CN103045533B - 适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术之培养基研发技术领域，是一种适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基，它包含23种基础代谢营养物、2种核酸类化合物、6种维生素、9种无机盐类化合物、1种剪切力保护剂、2种酸碱度缓冲剂、1种酸碱度指示剂、10种病毒增殖促进剂以及3种添加物；本发明的无血清培养基可采用常规的制备方法：将上述组分溶解于无热源超纯水中即可配制得到所述的无血清培养基。其使用方法也为常规方法。本发明的积极效果是：不含血清，总蛋白含量低于10毫克/升，有利于产物的分离纯化，适于流感疫苗的生产，支持动物细胞的正常生长和长期传代培养，无需适应即可使用，因组分明确而配制方便，成本可控，适于流感疫苗的大规模生产。

Description

适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基

技术领域

本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种适于动物细胞大规模微载体悬浮培养以及病毒扩增生产疫苗（大规模生产流感疫苗）的无血清培养基。

技术背景

世界卫生组织（WHO）的数据显示：全世界每年约有5～15%的人感染季节性流感，其中会有300～500万个严重病例，有高达25～50万人死亡。流感给人类造成的损失不仅仅是超额的死亡率，更涉及到各种形式的直接或间接的经济损失；其中，直接的经济损失包括医院成本、医药消费增加以及企业因工作缺勤率而导致效率低下等；有人在1999年就统计过，流感每年给美国造成的直接经济损失高达1000亿美元。而间接损失包括直接经济损失的放大效应及流感引起的基本经济行为、投资行为和消费行为的变化等等，这些损失是无法估量的。

目前公认的预防流感的最佳方法是接种流感疫苗。对大多数国家和地区而言，安全有效的灭活疫苗一直是预防流感的基础。在发达国家，若能保证疫苗的抗原性与流感易发季节有较高的匹配度，便可保护70%～80%的健康成人免于出现流感临床症状。对于未居住在养老院、护理机构的老人，在流感易发季节接种疫苗后不仅可减少25%～39%的住院人数，而且可使总死亡率降低39%～75%。因此，流感疫苗已成为当今受人重视的、销售额最大的疫苗品种之一。有研究表明，流感疫苗是过去10年中疫苗市场增长的主要推动者，也是未来10年疫苗市场增长的主要品种之一。目前就世界范围而言，流感疫苗的接种率还比较低，但是，随着各国生活水平的提高，流感疫苗的接种率会持续增长，对流感疫苗的需求将持续扩大。

目前，流感疫苗的制备多采用传统的鸡胚培养工艺。但是，该工艺是一种劳动密集型工艺，存在诸多缺陷，例如：第一，对鸡胚的要求严格，必须是SPF（Specific Pathogen Free 无特定病原）级洁净鸡胚。因此，准备合格鸡胚所需要的周期长，对流感大流行的应急能力差。第二，所饲养的种鸡个体的差异可能导致鸡胚存在差异，使得各批次疫苗间的质量均一性差。第三，疫苗的生产过程时间长、易污染。此外，鸡胚生产的疫苗还可能导致对鸡蛋过敏的人群发生严重的超敏反应。

因此，克服现有技术的不足，研究基于细胞培养的可高效生产流感疫苗的体系成为目前流感疫苗研制的重要方向之一，世界卫生组织及各国相关部门也在积极倡导利用细胞培养技术生产疫苗，以替代鸡胚培养工艺。

近年来，将各种动物细胞用于疫苗生产的研究也在不断推进之中。有大量文献报道了：MDCK细胞（Madin-Darby canine kidney cells）被广泛用于病毒的扩增和纯化，因其增殖快，且流感病毒对其感染效率高、不易变异，因此被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一。

