CN115216454A - 利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒灭活疫苗制备技术领域，具体涉及一种利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法。该利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法包括以下步骤：生物反应器无血清培养Vero细胞、病毒接种和培养。通过每天补加胰酶，促进病毒的增殖，并通过连续收获的方式，收获轮状病毒液，极大的提高了病毒产量。传统培养基中的血清，因其成分复杂，且难于检测，有较大的潜在风险，而无血清培养基成分清晰，无动物源成分添加。采用本发明内容，进行生物反应器大规模生产时在降低劳动力和空间需求以及污染风险的同时，还彻底消除了动物血清所存在的潜在风险。
Description
技术领域
本发明涉及病毒灭活疫苗制备技术领域，具体涉及一种利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法。
背景技术
目前，轮状病毒疫苗生产主要采用的是传统的转瓶培养、细胞工厂培养和发酵罐微载体培养。但上述培养模式均采用Vero细胞通过传统培养基进行，为解决细胞贴壁及病毒扩增的问题，需添加动物血清或一些蛋白水解物。因为动物血清及蛋白水解物成分复杂，难以检测，还存在有潜在未知病毒的风险，一直以来都是疫苗生产的一大安全隐患。同时轮状病毒引起的细胞病变较为温和，利用宿主细胞进行大规模增殖的能力较弱，导致产量较低，宿主细胞利用率低。较低的病毒宿主细胞杂质比，给下游纯化带来了极大的困难，大大提高了疫苗成本。因此开发新型的生产培养方式已成为一种趋势。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法，利用生物反应器无血清培养Vero细胞大规模培养轮状病毒，提高了轮状病毒产量和疫苗的安全性。
本发明的技术方案是这样实现的：一种利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1、生物反应器无血清培养Vero细胞:
A11、微载体的溶胀及灭菌
以GE为代表的Cytodex葡聚糖微载体或以华龛生物为代表的明胶微载体等专用于各类动物细胞的贴壁培养的微球；按照其说明书进行溶胀及灭菌处理待用。
A12、微载体预培养
将灭菌好的微载体转移至生物反应器，微载体密度控制在2g/L～18g/L之间，通过带滤网的排液管，充分排出灭菌所用溶液。
通过生物反应器顶管，加入无血清培养基，开启搅拌，充分混匀半小时以上，通过带滤网的排液管，充分排出无血清培养基。
重复三次上述操作后，补充无血清培养基至培养体积的40%～80%按培养条件设置生物反应器转速30～80转/分钟、温度35～39℃、pH值6.5～8.0、溶氧15％～100％，开始培养，三个小时以后，待生物反应器运行稳定后可进行细胞接种。
A2、细胞接种:
A21、细胞的挑选
选出培养4～7天、生长成致密单层、形态良好、不卷边、不脱落、无pH异常、无污染、培养液清亮的细胞；
A22、清洗细胞
将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝上，弃旧液，以含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS作为洗液加入细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，并将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3～5次，以冲洗细胞贴壁生长面；
A23、消化细胞
打开细胞培养瓶的瓶盖，弃洗液，加入0.125%胰蛋白酶消化液于细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3～5次，使胰蛋白酶消化液完全浸润细胞贴壁生长面，之后打开瓶盖，在酒精灯火焰保护下使细胞贴壁生长面朝上，弃胰蛋白酶消化液，再使细胞贴壁生长面朝下，平放3～15分钟，当细胞呈毛玻璃状时，轻拍细胞培养瓶，使细胞呈流沙状滑下后，直立细胞培养瓶；
