CN105018416B - 一种悬浮培养bhk-21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法 - Google Patents
一种悬浮培养bhk-21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种悬浮培养BHK‑21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法，发明通过对培养基中氨基酸、无机盐、维生素、脂类、水解物和其余添加物的添加和组分优化，显著促进了细胞的增殖速度，缩短了倍增时间，使细胞达到更高生长密度的同时保持较高的活力。该培养基是适合BHK‑21细胞高密度悬浮培养的低成本无血清无动物源低蛋白培养基，通过脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等成分的添加完全替代血清的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基组分的优化，使得BHK‑21细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适合于规模化工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法。
背景技术
BHK-21细胞系即叙利亚仓鼠肾细胞，英文名称:Baby Hamster Kidney Cell，1961年英国人I.A.Macpherson和M.G.P Stocker用1日龄叙利亚仓鼠的肾建立的传代细胞，常用的是克隆13，是由5只一日龄，性别特征不是特别明显的肾细胞而来，即：BHK-21C13，中文全名为：叙利亚仓鼠肾细胞克隆13，以下简称BHK-21细胞。BHK-21细胞是世界卫生组织和中国生物制品规程认可的生产疫苗的细胞系，可以用于多种病毒的增殖和纯化，如口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)，脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)，呼肠孤病毒(Reovirus)，水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)等。由于它生长速度较快、病毒敏感谱广、对大量制备病毒疫苗有利，研究人员经无数次传代驯化，使它可悬浮生长并用于病毒性疫苗的生产，如口蹄疫疫苗，狂犬病疫苗，乙脑疫苗等。
目前采用BHK-21细胞的疫苗生产中，无血清悬浮培养是最为先进的工艺。无血清培养基相比有血清培养基具有诸多优势：1)可克服血清批次间的差异性，使细胞培养性能更加稳定，能提高结果的重复性；2)可避免血清的外源性污染，因为动物来源血清常携带病毒或支原体；3)可简化下游目的产物的分离纯化，节省成本；4)成分相对明确，有利于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等一系列细胞行为。
目前，国外的无血清培养基产品价格高且配方保密，同时国内外均缺少专门针对BHK细胞培养的无血清培养基，而且培养基性能较差，例如中国内2014年公布的最新专利CN103555658A，其发明的BHK-21无血清悬浮培养基，以50*104cells/ml接种，24小时后仅能达到150*104cells/ml，细胞增殖速度缓慢，倍增时间较长，96小时后仅能达到500*104cells/ml，所能支持细胞生长的密度较低。中国内的培养基龙头企业北京清大天一生物技术有限公司开发出可以悬浮培养BHK细胞的低血清培养基，根据其细胞手册2011版显示，即使清大天一生物技术有限公司的低血清培养基，悬浮培养BHK-21细胞的密度也仅仅达到了400*104cells/ml。综上所述，开发低成本、支持细胞快速增殖和高密度悬浮培养的BHK-21细胞无血清培养基对国内动物疫苗行业的发展具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于，克服现有技术中的缺陷，提供一种针对中国工业生产所用BHK-21细胞的生长的特点，研制适合BHK-21细胞高密度悬浮培养的低成本无血清无动物源低蛋白培养基。通过添加脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等组分来替代血清的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基组分的优化，使BHK-21细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适合于规模化工业生产。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种促进悬浮培养BHK-21细胞快速增殖的无血清无动物源培养基，其特征在于：包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类和添加物；
