CN103555659B - 一种mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，所述MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基中，包含有氨基酸部分，维生素部分，无机盐部分和其他添加物部分。本发明的有益效果为：本发明提供的一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，该培养基培养细胞密度高，成分明确，不含动物血清，有利于下游产品的纯化，提高产品品质，且配制和使用方便，适用于流感疫苗和禽流感疫苗的规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种无血清培养基，具体涉及一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基。
背景技术
MDCK细胞(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离培养的。MDCK细胞目前广泛运用于多种病毒的扩增和纯化，如呼肠孤病毒、腺病毒、犬细小病毒、猫粒细胞缺少症病毒及禽流感病毒等，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系被公认为是最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。
我国目前流感疫苗（包括人用流感疫苗、动物流感疫苗）均采用鸡胚法生产，该工艺存在周期长、操作繁琐、工作量大以及很容易产品和环境污染等缺陷。随着生物制品质量安全性标准的提高和动物细胞生物反应器高密度培养技术的推广应用，研究和生产MDCK细胞培养的流感疫苗具有广泛的应用前景。生物反应器高密度培养工艺中细胞全悬浮培养比细胞载体培养更具优势，主要表现在全悬浮培养可用无血清培养基，降低了生产成本，提高了下游产品的生物安全性；第二全悬浮培养规模可线性放大，国际上细胞生物反应器全悬浮培养的规模可达20000L/罐，国内已生产和运用的细胞生物反应器全悬浮培养的规模可达3000L/罐，但是细胞生物反应器载体培养的规模国内外最大的也超不过200L。目前国内还没有商品化的MDCK细胞无血清培养基。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种低成本、成分明确的适用于MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，所述MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基中，各原料物质的终浓度为：
氨基酸部分：
L-丙氨酸 100-120 mg/L，
L-精氨酸盐酸盐 120-200 mg/L，
L-天冬酰胺 5-10 mg/L，
L-天冬氨酸 65-80 mg/L，
L-半胱氨酸一水合物 10-45 mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐 25-50 mg/L，
L-谷氨酸 45-72 mg/L，
L-谷氨酰胺 300-405 mg/L，
甘氨酸 70-85 mg/L，
L-组氨酸盐酸盐 110-155 mg/L，
L-异亮氨酸 142-180 mg/L，
L-亮氨酸 150-180 mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐 150-250 mg/L，
L-蛋氨酸 45-80 mg/L，
L-苯丙氨酸 130-155 mg/L，
L-脯氨酸 30-72 mg/L，
L-丝氨酸 55-80 mg/L，
L-苏氨酸 150-200 mg/L，
L-色氨酸 190-250 mg/L，
L-酪氨酸二钠盐 50-90 mg/L，
L-缬氨酸 150-200 mg/L，
维生素部分：
生物素 0.001-0.005 mg/L，（国药试剂，67000260），
氯化胆碱 5-15 mg/L，
D-泛酸钙 2-5 mg/L，
叶酸 2-5 mg/L，
烟酰胺 2-5 mg/L，
盐酸吡哆醇 2-5 mg/L，
核黄素 0.1-0.5 mg/L，
盐酸硫胺素 0.1-0.5 mg/L，
肌醇 5-20 mg/L，
B12维生素 0.5-1.0 mg/L，
无机盐部分：
无水氯化钙 70-120 mg/L，
氯化钾 200-350 mg/L，
氯化镁 20-40 mg/L，
无水硫酸镁 30-50 mg/L，
氯化钠 5000-8000 mg/L，
磷酸二氢钠 50-76 mg/L，
磷酸氢二钠 50-76 mg/L，
七水硫酸亚铁 0.1-0.5 mg/L，
九水硝酸铁 0.01-0.1 mg/L，
七水硫酸锌 0.1-0.5 mg/L，
硅酸钠 0.061 mg/L，
其余添加物部分：
D-葡萄糖 1000-5000 mg/L，
