CN101386837B - 一种动物细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种动物细胞培养方法，无需额外引入动物血清外的蛋白成分(例如重组蛋白、植物蛋白或动物来源组分如细胞因子等)，通过使用低含量动物血清就能达到与使用高含量动物血清持平甚至更好的促进动物细胞生长的作用，因此本发明的动物细胞培养方法不产生由所述动物血清外的蛋白成分伴随的副作用，安全性好且成本低。此外，由于本发明的动物细胞培养方法动物血清用量少，用本发明的动物细胞培养方法培养的细胞，不同批次差异小，成本低，利于分离细胞下游产品、安全性好，适于用作生产疫苗等生物制品的病毒宿主、表达载体等。

Description

一种动物细胞培养方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种动物细胞的培养方法。 
背景技术
现有的动物细胞培养方法中，一般必须使用终浓度至少10体积％的动物血清，才能保证细胞的正常生长传代。 
然而动物血清是成分不明确的复杂混合物。一方面动物血清含有例如，携带激素、矿物质、微量元素、脂类物质的转运蛋白；细胞贴壁因子和扩散因子等可以促进细胞生长、稳定解毒、维持培养基的pH值，并抑制蛋白酶直接或间接的酶解。但另一方面，动物血清存在很多问题例如，添加及补充过程中导致培养基pH值变化大，存储过程中易受其他微生物污染，低温贮存解冻后易产生沉淀，不同批次差异大，成本高，以及难以从细胞下游产品中去除、安全性差等。 
因此存在动物细胞培养中尽量不用或少用动物血清的趋势。现有技术一般通过额外添加胰岛素、重组胰岛素、人源转铁蛋白、牛血清白蛋白、细胞因子、生长因子等重组蛋白和动物来源成分，来降低使用动物血清的量，例如CN1723277中公开了一种源自肌肉组织的祖细胞/干细胞的培养基组合物，该组合物中添加了胰岛素、FGF型生长因子，通过使用这样的培养基组合物的培养方法，可以降低人血清的使用量。但是重组蛋白和动物来源成分对生物制品(比如疫苗)的安全性有很大影响，比如重组蛋白和动物来源成分引起过敏反应等。 
综上，一种新的动物细胞培养方法，可以使用终浓度小于10体积％的动物血清，就能促进动物细胞生长。 
发明内容
本发明的目的是克服现有动物细胞培养方法中必须使用高含量动物血清(比如，终浓度至少10体积％的动物血清)，才能促进动物细胞生长、安全性差的缺点，提供一种新的动物细胞培养方法，该方法使用低含量的动物血清浓 度就能促进动物细胞生长、安全性好。 
本发明的发明人意外地发现，在动物细胞培养时，将动物细胞培养基按照表1的组分和含量范围进行调整，则可仅使用低含量动物血清(终浓度1至小于10体积％)，就能达到同时使用重组蛋白、动物来源成分和低含量动物血清(终浓度1体积％至小于10体积％)、或者使用高含量动物血清的同样的促进细胞生长作用。 
本发明提供了一种动物细胞培养方法，该方法包括将动物细胞接种到细胞培养基中培养，其中，所述细胞培养基含有终浓度1至小于10体积％的动物血清，每升所述细胞培养基包括下表1所示的组分： 
表1 
    组分     mg     组分     mg
    L-丙氨酸     80-120     四水合硝酸钙     30-80
    L-精氨酸盐酸盐     180-210     氯化钾     320-500
    L-天门冬氨酸     5-30     无水硫酸镁     40-80
    L-天门冬酰胺     30-60     氯化钠     6000-8000
    L-半胱氨酸盐酸盐     10-30     无水磷酸氢二钠     300-400
    L-谷氨酸     100-150     七水硫酸亚铁     0.1-1
    L-谷氨酰胺     200-500     七水合硫酸锌     0.2-3
    L-组氨酸盐酸盐     20-50     D-葡萄糖     1000-3000
    L-羟脯氨酸     2-15     谷胱甘肽     0.2-2
    L-异亮氨酸     90-150     丙酮酸钠     20-120
    L-亮氨酸     10-70     抗坏血酸     1-10
    L-赖氨酸盐酸盐     100-200     氯化胆碱     5-25
    L-蛋氨酸     10-50     D-泛酸钙     1-10
    L-苯丙氨酸     10-50     叶酸     2-10
    L-脯氨酸     20-60     烟酰胺     1-5
    L-丝氨酸     20-60     盐酸吡哆醇     1-10
    L-苏氨酸     60-100     核黄素     0.2-2
    L-色氨酸     10-50     盐酸硫胺     1-10
    L-缬氨酸     30-70     维生素B12     1-10
    L-酪氨酸     30-80     六水合氯化镁     40-100
    甘氨酸     30-80     次黄嘌呤     1-10
    L-胱氨酸盐酸盐     30-80     胸苷     0.1-2
    无水氯化钙     30-80     无水磷酸二氢钾     20-100
    无水磷酸二氢钠     30-80
与现有的通过引入重组蛋白或动物来源组分来降低动物血清用量的动物细胞培养方法相比，由于本发明的动物细胞培养方法，无需额外引入蛋白成分 (例如重组蛋白、植物蛋白或动物来源组分如细胞因子等)，使用低含量动物血清就能达到与使用高含量动物血清持平甚至更好的促进动物细胞生长的作用，因此本发明的动物细胞培养方法不产生伴随蛋白成分的副作用，安全性好且成本低。用本发明的动物细胞培养方法培养的细胞，不同批次差异小，成本低，利于分离细胞下游产品、安全性好，适于用作生产疫苗等生物制品的病毒宿主、表达载体等。 
附图说明
图1为实施例1的动物细胞培养方法培养72小时的Vero细胞的照片； 
图2为对比例1的动物细胞培养方法培养72小时的Vero细胞的照片； 
图3为对比例2的动物物细胞培养方法培养72小时的Vero细胞的照片； 
图4为对比例3的动物细胞培养方法培养72小时的Vero细胞的照片； 