所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸一水合物、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐、L-缬氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸和甘氨酸；
所述无机盐包括无水氯化钙、氯化钠、磷酸氢二钠、六水氯化镁、无水硫酸镁、氯化钾、一水磷酸二氢钠、七水合硫酸锌、九水合硝酸铁、亚硒酸钠、五水硫酸铜和硫酸亚铁；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、核黄素、钴胺素、盐酸硫胺素和肌醇；
所述蛋白水解物包括酵母超滤物、棉籽水解物、大米水解物和麦麸水解物；
所述脂类包括亚油酸、大豆卵磷脂、胆固醇、腐胺和乙醇胺；
所述添加物包括D-葡萄糖、丙酮酸钠、硫辛酸、胸苷、腺嘌呤、胸腺嚓咤、重组胰岛素、柠檬酸铁、环庚三烯酚酮、酚红钠盐、F-68、碳酸氢钠、还原型谷胱甘肽和次黄嘌呤钠盐。
进一步，一种悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基，其特征在于，所述培养基中包括下列含量的原料物质：
(1)氨基酸：
L-丙氨酸100-180mg/L，
L-谷氨酰胺200-300mg/L，
L-精氨酸盐酸盐200-300mg/L，
L-天冬氨酸100-150mg/L，
L-天冬酰胺300-450mg/L，
L-半胱氨酸一水合物10-50mg/L，
L-谷氨酸50-150mg/L，
L-异亮氨酸100-300mg/L，
L-亮氨酸100-150mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐100-350mg/L，
L-蛋氨酸35-90mg/L，
L-苯丙氨酸10-60mg/L，
L-脯氨酸80-155mg/L，
L-丝氨酸100-200mg/L，
L-苏氨酸150-250mg/L，
L-色氨酸100-150mg/L，
L-酪氨酸二钠盐30-100mg/L，
L-缬氨酸100-185mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐50-85mg/L，
L-组氨酸盐酸盐50-150mg/L，
L-赖氨酸50-500mg/L，
甘氨酸50-90mg/L，
(2)无机盐：
无水氯化钙100-150mg/L，
氯化钠5000-7500mg/L，
磷酸氢二钠10-45mg/L，
六水氯化镁50-80mg/L，
无水硫酸镁2-65mg/L，
氯化钾40-350mg/L，
一水磷酸二氢钠20-50mg/L，
七水合硫酸锌0.1-0.7mg/L，
九水合硝酸铁0.01-0.6mg/L，
亚硒酸钠0.01-0.03mg/L，
五水硫酸铜0.0001-0.003mg/L，
硫酸亚铁0.01-0.2mg/L，
(3)维生素：
生物素0.005-0.01mg/L，
维生素C1-12mg/L，
氯化胆碱0.5-5mg/L，
D-泛酸钙0.2-2mg/L，
叶酸0.2-5mg/L，
烟酰胺5-8mg/L，
盐酸吡哆醇5-8mg/L，
磷酸吡哆醛0.06-0.3mg/L，
核黄素0.08-0.6mg/L，
钴胺素0.04-3mg/L，
盐酸硫胺素0.05-0.5mg/L，
肌醇5-8mg/L，
(4)脂类：
亚油酸0.1-0.3mg/L，
大豆卵磷脂15-20mg/L，
胆固醇6-10mg/L，
腐胺0.04-0.8mg/L，
乙醇胺1-30mg/L，
(5)水解物：
棉籽水解物500-4000mg/L，
酵母超滤物500-4000mg/L，
大米水解物500-2000mg/L，
麦麸水解物500-4000mg/L，
(6)其余添加物：
D-葡萄糖3000-6000mg/L，
