CN110747176B - 一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，包括以下步骤：将Vero细胞分瓶传代，然后接入含新生牛血清的细胞生长液，培养后得致密单层；再在致密单层中接种猪流行性腹泻病毒，培养得混合物；在混合物中加入含新生牛血清、胰岛素和海藻糖的维持液，旋转培养，待病变率大于80％时收获病毒，得猪流行性腹泻病毒。本发明能够显著的提高病毒含量，避免病毒失活，有效解决了病毒毒价较低的问题。

Description

一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法
技术领域
本发明涉及猪病毒培养技术领域，具体涉及一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)属于Ⅰ类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，仔猪感染此病毒后具有很高的死亡率。PEDV在肠上皮细胞的形态特征与其他冠状病毒相同，病毒通过胞浆内膜以出芽的方式进行装配。但在粪样中检测到的病毒粒子则具有多形性，并倾向于球形，直径约95～190nm(包括纤突在内)。大多数病毒粒子有一个电子不透明的中央区，顶端膨大的纤突长18～23nm，从核衣壳向外呈放射状排列。在生产猪流行性腹泻病毒(PEDV)的病毒液抗原时，虽然可以达到国家标准，但一直出现了病毒含量不高，病毒大量失活，病毒毒价较低，要生产出高效的产品还存在困难。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，能够显著的提高病毒含量，避免病毒失活，有效解决了病毒毒价较低的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，包括以下步骤：
(1)将Vero细胞按1:3～4的体积比分瓶传代，然后接入1300～1600mL含8～12vt％新生牛血清、pH值为7.2～7.4的细胞生长液，在36.5～37.5℃温度、9～11r/h转速条件下培养45～50h，得致密单层；
(2)倒掉使用后的生长液，再在步骤(1)所得的致密单层中接种1～3vt％的猪流行性腹泻病毒，在36.5～37.5℃温度、9～11r/h转速条件下培养50～70min，得混合物；
(3)在步骤(2)所得混合物中加入1400～1600mL含1～3vt％新生牛血清、8～12μg/mL胰岛素和7～9g/L海藻糖、pH值为7.2～7.4的维持液，在36.5～37.5℃温度、9～11r/h转速条件下培养，待病变率大于80％时收获病毒，得猪流行性腹泻病毒。
进一步，细胞生长液和维持液为DMEM培养基。
进一步，步骤(1)中，采用碳酸氢钠调节pH值。
进一步，步骤(3)中，新生牛血清浓度为2vt％，胰岛素浓度为10μg/mL，海藻糖浓度为7～9g/L。
进一步，猪流行性腹泻病毒的培养均在无菌转瓶中进行。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明在猪流行性腹泻病毒的培养过程中，加入了海藻糖成分，海藻糖是一种低聚糖，对生物体具有低温保护作用和脱水保护作用，可显著减缓疫苗成品中病毒的失活过程，利用海藻糖作为生物试剂的稳定剂和保护剂，可将制品置于常温条件下干燥并保存，简化了生物试剂的制备过程；而在病毒培养过程中就加入海藻糖，从源头上给病毒提供保护作用，培养产生的病毒均能以活病毒形式保存下来，提高后续生产工艺中有效病毒含量，避免病毒失活，有效解决了病毒毒价较低的问题。
2、海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类，在自然界中许多可食用动植物及微生物体内广泛存在；海藻糖通过影响蛋白水合作用来稳定和激活蛋白，可以降低溶液中蛋白质的水化作用，干燥时则能取代水或作为玻璃样稳定剂，能阻止酶发生不可逆的热凝聚-热变性反应；这一独特的功能特性，使得海藻糖作为优良的活性保护剂广泛用于蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品领域。
3、海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在病毒表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。
4、本发明在猪流行性腹泻病毒的培养过程中，加入了胰岛素成分。其作用有：促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进糖原合成，抑制糖异生，使血糖降低；促进脂肪酸合成和脂肪贮存，减少脂肪分解；促进氨基酸进入细胞，促进蛋白质合成的各个环节以增加蛋白质合成。在病毒培养过程中胰岛素可促进细胞和病毒蛋白的合成。
5、在细胞培养时加入一定量的动物血清，主要作用有：提供基本营养物质或合成培养基所缺乏的营养物质，如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等；提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子；提供贴壁细胞所需的贴壁因子和扩展因子；对培养中的细胞起到某些保护作用，有一些细胞如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，使细胞免受蛋白酶的损伤；血清还含有一些微量元素和离子，在代谢解毒中起重要作用；血清中的结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。