图5为实施例2的动物细胞培养方法培养72小时的CHO细胞的照片。 
具体实施方式
本发明提供了一种动物细胞培养方法，该方法包括将动物细胞接种到细胞培养基中培养，其中，所述细胞培养基含有终浓度1至小于10体积％的动物血清，每升所述细胞培养基包括下表1所示的组分： 
表1 
    组分     mg     组分     mg
    L-丙氨酸     80-120     四水合硝酸钙     30-80
    L-精氨酸盐酸盐     180-210     氯化钾     320-500
    L-天门冬氨酸     5-30     无水硫酸镁     40-80
    L-天门冬酰胺     30-60     氯化钠     6000-8000
    L-半胱氨酸盐酸盐     10-30     无水磷酸氢二钠     300-400
    L-谷氨酸     100-150     七水硫酸亚铁     0.1-1
    L-谷氨酰胺     200-500     七水合硫酸锌     0.2-3
    L-组氨酸盐酸盐     20-50     D-葡萄糖     1000-3000
    L-羟脯氨酸     2-15     谷胱甘肽     0.2-2
    L-异亮氨酸     90-150     丙酮酸钠     20-120
    L-亮氨酸     10-70     抗坏血酸     1-10
    L-赖氨酸盐酸盐     100-200     氯化胆碱     5-25
    L-蛋氨酸     10-50     D-泛酸钙     1-10
    L-苯丙氨酸     10-50     叶酸     2-10
    L-脯氨酸     20-60     烟酰胺     1-5
    L-丝氨酸     20-60     盐酸吡哆醇     1-10
    L-苏氨酸     60-100     核黄素     0.2-2
    L-色氨酸     10-50     盐酸硫胺     1-10
    L-缬氨酸     30-70     维生素B12     1-10
    L-酪氨酸     30-80     六水合氯化镁     40-100
    甘氨酸     30-80     次黄嘌呤     1-10
    L-胱氨酸盐酸盐     30-80     胸苷     0.1-2
    无水氯化钙     30-80     无水磷酸二氢钾     20-100
    无水磷酸二氢钠     30-80
优选所述细胞培养基含有终浓度1至小于5体积％的动物血清，每升所述细胞培养基包括下表2所示的组分： 
表2 
    组分     mg     组分     mg
    L-丙氨酸     90-110     四水合硝酸钙     30-60
    L-精氨酸盐酸盐     190-210     氯化钾     320-400
    L-天门冬氨酸     5-20     无水硫酸镁     50-70
    L-天门冬酰胺     30-50     氯化钠     6500-7500
    L-半胱氨酸盐酸盐     10-15     无水磷酸氢二钠     300-380
    L-谷氨酸     100-120     七水硫酸亚铁     0.1-0.5
    L-谷氨酰胺     300-500     七水合硫酸锌     0.2-1.5
    L-组氨酸盐酸盐     30-50     D-葡萄糖     2000-3000
    L-羟脯氨酸     2-10     谷胱甘肽     0.6-1.5
    L-异亮氨酸     90-120     丙酮酸钠     50-100
    L-亮氨酸     30-70     抗坏血酸     2-7
    L-赖氨酸盐酸盐     100-180     氯化胆碱     10-16
    L-蛋氨酸     20-50     D-泛酸钙     2-6
    L-苯丙氨酸     30-50     叶酸     3-6
    L-脯氨酸     40-60     烟酰胺     2-4
    L-丝氨酸     40-60     盐酸吡哆醇     2-6
    L-苏氨酸     60-80     核黄素     0.5-1
    L-色氨酸     10-30     盐酸硫胺     2-5
    L-缬氨酸     40-70     维生素B12     3-7
    L-酪氨酸     30-50     六水合氯化镁     50-80
    甘氨酸     30-60     次黄嘌呤     1-4
    L-胱氨酸盐酸盐     40-60     胸苷     0.5-1
    无水氯化钙     60-80     无水磷酸二氢钾     50-90
    无水磷酸二氢钠     40-70
更优选每升所述细胞培养基还可以包括1-3毫克的亚油酸、1-3毫克的维生素D2、1-3毫克的维生素K3和2-10毫克的酚红中的一种或几种。其中，亚油酸、维生素D2、维生素K3可以进一步促进细胞的生长；酚红作为pH值指示剂加入，可以通过目测随时掌握细胞的生长情况。更优选所述细胞干粉组合物还包括1.5-2毫克的亚油酸、1.5-2毫克的维生素D2、1.5-2毫克的维生素K3和3-5毫克的酚红中的一种或几种。 
制备本发明所用细胞培养基的方法，可以将包括将动物细胞培养基干粉组合物分散在载剂中，然后分散动物血清，过滤灭菌。所述载剂可以选自本领域用作培养细胞的各种载剂，优选选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水和超纯水中的一种或几种，更优选所述载剂为注射用水和/或超纯水。所述载剂 的用量为600000-1500000重量份，优选为800000-1200000重量份，更优选为1000000重量份。所述载剂的单位重量份与表1和表2中各个组分所采用的单位重量份相同。 
所用动物细胞培养基干粉的制备方法上述培养基组分的动物细胞培养基干粉组合物散在分散剂中，移除所得混合物中的分散剂。所述动物细胞培养基干粉组合物组分在分散剂中的分散可以通过本领域常用的各种分散方法实现，比如搅拌、超声振荡等。 
