清的新鲜199培养基替换培养板中原培养基，之后在5％CO₂、37℃下共同培养。在生长曲线中每个测定的时间点，收集孔中所有内含物。

2000g离心6分钟，收集上清中病毒，存放于-70℃，测定病毒效价，为胞外病毒效价。

将沉淀加入原始培养基相同体积的培养基悬浮，冻结-融化三次，2000g离心6分钟，收集上清中病毒，存放于-70C，测定病毒效价，为胞内病毒效价。

所有的病毒效价测定均在同一批次中测定，结果见附图1和附图2。

(3)病毒传代稳定性分析

选用病毒株在Vero细胞上第10代，第20代，第30代病毒，分析其在Vero细胞上生长时的基因稳定性(VP1)和表现型的稳定性(病毒生长动力学分析)，见附图3和附图4。EV71和Cox.A16疫苗株第10代，第20代，第30代病毒的VP1基因同源性与原代病毒比较均超过99.9％，基因比较稳定。通过附图3和附图4可以看出，病毒生长比较稳定，EV71的病毒效价峰值稳定在TCID₅₀效价10^7.8左右，Cox.A16的病毒效价峰值稳定在TCID₅₀效价10^7.5左右。

(4)病毒噬斑纯化

采用单层法对已经进行病毒分离和初步鉴定的病毒进行纯化，将已经长成Vero细胞单层的6孔细胞培养板用不含血清的细胞维持液37℃浸泡1小时后倾弃，接种10倍倍比稀释的病毒于细胞培养板中，感作1小时后用不含血清的细胞维持液洗涤1次，加40-42℃的含中性红的营养琼脂糖，厚度约2mm，凝固后37℃培养至噬斑出现，或者约3-5天用结晶紫染色。挑斑后增殖病毒再作2轮纯化，为纯化的病毒，见图5。

2、手足口病灭活疫苗病毒株的选育

分离手足口病病人临床病料获得手足口病病毒株，候选病毒株具有完整的记录、历史、来源。测定候选病毒的生物学特性，灭活疫苗候选病毒株应该具备病毒产量高、诱导免疫保护的能力强、交叉保护谱广、稳定的生物学特性，并依据流行病学和分子流行病学调查资料选择的、当前和今后具有广泛流行潜力的野生株。噬斑纯化经过筛选的候选病毒株，制备三级种子批库，获得工作种子批病毒。测定临床感染康复病人血清的中和工作种子批病毒的能力。将工作种子批病毒免疫动物，分离血清后，测定血清中和其他手足口病病毒毒株的能力，筛选保护谱广、诱导保护能力强的病毒作为灭活疫苗病毒株。

3、病毒种子批的建立和检定

疫苗生产用毒种应以病毒种子批系统为基础进行三级管理，即原始种子批、主种子批和工作种子批。原始种子批为Vero上的4代毒种。原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性。从原始种子批在Vero细胞上传至第5代为主种子批，进行全面检定，主种子批在Vero细胞上继续传代制备工作种子批，在Vero细胞上传代总次数不得超过12代。毒种保存在-60℃以下。种子批检定包括鉴别试验、无菌试验、病毒滴定、病毒外源因子检查、免疫原性检查等项目，检定合格后方可使用。

4、疫苗生产工艺流程

细胞：采用非洲绿猴肾传代细胞系(Vero细胞系)。该细胞由日本学者于1963年从非洲绿猴肾分离得到。第112代被送至美国典型培养物保藏中心(ATCC)。军事医学科学院于1998年10月从美国ATCC获得120代Vero细胞，贮存和制备了原始种子库、主细胞库、工作细胞库，经检定，均符合《中国药典(第3版)》及《中国生物制品规程》关于动物细胞制备生物制品规程的要求。

病毒：制备EV71和Cox.A16原始种子批、主种子批和工作种子批三级库，。

细胞培养：复苏工作库细胞，将一只安瓶的细胞复苏到一个15L转瓶中，培养4-6天后，按照1∶6的分种比例传出6个转瓶，如此传代扩增至50至200个15L转瓶。细胞培养也可以在发酵罐内或者在WAVE生物反应器中进行。在发酵罐内可以使用微载体，例如，Pharmacia公司的Cytodexl^TM，使用浓度为优选3g/L。该微载体适合于Vero细胞生长，维持时间可达28天。在细胞密度达到3×10⁶/ml时接种病毒，例如对培养3天的细胞接毒。