目前，基于动物细胞（MDCK细胞）培养流感疫苗的生产过程多采用两阶段操作工艺，即：前期在有血清的培养基中使细胞增殖至所需密度；后期通过洗涤去除血清成分及代谢废物，更换为无血清培养基以支持病毒在细胞中感染和复制。然而血清的应用可能存在很多问题：例如：第一，批次间组分和质量的差异易造成生物制品批次间质量的不均一；第二，易污染支原体、病毒、BSE-因子和其它传染因子的风险；第三，大量血清蛋白的存在增加了后期分离纯化的难度，并且部分物质无法彻底去除，会影响最终产品的质量；此外，血清来源受限、价格昂贵，大大增加了生产成本。因此，许多研究组织都在开发无需血清的培养条件或者血清来源产品的有效宿主系统。

在细胞增殖的方式中，悬浮培养模式因具有规模易放大、培养条件易控制等优点，大规模的细胞增殖多采用该模式。悬浮培养模式又分为微载体悬浮培养和单细胞悬浮培养方式。前者与后者比较具有一定的优势：首先，易更换培养基，无需专用细胞过滤器，可避免滤器堵塞等问题；其次，细胞与培养液易分离，易于洗涤细胞；再次，便于浓缩细胞密度，易制备高浓度、高效价生物产品，可降低产品分离纯化成本；最后，细胞可保持贴壁生长属性，避免悬浮细胞引起的致瘤性等安全问题。因此，目前流感疫苗的生产工艺中多采用微载体悬浮培养的模式。

综上所述，在基于MDCK细胞通过微载体悬浮培养的模式大规模培养并生产流感疫苗的工艺中，无血清培养基的开发和应用具有非常重要的意义。

近年来，对无血清培养基的研究已取得了一些长足的进展：

1979年，美国加利福利亚大学Taub等人开发出了MediumK-1无血清培养基，以SF-DMEM/F12（1:1）为基础培养基，添加多种激素和抗生素，其能支持贴壁MDCK细胞生长，每天增殖1.5倍，最大细胞密度可达2.6×10⁵ 细胞/平方厘米。

1994年，法国巴斯德研究所Merten等人开发了无血清培养基MDSS2，其蛋白总含量为40 毫克/升，含有多种动物源蛋白和蛋白水解物。1996年，他们继续开发了MDSS2N，用植物来源组分替代动物来源组分，以大豆蛋白水解物替代酪素蛋白胨，可用于MDCK细胞的贴壁培养。

2001年，美国Sigma-Aldrich公司的Johnson等人开发了无血清培养基MDCK-LP和MDCK-LPM，它们适于MDCK细胞的贴壁生长和乙肝病毒疫苗的生产。

2005年，日本Kyoritsu Seiyaku 集团的Mochizuki等人开发了无血清低蛋白培养基RPMI/SP，在经典培养基RPMI1640的基础上添加了大豆蛋白水解物、谷氨酰胺以及抗生素混合液，该培养基可以维持MDCK细胞的贴壁稳定生长以及几种犬病毒疫苗的生产。

2006年，德国Max Planck研究所Genzel等人在病毒滴度方面，用JRH Bioscience 的商业培养基Ex-Cell MDCK培养贴壁的MDCK细胞生产流感病毒疫苗，其病毒滴度为199.5-398.1 血凝单位/100 微升。

2001年，英国应用微生物研究中心Tree等人用Gibco公司的无血清商业培养基EpiSerf培养MDCK细胞生产流感病毒疫苗，其病毒滴度为1.0×10⁹ 病毒空斑形成单位/毫升。

2006年，美国Sigma-Aldrich公司的分公司推出了一种无血清无动物蛋白的MDCK细胞培养基Ex-Cell MDCK，它含有重组蛋白和大豆蛋白水解物，并宣称该培养基能够支持MDCK细胞贴壁培养和细胞悬浮培养以生产流感病毒疫苗，其病毒滴度为1.0×10⁹ 半数组织感染剂量/毫升。

上述商业培养基虽能支持细胞稳定生长和用于生物制品的生产，但是也存在一些明显的不足，将其用于某些研究或者用于大规模细胞培养和生物制品的生产会有不少困难。其主要问题是：①价格昂贵，只适用于部分小规模的实验研究，而不适于大规模的细胞培养及生物制品的生产。②大部分组分未公开，化学成分不明确，给科研和生产带来一定的困难。③有些培养基不能支持细胞的高密度生产，有些培养基用于MDCK细胞培养时延滞期过长，且细胞的生长缓慢，从而在一定程度上增加了生产成本。④大部分培养基只能支持MDCK细胞的贴壁生长，不支持流感病毒的增殖，即使能够支持流感病毒增殖的话，得到的病毒滴度也不高。