丙酮酸钠100-250mg/L，
硫辛酸0.05-0.6mg/L，
胸苷0.06-0.5mg/L，
腺嘌呤0.1-5mg/L，
胸腺嘧啶0.02-2mg/L，
重组胰岛素3-25mg/L，
柠檬酸铁0.02-1mg/L，
环庚三烯酚酮0.1-8mg/L，
酚红钠盐6-15mg/L，
F-6850-600mg/L，
碳酸氢钠1200-2200mg/L，
还原型谷胱甘肽0.01-0.9mg/L，
次黄嘌呤钠盐0.1-5mg/L。
本发明的优点及有益效果是，本发明所述悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基提供了一种低成本的适用于BHK-21细胞悬浮培养的无血清无动物源低蛋白培养基，通过添加脂类、维生素、微量元素等成分，特别是通过添加四种水解物并予以优化，完全替代了血清的功能，显著促进了细胞的增殖速度，并使细胞能保持较高的活力。
本发明采用的另一个技术方案是一种上述悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括如下步骤：
步骤1：在容器中加注射用水至总体积的90％，将权利要求1所述组分依次加入到溶液中，轻微搅拌溶解；
步骤2：轻微搅拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100％；
步骤3：用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.2；
步骤4：用0.2μm滤膜正压过滤除菌；
步骤5：溶液配制完成后应在2℃～8℃下密闭避光保存。
其中优选的技术方案是，所述步骤1步骤中注射用水的水温为25℃。
本发明的优点及有益效果还有，BHK-21细胞在该发明无血清培养基中，细胞生长增殖迅速，以80*104cells/ml的密度接种后，24小时细胞密度可以达到460*104cells/ml，细胞倍增时间显著低于目前市售产品，48小时细胞密度可以达到688*104cells/ml的高密度，细胞活力始终保持95％以上，完全满足了高密度悬浮培养规模化工业生产的要求。
附图说明
图1：实施例2，BHK-21细胞在新发明无血清培养基JYK-SFM中的生长情况，A：细胞生长图示；B：细胞生长曲线。
图2：对照组1，BHK-21细胞在MEM+10％FBS中的生长情况，A：细胞生长图示；B：细胞生长曲线。
图3：对照组2，BHK-21细胞在BSFM中的生长情况，A：细胞生长图示；B：细胞生长曲线。
具体实施方式
实施例1
本实施例是一种适合BHK-21细胞悬浮培养的无血清无动物源低蛋白培养基(JYK-SFM)，它包括22种氨基酸，12种无机盐，12种维生素，5种脂类，4种蛋白水解物，14种添加物；所用材料如无特殊说明均购自sigma公司。具体成分如下:
(1)氨基酸：
L-丙氨酸100mg/L，
L-谷氨酰胺200mg/L，
L-精氨酸盐酸盐200mg/L，
L-天冬氨酸150mg/L，
L-天冬酰胺450mg/L，
L-半胱氨酸一水合物10mg/L，
L-谷氨酸50mg/L，
L-异亮氨酸100mg/L，
L-亮氨酸130mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐250mg/L，
L-蛋氨酸90mg/L，
L-苯丙氨酸60mg/L，
L-脯氨酸100mg/L，
L-丝氨酸100mg/L，
L-苏氨酸250mg/L，
L-色氨酸100mg/L，
L-酪氨酸二钠盐100mg/L，
L-缬氨酸155mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐65mg/L，
L-组氨酸盐酸盐150mg/L，
L-赖氨酸500mg/L，
甘氨酸90mg/L，
(2)无机盐：
无水氯化钙100mg/L，
氯化钠5000mg/L，
磷酸氢二钠45mg/L，
六水氯化镁80mg/L，
无水硫酸镁65mg/L，
氯化钾350mg/L，
一水磷酸二氢钠50mg/L，
七水合硫酸锌0.1mg/L，
九水合硝酸铁0.01mg/L，
亚硒酸钠0.03mg/L，
五水硫酸铜0.0001mg/L，
硫酸亚铁0.01mg/L，
(3)维生素：
生物素0.008mg/L，
维生素C1mg/L，
氯化胆碱2.5mg/L，
D-泛酸钙1mg/L，
叶酸0.2mg/L，
烟酰胺5mg/L，
盐酸吡哆醇8mg/L，
磷酸吡哆醛0.3mg/L，
核黄素0.08mg/L，