所述0.125%胰蛋白酶消化液按下列体积比配制：
磷酸盐缓冲液PBS 84.7～87.5%
1%胰蛋白酶 12.0～14.0%
4% EDTA.2Na 0.3～0.8%
1mol/L NaOH 0.2～0.5%
各组分总合 100%；
A24、悬浮细胞
在细胞培养瓶中加入与步骤A相同的细胞培养液，拧紧瓶盖，使细胞贴壁生长面朝下，振摇细胞培养瓶，以分散细胞成细胞悬液，收集细胞悬液于虹吸瓶中，旋转摇晃该虹吸瓶5～10次，使细胞混匀；
A25、细胞接种
将上述准备好的细胞悬液接种至A1预培养中的生物反应器内。根据微载体密度的不同，接种细胞总数控制在1×105～2.5×106个细胞/ml（按最终培养体积计算）。
A3、细胞培养
A31、设置生物反应器中的转速30～80转/分钟、温度为35～39℃、pH值为6.5～8.0、溶氧15％～100％的条件下，进行细胞扩增培养；
A32、随着细胞的不断扩增，细胞密度逐渐增大，采用灌流培养、循环培养、换液培养中的一种继续进行细胞培养，获得规模化Vero细胞。
所述灌流培养，即通过连接生物反应器的进液管及其上的泵，送入新的细胞培养液、排出原有的细胞培养液及代谢产物，使生物反应器培养体积保持不变，提供细胞生长所必须的营养元素。
所述循环培养，即在生物反应器旁挂上新细胞培养液瓶，通过进液管及其上的泵将生物反应器与新细胞培养液瓶连通，使新的细胞培养液不断送入生物反应器中进行细胞培养，再通过生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物，实现细胞培养液循环，满足细胞生长所必须的营养元素。
所述换液培养，即在细胞培养过程中，将生物反应器中的原有细胞培养液及代谢产物通过出液管及其上的泵排出，再通过进液管及其上的泵送入新的细胞培养液，实现细胞培养液的更替，满足细胞生长所必须的营养元素。
A33、按照上述的方式进行3～8天的培养，待细胞长至单层，细胞密度在1×106～2×107个细胞/ml之间，即可进行病毒接种。
A4、病毒培养
A41、病毒接种
根据细胞计数结果，按MOI 0.01～0.8计算所需病毒液用量，在病毒液中加入胰蛋白酶，终浓度控制在1 mg/L～20 mg/L。调整pH≥7.2，将病毒液置于30℃～40℃，孵育激活20～120分钟。最后将激活后的毒液接种至生物反应器内，进行病毒培养。
A42、设置生物反应器中的转速30～80转/分钟、温度为35～39℃、pH值为6.5～8.0、溶氧15％～100％的条件下，进行细胞扩增培养；
A43、在病毒培养24小时后，可以开启灌流模式，按培养体积的10%～200%进行灌流式培养。
所述灌流式培养，即通过连接生物反应器的进液管及其上的泵，收获病毒液，同时按收获液的量，补加新鲜的无血清培养基，以维持生物反应器培养体积的不变。
A44、在病毒培养24小时后，与步骤43同时，每天定量添加胰蛋白酶，添加浓度控制在0.01 mg/L ～10 mg/L。
A45、每天取样，观察细胞病变情况，病毒收获可持续24～192小时，直至细胞完全病变破碎脱落为止。但观察到细胞完全脱落，即停止灌流，将生物反应器内的病毒液完全收获。
本发明还公开了一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法，利用收获的轮状病毒液按常规方法，制备成病毒活疫苗或者病毒灭活疫苗。
本发明解决了背景技术中存在的缺陷,具有以下有益效果：本发明利用生物反应器无血清培养Vero细胞大规模培养轮状病毒，通过胰蛋白酶对轮状病毒进行激活后使其能够感染Vero细胞，进行增殖，并在病毒接种后24～48小时后持续添加胰蛋白酶，以维持病毒培养液的胰蛋白酶浓度，使其能够在病毒增殖高峰期后仍能够在Vero细胞上持续增殖，极大的提高病毒产量。在使用微载体无血清培养基大规模培养Vero细胞，利用灌流技术，使得细胞能在微载体上表现出与传统培养基加血清一样的细胞扩增，持续的收获病毒液，极大的提高病毒产量。同时采用该无血清培养基进行轮状病毒培养，实现了整个培养阶段无动物源成分，极大的提高了疫苗的安全性。采用了高浓度胰蛋白酶激活病毒使其可感染宿主细胞，并通过连续补加胰酶的技术手段，保证了轮状病毒的持续扩增，极大的提高了宿主细胞的利用率，并采用轮状病毒灌流培养的技术手段，极大提高了病毒产量，显著降低了疫苗制造成本，能够很好地满足市场需求。