具体实施方式
实施例1
一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，包括以下步骤：
(1)将Vero细胞按1:3的体积比分瓶传代，然后接入1300mL含8vt％新生牛血清、pH值为7.2的DMEM培养基，在36.5℃温度、9r/h转速条件下培养45h，得致密单层；
(2)倒掉使用后的DMEM培养基，再在步骤(1)所得的致密单层中接种1vt％的猪流行性腹泻病毒，在36.5℃温度、9r/h转速条件下培养50min，得混合物；
(3)在步骤(2)所得混合物中加入1400mL含1vt％新生牛血清、8μg/mL胰岛素和7g/L海藻糖、pH值为7.2的DMEM培养基，在36.5℃温度、9r/h转速条件下培养，待病变率大于80％时收获病毒，得猪流行性腹泻病毒。
实施例2
一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，包括以下步骤：
(1)将Vero细胞按1:3的体积比分瓶传代，然后接入1500mL含10vt％新生牛血清、pH值为7.3的DMEM培养基，在36.5℃温度、10r/h转速条件下培养48h，得致密单层；
(2)倒掉使用后的DMEM培养基，再在步骤(1)所得的致密单层中接种2vt％的猪流行性腹泻病毒，在36.5℃温度、10r/h转速条件下培养60min，得混合物；
(3)在步骤(2)所得混合物中加入1500mL含2vt％新生牛血清、10μg/mL胰岛素和8g/L海藻糖、pH值为7.3的DMEM培养基，在36.5℃温度、10r/h转速条件下培养，待病变率大于80％时收获病毒，得猪流行性腹泻病毒。
实施例3
一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，包括以下步骤：
(1)将Vero细胞按1:4的体积比分瓶传代，然后接入1600mL含12vt％新生牛血清、pH值为7.4的DMEM培养基，在37.5℃温度、11r/h转速条件下培养50h，得致密单层；
(2)倒掉使用后的DMEM培养基，再在步骤(1)所得的致密单层中接种3vt％的猪流行性腹泻病毒，在37.5℃温度、11r/h转速条件下培养70min，得混合物；
(3)在步骤(2)所得混合物中加入1600mL含3vt％新生牛血清、12μg/mL胰岛素和9g/L海藻糖、pH值为7.4的DMEM培养基，在37.5℃温度、11r/h转速条件下培养，待病变率大于80％时收获病毒，得猪流行性腹泻病毒。
对比例1
对比例1中猪流行性腹泻病毒的培养方法与实施例1相同，区别在于步骤(3)中不加入海藻糖。
对比例2
对比例2中猪流行性腹泻病毒的培养方法与实施例2相同，区别在于步骤(3)中不加入海藻糖。
对比例3
对比例3中猪流行性腹泻病毒的培养方法与实施例3相同，区别在于步骤(3)中不加入海藻糖。
将实施例1～3和对比例1～3所得猪流行性腹泻病毒在-20℃温度下冷冻，冻融3次后将瓶壁上的残留细胞用力摇下，然后收集至无菌容器中，进行无菌检测和毒价检测，其结果见表1。
表1猪流行性腹泻病毒毒价检测结果统计表
Figure BDA0002278602370000061
由表1可知，在猪流行性腹泻病毒的培养过程中加入海藻糖，可显著减缓疫苗成品中病毒的失活过程，提高生产工艺中有效病毒含量，避免病毒失活，相较于一般方法可提高0.7以上的滴度。
虽然本发明的具体实施方式对本发明进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (4)

1.一种提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Vero细胞按1:3～4的体积比分瓶传代，然后接入1300～1600mL含8～12vt％新生牛血清、pH值为7.2～7.4的细胞生长液，在36.5～37.5℃温度、9～11r/h转速条件下培养45～50h，得致密单层；
(2)倒掉使用后的生长液，再在步骤(1)所得的致密单层中接种1～3vt％的猪流行性腹泻病毒，在36.5～37.5℃温度、9～11r/h转速条件下培养50～70min，得混合物；
(3)在步骤(2)所得混合物中加入1400～1600mL含1～3vt％新生牛血清、8～12μg/mL胰岛素和7～9g/L海藻糖、pH值为7.2～7.4的维持液，在36.5～37.5℃温度、9～11r/h转速条件下培养，待病变率大于80％时收获病毒，得猪流行性腹泻病毒。
2.如权利要求1所述的提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，其特征在于，所述细胞生长液和所述维持液为DMEM培养基。
3.如权利要求1所述的提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，采用碳酸氢钠调节pH值。
4.如权利要求1所述的提高猪流行性腹泻病毒毒价的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述新生牛血清浓度为2vt％，所述胰岛素浓度为10μg/mL，所述海藻糖浓度为7～9g/L。
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