CN102115729B

CN102115729B - 无血清培养bhk21细胞的方法和制备疫苗的方法

Info

Publication number: CN102115729B
Application number: CN 200910265983
Authority: CN
Inventors: 张韧; 陈文庆; 王建超
Original assignee: Beijing Skywing Technology Co Ltd
Current assignee: Merck Millipore Beijing Skywing Co ltd
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2029-12-31
Also published as: CN102115729A

Abstract

本发明提供了一种无血清培养BHK21细胞的方法，该方法包括将BHK21细胞接种到细胞培养基中培养，其中，所述细胞培养基包括基本培养基，并且以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。此外，本发明还提供了包括所述培养BHK21细胞的方法的制备疫苗(例如狂犬病疫苗和口蹄疫疫苗)的方法。由于本发明的方法使用了含有植物蛋白的培养基来培养BHK21细胞，本发明的方法所得BHK21细胞培养密度高、利于分离细胞下游产品、被培养细胞的批次差异性小、安全性好，适于用作生产疫苗等生物制品的病毒宿主、表达载体等。

Description

无血清培养BHK21细胞的方法和制备疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种培养BHK21细胞的方法以及制备疫苗的方法，尤其是一种无血清培养BHK21细胞的方法以及包括所述培养BHK21细胞的方法的制备疫苗的方法。

背景技术

现有的无血清培养BHK21细胞的方法中，一般通过增加大豆水解产物作为无血清动物细胞培养基的组分，来提高被培养BHK21细胞培养稳定性和培养密度、增加被培养BHK21细胞产量及利用BHK21细胞作为表达载体后所产生重组靶蛋白产物的产量。并且认为其它植物的水解产物，例如小麦水解产物不能得到与大豆水解产物相当的有益效果。

例如CN 1318577C(专利号00816020.1)中公开了一种培养哺乳动物细胞的方法，该方法使用了无蛋白无血清培养基，所述培养基包含大豆水解产物，其中至少40％的所述大豆水解产物的分子量≤500道尔顿。该培养基能够起到提高被培养重组细胞培养稳定性、终细胞密度以及重组细胞靶蛋白产率的作用。WO 02/29084也在说明书实施例中提及可以向培养动物细胞的培养基中添加大豆蛋白的水解产物。

但是大豆水解产物中除了含有大豆蛋白外还含有许多其他成分，比如，大豆油、大豆多糖、大豆皂甙等，因此在向无血清动物细胞培养基中添加大豆水解产物的同时，极有可能加入上述其他成分即加入杂质成分，从而不利于细胞的增殖和生长。此外，由于大豆蛋白在不同水解条件下被水解程度不同，因而得到的大豆蛋白水解产物成分很难统一，会造成培养基成分不确定，从而使被培养细胞的批次差异性大，且使被培养细胞的下游产品分离困难。

综上，虽然现有技术已经出现了使用添加大豆水解产物的无血清动物细胞培养基的培养动物细胞的方法，但目前这类动物细胞培养方法仍然存在细胞培养密度低、分离细胞下游产品成本高、被培养细胞的批次差异性大、安全性差的缺陷。

发明内容

本发明的目的是克服现有无血清培养BHK21细胞的方法存在细胞培养密度低、分离细胞下游产品成本高、被培养细胞的批次差异性大、安全差的缺点，提供一种新的无血清培养BHK21细胞的方法，该方法的细胞培养密度高、利于分离细胞下游产品、成本低、被培养细胞的批次差异性小、安全性好。

本发明的第二个目的是提供包括所述培养BHK21细胞的方法的制备狂犬病疫苗的方法。

本发明的第三个目的是提供包括所述培养BHK21细胞的方法的制备口蹄疫疫苗的方法。

现有技术公开的无血清培养BHK21细胞的方法揭示，向无血清细胞培养基中加入除大豆水解蛋白外的其他蛋白效果不好，例如，在CN 1318577C的说明书第3-4页明确记载，“与现有技术已知的其它水解产物(例如小麦水解产物、水稻水解产物或酵母水解产物)相反，已经发现仅大豆水解产物介导按照本发明的特性，并且导致例如显著提高重组靶蛋白的得率。”在该文件的实施例7中揭示出小麦水解产物不如大豆蛋白水解产物效果好。

然而本发明的发明人意外地发现，向无血清基本培养基中以培养基溶剂的体积为基准，加入100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白，用于无血清培养基培养叙利亚地鼠肾细胞(BHK21细胞)时，能够达到的细胞培养密度远高于现有技术添加大豆水解产物或大豆蛋白水解产物的无血清培养方法所能达到的细胞培养密度；由于添加的成分确定，一方面有利于分离细胞下游产品，使成本降低，另一方面使被培养细胞的批次差异性大大减小，安全性更好。

本发明提供了一种无血清培养BHK21细胞的方法，该方法包括将BHK21细胞接种到细胞培养基中培养，其中，所述细胞培养基包括基本培养基，并且以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。

本发明还提供了一种制备疫苗的方法，所述方法包括培养作为病毒宿主的BHK21细胞的步骤，其中，所述培养BHK21细胞的步骤按照本发明所述无血清培养BHK21细胞的方法进行。

与现有的添加大豆水解产物或大豆蛋白水解产物的无血清培养BHK21细胞的方法相比，本发明的无血清培养BHK21细胞的方法中还包括向无血清基本培养基中以培养基溶剂的体积为基准，加入100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。使用本发明的方法无血清培养BHK21细胞时，能够达到的细胞培养密度大大提高；由于添加的成分确定，一方面有利于分离细胞下游产品，使成本降低，另一方面使被培养细胞的批次差异性大大减小，安全性更好。包括本发明的无血清培养BHK21细胞的方法的制备病毒疫苗的方法，大大提高了疫苗生产的效率。

