CN105255810A - 一种适合昆虫细胞Sf-9的无血清无动物源培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种适合昆虫细胞Sf-9的无血清无动物源培养基的制备。本发明针对昆虫细胞Sf-9细胞的生长的特点，研制适合Sf-9细胞高密度悬浮培养的低成本、无血清、无动物源、低蛋白培养基。通过添加脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等组分来替代血清的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基组分的优化，使Sf-9细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适合于规模化工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种适合昆虫细胞Sf-9的无血清无动物源培养基的制备。
背景技术
杆状病毒表达系统(baculovirusexpressionsystem)是近年来应用较多的真核表达系统，它可以在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人、畜无害。杆状病毒表达系统的主要优越性有如下特点：
①表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；
②翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；
③与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的50％；
④可以容纳大片段外源基因。
目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)，其宿主是草地贪夜蛾，而Sf-9细胞，正是杆状病毒表达系统的宿主细胞之一。Sf-9细胞，即：Spodopterafrugiperda(草地夜蛾)卵巢细胞，是由G.E.Smith和C.L.Cherry在1983年从细胞株IPLB-SF21AE得来的一个克隆。IPLB-SF21AE是1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。Sf-9细胞属于半贴壁型细胞系，可以进行悬浮培养，也可以进行贴壁培养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点。早些年间Sf-9细胞的培养基常为TNM-FH培养液，即在Grace'sAntheraea培养液的基础上，每升培养液加3.3g酵母粉和3.3g乳白蛋白水解物，用1MKOH调pH到6.2-6.4过滤除菌，完整培养液在使用前加入10％热灭活的胎牛血清。
相对于添加血清的培养，无血清悬浮培养是最为先进的工艺。无血清培养基相比有血清培养基具有诸多优势：1)可避免血清的外源性污染，因为动物来源血清常携带病毒或支原体；2)可克服血清批次间的差异性，使细胞培养性能更加稳定，能提高结果的重复性；3)成分相对明确，有利于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等一系列细胞行为；4)可简化下游目的产物的分离纯化，节省成本。
目前，国外的无血清培养基产品价格高且配方保密，同时国内外均缺少专门针对昆虫细胞Sf-9细胞培养的无血清培养基，而且培养基性能较差，不能持续的维持细胞的活力，或者是成本较高。巴斯福股份公司申请的中国专利申请公开号CN1498267A，其所生产的培养基为液体培养基，对于运输和放菌要求极高，并且价格昂贵，不适合我国的目前的培养基发展状况。本发明基于上述状况，开发了适合Sf-9悬浮生长的纯固体培养基，特别是将一些脂类经过了特殊处理之后，能以固体的形式加入到培养基中，并且使细胞能够获得240h的连续生长，细胞活力能保持在95％以上。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种针对我国工业生产所用昆虫细胞Sf-9细胞的生长的特点，研制适合Sf-9细胞高密度悬浮培养的低成本、无血清、无动物源、低蛋白培养基。通过添加脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等组分来替代血清的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基组分的优化，使Sf-9细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适合于规模化工业生产。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种适合悬浮培养Sf-9细胞的无血清无动物源培养基，其特征在于，所述培养基中包括下列含量的原料物质：