病毒接种：细胞培养3天后，弃去细胞培养上清，接种工作种子批病毒。病毒接种量为0.1MOI，培养温度37℃，培养时间30-40小时，病毒维持液为无血清或含0.1％人血清白蛋白的199培养基。

收获病毒：当细胞出现明显病变时，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，由此收获病毒。

澄清过滤：用0.45μm的滤器过滤所有收获上清。

灭活病毒：病毒液采用β-丙内酯作为灭活剂，按1∶4000在2～8℃灭活2天，然后37℃水解2h。

超滤浓缩病毒：用截留分子量200KD超滤膜，浓缩倍数100倍。

凝胶过滤层析：用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FF^TM介质进行病毒纯化，收集外水体积流穿峰。杂蛋白去除可达95％以上。

离子交换层析：采用DEAE-SepharoseFF^TM介质，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS。

未进行病毒灭活步骤的疫苗生产过程中纯化及除菌过滤结果见表1。

表1未进行病毒灭活步骤的EV71和Cox.A16规模纯化及除菌过滤结果

配制：纯化后的EV71和Cox.A16灭活病毒原液混合，配制注射剂，两种灭活病毒原液的配制比例为1∶1(配制注射剂时是否需要加入佐剂？)。

5、疫苗纯度分析

根据《中国药典(第3版)》及《中国生物制品规程》关于《传代细胞作为生物制品细胞基质规程》的要求，测定疫苗的外观、无菌试验、DNA含量、蛋白质含量、牛血清蛋白残留量、pH值、支原体检查、病毒外源因子检查等。结果见表2。

表2疫苗成品检定结果

6、疫苗效力分析

采用Reed&Muench法测定血清中和效价。

将待测抗血清56℃30分钟灭活，以不含牛血清的199培养基稀释1-2¹¹倍。将稀释后样品加入含有100TCID₅₀病毒(64-160TCID₅₀/0.1mL)，2％胎牛血清，相同体积的199培养基中4℃孵育12小时。

将孵育后的混合液加入单层Vero细胞的96孔组织培养板中(2×10⁴细胞/孔)，37℃孵育1小时。

移除培养板中培养基，加入100μL2％胎牛血清的新鲜199培养基，5％CO2，37℃培养。

以显微镜观察，当培养至板中Vero细胞病变不增加时(第7天)，采用Reed&Muench法计算抗血清中和效价。

将本发明以上述方法制备的疫苗免疫SPF小鼠和猴体，每只小鼠每次0.1mL，每只猴子每次0.5mL，间隔14天，免疫3次，末次免疫后15天采血，分离血清。免疫恒河猴后血清于56℃30分钟灭活进行中和试验，测定血清中和效价，结果见表3。

表3疫苗成品免疫恒河猴产生的血清对肠道病毒临床分离株的中和抗体效价

7、安全性分析

按照中国生物制品规程，使用清洁级标准的小鼠和豚鼠对制备的灭活疫苗进行异常毒性试验，结果见表4。

表4疫苗成品异常毒性试验结果

取体重18-22g小鼠，注射前称取每只小鼠体重。每批样品用5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL测试疫苗，观察14天。

取体重250-350g豚鼠，注射前称取每只豚鼠体重。每批样品用5只豚鼠，每只豚鼠腹腔注射5.0mL测试疫苗，观察14天。

进行过敏原性试验，以牛血清为过敏试验的阳性对照，生理盐水为阴性对照。每组5只豚鼠，分别于腹部皮下注射0.5mL。隔日一次，共3次，第3次注射后24天，耳静脉给予相同物质0.5mL，立即观察注射后反应，结果见表5。

表5疫苗成品过敏原性试验结果

8、疫苗稳定性分析

将疫苗成品放于4℃，室温(20-25℃)，37℃6个月，观察效力稳定性、抗原稳定性、pH稳定性、外观稳定性。试验结果表明疫苗在4℃下存放稳定。手足口病灭活疫苗4℃的效力稳定性试验，结果见表6。