基于MDCK细胞通过无血清微载体悬浮培养的模式大规模生产流感疫苗的工艺，既可避免有血清培养的种种不利因素，又可解决静态贴壁培养带来的工作量大、成本高的问题，提高了MDCK细胞培养的生产效率并降低了流感疫苗的生产成本，能确保产品的质量，因而它具有巨大的前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基，它组分明确，能去除血清对流感疫苗生产过程的干扰，能降低生产成本，并能解除在利用MDCK细胞培养法生产流感疫苗过程中对血清的依赖，为流感疫苗的产业化生产带来极大方便。

在研究中，发明人确定为，本发明要提供的适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基应该包括：基础代谢营养物、核酸类化合物、维生素、无机盐类化合物、剪切力保护剂、酸碱度缓冲剂、酸碱度指示剂、病毒增殖促进剂以及添加物；其中，基础营养代谢物应包括基础碳源和氮源物质，要为细胞生长、正常代谢和维持生命提供物质基础；核酸类化合物是细胞物质能量代谢所必须的构件分子，同时也是RNA和DNA等遗传物质合成的物质基础；维生素是细胞代谢中必不可少的有机化合物，许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子，细胞的各种生长代谢活动都需要维生素；无机盐类化合物能调节细胞膜的通透性，控制水分，维持正常渗透压和酸碱平衡，维持细胞的形态和功能，有些无机或有机化合物以构成酶的辅基、激素、维生素、蛋白质和核酸的成分，或作为多种酶系统的激活剂，参与许多重要的重理功能；剪切力保护剂可削弱生物反应器中因搅拌、通气等机械外力对细胞的损伤作用；酸碱度缓冲剂能调控反应系统的酸碱度平衡，避免过酸性或过碱性环境对细胞核病毒的损伤作用；酸碱指示剂能在线指示细胞培养液的酸碱度变化，方便更换新鲜培养液、细胞传代等操作；病毒增殖促进剂能调控细胞生理状态、维持病毒活性、促进病毒增殖过程；（其它）添加物则包含血清替代物和为细胞生长提供重要的氨基酸、短肽等营养物的蛋白水解物。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。

一种适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基，其特征在于，包含23种基础代谢营养物、2种核酸类化合物、6种维生素、9种无机盐类化合物、1种剪切力保护剂、2种酸碱度缓冲剂、1种酸碱度指示剂、10种病毒增殖促进剂以及3种添加物；

——所述的基础代谢营养物为：葡萄糖、丙酮酸钠、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；

——所述的核酸类化合物为：次黄嘌呤、胸苷；

——所述的维生素为：生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸；

——所述的无机盐类化合物为：硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚硒酸钠；

——所述的剪切力保护剂为嵌段式聚醚 F68；

——所述的酸碱度缓冲剂为：碳酸氢钠、羟乙基哌嗪乙磺酸；

——所述的酸碱度指示剂为酚红；

——所述的病毒增殖促进剂为：胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、氯化镁、氯化钙、丁酸钠、二甲基亚砜；

——所述的添加物为：转铁蛋白、胰岛素、大豆水解物。

进一步，所述适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基，在无热源超纯水中溶解以下组分，其各种成分的含量为（以下浓度按MDCK培养基的总体积计算），单位为毫克/升：