丙酮酸钠 100-150 mg/L，
磷酸烯醇丙酮酸盐 1-5 mg/L，
亚油酸 0.01-0.1 mg/L，
鞘磷脂 0.5-1.2 mg/L，
大豆卵磷脂 5-10 mg/L，
胆固醇 2-5 mg/L，
硫辛酸 0.1-0.5 mg/L，
1-甲基组氨酸 1-5 mg/L，
3-甲基组氨酸 1-5 mg/L，
牛磺酸 50-70 mg/L，
胸苷 0.1-0.5 mg/L，
腺嘌呤 1-5 mg/L，
胸腺嘧啶 0.01-0.1 mg/L，
腐胺 0.01-0.1 mg/L，
重组胰岛素 5-20 mg/L，（通化东宝 ，Lot:LN09040024），
转铁蛋白 5-20 mg/L，（SIGMA，T-3309），
植物蛋白 1000-5000 mg/L，（KERRY，5X99023），
酵母粉 200-2000 mg/L，
EGF上皮生长因子 0.1-0.5 mg/L，（PEPROTECH，AF-100-15），
碘甲状腺原氨酸 0.001-0.005 mg/L，（SIGMA，T-6397），
PF-68抗剪切剂 100-400 mg/L，（GIBCO，9-5080IP），
Anti-Clumping细胞分散因子100-400 mg/L，（Invitrigen Corporation，725230），
将所有物质以注射用水充分溶解后加入2000mg/L碳酸氢钠，再用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.3。
进一步的，上述的一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，所述MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基中，各原料物质的终浓度为：
氨基酸部分：
L-丙氨酸 115.5 mg/L，
L-精氨酸盐酸盐 147.5 mg/L，
L-天冬酰胺 7.5 mg/L，
L-天冬氨酸 75.65 mg/L，
L-半胱氨酸一水合物 17.56 mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐 31.29 mg/L，
L-谷氨酸 50.35 mg/L，
L-谷氨酰胺 365 mg/L，
甘氨酸 78.75 mg/L，
L-组氨酸盐酸盐 131.48 mg/L，
L-异亮氨酸 154.47 mg/L，
L-亮氨酸 159.05 mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐 191.25 mg/L，
L-蛋氨酸 67.24 mg/L，
L-苯丙氨酸 135.48 mg/L，
L-脯氨酸 47.25 mg/L，
L-丝氨酸 76.25 mg/L，
L-苏氨酸 153.45 mg/L，
L-色氨酸 209.02 mg/L，
L-酪氨酸二钠盐 55.79 mg/L，
L-缬氨酸 152.85 mg/L，
维生素部分：
生物素 0.0035 mg/L，（国药试剂，67000260），
氯化胆碱 8.98 mg/L，
D-泛酸钙 2.24 mg/L，
叶酸 2.65 mg/L，
烟酰胺 2.02 mg/L，
盐酸吡哆醇 2.03 mg/L，
核黄素 0.22 mg/L，
盐酸硫胺素 0.2 mg/L，
肌醇 12.6 mg/L，
B12维生素 0.68 mg/L，
无机盐部分：
无水氯化钙 116.69 mg/L，
氯化钾 311.8 mg/L，
氯化镁 28.64 mg/L，
无水硫酸镁 48.84 mg/L，
氯化钠 6995.5 mg/L，
磷酸二氢钠 62.5 mg/L，
磷酸氢二钠 71.02 mg/L，
七水硫酸亚铁 0.42 mg/L，
九水硝酸铁 0.05 mg/L，
七水硫酸锌 0.432 mg/L，
硅酸钠 0.061 mg/L，
其余添加物部分：
D-葡萄糖 4500 mg/L，
丙酮酸钠 110 mg/L，
磷酸烯醇丙酮酸盐 2.67 mg/L，
亚油酸 0.084 mg/L，
鞘磷脂 1 mg/L，
大豆卵磷脂 6 mg/L，
胆固醇 2.9 mg/L，
硫辛酸 0.1 mg/L，
1-甲基组氨酸 1 mg/L，
3-甲基组氨酸 1 mg/L，
牛磺酸 50 mg/L，
胸苷 0.365 mg/L，
腺嘌呤 4 mg/L，
胸腺嘧啶 0.04 mg/L，
腐胺 0.081 mg/L，
重组胰岛素 10 mg/L，
转铁蛋白 10 mg/L，
植物蛋白 3000 mg/L，
酵母粉 1000 mg/L，
EGF上皮生长因子 0.2 mg/L，
碘甲状腺原氨酸 0.0034 mg/L，
PF-68抗剪切剂 300 mg/L，
Anti-Clumping细胞分散因子 200 mg/L，
将所有物质以注射用水充分溶解后加入2000mg/L碳酸氢钠，再用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.3