附图说明
图1为实施例1细胞24小时培养后分布图；
图2为实施例1细胞120小时培养后分布图；
图3为实施例1 微载体无血清培养Vero细胞生长曲线图；
图4为连续8天细胞病变情况对比图；
图5为连续8天病毒收获液Pattern检测结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
Vero细胞世界卫生组织认可的疫苗生产细胞系，具有可连续传代、生长速度快、遗传性状稳定，恶性转化程度低、生物安全性较高、培养条件要求不苛刻、易于在生物反应器实施大规模培养等优势。接种的病毒毒株ZTR-68，为轮状病毒G1型毒株。所使用无血清培养基由多家培养基供应商提供，经测试，按本发明方案进行适当调整，均可取得令人满意的效果，本实施例随机选取其中一种进行培养。
1、生物反应器的准备
1.1、微载体的溶胀及灭菌
以GE的Cytodex 1微载体60g按照其说明书，使用0.23mol/L PBS进行4℃溶胀24小时，121℃ 高温灭菌30 分钟待用。
A12、微载体预培养
将灭菌好的60g微载体转移至10L生物反应器，微载体密度最终密度为6g/L，通过带滤网的排液管，充分排出0.23mol/L PBS。
通过生物反应器顶管，加入无血清培养基，开启搅拌，充分混匀30分钟，通过带滤网的排液管，充分排出无血清培养基。
重复三次上述操作后，补充无血清培养基5L,设置生物反应器转速50转/分钟、温度37℃、pH值7.2、溶氧80％，开始培养。
A2、细胞接种
A21、细胞的挑选
选出培养5天、生长成致密单层、形态良好、不卷边、不脱落、无pH异常、无污染、培养液清亮的细胞；
A22、清洗细胞
将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝上，弃旧液，以含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS作为洗液加入细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，并将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3-5次，以冲洗细胞贴壁生长面；
A23、消化细胞
打开细胞培养瓶的瓶盖，弃洗液，加入0.125%胰蛋白酶消化液于细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3～5次，使胰蛋白酶消化液完全浸润细胞贴壁生长面，之后打开瓶盖，在酒精灯火焰保护下使细胞贴壁生长面朝上，弃胰蛋白酶消化液，再使细胞贴壁生长面朝下，平放3～15分钟，当细胞呈毛玻璃状时，轻拍细胞培养瓶，使细胞呈流沙状滑下后，直立细胞培养瓶；
所述0.125%胰蛋白酶消化液按下列体积比配制：
磷酸盐缓冲液PBS 84.7～87.5%
1%胰蛋白酶 12.0～14.0%
4% EDTA.2Na 0.3～0.8%
1mol/L NaOH 0.2～0.5%
各组分总合 100%；
A24、悬浮细胞
在细胞培养瓶中加入与步骤A相同的细胞培养液，拧紧瓶盖，使细胞贴壁生长面朝下，振摇细胞培养瓶，以分散细胞成细胞悬液，收集细胞悬液于虹吸瓶中，旋转摇晃该虹吸瓶5-10次，使细胞混匀；
A25、细胞接种
将上述制得的细胞悬液，培养体积为10L，细胞总数为5.6×109个细胞，完全接种于预培养3小时，运行稳定的15L生物反应器，细胞密度为5.6×105个细胞/ml。
A3、细胞培养
A31、设置生物反应器中的转速50转/分钟、温度为37℃、pH值为7.2、溶氧80％进行细胞扩增培养；
细胞培养24小时后，取样观察，可见细胞贴壁均匀，形态正常。培养悬液终无悬浮细胞。如图1所示。