附图说明

图1为使用本发明实施例1的无血清培养BHK21细胞的方法培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍)；

图2为使用对比例1(CN 1318577C)的无血清动物细胞培养方法(包括大豆水解产物)培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍)；

图3为使用对比例2(WO 02/29084)的无血清动物细胞培养方法(包括大豆水解产物)培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍)；

图4为使用本发明实施例2的无血清培养BHK21细胞的方法培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍)；

图5为使用实施例3的无血清培养BHK21细胞的方法培养48小时的BHK21细胞的照片(放大300倍)；

图6为使用实施例4的无血清培养BHK21细胞的方法培养48小时的BHK21细胞的照片(放大200倍)；

图7为对比例1-2和实施例1-4随培养时间变化的BHK21细胞密度对比图。

具体实施方式

本发明的无血清培养BHK21细胞的方法，优选其中以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋白、150-180g/100L的蚕豆蛋白、50-80g/100L的马铃薯蛋白、150-180g/100L的小麦麸蛋白和50-80g/100L的水稻蛋白；更优选其中以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的豌豆蛋白、170-180g/100L的蚕豆蛋白、50-60g/100L的马铃薯蛋白、150-160g/100L的小麦麸蛋白、50-60g/100L的水稻蛋白。

本发明的无血清培养BHK21细胞的方法中，所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白可以是商业上可供的商品，也可以是按照常规实验手段从相应植物种子或果实中分离出来的蛋白。蛋白质的分离提纯方法以及定性定量的检测方法为本领域技术人员公知，比如TCA-丙酮法(Mechin V，Damerval C，Zivy M.Total protein extraction with TCA-acetone.Methods MolBiol 2007；355：1-8)、酸水解以及酶水解法，优选酶水解法。

优选本发明所述的大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白通过以下方法制备：

a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至直径为0.1-3mm³的颗粒；

b)在酶解时间为0.5-10h、酶解PH值为5-9、酶解温度为45℃-60℃、酶量为2-5重量％的条件下酶解步骤a)所得的颗粒；其中，所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种，所述酶的酶活≥1×10⁵单位/克；

c)在80-100℃保持5-20min以终止步骤b)所述的酶解；

d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-8000rpm下离心5-20min，收集上清液；

e)将步骤d)所得上清液用中空纤维过滤器超滤，所述过滤器所用膜的透过分子量为10000-20000道尔顿；

f)收集步骤e)所得超滤液，真空冷冻干燥，获得相应植物蛋白。

更优选所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白通过以下方法制备：

a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至直径为0.1-1mm³的颗粒；

b)在酶解时间为2-10h、酶解PH值为5-8、酶解温度为45℃-60℃、酶量为2-5重量％的条件下酶解步骤a)所得的颗粒；其中，所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种，所述酶的酶活≥1×10⁵单位/克；

c)在80-90℃保持5-10min以终止步骤b)所述的酶解；

d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-5000rpm下离心15-20min，收集上清液；

更优选地，根据不同的植物原料进行不同的前处理，例如，对于豆类原料(大豆、豌豆和蚕豆)可以先脱脂前处理。不同的植物原料也可以采用不同的酶解条件，例如，在温度为52.9℃、碱性蛋白酶(10⁵单位/克)加酶量为5.2％、pH为8.7、底物浓度为8.06重量％以及提取时间为2小时的条件下制备小麦麸蛋白；或者在温度为50℃、中性蛋白酶(10⁵单位/克)加酶量为4％、pH为6.8、底物浓度为6.5重量％以及提取时间为2.5小时的条件下制备小麦麸蛋白。马铃薯蛋白可以通过以下方法制得：清洗去皮马铃薯原料与等体积1％亚硫酸钠溶液匀浆，固液分离(离心、静置或榨汁)，收集所得马铃薯汁在pH为3.0下静置5h，离心收集沉淀，喷雾干燥得粉末。收集所述粉末加缓冲液，在温度为50℃、胰蛋白酶加酶量(10⁵单位/克)为4％、pH为8.0、底物浓度为20重量％(10⁵单位/克)以及提取时间为1.5小时的条件下制备马铃薯蛋白。

本发明的无血清培养BHK21细胞的方法，其所使用的基本培养基是本领域常用的各种基本培养基，例如，选自BME细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、Fischer′s细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、F10细胞培养基、F12细胞培养基和1640细胞培养基中的一种或几种。优选包括的所述基本培养基为重量比1∶1的F12细胞培养基和DMEM细胞培养基。所述基本培养基的成分为本领域公知，上述列举的基本培养基名称为它们的商品名，商业上可供。

更优选本发明无血清培养BHK21细胞的方法所使用的培养基中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括下表1所示的组分：