进一步的，上述的一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，将所述原料物质根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于10℃-30℃混合，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的pH值至7.1-7.3，定容后即得MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基。
进一步的，上述的一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，将所述原料物质混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10℃-30℃蒸馏水中溶解，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的pH值至7.1-7.3，定容后即得MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，该培养基培养细胞密度高，成分明确，不含动物血清，有利于下游产品的纯化，提高产品品质，且配制和使用方便，适用于流感疫苗和禽流感疫苗的规模化生产。
附图说明
图1为本发明提供的MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基与现有市售产品针对细胞密度和细胞活力的对比效果示意图。
具体实施方式
实施例1：
一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，原料物质根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于25.9℃混合，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的pH值至7.22，定容后即得MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，其中，各原料物质的终浓度为：
氨基酸部分：
L-丙氨酸 100 mg/L，
L-精氨酸盐酸盐 120 mg/L，
L-天冬酰胺 5 mg/L，
L-天冬氨酸 65 mg/L，
L-半胱氨酸一水合物 10 mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐 25 mg/L，
L-谷氨酸 45 mg/L，
L-谷氨酰胺 300 mg/L，
甘氨酸 70 mg/L，
L-组氨酸盐酸盐 110 mg/L，
L-异亮氨酸 142 mg/L，
L-亮氨酸 150 mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐 150 mg/L，
L-蛋氨酸 45 mg/L，
L-苯丙氨酸 130 mg/L，
L-脯氨酸 30 mg/L，
L-丝氨酸 55 mg/L，
L-苏氨酸 150 mg/L，
L-色氨酸 190 mg/L，
L-酪氨酸二钠盐 50 mg/L，
L-缬氨酸 150 mg/L，
维生素部分：
生物素 0.001 mg/L，（国药试剂，67000260），
氯化胆碱 5 mg/L，
D-泛酸钙 2 mg/L，
叶酸 2 mg/L，
烟酰胺 2 mg/L，
盐酸吡哆醇 2 mg/L，
核黄素 0.1 mg/L，
盐酸硫胺素 0.1 mg/L，
肌醇 5 mg/L，
B12维生素 0.5 mg/L，
无机盐部分：
无水氯化钙 70 mg/L，
氯化钾 200 mg/L，
氯化镁 20 mg/L，
无水硫酸镁 30 mg/L，
氯化钠 5000 mg/L，
磷酸二氢钠 50 mg/L，
磷酸氢二钠 50 mg/L，
七水硫酸亚铁 0.1 mg/L，
九水硝酸铁 0.01 mg/L，
七水硫酸锌 0.1 mg/L，
硅酸钠 0.061 mg/L，
其余添加物部分：
D-葡萄糖 1000 mg/L，
丙酮酸钠 100 mg/L，
磷酸烯醇丙酮酸盐 1 mg/L，
亚油酸 0.01 mg/L，
鞘磷脂 0.5 mg/L，
大豆卵磷脂 5 mg/L，
胆固醇 2 mg/L，
硫辛酸 0.1 mg/L，
1-甲基组氨酸 1 mg/L，
3-甲基组氨酸 1 mg/L，
牛磺酸 50 mg/L，
胸苷 0.1 mg/L，
腺嘌呤 1 mg/L，
胸腺嘧啶 0.01 mg/L，
腐胺 0.01 mg/L，
重组胰岛素 5 mg/L，（通化东宝，Lot：LN09040024）,
转铁蛋白 5 mg/L，（SIGMA,T-3309），
植物蛋白 1000 mg/L，（KERRY, 5X99023），
酵母粉 200 mg/L，
EGF上皮生长因子 0.1 mg/L，（PEPROTECH,AF-100-15），
碘甲状腺原氨酸 0.001 mg/L，（SIGMA,T-6397），