制备本发明所用动物细胞培养基干粉组合物可以使用干法和湿法两类方法。所谓干法指在干燥的条件下混合固体组分的粉末(比如利用球磨机球磨混合)。使用干法时，优选首先按照构成培养基干粉组合物的各个组分的性质对它们分别干燥。比如将无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾可以在100-120℃，优选100-105℃下干燥1-5小时；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐在30-80℃优选35-50℃下干燥1-3小时；无水磷酸二氢钾将四水合硝酸钙、谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠放入真空干燥箱内抽真空干燥10小时以上。所谓湿法指将可以形成动物细胞培养基干粉组合物的固体组分与分散剂混合，然后移除所得混合物的分散剂。还可以将干法与湿法结合，即将一部分固体组分用湿法混合，移除分散剂后，用干法与其余部分的固体组分混合。 
所述分散剂可以选自本领域用于制备动物细胞培养基干粉组合物的各种分散剂。所述分散剂的作用是使动物细胞培养基干粉组合物的各种组分均匀地混合，一般对分散剂没有特别的要求，只要不引入新的影响细胞生长的离子、污染杂质(如内毒素、微生物等)，不改变该动物细胞培养基干粉组合物溶于载剂后的适宜细胞生长的pH值范围、在不破坏培养基组分的前提下容易去除即可。因此所述分散剂优选选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水、超纯水、能与水以任意比互溶的醇、碱性水溶液和酸性水溶液中的一种或几种，其中所述碱性水溶液为氨水或者本发明所用动物细胞培养基干粉组合物中出现 的阳离子的碱的水溶液，所述酸性水溶液为本发明中所用动物细胞培养基干粉组合物出现的酸根离子的酸的水溶液。所述能与水以任意比互溶的醇可以为乙醇、甲醇、丙醇中的一种或几种。所述碱性水溶液优选氢氧化钠的水溶液、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钙的水溶液、氨水、碱性氨基酸的水溶液中的一种或几种，最优选氢氧化钠的水溶液。所述酸性水溶液优选盐酸溶液、硫酸的水溶液、硝酸的水溶液、有机酸(碳酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、磷酸、酸性氨基酸)的水溶液中的一种或几种，最优选盐酸的水溶液。 
本发明对所用动物细胞培养基干粉组合物中各个组分加入到分散剂中的顺序没有特别的要求。此外，可以将各种组分分散在同一种分散剂中，也可以将不同组分分散在不同的分散剂中，然后混合得到的分散体。优选后者，例如优选将胸苷、次黄嘌呤分散于1-10重量％的氢氧化钠的水溶液(氢氧化钠的水溶液优选用重蒸水配制)中，可以适当加热至60℃；将亲脂性物质(如维生素K3、维生素D2)先分散于低沸点亲水小分子有机溶剂(如乙醇)中。对于所用培养基组合物中含量很少的组分(比如含量不超过10重量份的组分)，在制备时，可以先用分散剂配制该组分的高浓度液体分散体，然后按照最终培养基干粉组合物中该组分所需的定量以该高浓度液体分散体的形式使该组分与其他组分混合。所用分散剂的温度不应高于被分散组分的最低分解温度。 
所述分散剂的用量没有特别的限制，只要能使培养基干粉组合物的组分与分散剂形成均一稳定的分散体即可；另外，在满足前述条件的前提下，出于能耗的考虑，分散剂的用量越少越好。 
可以采用本领域常用的方法除去分散剂，比如干燥。所述干燥可以为加热、真空干燥、真空冷冻干燥、干燥剂(如硅胶、氧化铝凝胶、分子筛、活性炭、骨炭、木炭、活性白土、五氧化磷、生石灰、氯化钙等)吸湿等。 
制备本发明所用动物细胞培养基组合物还可以包括将上述动物细胞培养基组分和动物血清，分散在相同的载剂中，然后过滤灭菌；或者使所述组分和动物血清分别分散在不同载剂中，然后混合不同的分散体，然后过滤灭菌。对于所述培养基组合物组分中含量很少的组分(比如含量不超过10重量份的组分)，在制备时，可以先用载剂配制该组分的高浓度液体分散体，然后按照最终液体培养基中组分所需的定量以该高浓度液体分散体的形式添加该组分。所 用载剂的温度不应高于被分散组分的最低分解温度。 
所述过滤灭菌的方法为本领域公知，可以采用孔径不大于0.22μm的滤菌膜，进行一次或几次过滤。所述动物细胞培养基干粉组合物在载剂中的分散可以通过本领域常用的各种分散方法实现，比如搅拌、超声振荡等。 
所述动物细胞培养基组合物中动物血清的终浓度可以为1体积％至小于10体积％，优选为1体积％至5体积％，更优选为3体积％至5体积％。所述动物血清可以是牛血清(如胎牛血清)、马血清、兔血清、猴血清和人源血清中的一种或几种。 
由于本发明的动物细胞培养方法，只涉及对所用动物细胞培养基的改进，因此动物细胞培养的其它方面没有特别的限制。例如，所述细胞的接种量可以为103-108个/毫升培养基，优选为所述细胞的接种量为105-106个/毫升培养基。所述培养的条件包括30-37℃的温度、90-98％的湿度和3-8体积％的二氧化碳，优选包括35-37℃的温度、92-96％的湿度和4-6体积％的二氧化碳。 
本发明的动物细胞培养方法对能够培养的细胞没有特别的限制，可以培养体细胞、生殖细胞，癌细胞、正常细胞以及经过基因工程修饰的细胞。比如vero细胞、hela细胞。 
除非特别说明，本发明使用的各种试剂均可以商购，也可以采用本领域常用的方法制备。用于细胞培养的试剂，不仅纯度要求高，优选分析纯，而且不能存在任何影响细胞正常生理活动的物质，因此还需要符合医药制品的要求，优选注射级原料药。 
以下结合实施例，进一步说明本发明。 
实施例1 
本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。 
表3 
    组分     mg/L     组分     mg/L
    L-丙氨酸     90     四水合硝酸钙     50
    L-精氨酸盐酸盐     200     氯化钾     400
    L-天门冬氨酸     20     无水硫酸镁     43
    L-天门冬酰胺     30     氯化钠     6400