葡萄糖（D-Glucose）	1000～6000
		丙酮酸钠（Sodium Pyruvate）	50～200
丙氨酸（L-Alanine）	4～9
		精氨酸（L-Arginine Hydrochloride）	40～200
天冬酰胺（L- Asparagine Monohydrate）	5～20
		天冬氨酸（L-Aspartic cid）	2～20
胱氨酸（L-Cystine Dihydrochloride）	5～50
		半胱氨酸（L- Cysteine Hydrochloride Monohydrate）	10～50
谷氨酸（L-Glutamic Acid）	3～30
		谷氨酰胺（L-Glutamine）	100～2000
甘氨酸（Glycine）	5～50
		组氨酸（L-Histidine Hydrochloride Monohydrate）	10～50
异亮氨酸（L-Isoleucine）	20～70
		亮氨酸（L-Leucine）	30～80
赖氨酸（L- Lydine hydrochloride）	50～200
		甲硫氨酸（L-Methionine）	10～50
苯丙氨酸（L-Phenylalanine）	20～50
		脯氨酸（L-Proline）	2～40
丝氨酸（L-Serine）	10～60
		苏氨酸（L-Threonine）	10～70
色氨酸（L-Tryptophan）	5～20
		酪氨酸（L-Tyrosine Disodium Dihydrate）	30～80
缬氨酸（L-Valine）	30～90
		次黄嘌呤（Hypoxanthine）	3～15
胸苷（Thymidine）	0.1～1
		生物素（D-Biotin）	0.001～0.1
叶酸（Folic Acid）	2～5
		烟酰胺（Niacinamide）	2～10
吡哆醇（Pyridoxine Hydrochloride）	1～5
		硫胺素（Thiamine Hydrochloride）	1～8
硫辛酸（Lipoic Acid）	0.1～1
		硫酸铜（Cupric Sulfate Pentahydrate）	5～30
硝酸铁（Ferric Nitrate Nonahydrate）	10～100
		硫酸亚铁（Ferrous Sulfate Heptahydrate）	0.1～1
硫酸镁（Magnesium Sulfate）	20～120
		氯化钾（Potassium Chloride）	300～550
氯化钠（Sodium Chloride）	1000～7000
		磷酸氢二钠（Dibasic Sodium Phosphate）	50～120
磷酸二氢钠（Sodium Dihydrogen Phosphate）	50～120
		亚硒酸钠（Sodium Selenite）	50～200
嵌段式聚醚F68（Pluronic F68）	220～2200
		碳酸氢钠（Sodium Bicarbonate）	1000～4000
羟乙基哌嗪乙磺酸（Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid）	1000～5000
		酚红（Sodium Phenol Red）	5～10
胆固醇（Cholesterol）	1～5
		生育酚醋酸酯（DL-alpha-Tocopherol Acetate）	0.01～0.2
豆蔻酸（Myristic Acid）	0.01～0.2
		棕榈酸（Palmitic Acid）	0.01～0.2
棕榈油酸（Palmitoleic Acid）	0.01～0.2
		硬脂酸（Stearic Acid）	0.01～0.2
氯化镁（Magnesium Chloride Hexahydrate）	1000～5500
		氯化钙（Calcium Chloride Dihydrate）	150～200
丁酸钠（Sodium Butyrate）	10～200
		二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide）	5～20
转铁蛋白（Transferrin）	5～50
		胰岛素（Insulin）	5～40
大豆水解物（Lucaratone Soy）	1500～4000

本发明适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基采用常规的制备方法，即：将上述组分溶解于无热源超纯水中即可配制得到所述的无血清培养基。

本发明适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基的使用方法也为常规方法。

本发明适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基的积极效果是：

（1）组分明确，不含血清，总蛋白含量低于10 毫克/升，有利于产物的分离和纯化，适于流感疫苗的生产。

（2）支持MDCK细胞长期传代培养，无需长期而复杂的适应过程。

（3）能良好地支持MDCK细胞的贴壁生长及微载体悬浮培养，其最高细胞密度接近甚至超过有血清培养基和已知的商业培养基。

（4）能良好地支持MDCK细胞的贴壁生长及微载体悬浮高密度培养以及病毒扩增生产流感病毒疫苗，易于放大生产，从而能有效地降低生产成本。

（5）因为组分明确，所以能适合对细胞生长代谢、病毒扩增等方面的研究工作。

（6）因为组分明确，所以容易配制使用、成本可控，适用于大规模生产。

附图说明

附图1为MDCK细胞在本发明的无血清培养基中批次培养生长和流感病毒增殖曲线的坐标图I。

附图2为MDCK细胞在本发明的无血清培养基中批次培养生长和流感病毒增殖曲线的坐标图II。

附图3为MDCK细胞在本发明的无血清培养基中批次培养生长和流感病毒增殖曲线的坐标图III。

具体实施方式

以下结合附图介绍本发明适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基的具体实施方式，提供3个实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。