(1)氨基酸部分：
L-丙氨酸100-500mg/L,
L-谷氨酰胺900-5500mg/L,
L-精氨酸盐酸盐700-2500mg/L,
L-天冬氨酸900-1700mg/L,
L-天冬酰胺800-1800mg/L,
L-半胱氨酸一水合物120-320mg/L,
L-谷氨酸1300-2800mg/L,
L-异亮氨酸400-1300mg/L,
L-亮氨酸300-750mg/L,
L-赖氨酸盐酸盐400-1600mg/L,
L-蛋氨酸600-1650mg/L,
L-苯丙氨酸700-1800mg/L,
L-脯氨酸300-1000mg/L,
L-丝氨酸200-1050mg/L,
L-苏氨酸200-900mg/L,
L-色氨酸100-400mg/L,
L-酪氨酸二钠盐200-900mg/L,
L-缬氨酸300-980mg/L,
L-胱氨酸盐酸盐50-85mg/L,
L-组氨酸盐酸盐100-250mg/L,
L-赖氨酸300-1000mg/L,
甘氨酸200-900mg/L；
(2)无机盐部分：
四水钼酸铵0.01-2mg/L,
无水氯化钙100-950mg/L,
氯化钠1000-7500mg/L,
磷酸氢二钠10-45mg/L,
六水氯化镁500-800mg/L,
无水硫酸镁200-900mg/L,
氯化钾400-2350mg/L,
一水磷酸二氢钠800-1500mg/L,
七水合硫酸锌0.1-0.7mg/L,
亚硒酸钠0.01-0.03mg/L,
硫酸亚铁0.01-0.2mg/L,
碳酸氢钠100-900mg/L；
(3)维生素部分：
生物素0.005-0.01mg/L,
维生素B120.1-0.8mg/L,
氯化胆碱0.5-5mg/L,
D-泛酸钙0.2-2mg/L,
叶酸0.2-5mg/L,
烟酰胺5-8mg/L,
盐酸吡哆醇5-8mg/L,
磷酸吡哆醛0.06-0.3mg/L,
核黄素0.08-0.6mg/L,
钻胺素0.04-3mg/L,
盐酸硫胺素0.05-0.5mg/L,
肌醇5-8mg/L；
(4)脂类添加部分：
亚油酸0.1-0.3mg/L,
大豆卵磷脂15-20mg/L,
胆固醇20-60mg/L,
腐胺0.04-0.8mg/L,
乙醇胺5-40mg/L,
无水乙醇0.5-2ml/L；
(5)水解物添加部分：
大豆水解物500-4000mg/L,
酵母超滤物500-4000mg/L,
大米水解物500-2000mg/L,
(6)其余添加物部分：
D-葡萄糖3000-6000mg/L,
丙酮酸钠100-250mg/L,
硫辛酸0.05-0.6mg/L,
胸苷0.06-0.5mg/L,
腺嘌呤0.1-5mg/L,
胸腺嘧啶0.02-2mg/L,
重组胰岛素3-25mg/L,
柠檬酸铁0.02-1mg/L,
环庚三烯酚酮0.1-8mg/L,
F-6850-600mg/L,
还原型谷胱甘肽0.01-0.9mg/L,
次黄嘌呤钠盐0.1-5mg/L。
其中，F-68是pluronicF-68的简称，在细胞培养过程中的常用添加物，对细胞具有保护作用。
关于“大豆水解物”、“酵母超滤物”以及“大米水解物”在本领域中有公认的含义，就是将大豆，酵母，大米，经过特殊的工艺，包括酶消化、酸处理等手段进行处理后，提取适合细胞生长组分，目前均有商品化试剂，本发明具体使用的是Difico公司生产的水解物。
本发明的优点及有益效果如下：本发明提供一种适宜悬浮培养Sf-9细胞的无血清、无动物源培养基，它是一种低成本的、适用于Sf-9细胞悬浮培养的无血清、无动物源、低蛋白培养基，通过一些脂类、维生素、微量元素等成分的添加，特别是通过三种水解物的添加和优化，完全替代了血清的功能，显著促进了细胞的增殖速度，并使细胞能保持较高的活力。本发明开发了适合Sf-9悬浮生长的纯固体培养基，特别是将一些脂类经过了特殊处理之后，能以固体的形式加入到培养基中，并且使细胞能够获得240h的连续生长，细胞活力能保持在95％以上。
为实现上述发明目的，本发明采用的另一个技术方案是针对于工业化生产而配置的一种悬浮培养昆虫细胞Sf-9的无血清无动物源培养基的固体实现方法，其特征在于，所述配制方法包括如下工艺步骤：
第一步，在容器中加入注射用水(水温25℃)至总体积的90％；
第二步，将上述混合好的培养基加入容器中，轻微搅拌溶解；
第三步，轻微搅拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100％；
第四步，用1mol/L氢氧化钾溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至6.2；
第五步，用0.2μm滤膜正压过滤除菌；
第六步，溶液配制完成后应在2-8℃下密闭避光保存。
本发明开发了适合Sf-9悬浮生长的纯固体培养基，特别是将一些脂类经过了特殊处理之后，能以固体的形式加入到培养基中，并且使细胞能够获得240h的连续生长，细胞的峰值浓度可达1300万/毫升，细胞活力能保持在95％以上。
附图说明