PF-68抗剪切剂 100 mg/L，（GIBCO，89-5080IP），
Anti-Clumping细胞分散因子 100 mg/L，（Invitrigen Corporation， 725230）。
实施例2：
一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，原料物质根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于25.1℃混合，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的pH值至7.12，定容后即得MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，其中，各原料物质的终浓度为：
氨基酸部分：
L-丙氨酸 120 mg/L，
L-精氨酸盐酸盐 200 mg/L，
L-天冬酰胺 10 mg/L，
L-天冬氨酸 80 mg/L，
L-半胱氨酸一水合物 45 mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐 50 mg/L，
L-谷氨酸 72 mg/L，
L-谷氨酰胺 405 mg/L，
甘氨酸 85 mg/L，
L-组氨酸盐酸盐 155 mg/L，
L-异亮氨酸 180 mg/L，
L-亮氨酸 180 mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐 250 mg/L，
L-蛋氨酸 80 mg/L，
L-苯丙氨酸 155 mg/L，
L-脯氨酸 72 mg/L，
L-丝氨酸 80 mg/L，
L-苏氨酸 200 mg/L，
L-色氨酸 250 mg/L，
L-酪氨酸二钠盐 90 mg/L，
L-缬氨酸 200 mg/L，
维生素部分：
生物素 0.003 mg/L，（国药试剂,67000260），
氯化胆碱 15 mg/L，
D-泛酸钙 5 mg/L，
叶酸 5 mg/L，
烟酰胺 5 mg/L，
盐酸吡哆醇 5 mg/L，
核黄素 0.5 mg/L，
盐酸硫胺素 0.5 mg/L，
肌醇 20 mg/L，
B12维生素 1.0 mg/L，
无机盐部分：
无水氯化钙 120 mg/L，
氯化钾 350 mg/L，
氯化镁 40 mg/L，
无水硫酸镁 50 mg/L，
氯化钠 8000 mg/L，
磷酸二氢钠 76 mg/L，
磷酸氢二钠 76 mg/L，
七水硫酸亚铁 0.5 mg/L，
九水硝酸铁 0.1 mg/L，
七水硫酸锌 0.5 mg/L，
硅酸钠 0.061 mg/L，
其余添加物部分：
D-葡萄糖 5000 mg/L，
丙酮酸钠 150 mg/L，
磷酸烯醇丙酮酸盐 5 mg/L，
亚油酸 0.1 mg/L，
鞘磷脂 1.2 mg/L，
大豆卵磷脂 10 mg/L，
胆固醇 5 mg/L，
硫辛酸 0.5 mg/L，
1-甲基组氨酸 5 mg/L，
3-甲基组氨酸 5 mg/L，
牛磺酸 70 mg/L，
胸苷 0.5 mg/L，
腺嘌呤 5 mg/L，
胸腺嘧啶 0.1 mg/L，
腐胺 0.1 mg/L，
重组胰岛素 20 mg/L，（通化东宝 Lot:LN09040024），
转铁蛋白 20 mg/L，（SIGMA,T-3309），
植物蛋白 5000 mg/L，（KERRY,5X99023），
酵母粉 2000 mg/L，
EGF上皮生长因子 0.5 mg/L，（PEPROTECH，AF-100-15），
碘甲状腺原氨酸 0.005 mg/L，（SIGMA,T-6397）
PF-68抗剪切剂 400 mg/L，（GIBCO，89-5080IP），
Anti-Clumping细胞分散因子 400 mg/L，（Invitrigen Corporation，725230）。
实施例3：
一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，将原料物质混合后磨成细粉，然后将所得细粉于28.6℃蒸馏水中溶解，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的pH值至7.13，定容后即得MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，其中，各原料物质的终浓度为：
氨基酸部分：
L-丙氨酸 115.5 mg/L，
L-精氨酸盐酸盐 147.5 mg/L，
L-天冬酰胺 7.5 mg/L，
L-天冬氨酸 75.65 mg/L，
L-半胱氨酸一水合物 17.56 mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐 31.29 mg/L，
L-谷氨酸 50.35 mg/L，
L-谷氨酰胺 365 mg/L，
甘氨酸 78.75 mg/L，
L-组氨酸盐酸盐 131.48 mg/L，