钴胺素3mg/L，
盐酸硫胺素0.05mg/L，
肌醇6mg/L，
(4)脂类：
亚油酸0.1mg/L，
大豆卵磷脂20mg/L，
胆固醇10mg/L，
腐胺0.04mg/L，
乙醇胺1mg/L，
(5)水解物：
棉籽水解物500mg/L，
酵母超滤物4000mg/L，
大米水解物2000mg/L，
麦麸水解物500mg/L，
(6)其余添加物：
D-葡萄糖4000mg/L，
丙酮酸钠100mg/L，
硫辛酸0.05mg/L，
胸苷0.06mg/L，
腺嘌呤5mg/L，
胸腺嘧啶2mg/L，
重组胰岛素3mg/L，
柠檬酸铁0.02mg/L，
环庚三烯酚酮0.1mg/L，
酚红钠盐15mg/L，
F-68600mg/L，
碳酸氢钠1200mg/L，
还原型谷胱甘肽0.01mg/L，
次黄嘌呤钠盐0.1mg/L。
实施例2
本实施例是一种适合BHK-21细胞悬浮培养的无血清无动物源低蛋白培养基(JYK-SFM)，它包括22种氨基酸，12种无机盐，12种维生素，5种脂类，4种蛋白水解物，14种添加物；所用材料如无特殊说明均购自sigma公司，具体成分如下：
(1)氨基酸：
L-丙氨酸150mg/L，
L-谷氨酰胺275mg/L，
L-精氨酸盐酸盐260mg/L，
L-天冬氨酸100mg/L，
L-天冬酰胺300mg/L，
L-半胱氨酸一水合物35mg/L，
L-谷氨酸100mg/L，
L-异亮氨酸180mg/L，
L-亮氨酸150mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐100mg/L，
L-蛋氨酸50mg/L，
L-苯丙氨酸35mg/L，
L-脯氨酸80mg/L，
L-丝氨酸200mg/L，
L-苏氨酸150mg/L，
L-色氨酸150mg/L，
L-酪氨酸二钠盐70mg/L，
L-缬氨酸185mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐50mg/L，
L-组氨酸盐酸盐135mg/L，
L-赖氨酸200mg/L，
甘氨酸60mg/L，
(2)无机盐：
无水氯化钙150mg/L，
氯化钠6000mg/L，
磷酸氢二钠35mg/L，
六水氯化镁50mg/L，
无水硫酸镁30mg/L，
氯化钾250mg/L，
一水磷酸二氢钠40mg/L，
七水合硫酸锌0.3mg/L，
九水合硝酸铁0.2mg/L，
亚硒酸钠0.01mg/L，
五水硫酸铜0.001mg/L，
硫酸亚铁0.03mg/L，
(3)维生素：
生物素0.005mg/L，
维生素C5mg/L，
氯化胆碱5mg/L，
D-泛酸钙2mg/L，
叶酸2mg/L，
烟酰胺8mg/L，
盐酸吡哆醇5mg/L，
磷酸吡哆醛0.1mg/L，
核黄素0.3mg/L，
钴胺素0.2mg/L，
盐酸硫胺素0.2mg/L，
肌醇7mg/L，
(4)脂类：
亚油酸0.2mg/L，
大豆卵磷脂15mg/L，
胆固醇6mg/L，
腐胺0.1mg/L，
乙醇胺5mg/L，
(5)水解物：
棉籽水解物1000mg/L，
酵母超滤物1200mg/L，
大米水解物500mg/L，
麦麸水解物4000mg/L，
(6)其余添加物：
D-葡萄糖3000mg/L，
丙酮酸钠165mg/L，
硫辛酸0.32mg/L，
胸苷0.18mg/L，
腺嘌呤2mg/L，
胸腺嘧啶0.05mg/L，
重组胰岛素5mg/L，
柠檬酸铁0.3mg/L，
环庚三烯酚酮1.2mg/L，
酚红钠盐6mg/L，
F-68400mg/L，
碳酸氢钠2200mg/L，
还原型谷胱甘肽0.4mg/L，
次黄嘌呤钠盐2mg/L。
实施例3
本实施例是一种适合BHK-21细胞悬浮培养的无血清无动物源低蛋白培养基(JYK-SFM)，它包括22种氨基酸，12种无机盐，12种维生素，5种脂类，4种蛋白水解物，14种添加物；所用材料如无特殊说明均购自sigma公司。具体成分如下：
(1)氨基酸：
L-丙氨酸180mg/L，
L-谷氨酰胺300mg/L，
L-精氨酸盐酸盐300mg/L，
L-天冬氨酸120mg/L，
L-天冬酰胺400mg/L，
L-半胱氨酸一水合物50mg/L，
L-谷氨酸150mg/L，
L-异亮氨酸300mg/L，
L-亮氨酸100mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐350mg/L，
L-蛋氨酸35mg/L，
L-苯丙氨酸10mg/L，
L-脯氨酸155mg/L，
L-丝氨酸150mg/L，