图1：Sf-9细胞在本发明所提供的培养基JYK-SF9中的生长情况。
图2：对照组1，即Sf-9细胞在Gibico培养基SF900II当中的生长情况。
图3：对照组2，即Sf-9细胞在苏州沃美培养基SF-SFM当中的生长情况。
具体实施方式
实施例1.无血清、无动物源、低蛋白培养基的制备
本实施例是一种适合Sf-9细胞悬浮培养的无血清无动物源低蛋白培养基(JYK-Sf9)，它包括22种氨基酸，12种无机盐，12种维生素，6种脂类，3种蛋白水解物，12种添加物；所用材料如无特殊说明均购自sigma公司。具体成分如下：
(1)氨基酸部分：
L-丙氨酸100-500mg/L,
L-谷氨酰胺900-5500mg/L,
L-精氨酸盐酸盐700-2500mg/L,
L-天冬氨酸900-1700mg/L,
L-天冬酰胺800-1800mg/L,
L-半胱氨酸一水合物120-320mg/L,
L-谷氨酸1300-2800mg/L,
L-异亮氨酸400-1300mg/L,
L-亮氨酸300-750mg/L,
L-赖氨酸盐酸盐400-1600mg/L,
L-蛋氨酸600-1650mg/L,
L-苯丙氨酸700-1800mg/L,
L-脯氨酸300-1000mg/L,
L-丝氨酸200-1050mg/L,
L-苏氨酸200-900mg/L,
L-色氨酸100-400mg/L,
L-酪氨酸二钠盐200-900mg/L,
L-缬氨酸300-980mg/L,
L-胱氨酸盐酸盐50-85mg/L,
L-组氨酸盐酸盐100-250mg/L,
L-赖氨酸300-1000mg/L,
甘氨酸200-900mg/L；
(2)无机盐部分：
四水钼酸铵0.01-2mg/L,
无水氯化钙100-950mg/L,
氯化钠1000-7500mg/L,
磷酸氢二钠10-45mg/L,
六水氯化镁500-800mg/L,
无水硫酸镁200-900mg/L,
氯化钾400-2350mg/L,
一水磷酸二氢钠800-1500mg/L,
七水合硫酸锌0.1-0.7mg/L,
亚硒酸钠0.01-0.03mg/L,
硫酸亚铁0.01-0.2mg/L,
碳酸氢钠100-900mg/L；
(3)维生素部分：
生物素0.005-0.01mg/L,
维生素B120.1-0.8mg/L,
氯化胆碱0.5-5mg/L,
D-泛酸钙0.2-2mg/L,
叶酸0.2-5mg/L,
烟酰胺5-8mg/L,
盐酸吡哆醇5-8mg/L,
磷酸吡哆醛0.06-0.3mg/L,
核黄素0.08-0.6mg/L,
钻胺素0.04-3mg/L,
盐酸硫胺素0.05-0.5mg/L,
肌醇5-8mg/L；
(4)脂类添加部分：
亚油酸0.1-0.3mg/L,
大豆卵磷脂15-20mg/L,
胆固醇20-60mg/L,
腐胺0.04-0.8mg/L,
乙醇胺5-40mg/L,
无水乙醇0.5-2ml/L；
(5)水解物添加部分：
大豆水解物500-4000mg/L,
酵母超滤物500-4000mg/L,
大米水解物500-2000mg/L,
(6)其余添加物部分：
D-葡萄糖3000-6000mg/L,
丙酮酸钠100-250mg/L,
硫辛酸0.05-0.6mg/L,
胸苷0.06-0.5mg/L,
腺嘌呤0.1-5mg/L,
胸腺嘧啶0.02-2mg/L,
重组胰岛素3-25mg/L,
柠檬酸铁0.02-1mg/L,
环庚三烯酚酮0.1-8mg/L,
F-6850-600mg/L,
还原型谷胱甘肽0.01-0.9mg/L,
次黄嘌呤钠盐0.1-5mg/L。
其中，“大豆水解物”、“酵母超滤物”以及“大米水解物”在本领域中有公认的含义，就是将大豆，酵母，大米，经过特殊的工艺，包括酶消化、酸处理等手段进行处理后，提取适合细胞生长组分，目前均有商品化试剂，本发明具体使用的是Difico公司生产的水解物。
该培养基的具体配制方法如下：
第一步，在容器中加入注射用水(水温25℃)至总体积的90％；
第二步，将上述混合好的培养基加入容器中，轻微搅拌溶解；
第三步，轻微搅拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100％；
第四步，用1mol/L氢氧化钾溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至6.2；
第五步，用0.2μm滤膜正压过滤除菌；
第六步，溶液配制完成后应在2-8℃下密闭避光保存。
实施例2.本发明的培养基用于细胞培养的对比实验
将悬浮培养型Sf-9细胞以100*104Cells/ml的初试密度接种到1000ml细胞三角培养瓶中，培养条件为：温度27摄氏度，转速110rpm/min，每24h取样计数并检查细胞活力。细胞培养实验中，设计两组作为对照实验，实验组为自制培养基JYK-SF9，对照组1是成熟的Gibico昆虫培养基SF900II，对照组2为市售的现有产品，我们选用苏州沃美培养基的Sf-9细胞无血清培养基SF-SFM，每组培养20瓶细胞，重复三次。