表1

组分	g/100L	组分	g/100L
				无水氯化钙	10-20	L-色氨酸	0.5-2
五水合硫酸铜	0-0.001	L-酪氨酸	2-10
				九水合硝酸铁	0-0.01	L-缬氨酸	3-10
七水合硫酸亚铁	0.1-0.5	D-葡萄糖	500-700
				氯化钾	10-50	HEPES	300-400
六水合氯化镁	1-10	亚油酸	0.01-0.05
				无水硫酸镁	2-8	硫辛酸	0.05-0.1
氯化钠	600-700	1，4-丁二胺二盐酸盐	0.02-1
				无水磷酸二氢钠	2-8	丙酮酸钠	10-20
磷酸氢二钠	6-10	维生素H	0.001-0.005
				七水合硫酸锌	0.01-0.05	D-泛酸钙	0.1-0.5
无水磷酸二氢钾	2-10	氯化胆碱	5-10
				L-精氨酸盐酸盐	20-80	叶酸	0.1-0.5
L-胱氨酸盐酸盐	3-10	i-肌醇	2-10
				L-谷氨酰胺	50-150	烟酰胺	0.1-0.5
甘氨酸	2-8	盐酸吡哆醛	0.1-0.5
				L-组氨酸盐酸盐	1-5	盐酸吡哆醇	0.01-0.05
L-异亮氨酸	4-10	核黄素	0.01-0.05
				L-亮氨酸	4-10	盐酸硫胺	0.1-0.5
L-赖氨酸盐酸盐	5-12	胸苷	0.01-0.05
				L-蛋氨酸	0.5-5	维生素B12	0.1-1
L-苯丙氨酸	2-6	重组人胰岛素	0.2-1
				L-丝氨酸	1.5-5	亚硒酸	0.0001-0.001
L-苏氨酸	3-8	乙醇胺	0-0.0005
				L-丙氨酸	0.2-1	大豆蛋白	100-200
L-天门冬酰胺	6-15	豌豆蛋白	120-200
				L-天门冬氨酸	0.5-2	蚕豆蛋白	120-180
L-半胱氨酸盐酸盐	10-20	马铃薯蛋白	0-50
				L-谷氨酸	0-2	小麦麸蛋白	0-100
L脯氨酸	8-20	水稻蛋白	50-100

更优选本发明无血清培养BHK21细胞的方法所使用的培养基中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括0.1-1g/100L的次黄嘌呤和/或0.1-2g/100L的酚红。其中，次黄嘌呤可以作为嘌呤的来源；酚红作为pH值指示剂加入，可以通过目测随时掌握细胞的生长情况。

进一步优选本发明无血清培养BHK21细胞的方法所使用的培养基中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括下表2所示的组分：

表2

组分	g/100L	组分	g/100L
				无水氯化钙	15-20	L-色氨酸	1-2
五水合硫酸铜	0-0.001	L-酪氨酸	2-8
				九水合硝酸铁	0-0.01	L-缬氨酸	3-10
七水合硫酸亚铁	0.3-0.5	D-葡萄糖	500-700
				氯化钾	30-50	HEPES	300-400
六水合氯化镁	3-10	亚油酸	0.01-0.05
				无水硫酸镁	3-8	硫辛酸	0.05-0.1
氯化钠	600-700	1，4-丁二胺二盐酸盐	0.02-1
				无水磷酸二氢钠	2-8	丙酮酸钠	10-20
磷酸氢二钠	6-10	维生素H	0.001-0.005
				七水合硫酸锌	0.01-0.05	D-泛酸钙	0.1-0.5
无水磷酸二氢钾	2-10	氯化胆碱	5-10
				L-精氨酸盐酸盐	20-80	叶酸	0.1-0.5
L-胱氨酸盐酸盐	3-10	i-肌醇	5-10
				L-谷氨酰胺	50-150	烟酰胺	0.3-0.5
甘氨酸	2-8	盐酸吡哆醛	0.1-0.4
				L-组氨酸盐酸盐	1-5	盐酸吡哆醇	0.01-0.04
L-异亮氨酸	4-10	核黄素	0.03-0.05
				L-亮氨酸	4-10	盐酸硫胺	0.3-0.5
L-赖氨酸盐酸盐	5-12	胸苷	0.01-0.04
				L-蛋氨酸	0.5-5	维生素B12	0.1-0.5
L-苯丙氨酸	2-6	重组人胰岛素	0.5-1
				L-丝氨酸	1.5-5	亚硒酸	0.0001-0.005
L-苏氨酸	3-8	乙醇胺	0-0.0003
				L-丙氨酸	0.2-1	大豆蛋白	150-200
L-天门冬酰胺	6-15	豌豆蛋白	120-180
				L-天门冬氨酸	0.5-2	蚕豆蛋白	120-180
L-半胱氨酸盐酸盐	10-20	马铃薯蛋白	20-50
				L-谷氨酸	0-2	小麦麸蛋白	0-50
L-脯氨酸	10-20	水稻蛋白	60-90

制备本发明所用细胞培养基的方法，可以将包括将无血清BHK21细胞培养基干粉的组分分散在分散剂中，移除所得混合物中的分散剂。所述无血清BHK21细胞培养基干粉的组分在分散剂中的分散可以通过本领域常用的各种分散方法实现，比如搅拌、超声振荡等。

制备本发明所用无血清BHK21细胞培养基干粉可以使用干法和湿法两类方法。所谓干法指在干燥的条件下混合固体组分的粉末(比如利用球磨机球磨混合)。使用干法时，优选首先按照构成培养基干粉的各个组分的性质对它们分别干燥。比如将无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾可以在100-120℃，优选100-105℃下干燥1-5小时；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐在30-80℃优选35-50℃下干燥1-3小时；将七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠放入真空干燥箱内抽真空干燥10小时以上。所谓湿法指将可以形成本发明无血清BHK21细胞培养基干粉的固体组分与分散剂混合，然后移除所得混合物的分散剂。还可以将干法与湿法结合，即将一部分固体组分用湿法混合，移除分散剂后，用干法与其余部分的固体组分混合。