L-苏氨酸200mg/L，
L-色氨酸130mg/L，
L-酪氨酸二钠盐30mg/L，
L-缬氨酸100mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐85mg/L，
L-组氨酸盐酸盐50mg/L，
L-赖氨酸50mg/L，
甘氨酸50mg/L，
(2)无机盐：
无水氯化钙125mg/L，
氯化钠7500mg/L，
磷酸氢二钠10mg/L，
六水氯化镁60mg/L，
无水硫酸镁2mg/L，
氯化钾40mg/L，
一水磷酸二氢钠20mg/L，
七水合硫酸锌0.7mg/L，
九水合硝酸铁0.6mg/L，
亚硒酸钠0.03mg/L，
五水硫酸铜0.003mg/L，
硫酸亚铁0.2mg/L
(3)维生素：
生物素0.01mg/L，
维生素C12mg/L，
氯化胆碱0.5mg/L，
D-泛酸钙0.2mg/L，
叶酸5mg/L，
烟酰胺6mg/L，
盐酸吡哆醇6mg/L，
磷酸吡哆醛0.06mg/L，
核黄素0.6mg/L，
钴胺素0.04mg/L，
盐酸硫胺素0.5mg/L，
肌醇8mg/L，
(4)脂类：
亚油酸0.3mg/L，
大豆卵磷脂18mg/L，
胆固醇8mg/L，
腐胺0.8mg/L，
乙醇胺30mg/L，
(5)水解物：
棉籽水解物4000mg/L，
酵母超滤物500mg/L，
大米水解物1000mg/L，
麦麸水解物1000mg/L，
(6)其余添加物：
D-葡萄糖6000mg/L，
丙酮酸钠250mg/L，
硫辛酸0.6mg/L，
胸苷0.5mg/L，
腺嘌呤0.1mg/L，
胸腺嘧啶0.02mg/L，
重组胰岛素25mg/L，
柠檬酸铁1mg/L，
环庚三烯酚酮8mg/L，
酚红钠盐9mg/L，
F-6850mg/L，
碳酸氢钠1800mg/L，
还原型谷胱甘肽0.9mg/L，
次黄嘌呤钠盐5mg/L。
配制方法：
步骤1，在容器中加入注射用水(水温25℃)至总体积的90％；
步骤2，将上述添加组分依次加入到容器中，轻微搅拌溶解；
步骤3，轻微搅拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100％；
步骤4，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2；
步骤5，用0.2μm滤膜正压过滤除菌；
步骤6，溶液配制完成后应在2-8℃下密闭避光保存。
按照上述配制方法制成的培养基用于细胞培养的方法如下：
将悬浮培养型BHK-21细胞以80*104Cells/ml的初试密度接种到1000ml细胞悬浮培养瓶中，培养条件为：温度37摄氏度，转速65rpm/min，每12h取样计数并检查细胞活力。细胞培养实验中，设计两组作为对照实验，对照组1是成熟的MEM+10％FBS，对照组2为市售的现有产品，申请人选用清大天一生物技术有限公司生产的BHK-21细胞无血清培养基BSFM，每组培养20瓶细胞，重复三次，细胞培养结果如下表1所示。
表1.细胞培养结果
如表1所示：实施例1、2、3中细胞在本发明的无血清培养基JYK-SFM中接种培养24小时细胞密度均增殖了5倍以上，分别为422*104Cells/ml、460*104Cells/ml、415*104Cells/ml，显著高于对照组一(MEM+10％FBS)的247*104Cells/ml和对照组二(BSFM)的278*104Cells/ml，表明本发明的培养基在细胞培养初期能明显促进细胞快速生长，缩短倍增时间。最终经过48小时的培养，实施例1、2、3、细胞密度分别达到了612*104Cells/ml、688*104Cells/ml、621*104Cells/ml，显著高于对照组一的405*104Cells/ml和对照组二的448*104Cells/ml，而且细胞活力始终保持在95％以上，明显高于对照组的92.6％和93.1％。表明发明培养基相比于传统的MEM+10％FBS以及市售的无血清培养基BSFM，更适合于BHK-21细胞的富集高密度悬浮培养。
本发明不限于上述实施方式，本领域技术人员所做出的对上述实施方式任何显而易见的改进或变更，都不会超出本发明的构思和所附权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.一种悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基，其特征在于：包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类和添加物；