表6手足口病灭活疫苗4℃的效力稳定性试验结果

Claims

1.一种预防手足口病的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

a,选育手足口病疫苗株；

b,建立并检定疫苗株三级种子批库；

c,培养细胞；

d,在细胞长成致密单层或微载体培养细胞成合适密度时，接种病毒；

e,在细胞中增殖病毒；

f,收集细胞所产生的病毒悬液，澄清过滤，去除细胞残渣；

g,用灭活剂灭活病毒；

h,超滤浓缩后的病毒悬液，通过凝胶过滤层析和离子交换层析纯化病毒液，或者通

过蔗糖密度梯度离心纯化病毒液，得纯化的病毒原液，即抗原；

i,配制及检定单、双价灭活疫苗半成品及成品，测量疫苗的安全性、有效性及稳定

性;

该单价灭活疫苗由Cox.A16抗原与Al（OH）₃佐剂按下述重量比配制而成：

Cox.A16抗原 0.0015-0.002重量份

Al（OH）₃佐剂 0.25-0.5重量份；

该双价灭活疫苗由EV71抗原和Cox.A16抗原与Al（OH）₃佐剂按下述重量比配制而成：

EV71抗原和Cox.A16抗原共0.0015-0.002重量份

Al（OH）₃佐剂 0.25-0.5重量份；

其中EV71抗原和Cox.A16抗原的比例为1：1。

2.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中b步骤建立并检定疫苗株三级种子批库的方法为：经过噬斑纯化的Vero细胞上的4代毒种原始种子批；验明原始种子批的记录、历史、来源和生物学特性；从原始种子批在Vero细胞上传至第5代为主种子批；主种子批在Vero细胞上继续传代总次数不超过12代制备工作种子批。

3.如权利要求1或2所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中c步骤中所用的细胞是从ATCC引进获得常规用于增殖肠道病毒的Vero细胞系的细胞，由工作Vero细胞库复苏，经传代扩增得到；细胞的培养方法为：将用于疫苗生产的Vero细胞系细胞在15L转瓶内以1：6比例分种，培养3天后接种肠道病毒；或者在发酵罐内或在WAVE生物反应器中进行，其中，在发酵罐内进行时要使用微载体，使用浓度为1-10g/L。

4.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中d步骤中微载体培养细胞成合适密度是指细胞密度达到3×10⁶/ml时接种病毒；以0.001-0.01的感染复数（MOI）接种病毒。

5.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中f步骤的具体方法为：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，收获病毒，通过滤器澄清过滤，滤器孔径为0.45μm。

6.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中g步骤中灭活病毒使用WHO规定的灭活剂和灭活条件：采用甲醛作为灭活剂，使用浓度1：4000，灭活温度37℃，灭活时间为3天；或采用β－丙内酯作为灭活剂，按1:4000在2～8℃灭活2天。

7.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中h步骤中超滤浓缩时使用的超滤膜的截留分子量为200-300KD，浓缩倍数为50-100倍。

8.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中h步骤中病毒液纯化的具体步骤为：

凝胶过滤层析和离子交换层析纯化：进行凝胶过滤层析，介质采用合适的凝胶过滤介质，平衡液为pH6.5-7.5的PBS；再进行离子交换层析，使用弱阴离子交换介质，缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲系统，平衡缓冲液为盐浓度范围0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.06-0.12M的氯化钠；洗脱缓冲液为盐浓度0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.2-0.4M的氯化钠；

或蔗糖密度梯度离心纯化：使用不连续蔗糖密度梯度为15%、30%和65%，30000g超速离心3小时后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色条带；

9.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中i步骤中的疫苗半成品和成品是指将将纯化病毒原液配制成包括药学可接受的载体：标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂，增溶剂；或配制成便于缓释的剂型，或添加铝盐吸附佐剂，或注射剂型；

将上述纯化的EV71灭活病毒原液和Cox.A16灭活病毒原液，按常规比例混合制备成单价或双价的形式；或将i步骤中制得的疫苗与本领域中的一种或多种疫苗制成联合疫苗。

10.如权利要求1或2所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中c步骤中所用的细胞是从ATCC引进获得常规用于增殖肠道病毒的Vero细胞系的细胞，由工作Vero细胞库复苏，经传代扩增得到；细胞的培养方法为：将用于疫苗生产的Vero细胞系细胞在15L转瓶内以1：6比例分种，培养3天后接种肠道病毒；或者在发酵罐内或在WAVE生物反应器中进行，其中，在发酵罐内进行时要使用微载体，使用浓度为3g/L。