所述分散剂可以选自本领域用于制备无血清动物细胞培养基干粉的各种分散剂。所述分散剂的作用是使无血清BHK21细胞培养基干粉的各种组分均匀地混合，一般对分散剂没有特别的要求，只要不引入新的影响细胞生长的离子、污染杂质(如内毒素、微生物等)，不改变该动物细胞培养基干粉分散于培养基溶剂后的适宜细胞生长的pH值范围、在不破坏培养基组分(比如使蛋白质变性)的前提下容易去除即可。因此所述分散剂优选选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水、超纯水、能与水以任意比互溶的醇、碱性水溶液和酸性水溶液中的一种或几种，其中所述碱性水溶液为氨水或者本发明所用无血清BHK21细胞培养基干粉中出现的阳离子的碱的水溶液，所述酸性水溶液为本发明所用无血清BHK21细胞培养基干粉出现的酸根离子的酸的水溶液。所述能与水以任意比互溶的醇可以为乙醇、甲醇、丙醇中的一种或几种。所述碱性水溶液优选氢氧化钠的水溶液、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钙的水溶液、氨水、碱性氨基酸的水溶液中的一种或几种，最优选氢氧化钠的水溶液。所述酸性水溶液优选盐酸溶液、硫酸的水溶液、硝酸的水溶液、有机酸(碳酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、磷酸、酸性氨基酸)的水溶液中的一种或几种，最优选盐酸的水溶液。

本发明对其所用无血清BHK21细胞培养基干粉中各个组分加入到分散剂中的顺序没有特别的要求。此外，可以将各种组分分散在同一种分散剂中，也可以将不同组分分散在不同的分散剂中，然后混合得到的分散体。优选后者，例如优选将胸苷、次黄嘌呤分散于1-10重量％的氢氧化钠的水溶液(氢氧化钠的水溶液优选用重蒸水配制)中，可以适当加热至60℃；将酪氨酸分散于pH值为1的酸性水溶液(如用重蒸水配制的盐酸水溶液)中；将亲脂性物质(如亚油酸)先分散于低沸点亲水小分子有机溶剂(如乙醇)中。对于在培养基中含量很少的组分(比如含量不超过0.01g/100L的组分)，在制备时，可以先用分散剂配制该组分的高浓度液体分散体，然后按照最终培养基干粉中该组分所需的定量以该高浓度液体分散体的形式使该组分与其他组分混合。所用分散剂的温度不应高于被分散组分的最低分解温度。

所述分散剂的用量没有特别的限制，只要能使培养基干粉的组分与分散剂形成均一稳定的分散体即可；另外，在满足前述条件的前提下，出于能耗的考虑，分散剂的用量越少越好。

可以采用本领域常用的方法除去分散剂，比如干燥。所述干燥可以为加热、真空干燥、真空冷冻干燥、干燥剂(如硅胶、氧化铝凝胶、分子筛、活性炭、骨炭、木炭、活性白土、五氧化磷、生石灰、氯化钙等)吸湿等。

BHK21细胞可以作为多种病毒的宿主细胞。除了培养基，本发明所述无血清培养BHK21细胞的方法可以采用本领域常规的其他培养条件进行BHK21细胞培养，例如，悬浮培养过程中细胞的接种量可以为10³-10⁸个/毫升培养基，优选为细胞的接种量为10⁵-10⁶个/毫升培养基；培养的温度可以为30-38℃，湿度可以为90-98％和二氧化碳的浓度可以为3-8体积％，优选包括温度为35-37℃，湿度为92-96％以及二氧化碳的浓度为4-6体积％。最优选细胞的接种量可以为2×10⁵-5×10⁵个/毫升培养基；培养的温度可以为36-37℃，湿度可以为93-95％和二氧化碳的浓度可以为4-5体积％。

本发明还提供了一种制备狂犬病疫苗的方法，所述方法包括培养作为狂犬病病毒宿主的BHK21细胞的步骤，其中，所述培养BHK21细胞的步骤按照本发明所述无血清培养BHK21细胞的方法进行。

本发明还提供了一种制备口蹄疫疫苗的方法，所述方法包括培养作为口蹄疫病毒宿主的BHK21细胞的步骤，其中，所述培养BHK21细胞的步骤按照本发明所述无血清培养BHK21细胞的方法进行。

除非特别说明，本发明使用的各种试剂均可以商购，也可以采用本领域常用的方法制备。用于细胞培养的试剂，不仅纯度要求高，优选分析纯，而且不能存在任何影响细胞正常生理活动的物质，因此还需要符合医药制品的要求，优选注射级原料药。

以下结合实施例，进一步说明本发明。

实施例1

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。

表3

组分	g/100L	组分	g/100L
				无水氯化钙	20	L-色氨酸	0.5
五水合硫酸铜	0.0001	L-酪氨酸	7
				九水合硝酸铁	0	L-缬氨酸	3
七水合硫酸亚铁	0.2	D-葡萄糖	550
				氯化钾	30	HEPES	400
六水合氯化镁	1	亚油酸	0.03
				无水硫酸镁	6	硫辛酸	0.05
氯化钠	600	1，4-丁二胺二盐酸盐	0.7
				无水磷酸二氢钠	5	丙酮酸钠	20
磷酸氢二钠	6	维生素H	0.001
				七水合硫酸锌	0.04	D-泛酸钙	0.4
无水磷酸二氢钾	8	氯化胆碱	5
				L-精氨酸盐酸盐	20	叶酸	0.4
L-胱氨酸盐酸盐	4	i-肌醇	2
				L-谷氨酰胺	150	烟酰胺	0.1
甘氨酸	6	盐酸吡哆醛	0.5
				L-组氨酸盐酸盐	2	盐酸吡哆醇	0.01
L-异亮氨酸	4	核黄素	0.02
				L-亮氨酸	9	盐酸硫胺	0.3
L-赖氨酸盐酸盐	5	胸苷	0.01
				L-蛋氨酸	1	维生素B12	0.7
L-苯丙氨酸	2	重组人胰岛素	0.2
				L-丝氨酸	1.5	亚硒酸	0.0001
L-苏氨酸	8	乙醇胺	0.0005
				L-丙氨酸	0.2	大豆蛋白	170
L-天门冬酰胺	15	豌豆蛋白	120
				L-天门冬氨酸	0.5	蚕豆蛋白	170
L-半胱氨酸盐酸盐	10	马铃薯蛋白	0
				L-谷氨酸	1.5	小麦麸蛋白	100
L-脯氨酸	8	水稻蛋白	50