实施例1

一种适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基，包含23种基础代谢营养物、2种核酸类化合物、6种维生素、9种无机盐类化合物、1种剪切力保护剂、2种酸碱度缓冲剂、1种酸碱度指示剂、10种病毒增殖促进剂以及3种添加物，在无热源超纯水中溶解以下组分，其各种成分如下，单位为毫克/升：

葡萄糖（D-Glucose）	5400
		丙酮酸钠（Sodium Pyruvate）	110
丙氨酸（L-Alanine）	4.45
		精氨酸（L-Arginine Hydrochloride）	147.5
天冬酰胺（L- Asparagine Monohydrate）	7.5
		天冬氨酸（L-Aspartic cid）	6.65
胱氨酸（L-Cystine Dihydrochloride）	17.56
		半胱氨酸（L- Cysteine Hydrochloride Monohydrate）	31.29
谷氨酸（L-Glutamic Acid）	7.35
		谷氨酰胺（L-Glutamine）	876
甘氨酸（Glycine）	18.75
		组氨酸（L-Histidine Hydrochloride Monohydrate）	31.48
异亮氨酸（L-Isoleucine）	54.47
		亮氨酸（L-Leucine）	59.05
赖氨酸（L- Lydine hydrochloride）	91.25
		甲硫氨酸（L-Methionine）	34.48
苯丙氨酸（L-Phenylalanine）	35.48
		脯氨酸（L-Proline）	34.50
丝氨酸（L-Serine）	26.25
		苏氨酸（L-Threonine）	53.45
色氨酸（L-Tryptophan）	9.02
		酪氨酸（L-Tyrosine Disodium Dihydrate）	55.79
缬氨酸（L-Valine）	82.85
		次黄嘌呤（Hypoxanthine）	6.3
胸苷（Thymidine）	0.73
		生物素（D-Biotin）	0.007
叶酸（Folic Acid）	3.99
		烟酰胺（Niacinamide）	6.06
吡哆醇（Pyridoxine Hydrochloride）	4
		硫胺素（Thiamine Hydrochloride）	6.51
硫辛酸（Lipoic Acid）	0.315
		硫酸铜（Cupric Sulfate Pentahydrate）	15.97
硝酸铁（Ferric Nitrate Nonahydrate）	20.02
		硫酸亚铁（Ferrous Sulfate Heptahydrate）	0.417
硫酸镁（Magnesium Sulfate）	48.84
		氯化钾（Potassium Chloride）	311.8
氯化钠（Sodium Chloride）	6996
		磷酸氢二钠（Dibasic Sodium Phosphate）	71.02
磷酸二氢钠（Sodium Dihydrogen Phosphate）	54.3
		亚硒酸钠（Sodium Selenite）	162.94
嵌段式聚醚F68（Pluronic F68）	1000
		碳酸氢钠（Sodium Bicarbonate）	2400
羟乙基哌嗪乙磺酸（Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid）	1150
		酚红（Sodium Phenol Red）	8.63
胆固醇（Cholesterol）	4.92
		生育酚醋酸酯（DL-alpha-Tocopherol Acetate）	0.09
豆蔻酸（Myristic Acid）	0.015
		棕榈酸（Palmitic Acid）	0.015
棕榈油酸（Palmitoleic Acid）	0.015
		硬脂酸（Stearic Acid）	0.015
氯化镁（Magnesium Chloride Hexahydrate）	5000
		氯化钙（Calcium Chloride Dihydrate）	154.5
丁酸钠（Sodium Butyrate）	55
		二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide）	11
转铁蛋白（Transferrin）	10
		胰岛素（Insulin）	10
大豆水解物（Lucaratone Soy）	2000