    L-半胱氨酸盐酸盐     20     无水磷酸氢二钠     320
    L-谷氨酸     130     七水硫酸亚铁     0.2
    L-谷氨酰胺     300     七水合硫酸锌     0.3
    L-组氨酸盐酸盐     30     D-葡萄糖     2000
    L-羟脯氨酸     10     谷胱甘肽     0.3
    L-异亮氨酸     120     丙酮酸钠     50
    L-亮氨酸     30     抗坏血酸     3
    L-赖氨酸盐酸盐     150     氯化胆碱     15
    L-蛋氨酸     20     D-泛酸钙     3
    L-苯丙氨酸     30     叶酸     5
    L-脯氨酸     40     烟酰胺     5
    L-丝氨酸     30     盐酸吡哆醇     3
    L-苏氨酸     80     核黄素     0.6
    L-色氨酸     20     盐酸硫胺     2
    L-缬氨酸     50     维生素B12     2
    L-酪氨酸     32     六水合氯化镁     60
    甘氨酸     50     次黄嘌呤     2
    L-胱氨酸盐酸盐     50     胸苷     1
    无水氯化钙     60     无水磷酸二氢钾     25
    无水磷酸二氢钠     40
表3及以下各表中固体组分的单位mg/L是指，以将该培养基干粉组合物与载剂混合所得最终液体培养基的体积为基准，相对于每升最终液体培养基，在制备培养基时需要加入的固体物质的毫克数。将表3所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一天平一一精确称量混合后，再加入10升蒸馏水，用上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司85-2型搅拌器搅拌2小时后，得到均匀分散体，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-45℃，缓慢升温保持仪器内真空度9Pa下冷冻干燥50小时，得到动物细胞培养基干粉组合物。 
将上述制得的动物细胞培养基干粉组合物11022.4毫克，溶于900ml超纯水中，向所得混合物中加入30ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。 使用0.20μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。 
在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm2细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×104细胞/ml。然后在37℃温度条件、95％湿度条件及5体积％二氧化碳条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表8，细胞培养72小时的照片见图1。由图1可以看出，被培养的细胞密度大，细胞的边缘非常清晰，形态正常。 
实施例2 
本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。 
表4 
    组分     mg/L     组分     mg/L
    L-丙氨酸     110     四水合硝酸钙     60
    L-精氨酸盐酸盐     190     氯化钾     320
    L-天门冬氨酸     10     无水硫酸镁     60
    L-天门冬酰胺     50     氯化钠     7300
    L-半胱氨酸盐酸盐     10     无水磷酸氢二钠     380
    L-谷氨酸     100     七水硫酸亚铁     0.4
    L-谷氨酰胺     500     七水合硫酸锌     0.8
    L-组氨酸盐酸盐     45     D-葡萄糖     3000
    L-羟脯氨酸     5     谷胱甘肽     0.9
    L-异亮氨酸     90     丙酮酸钠     60
    L-亮氨酸     70     抗坏血酸     7
    L-赖氨酸盐酸盐     100     氯化胆碱     10
    L-蛋氨酸     40     D-泛酸钙     4
    L-苯丙氨酸     50     叶酸     3
    L-脯氨酸     60     烟酰胺     4
    L-丝氨酸     60     盐酸吡哆醇     5
    L-苏氨酸     60     核黄素     1
    L-色氨酸     15     盐酸硫胺     5
    L-缬氨酸     70     维生素B12     5
    L-酪氨酸     50     六水合氯化镁     80
    甘氨酸     30     次黄嘌呤     4
    L-胱氨酸盐酸盐     60     胸苷     0.5
    无水氯化钙     80     无水磷酸二氢钾     60
    无水磷酸二氢钠     60     酚红     5
    亚油酸     3     维生素D2     1
表4所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析 天平称取。其中，将次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、抗坏血酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液；将维生素D2、亚油酸溶于10ml 99％的乙醇得到C溶液；合并A溶液、B溶液、C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-酪氨酸、L-天门冬酰胺、四水合硝酸钙、谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、酚红，用蒸馏水定容至10000ml摇匀，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-50℃，缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥40小时，即得到动物细胞培养基干粉组合物。 