对细胞进行计数，细胞密度为6.3×105个细胞/ml。
A32、每天取样进行细胞计数，培养至48小时，细胞密度为1.1×106个细胞/ml。即开启灌流培养，灌流速度为5L/天。
培养至120小时，细胞密度为6.2×106个细胞/ml，镜下观察可见细胞已长为致密单层，如图2所示，细胞培养120小时已长至致密单层。整个细胞生长曲线如图3所示，可见细胞已出现平台期拐点。
A4、病毒培养
A41、病毒接种
根据细胞计数结果，按MOI 0.01计算所需病毒液用量。相关计算公式：MOI= (病毒滴度X病毒体积) /细胞数目。取200ml 病毒滴度log CCID50为6.49的ZTR-68毒种(轮状病毒G1)，在病毒液中加入2000ug胰蛋白酶。调整pH至 7.6，将病毒液置于37 ℃，孵育激活30分钟。最后将激活后的病毒液接种至生物反应器内，进行病毒培养。
A42、设置生物反应器中的转速50转/分钟、温度为37℃、pH值为7.2、溶氧30％进行病毒培养；
A43、在病毒培养至48小时后，开启灌流模式，按5L/天进行灌流培养。
A44、在病毒培养24小时后，同时每天补加胰蛋白酶50mg。
A45、每天取样，观察细胞病变情况，培养至192小时，细胞完全病变破碎脱落。即停止灌流，将生物反应器内的病毒液完全收获。共收获得病毒液64L。
每天观察细胞病变情况如图4所示。图4中，图从左至右，从上至下依次是细胞24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h病变情况。
3.1.3.病毒收获液检测情况
抗原含量及蛋白含量检测结果如下表
整体抗原含量与传统批培养无显著性差异，但收获体积远大于批培养。10L细胞悬液共收获病毒液64L，若采用传统批培养，其收获体积约为8L，在抗原含量相同的情况下，抗原产量提高了进8倍。
每隔24小时取病毒培养液，如图5所示的连续8天病毒收获液Pattern检测结果。提取病毒基因组后进行PAGE电泳，电泳条带排列为4-2-3-2型，与参考病毒ZTR-68的病毒RNA基因组带型保持一致。
规模化培养病毒是制备疫苗最基本的条件。目前，主要采用转瓶来生产轮状病毒。微载体无血清大规模培养Vero细胞制备轮状病毒，采用灌流培养的模式，使得Vero细胞在无血清条件下获得了很好的增殖。病毒培养阶段，采用连续补加胰酶的手段，使得整个病毒培养阶段，病毒液都能维持一定的胰酶浓度下，使得新扩增出来的轮状病毒有再次感染宿主细胞，并继续增殖的能力，极大的提高了宿主细胞的利用率。并采用灌流的形式对增殖病毒进行收集，病毒收获液在获得了与批培养相同的抗原含量同时获得了批培养6～10倍的收获液体积，极大的提高了产能。缓慢的病毒液收获过程，因宿主细胞缓慢的破碎脱落，使得收获液蛋白含量较低，无血清培养基的使用，这些都使得在后续的纯化上，极大的降低了纯化难度，更少的杂质，带来的是更高的纯化回收率，更高的纯度，这些都极大提高了疫苗的安全性，更适合于规模化、产业化制备疫苗生产的需求，这将是极佳的轮状病毒疫苗生产工艺。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (7)
1.一种利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1、生物反应器无血清培养Vero细胞:
A11、微载体的溶胀及灭菌
以葡聚糖微载体或明胶微载体用于细胞的贴壁培养，按照其说明书进行溶胀及灭菌处理待用；
A12、微载体预培养
将灭菌好的微载体转移至生物反应器，微载体密度控制在2g/L～18g/L之间，使用无血清培养基充分置换灭菌溶液，按培养条件设置生物反应器转速30～80转/分钟、温度35～39℃、pH值6.5～8.0、溶氧15％～100％，开始预培养，三个小时以后，待生物反应器运行稳定后可进行细胞接种；
A2、细胞接种：
挑选培养4～7天、生长成致密单层、形态良好、不卷边、不脱落、无pH异常、无污染、培养液清亮的Vero细胞；经胰蛋白酶消化后重悬；按细胞密度1×105～2.5×106个细胞/ml接种至预培养运行稳定的生物反应器中；