    将用于生产流感病毒疫苗的MDCK细胞在实施例1制备的适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基中进行贴壁培养，具体的培养方法为：将MDCK细胞接种于2升生物反应器中，培养液体积为1.5升，接种密度为3×10⁵ 细胞/毫升，溶氧为50%，pH值为7.0，培养至72小时细胞密度为6.09×10⁶ 细胞/毫升。此时，添加TPCK胰酶，终浓度为5 毫克/升，感染流感病毒，将pH值设为7.4，培养至120小时，此时病毒滴度达到最高，为2¹¹ 血凝单位/50微升，其结果见附图1：MDCK细胞在本发明的无血清培养基中批次培养生长和流感病毒增殖曲线的坐标图I，图中：                                                

为流感病毒血凝值曲线；■为MDCK活细胞密度曲线。

从附图1中的曲线可以得知，实施例1的适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基能够良好地支持细胞的正常生长和流感病毒增殖，其最高细胞密度及流感病毒血凝滴度均超过已知的商业培养基。

实施例2

一种适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基，包含23种基础代谢营养物、2种核酸类化合物、6种维生素、9种无机盐类化合物、1种剪切力保护剂、2种酸碱度缓冲剂、1种酸碱度指示剂、10种病毒增殖促进剂以及3种添加物，在无热源超纯水中溶解以下组分，其各种成分如下，单位为毫克/升：

葡萄糖（D-Glucose）	1000
		丙酮酸钠（Sodium Pyruvate）	50
丙氨酸（L-Alanine）	4
		精氨酸（L-Arginine Hydrochloride）	40
天冬酰胺（L- Asparagine Monohydrate）	5
		天冬氨酸（L-Aspartic cid）	2
胱氨酸（L-Cystine Dihydrochloride）	5
		半胱氨酸（L- Cysteine Hydrochloride Monohydrate）	10
谷氨酸（L-Glutamic Acid）	3
		谷氨酰胺（L-Glutamine）	100
甘氨酸（Glycine）	5
		组氨酸（L-Histidine Hydrochloride Monohydrate）	10
异亮氨酸（L-Isoleucine）	20
		亮氨酸（L-Leucine）	30
赖氨酸（L- Lydine hydrochloride）	50
		甲硫氨酸（L-Methionine）	10
苯丙氨酸（L-Phenylalanine）	20
		脯氨酸（L-Proline）	2
丝氨酸（L-Serine）	10
		苏氨酸（L-Threonine）	10
色氨酸（L-Tryptophan）	5
		酪氨酸（L-Tyrosine Disodium Dihydrate）	30
缬氨酸（L-Valine）	30
		次黄嘌呤（Hypoxanthine）	3
胸苷（Thymidine）	0.1
		生物素（D-Biotin）	0.001
叶酸（Folic Acid）	2
		烟酰胺（Niacinamide）	2
吡哆醇（Pyridoxine Hydrochloride）	1
		硫胺素（Thiamine Hydrochloride）	1
硫辛酸（Lipoic Acid）	0.1
		硫酸铜（Cupric Sulfate Pentahydrate）	5
硝酸铁（Ferric Nitrate Nonahydrate）	100
		硫酸亚铁（Ferrous Sulfate Heptahydrate）	1
硫酸镁（Magnesium Sulfate）	120
		氯化钾（Potassium Chloride）	300
氯化钠（Sodium Chloride）	7000
		磷酸氢二钠（Dibasic Sodium Phosphate）	50
磷酸二氢钠（Sodium Dihydrogen Phosphate）	50
		亚硒酸钠（Sodium Selenite）	50
嵌段式聚醚F68（Pluronic F68）	220
		碳酸氢钠（Sodium Bicarbonate）	4000
羟乙基哌嗪乙磺酸（Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid）	1000
		酚红（Sodium Phenol Red）	10
胆固醇（Cholesterol）	1
		生育酚醋酸酯（DL-alpha-Tocopherol Acetate）	0.01
豆蔻酸（Myristic Acid）	0.01
		棕榈酸（Palmitic Acid）	0.01
棕榈油酸（Palmitoleic Acid）	0.01
		硬脂酸（Stearic Acid）	0.01
氯化镁（Magnesium Chloride Hexahydrate）	1000
		氯化钙（Calcium Chloride Dihydrate）	150
丁酸钠（Sodium Butyrate）	10
		二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide）	5
转铁蛋白（Transferrin）	5
		胰岛素（Insulin）	5
大豆水解物（Lucaratone Soy）	1500