将上述制得的动物细胞培养基干粉组合物13294.6毫克，溶于900ml超纯水中，向所得混合物中加入40ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。使用0.10μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。 
在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm2细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×104细胞/ml。然后在37℃温度条件、95％湿度条件及5体积％二氧化碳条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表8。 
实施例3 
本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。 
表5 
    组分     mg/L     组分     mg/L
    L-丙氨酸     100     四水合硝酸钙     40
    L-精氨酸盐酸盐     205     氯化钾     350
    L-天门冬氨酸     15     无水硫酸镁     55
    L-天门冬酰胺     40     氯化钠     7000
    L-半胱氨酸盐酸盐     15     无水磷酸氢二钠     350
    L-谷氨酸     120     七水硫酸亚铁     0.3
    L-谷氨酰胺     400     七水合硫酸锌     0.5
    L-组氨酸盐酸盐     35     D-葡萄糖     2500
    L-羟脯氨酸     8     谷胱甘肽     0.6
    L-异亮氨酸     100     丙酮酸钠     80
    L-亮氨酸     50     抗坏血酸     5
    L-赖氨酸盐酸盐     130     氯化胆碱     13
    L-蛋氨酸     30     D-泛酸钙     5
    L-苯丙氨酸     40     叶酸     4
    L-脯氨酸     50     烟酰胺     3
    L-丝氨酸     50     盐酸吡哆醇     4
    L-苏氨酸     70     核黄素     0.8
    L-色氨酸     28     盐酸硫胺     4
    L-缬氨酸     60     维生素B12     6
    L-酪氨酸     40     六水合氯化镁     70
    甘氨酸     40     次黄嘌呤     3
    L-胱氨酸盐酸盐     55     胸苷     0.8
    无水氯化钙     70     无水磷酸二氢钾     50
    无水磷酸二氢钠     50     酚红     4
    亚油酸     2     维生素D2     2
    维生素K3     2
表5所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。其中，将次黄嘌呤、胸苷，溶于1000ml的1mol/LNaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将维生素K3、维生素D2、亚油酸溶于10ml 99％乙醇溶液，得到B溶液；将抗坏血酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12溶于1000ml蒸馏水中得到C溶液，合并A溶液、B溶液和C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖，用蒸馏水定容至10000ml摇匀，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-40℃，缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥30小时，得到冻干粉。将无水磷酸二氢钠、氯 化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、无水氯化钙于105℃干燥2小时，将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、酚红于40℃下干燥1小时。将四水合硝酸钙、六水合氯化镁、谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、L-羟脯氨酸放入真空干燥箱内干燥20小时。将上述所有干燥后的组分以及冻干粉装入球磨罐内，球磨10小时，即得本发明动物细胞培养基干粉组合物。 
将实施例3制得的动物细胞培养基干粉组合物12316毫克，溶于900ml超纯水中，向所得混合物中加入10ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。使用0.15μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。 
在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm2细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×104细胞/ml。然后在36.5℃温度条件、97％湿度条件及5.1体积％二氧化碳条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表8。 
实施例4 
本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。 