A3、细胞培养：
A31、设置生物反应器中的转速30～80转/分钟、温度为35～39℃、pH值为6.5～8.0、溶氧15％～100％的条件下，进行细胞扩增培养；
A32、随着细胞的不断扩增，细胞密度逐渐增大，采用灌流培养、循环培养或换液培养中的一种继续进行细胞培养，获得规模化Vero细胞；
A33、按照上述的方式进行3～8天的培养，待细胞长至单层，细胞密度在1×106～2×107个细胞/ml之间，即可进行病毒接种；
A4、病毒培养：
A41、病毒接种
根据细胞计数结果，按MOI 0.01～0.8计算所需轮状病毒液用量，在轮状病毒液中加入胰蛋白酶，终浓度控制在1 mg/L～20 mg/L，调整pH≥7.2，将病毒液置于30℃～40℃，孵育激活20～120分钟，最后将激活后的病毒液接种至生物反应器内，进行病毒培养；
A42、设置生物反应器中的转速30～80转/分钟、温度为35～39℃、pH值为6.5～8.0、溶氧15％～100％的条件下，进行细胞扩增培养；
A43、在病毒培养24小时后，开启灌流模式，按培养体积的10%～200%进行灌流式培养；
A44、在病毒培养24小时后，与步骤43同时，每天定量添加胰蛋白酶，添加浓度控制在0.01 mg/L～10 mg/L；
A45、每天取样，观察细胞病变情况，病毒收获可持续24～192小时，直至细胞完全病变破碎脱落，一旦观察到细胞完全脱落，即停止灌流，将生物反应器内的轮状病毒液完全收获。
2.根据权利要求1所述的利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法，其特征在于：在步骤A3中，
所述灌流培养，即通过连接生物反应器的进液管及其上的泵，送入新的细胞培养液、排出原有的细胞培养液及代谢产物，使生物反应器培养体积保持不变，提供细胞生长所必须的营养元素；
所述循环培养，即在生物反应器旁挂上新细胞培养液瓶，通过进液管及其上的泵将生物反应器与新细胞培养液瓶连通，使新的细胞培养液不断送入生物反应器中进行细胞培养，再通过生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物，实现细胞培养液循环，满足细胞生长所必须的营养元素；
所述换液培养，即在细胞培养过程中，将生物反应器中的原有细胞培养液及代谢产物通过出液管及其上的泵排出，再通过进液管及其上的泵送入新的细胞培养液，实现细胞培养液的更替，满足细胞生长所必须的营养元素。
3.根据权利要求1或2所述的利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法，其特征在于：采用所述灌流培养、循环培养或换液培养的方式，能够提供细胞增殖必须的营养元素同时排除细胞增殖代谢终产物。
4.根据权利要求1所述的利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法，其特征在于：在步骤A43中，所述灌流式培养，即通过连接生物反应器的进液管及其上的泵，收获病毒液，同时按收获液的量，补加新鲜的无血清培养基，以维持生物反应器培养体积的不变。
5.根据权利要求1所述的利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法，其特征在于：用于细胞培养及病毒培养的培养基均为无血清培养基，所述无血清培养基各组分均为人工合成，不添加血清和水解物等复杂的动物源成分。
6.根据权利要求1所述的利用生物反应器无血清大规模培养轮状病毒的方法，其特征在于：步骤A2中，所述Vero细胞的培养条件为转速30～80转/分钟、温度35～39℃、pH值6.5～8.0、溶氧15％～100％。
7.一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
使用权利要求1～6任一项所述的培养轮状病毒的方法对轮状病毒毒株进行培养，得到轮状病毒液；
将收获的病毒液按常规制备成病毒活疫苗或者病毒灭活疫苗。
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