将用于生产流感病毒疫苗的MDCK细胞在实施例2制备的适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基中进行贴壁培养，具体的培养方法为：将MDCK细胞接种于2升生物反应器中，培养液体积为1.5升，接种密度为3×10⁵ 细胞/毫升，溶氧为50%，pH值为7.0，培养至72小时细胞密度为5.07×10⁶ 细胞/毫升。此时，添加TPCK胰酶，终浓度为5 毫克/升，感染流感病毒，将pH值设为7.4，培养至120小时，此时病毒滴度达到最高，为2^10.25  血凝单位/50微升，其结果见附图2：MDCK细胞在本发明的无血清培养基中批次培养生长和流感病毒增殖曲线的坐标图II，图中：

 为流感病毒血凝值曲线；■为MDCK活细胞密度曲线。

从附图2中的曲线可以得知，实施例2的适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基能够良好地支持细胞的正常生长和流感病毒增殖，其最高细胞密度及流感病毒血凝滴度均超过已知的商业培养基。

实施例3

一种适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基，包含23种基础代谢营养物、2种核酸类化合物、6种维生素、9种无机盐类化合物、1种剪切力保护剂、2种酸碱度缓冲剂、1种酸碱度指示剂、10种病毒增殖促进剂以及3种添加物，在无热源超纯水中溶解以下组分，其各种成分如下，单位为毫克/升：

葡萄糖（D-Glucose）	6000
		丙酮酸钠（Sodium Pyruvate）	200
丙氨酸（L-Alanine）	9
		精氨酸（L-Arginine Hydrochloride）	200
天冬酰胺（L- Asparagine Monohydrate）	20
		天冬氨酸（L-Aspartic cid）	20
胱氨酸（L-Cystine Dihydrochloride）	50
		半胱氨酸（L- Cysteine Hydrochloride Monohydrate）	50
谷氨酸（L-Glutamic Acid）	30
		谷氨酰胺（L-Glutamine）	2000
甘氨酸（Glycine）	50
		组氨酸（L-Histidine Hydrochloride Monohydrate）	50
异亮氨酸（L-Isoleucine）	70
		亮氨酸（L-Leucine）	80
赖氨酸（L- Lydine hydrochloride）	200
		甲硫氨酸（L-Methionine）	50
苯丙氨酸（L-Phenylalanine）	50
		脯氨酸（L-Proline）	40
丝氨酸（L-Serine）	60
		苏氨酸（L-Threonine）	70
色氨酸（L-Tryptophan）	20
		酪氨酸（L-Tyrosine Disodium Dihydrate）	80
缬氨酸（L-Valine）	90
		次黄嘌呤（Hypoxanthine）	15
胸苷（Thymidine）	1
		生物素（D-Biotin）	0.1
叶酸（Folic Acid）	5
		烟酰胺（Niacinamide）	10
吡哆醇（Pyridoxine Hydrochloride）	5
		硫胺素（Thiamine Hydrochloride）	8
硫辛酸（Lipoic Acid）	1
		硫酸铜（Cupric Sulfate Pentahydrate）	30
硝酸铁（Ferric Nitrate Nonahydrate）	10
		硫酸亚铁（Ferrous Sulfate Heptahydrate）	0.1
硫酸镁（Magnesium Sulfate）	20
		氯化钾（Potassium Chloride）	550
氯化钠（Sodium Chloride）	1000
		磷酸氢二钠（Dibasic Sodium Phosphate）	120
磷酸二氢钠（Sodium Dihydrogen Phosphate）	120
		亚硒酸钠（Sodium Selenite）	200
嵌段式聚醚F68（Pluronic F68）	2200
		碳酸氢钠（Sodium Bicarbonate）	1000
羟乙基哌嗪乙磺酸（Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid）	5000
		酚红（Sodium Phenol Red）	5
胆固醇（Cholesterol）	5
		生育酚醋酸酯（DL-alpha-Tocopherol Acetate）	0.2
豆蔻酸（Myristic Acid）	0.2
		棕榈酸（Palmitic Acid）	0.2
棕榈油酸（Palmitoleic Acid）	0.2
		硬脂酸（Stearic Acid）	0.2
氯化镁（Magnesium Chloride Hexahydrate）	5500
		氯化钙（Calcium Chloride Dihydrate）	200
丁酸钠（Sodium Butyrate）	200
		二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide）	20
转铁蛋白（Transferrin）	50
		胰岛素（Insulin）	40
大豆水解物（Lucaratone Soy）	4000