将实施例3中制得的培养基干粉组合物123.64克，溶于9升蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至10升混匀，使用0.22μm的滤菌膜过滤灭菌。向970ml所得动物细胞培养基中加入30ml马血清混合，使用0.15μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。 
在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm2细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×104细胞/ml。然后在37℃温度条件、95％湿度条件及5体积％二氧化碳条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表8。 
实施例5 
本实施例用于说明本发明的动物细胞培养方法。 
表6 
    组分     mg/L     组分     mg/L
    L-丙氨酸     80     四水合硝酸钙     30
    L-精氨酸盐酸盐     210     氯化钾     380
    L-天门冬氨酸     7     无水硫酸镁     70
    L-天门冬酰胺     45     氯化钠     6500
    L-半胱氨酸盐酸盐     13     无水磷酸氢二钠     330
    L-谷氨酸     110     七水硫酸亚铁     0.5
    L-谷氨酰胺     450     七水合硫酸锌     1.2
    L-组氨酸盐酸盐     50     D-葡萄糖     2700
    L-羟脯氨酸     3     谷胱甘肽     1.2
    L-异亮氨酸     110     丙酮酸钠     100
    L-亮氨酸     60     抗坏血酸     6
    L-赖氨酸盐酸盐     180     氯化胆碱     12
    L-蛋氨酸     50     D-泛酸钙     6
    L-苯丙氨酸     45     叶酸     6
    L-脯氨酸     55     烟酰胺     2
    L-丝氨酸     40     盐酸吡哆醇     6
    L-苏氨酸     75     核黄素     0.5
    L-色氨酸     30     盐酸硫胺     3
    L-缬氨酸     40     维生素B12     4
    L-酪氨酸     30     六水合氯化镁     50
    甘氨酸     60     次黄嘌呤     1
    L-胱氨酸盐酸盐     40     胸苷     0.6
    无水氯化钙     75     无水磷酸二氢钾     70
    无水磷酸二氢钠     70     酚红     6
    亚油酸     1.5     维生素D2     3
    维生素K3     3
表6所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。其中，将次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、抗坏血酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液；将维生素D2、亚油酸、维生素K3溶于10ml99％的乙醇得到C溶液；将L-酪氨酸分散于pH值为1的盐酸蒸馏水溶液中得到D溶液，合并 A溶液、B溶液、C溶液和D溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、四水合硝酸钙、谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、酚红，用蒸馏水定容至10000ml摇匀。将300ml小牛血清加入所得培养基混匀，将所得混合物使用0.22μm的滤菌膜过滤灭菌，得到10300ml含2.9％牛血清的本发明培养基组合物。 
取上述制得的培养基组合物1000ml直接使用，其中含有2.9体积％的小牛血清。在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm2细胞培养瓶中，接种CHO细胞悬液，接种密度为5×104细胞/ml。然后在37℃温度条件、95％湿度条件及5体积％二氧化碳条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表8，细胞培养72小时的照片见图5。由图5可以看出，被培养的细胞密度大，细胞的边缘非常清晰，形态正常。 
对比例1 
本对比例用于说明现有的动物细胞培养方法。 
表7 
    组分     (mg/L)     组分     (mg/L)
    氯化钙     200.00     D-葡萄糖     1000.00
    九水合硝酸铁     0.70     谷胱甘肽(还原型)     0.05
    氯化钾     400.00     盐酸鸟嘌呤     0.30
    无水硫酸镁     97.67     次黄嘌呤     0.30
    氯化钠     6800.00     酚红     20.00
    无水磷酸二氢钠     121.74     D-核糖     0.50
    L-丙氨酸     25.00     乙酸钠     50.00
    L-精氨酸盐酸盐     70.00     胸腺嘧啶     0.30
    L-天门冬氨酸     30.00     吐温80     20.00
    L-半胱氨酸盐酸盐     0.11     尿嘧啶     0.30
    L-胱氨酸盐酸盐     26.00     黄嘌呤     0.30
    L-谷氨酸     75.00     维生素C     0.05
    L-谷氨酰胺     100.00     维生素E     0.01
    甘氨酸     50.00     维生素H     0.01