将表3所示的固体组分按照100升最终液体培养基的用量，用万分之一天平一一精确称量混合后，再加入50升蒸馏水，用上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司85-2型搅拌器搅拌2小时后，得到均匀分散体，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-45℃，缓慢升温保持仪器内真空度9Pa下冷冻干燥50小时，得到本发明所用无血清BHK21细胞培养基干粉。所述无血清BHK21细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。

将上述制得的本发明所用的无血清BHK21细胞培养基干粉2524.862克，溶于30℃100L超纯水中，所得溶液使用0.20μm的滤菌膜过滤灭菌，即得液体无血清动物细胞培养基，在2℃下冷藏备用。

实施例2

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。

表4

组分	g/100L	组分	g/100L
				无水氯化钙	10	L-色氨酸	2
五水合硫酸铜	0	L-酪氨酸	10
				九水合硝酸铁	0.01	L-缬氨酸	10
七水合硫酸亚铁	0.1	D-葡萄糖	700
				氯化钾	20	HEPES	330
六水合氯化镁	10	亚油酸	0.05
				无水硫酸镁	4	硫辛酸	0.08
氯化钠	620	1，4-丁二胺二盐酸盐	0.02
				无水磷酸二氢钠	7	丙酮酸钠	10
磷酸氢二钠	10	维生素H	0.005
				七水合硫酸锌	0.01	D-泛酸钙	0.2
无水磷酸二氢钾	5	氯化胆碱	10
				L-精氨酸盐酸盐	80	叶酸	0.2
L-胱氨酸盐酸盐	7	i-肌醇	10
				L-谷氨酰胺	50	烟酰胺	0.5
甘氨酸	8	盐酸吡哆醛	0.3
				L-组氨酸盐酸盐	1	盐酸吡哆醇	0.05
L-异亮氨酸	10	核黄素	0.03
				L-亮氨酸	6	盐酸硫胺	0.4
L-赖氨酸盐酸盐	12	胸苷	0.05
				L-蛋氨酸	3.5	维生素B12	0.5
L-苯丙氨酸	6	重组人胰岛素	1
				L-丝氨酸	2.5	亚硒酸	0.0009
L-苏氨酸	3	乙醇胺	0.0001
				L-丙氨酸	1	大豆蛋白	140
L-天门冬酰胺	6	豌豆蛋白	200
				L-天门冬氨酸	2	蚕豆蛋白	150
L-半胱氨酸盐酸盐	20	马铃薯蛋白	50
				L-谷氨酸	2	小麦麸蛋白	40
L-脯氨酸	10	水稻蛋白	100
				次黄嘌呤	0.3

表4所示的固体组分按照100升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。其中，将维生素H、次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液；将亚油酸溶于10ml 99％的乙醇得到C溶液；将L-酪氨酸分散于pH值为1的盐酸蒸馏水溶液中得到D溶液，合并A溶液、B溶液、C溶液和D溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1，4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白，用蒸馏水定容至10000ml摇匀，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-50℃，缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥40小时，即得到无血清动物细胞培养基干粉。无血清动物细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。

将上述制得的动物细胞培养基干粉2681.806克，溶于80L超纯水中，然后用超纯水定容至100L。使用0.10μm的滤菌膜过滤灭菌，即得液体无血清动物细胞培养基，在2℃下冷藏备用。

实施例3

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。

表5

组分	g/100L	组分	g/100L
				无水氯化钙	17	L-色氨酸	1
五水合硫酸铜	0.001	L-酪氨酸	2
				九水合硝酸铁	0.008	L-缬氨酸	5
七水合硫酸亚铁	0.5	D-葡萄糖	600
				氯化钾	50	HEPES	370
六水合氯化镁	6	亚油酸	0.02
				无水硫酸镁	8	硫辛酸	0.1
氯化钠	670	1，4-丁二胺二盐酸盐	0.9
				无水磷酸二氢钠	8	丙酮酸钠	11
磷酸氢二钠	7	维生素H	0.002
				七水合硫酸锌	0.02	D-泛酸钙	0.1
无水磷酸二氢钾	2	氯化胆碱	6
				L-精氨酸盐酸盐	30	叶酸	0.1
L-胱氨酸盐酸盐	3	i-肌醇	3
				L-谷氨酰胺	120	烟酰胺	0.2
甘氨酸	2	盐酸吡哆醛	0.2
				L-组氨酸盐酸盐	3	盐酸吡哆醇	0.04
L-异亮氨酸	7	核黄素	0.01
				L-亮氨酸	4	盐酸硫胺	0.1
L-赖氨酸盐酸盐	9	胸苷	0.04
				L-蛋氨酸	0.5	维生素B12	1
L-苯丙氨酸	5	重组人胰岛素	0.5
				L-丝氨酸	3	亚硒酸	0.001
L-苏氨酸	7	乙醇胺	0.0002
				L-丙氨酸	0.6	大豆蛋白	100
L-天门冬酰胺	12	豌豆蛋白	140
				L-天门冬氨酸	1	蚕豆蛋白	180
L-半胱氨酸盐酸盐	13	马铃薯蛋白	25
				L-谷氨酸	0.5	小麦麸蛋白	60
L-脯氨酸	17	水稻蛋白	60
				次黄嘌呤	0.5	酚红	1