将用于生产流感病毒疫苗的MDCK细胞在实施例3制备的适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基中进行贴壁培养，具体的培养方法为：将MDCK细胞接种于2升生物反应器中，培养液体积为1.5升，接种密度为3×10⁵ 细胞/毫升，溶氧为50%，pH值为7.0，培养至72小时细胞密度为6.19×10⁶ 细胞/毫升。此时，添加TPCK胰酶，终浓度为5 毫克/升，感染流感病毒，将pH值设为7.4，培养至120小时，此时病毒滴度达到最高，为2^10.75  血凝单位/50微升，其结果见附图3：MDCK细胞在本发明的无血清培养基中批次培养生长和流感病毒增殖曲线的坐标图III，图中：

 为流感病毒血凝值曲线；■为MDCK活细胞密度曲线。

从附图3中的曲线可以得知，实施例3的适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基能够良好地支持细胞的正常生长和流感病毒增殖，其最高细胞密度及流感病毒血凝滴度均超过已知的商业培养基。 

Claims (1)

1.一种适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基，其特征在于，在无热源超纯水中溶解以下组分，其各种成分的含量为，单位为毫克/升：

葡萄糖    1000～6000；

丙酮酸钠    50～200；

丙氨酸       4～9；

精氨酸      40～200；

天冬酰胺     5～20；

天冬氨酸     2～20；

胱氨酸       5～50；

半胱氨酸    10～50；

谷氨酸       3～30；

谷氨酰胺   100～2000；

甘氨酸       5～50；

组氨酸      10～50；

异亮氨酸    20～70；

亮氨酸      30～80；

赖氨酸      50～200；

甲硫氨酸    10～50；

苯丙氨酸    20～50；

脯氨酸      2～40；

丝氨酸     10～60；

苏氨酸     10～70；

色氨酸      5～20；

酪氨酸     30～80；

缬氨酸     30～90；

次黄嘌呤    3～15；

胸苷      0.1～1；

生物素  0.001～0.1；

叶酸        2～5；

烟酰胺      2～10；

吡哆醇      1～5；

硫胺素      1～8；

硫辛酸    0.1～1；

硫酸铜      5～30；

硝酸铁     10～100；

硫酸亚铁  0.1～1；

硫酸镁     20～120；

氯化钾    300～550；

氯化钠   1000～7000；

磷酸氢二钠  50～120；

磷酸二氢钠  50～120；

亚硒酸钠  50～200；

嵌段式聚醚F68  220～2200；

碳酸氢钠  1000～4000；

羟乙基哌嗪乙磺酸  1000～5000；

酚红         5～10；

胆固醇       1～5；

生育酚醋酸酯  0.01～0.2；

豆蔻酸  0.01～0.2；

棕榈酸  0.01～0.2；

棕榈油酸  0.01～0.2；

硬脂酸    0.01～0.2；

氯化镁    1000～5500；

氯化钙     150～200；

丁酸钠      10～200；

二甲基亚砜   5～20；

转铁蛋白     5～50；

胰岛素       5～40；

大豆水解物  1500～4000。

Images