    L-组氨酸盐酸盐     21.88     维生素D2     0.10
    L-羟脯氨酸     10.00     D-泛酸钙     0.01
    L-异亮氨酸     40.00     氯化胆碱     0.50
    L-亮氨酸     60.00     叶酸     0.01
    L-赖氨酸盐酸盐     70.00     i-肌醇     0.05
    L-蛋氨酸     15.00     维生素K3     0.01
    L-苯丙氨酸     25.00     烟酸     0.025
    L-脯氨酸     40.00     烟酰胺     0.025
    L-丝氨酸     25.00     对氨基苯甲酸     0.05
    L-苏氨酸     30.00     盐酸吡哆醛     0.025
    L-色氨酸     10.00     盐酸吡哆醇     0.025
    L-酪氨酸     40.00     核黄素     0.01
    L-缬氨酸     25.00     盐酸硫胺     0.01
    硫酸腺嘌呤     10.00     维生素A醋酸酯     0.14
    腺苷酸     0.20     胆固醇     0.20
    三磷酸腺苷二钠     1.00     脱氧核糖     0.50
表7为商品名199培养基的组分，按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。将胆固醇、维生素A醋酸酯、维生素E、维生素D2、维生素K3和吐温80溶于0.1升乙醇中；将胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤加入含有0.5毫升氨水的1升重蒸水中，并60℃加热至溶解；使叶酸和核黄素振荡溶于2.5升重蒸水；将维生素H和盐酸鸟嘌呤加入到2升0.075N的盐酸溶液中，并50℃加热至溶解；将三磷酸腺苷二钠、腺苷酸、脱氧核糖、谷胱甘肽、D-核糖、D-泛酸钙、维生素C、叶酸、氯化胆碱、i-肌醇、烟酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺溶于200毫升重 蒸水中；合并得到的五种溶液，然后加入D-葡萄糖，用双蒸水定容至10升摇匀。使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-50℃，缓慢升温保持真空度8Pa下冷冻干燥24小时，得到冻干粉。 
将氯化钠、氯化钾、无水硫酸镁、硫酸腺嘌呤、九水合硝酸铁、氯化钙、乙酸钠、无水磷酸二氢钠在105℃烘箱中干燥2小时。将L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-羟脯氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-天门冬氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、酚红用真空干燥箱抽真空干燥15小时。 
将上述所得冻干粉和干燥固体组分在球磨机中进行连续10小时混合，所得固体粉末即为现有的动物细胞培养基干粉组合物，商品名MD500型199培养基。 
将上述制得的动物细胞培养基干粉组合物9513.11毫克，溶于850ml超纯水中，向所得混合物中加入100ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。使用0.20μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。 
在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm2细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×104细胞/ml。然后在37℃温度条件、95％湿度条件及5％二氧化碳体积分数条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表8，细胞培养72小时的照片见图2。由图2可以看出，被培养的细胞密度大，细胞的边缘清晰，形态正常。 
对比例2 
本对比例用于说明现有的动物细胞培养方法。 
采用CN 1723277的实施例2记载的培养基[5％人血清+FGF-2(10ng/ml)+胰岛素(10μg/ml)+PDGF(1ng/ml)+EGF(10ng/ml)地塞米松(5×10-9M)+凝血酶(1单位)]，按照培养对比例1相同的条件下培养细胞，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表8，细胞培 养72小时的照片见图3。由图3可以看出，被培养的细胞密度大，细胞的边缘清晰，形态正常。 
对比例3 
本对比例用于说明现有的动物细胞培养方法。 
按照对比例1的方法制备培养液并培养细胞，不同的是，只加入30ml小牛血清。培养结果见后文表8，细胞培养72小时的照片见图4。从图4可以看出，由于培养过程中使用的血清少，导致Vero细胞生长速度慢、密度低，细胞的边缘不清晰，形态不正常。 
表8 
  动物血清  添加量  (体积％)   接种细胞  密度(细   胞/ml)   24小时平均  细胞数量  (覆盖瓶底   面积％) 48小时平均细胞数量(覆盖瓶底 面积％)   72小时平均  细胞数量  (覆盖瓶底   面积％) 铺满瓶底时间 (h)
    实施例1     3     5×104     50     85     100     60
    实施例2     4     5×104     60     90     100     60
    实施例3     1     5×104     40     70     90     75
    实施例4     3     5×104     50     83     100     72
    实施例5     2.9     5×104     50     82     100     72
    对比例1     10     5×104     60     85     100     72