表5所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。其中，将维生素H、次黄嘌呤、胸苷，溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将亚油酸溶于10ml 99％乙醇溶液，得到B溶液；将氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于1000ml蒸馏水中得到C溶液，合并A溶液、B溶液和C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖，用蒸馏水定容至10000ml摇匀，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-40℃，缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥30小时，得到冻干粉。将无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、无水氯化钙于105℃干燥2小时，将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、酚红于40℃下干燥1小时。将六水合氯化镁、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1，4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺放入真空干燥箱内干燥20小时。将上述所有干燥后的组分以及冻干粉装入球磨罐内，球磨10小时，即得本发明无血清动物细胞培养基干粉。无血清动物细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。

将实施例3制得的无血清动物细胞培养基干粉257.3942克，溶于8L超纯水中，然后用超纯水定容至10L。使用0.15μm的滤菌膜过滤灭菌，即得液体无血清动物细胞培养基，在2℃下冷藏备用。

实施例4

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。

表6

组分	g/100L	组分	g/100L
				无水氯化钙	11	L-色氨酸	1.5
五水合硫酸铜	0.0009	L-酪氨酸	3
				九水合硝酸铁	0.006	L-缬氨酸	9
七水合硫酸亚铁	0.3	D-葡萄糖	500
				氯化钾	10	HEPES	300
六水合氯化镁	2	亚油酸	0.01
				无水硫酸镁	2	硫辛酸	0.06
氯化钠	700	1，4-丁二胺二盐酸盐	1
				无水磷酸二氢钠	2	丙酮酸钠	15
磷酸氢二钠	8	维生素H	0.003
				七水合硫酸锌	0.05	D-泛酸钙	0.5
无水磷酸二氢钾	10	氯化胆碱	7
				L-精氨酸盐酸盐	50	叶酸	0.5
L-胱氨酸盐酸盐	10	i-肌醇	7
				L-谷氨酰胺	60	烟酰胺	0.4
甘氨酸	7	盐酸吡哆醛	0.1
				L-组氨酸盐酸盐	5	盐酸吡哆醇	0.02
L-异亮氨酸	9	核黄素	0.05
				L-亮氨酸	10	盐酸硫胺	0.5
L-赖氨酸盐酸盐	8	胸苷	0.03
				L-蛋氨酸	5	维生素B12	0.1
L-苯丙氨酸	4	重组人胰岛素	0.9
				L-丝氨酸	5	亚硒酸	0.0004
L-苏氨酸	5	乙醇胺	0
				L-丙氨酸	0.3	大豆蛋白	200
L-天门冬酰胺	8	豌豆蛋白	190
				L-天门冬氨酸	1.5	蚕豆蛋白	120
L-半胱氨酸盐酸盐	18	马铃薯蛋白	45
				L-谷氨酸	0	小麦麸蛋白	0
L-脯氨酸	20	水稻蛋白	90
				次黄嘌呤	0.5	酚红	1

表6所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。其中，将维生素H、次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液；将亚油酸溶于10ml99％的乙醇得到C溶液；将L-酪氨酸分散于pH值为1的盐酸蒸馏水溶液中得到D溶液，合并A溶液、B溶液、C溶液和D溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1，4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白，用蒸馏水定容至10L摇匀。即得液体无血清动物细胞培养基，在2℃下冷藏备用。

以上实施例1-4中所述植物蛋白按照如下方法制得，具体制备的条件参数见表7。所述方法包括以下步骤：

a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至0.1-3mm³颗粒；

c)在80-100℃保持5-20min以终止步骤b)所述的酶解；

表7

实施例	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					颗粒直径(mm³)	0.7-2	0.4-2.5	1-3	0.8-3
酶	菠萝蛋白酶	木瓜蛋白酶	木瓜蛋白酶	胰蛋白酶
					酶活(单位/克)	10⁷	10⁶	10⁵	10⁵
酶解时间(h)	4	6	7	8
					终止温度(℃)/时间(min)	93/8	85/19	96/12	89/13
离心转速/时间(min)	7500/8	5000/19	6000/12	6500/13
					膜透过分子量范围	10000-20000	15000-20000	10000-20000	10000-20000

对比例1

本对比例用于说明现有的动物细胞培养方法。

表8是CN 1318577C的实施例4记载表2的配方，按照该配方制备液体现有技术的无血清动物细胞培养基，在2℃下冷藏备用。

表8

组分	g/L
		基本培养基(DMEM/HAM’s F12)	11.5
大豆蛋白胨	2.5
		L谷氨酰胺	0.36
抗坏血酸	0.0035
		NaHCO₃	2.00
乙醇胺	0.0015
		亚硒酸钠	8.6μgl
Synperonic F68	0.25