所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸一水合物、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐、L-缬氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸和甘氨酸；
所述无机盐包括无水氯化钙、氯化钠、磷酸氢二钠、六水氯化镁、无水硫酸镁、氯化钾、一水磷酸二氢钠、七水合硫酸锌、九水合硝酸铁、亚硒酸钠、五水硫酸铜和硫酸亚铁；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、核黄素、钴胺素、盐酸硫胺素和肌醇；
所述蛋白水解物包括酵母超滤物、棉籽水解物、大米水解物和麦麸水解物；
所述脂类包括亚油酸、大豆卵磷脂、胆固醇、腐胺和乙醇胺；
所述添加物包括D-葡萄糖、丙酮酸钠、硫辛酸、胸苷、腺嘌呤、胸腺嚓咤、重组胰岛素、柠檬酸铁、环庚三烯酚酮、酚红钠盐、F-68、碳酸氢钠、还原型谷胱甘肽和次黄嘌呤钠盐；
其中所述培养基中各种原料物质的含量分别为：
(1)氨基酸：
L-丙氨酸100-180mg/L，
L-谷氨酰胺200-300mg/L，
L-精氨酸盐酸盐200-300mg/L，
L-天冬氨酸100-150mg/L，
L-天冬酰胺300-450mg/L，
L-半胱氨酸一水合物10-50mg/L，
L-谷氨酸50-150mg/L，
L-异亮氨酸100-300mg/L，
L-亮氨酸100-150mg/L，
L-赖氨酸盐酸盐100-350mg/L，
L-蛋氨酸35-90mg/L，
L-苯丙氨酸10-60mg/L，
L-脯氨酸80-155mg/L，
L-丝氨酸100-200mg/L，
L-苏氨酸150-250mg/L，
L-色氨酸100-150mg/L，
L-酪氨酸二钠盐30-100mg/L，
L-缬氨酸100-185mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐50-85mg/L，
L-组氨酸盐酸盐50-150mg/L，
L-赖氨酸50-500mg/L，
甘氨酸50-90mg/L，
(2)无机盐:
无水氯化钙100-150mg/L，
氯化钠5000-7500mg/L，
磷酸氢二钠10-45mg/L，
六水氯化镁50-80mg/L，
无水硫酸镁2-65mg/L，
氯化钾40-350mg/L，
一水磷酸二氢钠20-50mg/L，
七水合硫酸锌0.1-0.7mg/L，
九水合硝酸铁0.01-0.6mg/L，
亚硒酸钠0.01-0.03mg/L，
五水硫酸铜0.0001-0.003mg/L，
硫酸亚铁0.01-0.2mg/L
(3)维生素：
生物素0.005-0.01mg/L，
维生素C1-12mg/L，
氯化胆碱0.5-5mg/L，
D-泛酸钙0.2-2mg/L，
叶酸0.2-5mg/L，
烟酰胺5-8mg/L，
盐酸吡哆醇5-8mg/L，
磷酸吡哆醛0.06-0.3mg/L，
核黄素0.08-0.6mg/L，
钴胺素0.04-3mg/L，
盐酸硫胺素0.05-0.5mg/L，
肌醇5-8mg/L，
(4)脂类添加：
亚油酸0.1-0.3mg/L，
大豆卵磷脂15-20mg/L，
胆固醇6-10mg/L，
腐胺0.04-0.8mg/L，
乙醇胺1-30mg/L，
(5)水解物：
棉籽水解物500-4000mg/L，
酵母超滤物500-4000mg/L，
大米水解物500-2000mg/L，
麦麸水解物500-4000mg/L，
(6)其余添加物：
D-葡萄糖3000-6000mg/L，
丙酮酸钠100-250mg/L，
硫辛酸0.05-0.6mg/L，
胸苷0.06-0.5mg/L，
腺嘌呤0.1-5mg/L，
胸腺嘧啶0.02-2mg/L，
重组胰岛素3-25mg/L，
柠檬酸铁0.02-1mg/L，
环庚三烯酚酮0.1-8mg/L，
酚红钠盐6-15mg/L，
F-6850-600mg/L，
碳酸氢钠1200-2200mg/L，
还原型谷胱甘肽0.01-0.9mg/L，
次黄嘌呤钠盐0.1-5mg/L。
2.一种权利要求1所述悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括如下步骤：
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