    对比例2     3     5×104     60     85     100     72
    对比例3     3     5×104     30     60     80     90
从表8的结果可以看出，本发明的动物细胞培养方法使用低含量动物血清，可以达到与使用高含量动物血清持平甚至更好的促进动物细胞生长的作用。由于采用本发明的动物细胞培养方法，在动物细胞培养的整个过程中，在不影响细胞生长的前提下，血清的使用量可以显著降低，从而使大规模生产的成本显著降低。由于本发明的动物细胞培养方法无需额外引入蛋白成分(例如重组蛋白、植物蛋白或动物来源组分如细胞因子等)，因此不产生伴随蛋白成分的副作用，安全性好。 

Claims (8)

1.一种动物细胞培养方法，该方法包括将动物细胞接种到细胞培养基中培养，其特征在于，所述细胞培养基含有终浓度1至小于10体积％的动物血清，并且每升所述细胞培养基包括下表1所示的组分：
表1
  组分   mg   组分   mg   L-丙氨酸   80-120   四水合硝酸钙   30-80   L-精氨酸盐酸盐   180-210   氯化钾   320-500   L-天门冬氨酸   5-30   无水硫酸镁   40-80   L-天门冬酰胺   30-60   氯化钠   6000-8000   L-半胱氨酸盐酸盐   10-30   无水磷酸氢二钠   300-400   L-谷氨酸   100-150   七水硫酸亚铁   0.1-1   L-谷氨酰胺   200-500   七水合硫酸锌   0.2-3   L-组氨酸盐酸盐   20-50   D-葡萄糖   1000-3000   L-羟脯氨酸   2-15   谷胱甘肽   0.2-2   L-异亮氨酸   90-150   丙酮酸钠   20-120   L-亮氨酸   10-70   抗坏血酸   1-10   L-赖氨酸盐酸盐   100-200   氯化胆碱   5-25   L-蛋氨酸   10-50   D-泛酸钙   1-10   L-苯丙氨酸   10-50   叶酸   2-10   L-脯氨酸   20-60   烟酰胺   1-5   L-丝氨酸   20-60   盐酸吡哆醇   1-10   L-苏氨酸   60-100   核黄素   0.2-2   L-色氨酸   10-50   盐酸硫胺   1-10   L-缬氨酸   30-70   维生素B12   1-10   L-酪氨酸   30-80   六水合氯化镁   40-100
  甘氨酸   30-80   次黄嘌呤   1-10   L-胱氨酸盐酸盐   30-80   胸苷   0.1-2   无水氯化钙   30-80   无水磷酸二氢钾   20-100   无水磷酸二氢钠   30-80
。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞培养基含有终浓度1至小于5体积％的动物血清，每升所述细胞培养基包括下表2所示的组分：
表2
  组分   mg   组分   mg   L-丙氨酸   90-110   四水合硝酸钙   30-60   L-精氨酸盐酸盐   190-210   氯化钾   320-400   L-天门冬氨酸   5-20   无水硫酸镁   50-70   L-天门冬酰胺   30-50   氯化钠   6500-7500   L-半胱氨酸盐酸盐   10-15   无水磷酸氢二钠   300-380   L-谷氨酸   100-120   七水硫酸亚铁   0.1-0.5   L-谷氨酰胺   300-500   七水合硫酸锌   0.2-1.5   L-组氨酸盐酸盐   30-50   D-葡萄糖   2000-3000   L-羟脯氨酸   2-10   谷胱甘肽   0.6-1.5   L-异亮氨酸   90-120   丙酮酸钠   50-100   L-亮氨酸   30-70   抗坏血酸   2-7   L-赖氨酸盐酸盐   100-180   氯化胆碱   10-16   L-蛋氨酸   20-50   D-泛酸钙   2-6   L-苯丙氨酸   30-50   叶酸   3-6   L-脯氨酸   40-60   烟酰胺   2-4   L-丝氨酸   40-60   盐酸吡哆醇   2-6
  L-苏氨酸   60-80   核黄素   0.5-1   L-色氨酸   10-30   盐酸硫胺   2-5   L-缬氨酸   40-70   维生素B12   3-7   L-酪氨酸   30-50   六水合氯化镁   50-80   甘氨酸   30-60   次黄嘌呤   1-4   L-胱氨酸盐酸盐   40-60   胸苷   0.5-1   无水氯化钙   60-80   无水磷酸二氢钾   50-90 无水磷酸二氢钠 40-70
。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，每升所述细胞培养基还包括1-3毫克的亚油酸、1-3毫克的维生素D2、1-3毫克的维生素K3和2-10毫克的酚红中的一种或几种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述动物血清选自牛血清、马血清、兔血清、猴血清和人源血清中的一种或几种。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞的接种量为103-108个/毫升培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述细胞的接种量为105-106个/毫升培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养的条件包括30-37℃的温度、90-98％的湿度和3-8体积％的二氧化碳。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养的条件包括35-37℃的温度、92-96％的湿度和4-6体积％的二氧化碳。
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