对比例2

本对比例用于说明现有的动物细胞培养方法。

按照WO 02/29084的表13(本申请排序为表9)记载的配方，制备液体现有技术的无血清动物细胞培养基，在2℃下冷藏备用。

表9

组分	含量(mg/l)	组分	含量(mg/l)
				氯化钠	6122	L-甲硫氨酸	137.24
氯化钾	311.8	L-苯丙氨酸	155.48
				一水合磷酸二氢钠	62.5	L-脯氨酸	17.25
碳酸氢钠	0	L-丝氨酸	266.25
				无水磷酸氢二钠	71.02	L-苏氨酸	173.45
七水合磷酸氢二钠	0	L-色氨酸	39.02
				无水氯化镁	28.64	L-酪氨酸二钠二水合物(L-tyrosine disodium dihydrate)	55.79
六水合氯化镁	0	L-缬氨酸	177.85
				无水硫酸镁	48.84	L-胱氨酸二盐酸盐	31.29
七水合硫酸镁	0	次黄嘌呤钠(Sodium Hypoxanthine)	2.39
				无水氯化钙	116.6	腐胺二盐酸盐(Putrescinedihydrochloride)	0.081
五水合硫酸铜	0.0013	丙酮酸钠	220
				七水合硫酸亚铁	0.147	D-生物素	0.1313
九水合硝酸铁	0.05	D-泛酸钙	4.08
				柠檬酸铁	0.4	叶酸	4.65
七水合硫酸锌	0.432	i-肌醇	39.1
				无水葡萄糖	4501	烟酰胺	3.085
亚油酸	1.189	氯化胆碱	29.32
				胰岛素	5	盐酸吡多醇	0.117
DL 68硫辛酸	0.473	核黄素	0.219
				L-丙氨酸	4.45	盐酸硫胺	2.67
氯化L-精氨酸(L-arginine chloride)	547.8	胸苷	0.365
				L-天门冬酰胺一水合物(L-asparaginemonohydrate)	407.5	维生素B12	2.68
L-天门冬氨酸	6.65	盐酸吡哆醛	6
				L-半胱氨酸盐酸一水合物(L-cysteine hydrochloridemonohydrate)	117.65	谷胱苷肽	2.5
L-谷氨酸	251.35	亚硒酸钠	0.02175

甘氨酸	18.75	L-抗坏血酸	27.5
				L-组氨酸盐酸一水合物	211.48	普朗尼克F68(PLURONIC F68)	1000
L-异亮氨酸	54.47	维生素K	5
				L-亮氨酸	179.05	葡聚糖D70	0
L-赖氨酸盐酸盐	231.25	HY-SOY	500

实验实施例1

在无菌条件下，用灭菌移液器分别将50ml上述液体无血清动物细胞培养基转移到250ml细胞培养摇瓶中，接种BHK21细胞悬液，接种密度为8×10⁵细胞/ml，每种培养基接种20瓶。然后在37℃温度条件、95％湿度条件及5体积％二氧化碳条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。用血球计数法记录单位天数的细胞密度，用MTT法测定细胞活力(即活细胞占细胞总数的百分比)。培养结果见表10及图7。实施例1培养基培养72小时的细胞照片见图1；对比例1培养基培养72小时的细胞照片见图2；对比例2培养基培养72小时的细胞照片见图3；实施例2细培养基培养72小时的细胞照片见图4；实施例3培养基培养48小时的细胞照片见图5；实施例4培养基培养48小时的细胞照片见图6。

表10

从表10的结果可以看出，当使用本发明的无血清培养BHK21细胞的方法培养BHK21细胞时，能够达到的细胞培养密度大大提高。

实验实施例2

细胞培养基：按实施例1-4以及对比例1-2中配方配制BHK21无血清细胞培养基。

生物反应器：650L搅拌式生物反应器(北京清大天一生物技术有限公司)

培养体积：200L

接种密度：6×10⁵

细胞培养条件：温度为37℃、pH值为7.3、溶氧60％。

培养7天，细胞密度为5×10⁶细胞/ml左右时，按病毒感染复数MOI为0.1的量接种狂犬病病毒。

病毒维持液：除不包含蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白外，其他与细胞培养基相同。

病毒培养条件：温度为34℃、pH值为7.6、溶氧55％。

培养48小时后，以100-200升/天的速度从生物培养器下部灌注灭菌的新鲜病毒维持液，并从生物培养器上部接近培养基液面收集病毒。连续灌注培养10天，共收获1400升病毒溶液。用中国药典(2005版)人用狂犬病疫苗规程中的小鼠脑内测定法方法，从第二天起，对每天所取的反应器样品的狂犬病病毒滴度(LD₅₀)进行测定。结果如表11所示。

表11

病毒滴度(LD₅₀)	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天	第8天	第9天	第10天
										实施例1	3.2	4.6	6.1	6.5	6.8	7.4	7.8	7.5	7.3
实施例2	/	3.5	4.9	5.6	6.7	7.3	7.7	7.9	7.6
										实施例3	3.4	4.5	5.3	6.8	7.8	8.1	7.8	7.7	7.2
实施例4	/	3.5	4.8	5.6	6.7	7.8	7.4	7.2	7.0
										对比例1	/	3.4	4.7	5.4	6.3	/	/	/	/
对比例2	/	3.2	4.9	5.6	6.5	/	/	/	/

其中“/”表示病毒滴度过低，不能测出有效滴度。

从表11的结果可以看出，当使用本发明无血清培养BHK21细胞的方法培养BHK21细胞并用于生产狂犬病病毒疫苗过程中时，能够收获到的病毒滴度大大提高，而且能够生产有效病毒滴度的周期延长。