结果发现：Sf-9细胞在自制培养基JYK-SF9生长细胞倍增时间短，且细胞活力明显优于其他对照组(参见表1)。
Sf-9细胞在本发明所提供的培养基JYK-SF9中的生长情况如图1所示。从图1中可以看出细胞表现出持续生长状态，并且峰值浓度可达1320万/ml，且进入平台期细胞密度持续时间长。
图2为对照组1，即Sf-9细胞在Gibico培养基SF900II当中的生长情况，从生长曲线中可以看出，细胞的峰值浓度约为680万/ml，并且细胞进入平台期保持细胞密度的时间较短。
图3为对照组2，即Sf-9细胞在苏州沃美培养基SF-SFM当中的生长情况。从生长曲线中可以看出，细胞的峰值浓度约为690万/ml，并且细胞进入平台期保持细胞密度的时间较SF900II时间长，但是与JYK-SF9相比则较短。
表1不同培养基培养的Sf-9细胞的细胞密度和细胞活力
以上的结果表明，由本发明提供的Sf-9昆虫培养基JYK-SF9能够适合昆虫细胞高密度培养。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种适合悬浮培养昆虫细胞的无血清、无动物源培养基，其特征在于，所述培养基中包括下列含量的原料物质：
(1)氨基酸部分：
L-丙氨酸100-500mg/L,
L-谷氨酰胺900-5500mg/L,
L-精氨酸盐酸盐700-2500mg/L,
L-天冬氨酸900-1700mg/L,
L-天冬酰胺800-1800mg/L,
L-半胱氨酸一水合物120-320mg/L,
L-谷氨酸1300-2800mg/L,
L-异亮氨酸400-1300mg/L,
L-亮氨酸300-750mg/L,
L-赖氨酸盐酸盐400-1600mg/L,
L-蛋氨酸600-1650mg/L,
L-苯丙氨酸700-1800mg/L,
L-脯氨酸300-1000mg/L,
L-丝氨酸200-1050mg/L,
L-苏氨酸200-900mg/L,
L-色氨酸100-400mg/L,
L-酪氨酸二钠盐200-900mg/L,
L-缬氨酸300-980mg/L,
L-胱氨酸盐酸盐50-85mg/L,
L-组氨酸盐酸盐100-250mg/L,
L-赖氨酸300-1000mg/L,
甘氨酸200-900mg/L；
(2)无机盐部分：
四水钼酸铵0.01-2mg/L,
无水氯化钙100-950mg/L,
氯化钠1000-7500mg/L,
磷酸氢二钠10-45mg/L,
六水氯化镁500-800mg/L,
无水硫酸镁200-900mg/L,
氯化钾400-2350mg/L,
一水磷酸二氢钠800-1500mg/L,
七水合硫酸锌0.1-0.7mg/L,
亚硒酸钠0.01-0.03mg/L,
硫酸亚铁0.01-0.2mg/L,
碳酸氢钠100-900mg/L；
(3)维生素部分：
生物素0.005-0.01mg/L,
维生素B120.1-0.8mg/L,
氯化胆碱0.5-5mg/L,
D-泛酸钙0.2-2mg/L,
叶酸0.2-5mg/L,
烟酰胺5-8mg/L,
盐酸吡哆醇5-8mg/L,
磷酸吡哆醛0.06-0.3mg/L,
核黄素0.08-0.6mg/L,
钻胺素0.04-3mg/L,
盐酸硫胺素0.05-0.5mg/L,
肌醇5-8mg/L；
(4)脂类添加部分：
亚油酸0.1-0.3mg/L,
大豆卵磷脂15-20mg/L,
胆固醇20-60mg/L,
腐胺0.04-0.8mg/L,
乙醇胺5-40mg/L,
无水乙醇0.5-2ml/L；
(5)水解物添加部分：
大豆水解物500-4000mg/L,
酵母超滤物500-4000mg/L,
大米水解物500-2000mg/L,
(6)其余添加物部分：
D-葡萄糖3000-6000mg/L,
丙酮酸钠100-250mg/L,
硫辛酸0.05-0.6mg/L,
胸苷0.06-0.5mg/L,
腺嘌呤0.1-5mg/L,
胸腺嘧啶0.02-2mg/L,
重组胰岛素3-25mg/L,
柠檬酸铁0.02-1mg/L,
环庚三烯酚酮0.1-8mg/L,
F-6850-600mg/L,
还原型谷胱甘肽0.01-0.9mg/L,
次黄嘌呤钠盐0.1-5mg/L。
2.根据权利要求1中所述的培养基，其中，昆虫细胞为Sf9细胞。
3.权利要求1所述培养基的配制方法，所述配制方法包括如下工艺步骤：
S1)在容器中加入注射用水至总体积的90％；
S2)将上述混合好的培养基加入容器中，轻微搅拌溶解；
S3)轻微搅拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100％；
S4)用1mol/L氢氧化钾溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至6.2；
S5)用0.2μm滤膜正压过滤除菌；
S6)溶液配制完成后应在2-8℃下密闭避光保存。
4.根据权利要求3的配置方法，所述S1步骤中注射用水的水温为25℃。
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