L-异亮氨酸 154.47 mg/L，
L-亮氨酸 159.05 mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐 191.25 mg/L，
L-蛋氨酸 67.24 mg/L，
L-苯丙氨酸 135.48 mg/L，
L-脯氨酸 47.25 mg/L，
L-丝氨酸 76.25 mg/L，
L-苏氨酸 153.45 mg/L，
L-色氨酸 209.02 mg/L，
L-酪氨酸二钠盐 55.79 mg/L，
L-缬氨酸 152.85 mg/L，
维生素部分：
生物素 0.0035 mg/L，（国药试剂，67000260），
氯化胆碱 8.98 mg/L，
D-泛酸钙 2.24 mg/L，
叶酸 2.65 mg/L，
烟酰胺 2.02 mg/L，
盐酸吡哆醇 2.03 mg/L，
核黄素 0.22 mg/L，
盐酸硫胺素 0.2 mg/L，
肌醇 12.6 mg/L，
B12维生素 0.68 mg/L，
无机盐部分：
无水氯化钙 116.69 mg/L，
氯化钾 311.8 mg/L，
氯化镁 28.64 mg/L，
无水硫酸镁 48.84 mg/L，
氯化钠 6995.5 mg/L，
磷酸二氢钠 62.5 mg/L，
磷酸氢二钠 71.02 mg/L，
七水硫酸亚铁 0.42 mg/L，
九水硝酸铁 0.05 mg/L，
七水硫酸锌 0.432 mg/L，
硅酸钠 0.061 mg/L，
其余添加物部分：
D-葡萄糖 4500 mg/L，
丙酮酸钠 110 mg/L，
磷酸烯醇丙酮酸盐 2.67 mg/L，
亚油酸 0.084 mg/L，
鞘磷脂 1 mg/L，
大豆卵磷脂 6 mg/L，
胆固醇 2.9 mg/L，
硫辛酸 0.1 mg/L，
1-甲基组氨酸 1 mg/L，
3-甲基组氨酸 1 mg/L，
牛磺酸 50 mg/L，
胸苷 0.365 mg/L，
腺嘌呤 4 mg/L，
胸腺嘧啶 0.04 mg/L，
腐胺 0.081 mg/L，
重组胰岛素 10 mg/L，
转铁蛋白 10 mg/L，
植物蛋白 3000 mg/L，
酵母粉 1000 mg/L，
EGF上皮生长因子 0.2 mg/L，
碘甲状腺原氨酸 0.0034 mg/L，
PF-68抗剪切剂 300 mg/L，（GIBCO，89-5080IP），
Anti-Clumping细胞分散因子 200 mg/L，（Invitrigen Corporation，725230）。
培养验证过程：
1、仪器设备：
生物反应器，型号：BIOSTATEOR B plus（德国Sartorius）,培养罐体积5L。
2、细胞：
全悬浮型MDCK细胞，由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供。
3、培养方法：
将全悬浮培养型MDCK细胞以5.0×105/ml接种到生物反应器中，反应器参数设置为：温度37℃,转速110rpm/min，溶氧60%，pH7.2。接通空气、氧气、氮气和二氧化碳四路气体以及1N氢氧化钠，每24h取样计数和检查细胞活力。
4、培养结果如表1所示。
表1
。
5、与现有产品对比，对比结果如图1所示，其中，对照用产品为市售的MDCK细胞无血清培养基（LONZA，12-749Q）。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基中，各原料物质的终浓度为：
氨基酸部分：
维生素部分：
无机盐部分：
其余添加物部分：
将所有物质以注射用水充分溶解后加入2000mg/L碳酸氢钠，再用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.3。
2.根据权利要求1所述的一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，将所述原料物质根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于10℃-30℃混合，使各原料物质终浓度如权利要求1所述，调节所得混合液的pH值至7.1-7.3，定容后即得MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基。
3.根据权利要求1所述的一种MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，将所述原料物质混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10℃-30℃蒸馏水中溶解，使各原料物质终浓度如权利要求1所述，调节所得混合液的pH值至7.1-7.3，定容后即得MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基。
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