实验实施例3

生物反应器：100L搅拌式生物反应器。

培养体积：50L

接种密度：3×10⁵

细胞培养条件：温度为36℃、pH值为7.2、溶氧50％。

培养5天，细胞密度为1×10⁶细胞/ml左右时，按病毒感染复数MOI为0.05的量接种口蹄疫病毒。

病毒培养条件：温度为35℃、pH值为7.4、溶氧50％。

培养48小时后，以30-40升/天的速度从生物培养器下部灌注灭菌的新鲜病毒维持液，并从生物培养器上部接近培养基液面收集病毒。连续灌注培养15天，共收获450升病毒溶液。用乳鼠半数致死量测定方法，从6h起，对每6h或3h所取的反应器样品的口蹄疫病毒滴度(LD₅₀)进行测定。结果如表12所示。

表12

病毒滴度(LD₅₀)	6h	12h	18h	21h	24h
						实施例1	6.5	7.35	8.0	7.75	7.5
实施例6	6.75	7.35	8.0	7.25	7.0
						实施例7	6.5	7.5	7.75	7.5	7.25
实施例8	7.0	7.5	8.25	8.0	7.75
						对比例1	6.0	7.0	7.25	7.0	6.5
对比例2	6.25	7.25	7.5	7.25	6.75

从表12的结果可以看出，当使用本发明无血清培养BHK21细胞的方法培养BHK21细胞并用于生产口蹄疫病毒疫苗过程中时，能够收获到的病毒滴度大大提高。

Claims

1.一种无血清培养BHK21细胞的方法，该方法包括将BHK21细胞接种到细胞培养基中培养，其特征在于，所述细胞培养基包括基本培养基，并且以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白；

其中，所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白通过以下方法制备：

c)在80-100℃保持5-20min以终止步骤b)所述的酶解；

f)收集步骤e)所得超滤液，真空冷冻干燥，获得相应植物蛋白；

其中，所述基本培养基选自BME细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、Fischer′s细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、F10细胞培养基、F12细胞培养基和1640细胞培养基中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋白、150-180g/100L的蚕豆蛋白、50-80g/100L的马铃薯蛋白、150-180g/100L的小麦麸蛋白和50-80g/100L的水稻蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的豌豆蛋白、170-180g/100L的蚕豆蛋白、50-60g/100L的马铃薯蛋白、150-160g/100L的小麦麸蛋白、50-60g/100L的水稻蛋白。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白通过以下方法制备：

c)在80-90℃保持5-10min以终止步骤b)所述的酶解；

5.根据权利要求1所述的方法，其中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括下表1所示的组分：

表1

组分 g/100L 组分 g/100L 无水氯化钙 10-20 L-色氨酸 0.5-2 五水合硫酸铜 0-0.001 L-酪氨酸 2-10 九水合硝酸铁 0-0.01 L-缬氨酸 3-10 七水合硫酸亚铁 0.1-0.5 D-葡萄糖 500-700 氯化钾 10-50 HEPES 300-400 六水合氯化镁 1-10 亚油酸 0.01-0.05 无水硫酸镁 2-8 硫辛酸 0.05-0.1 氯化钠 600-700 1，4-丁二胺二盐酸盐 0.02-1 无水磷酸二氢钠 2-8 丙酮酸钠 10-20 磷酸氢二钠 6-10 维生素H 0.001-0.005 七水合硫酸锌 0.01-0.05 D-泛酸钙 0.1-0.5 无水磷酸二氢钾 2-10 氯化胆碱 5-10 L-精氨酸盐酸盐 20-80 叶酸 0.1-0.5 L-胱氨酸盐酸盐 3-10 i-肌醇 2-10 L-谷氨酰胺 50-150 烟酰胺 0.1-0.5 甘氨酸 2-8 盐酸吡哆醛 0.1-0.5 L-组氨酸盐酸盐 1-5 盐酸吡哆醇 0.01-0.05 L-异亮氨酸 4-10 核黄素 0.01-0.05 L-亮氨酸 4-10 盐酸硫胺 0.1-0.5 L-赖氨酸盐酸盐 5-12 胸苷 0.01-0.05 L-蛋氨酸 0.5-5 维生素B12 0.1-1 L-苯丙氨酸 2-6 重组人胰岛素 0.2-1 L-丝氨酸 1.5-5 亚硒酸 0.0001-0.001 L-苏氨酸 3-8 乙醇胺 0-0.0005 L-丙氨酸 0.2-1 大豆蛋白 100-200 L-天门冬酰胺 6-15 豌豆蛋白 120-200 L-天门冬氨酸 0.5-2 蚕豆蛋白 120-180 L-半胱氨酸盐酸盐 10-20 马铃薯蛋白 0-50 L-谷氨酸 0-2 小麦麸蛋白 0-100 L-脯氨酸 8-20 水稻蛋白 50-100

6.根据权利要求5所述的方法，其中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括0.1-1g/100L的次黄嘌呤和/或0.1-2g/100L的酚红。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基包括下表2所示的组分：

表2

8.一种制备疫苗的方法，所述方法包括培养作为病毒宿主的BHK21细胞的步骤，其特征在于，所述培养BHK21细胞的步骤按照权利要求1-7中任意一项所述的无血清培养BHK21细胞的方法进行。

9.根据权利要求8所述的方法，所述疫苗为狂犬病疫苗，所述方法包括培养作为狂犬病病毒宿主的BHK21细胞的步骤，其特征在于，所述培养BHK21细胞的步骤按照权利要求1-7中任意一项所述的无血清培养BHK21细胞的方法进行。

10.根据权利要求8所述的方法，所述疫苗为口蹄疫疫苗，所述方法包括培养作为口蹄疫病毒宿主的BHK21细胞的步骤，其特征在于，所述培养BHK21细胞的步骤按照权利要求1-7中任意一项所述的无血清培养BHK21细胞的方法进行。