CN114250191B

CN114250191B - 适用于昆虫细胞高密度培养和产物高表达的无血清培养基

Info

Publication number: CN114250191B
Application number: CN202011010590.8A
Authority: CN
Inventors: 谭文松; 刘旭平; 赵亮; 范里; 陈敏; 彭雯娟
Original assignee: Shanghai Bioengine Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Bioengine Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2040-09-23
Also published as: CN114250191A

Abstract

本发明提供了一种适用于昆虫细胞高密度培养和产物高表达的无血清培养基。具体地，所述培养基包括：包含4000‑9000mg/L碳水化合物、9000‑27920mg/L氨基酸、10.56‑44.03mg/L维生素、5154.9‑15164.2mg/L无机盐离子、14‑90mg/L有机酸、1100‑7000mg/L水解物、5‑15mg/L脂类和5‑25mg/L核苷类。本发明的无血清培养基组分种类少、制备方法简单，且能支持昆虫细胞稳定传代、高密度扩增、产物高表达。

Description

适用于昆虫细胞高密度培养和产物高表达的无血清培养基

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，更具体地，本发明涉及一种适用于昆虫细胞高密度培养和产物高表达的无血清培养基。

背景技术

昆虫细胞杆状病毒载体表达系统(BEVS)，是基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立的表达体系，始于上世纪80年代，与大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统并称基因工程的四大表达系统。

与其他三种表达系统相比，BEVS具有如下显著的优势：1、重组蛋白具有完整的生物学功能；2、能进行复杂的翻译后修饰；3、载体与哺乳动物细胞相比构建时间短；4、更高的基因/蛋白表达水平；5、可容纳的目标基因片段尺寸尚无上限；6、能同时表达多个目的基因；7、对脊椎动物无感染性，目标产品更安全……BEVS在生物医药领域的应用跨足药品研发、重组蛋白生产、人用/兽用疫苗生产和基因治疗等多个方面，利用该表达系统生产或形成的商业化医药产品如Cervarix(人乳头瘤病毒疫苗)、Flublok(人用流感疫苗)、Provenge(免疫疗法用于前列腺癌)、Glybera(基因治疗用于脂蛋白脂肪酶缺乏)、IngelvacCircoFLEX(猪圆环病毒疫苗)、Porcilis Pesti(猪瘟病毒疫苗)以及国内获批上市的猪圆环病毒II型灭活疫苗等，另有大量医药产品处于临床阶段，成千上万的重组蛋白在实验室内被成功表达。BEVS的应用领域将越来越广泛。

BEVS目前最常用的宿主细胞包括粉蝶夜蛾High Five细胞系和草地贪夜蛾卵巢细胞系(Sf21和Sf9细胞系，Sf21已逐渐被Sf9所取代，之后出现的Sf+来源于Sf9细胞，更适合规模化应用)。两类细胞系皆能适应贴壁和悬浮培养，从而在滚瓶体系和生物反应器中放大规模。悬浮培养工艺的优势和其逐渐取代贴壁培养工艺的趋势已经得到广泛的认同；优化培养工艺，特别是无血清培养基，为宿主细胞的生长增殖和产物表达提供适宜的生存环境，使宿主细胞达到较高的活细胞密度、维持良好的细胞状态和稳定的培养体系参数，实现重组蛋白的高效表达和高产病毒是工业化应用的研发热点。

去除了血清成分可能引入的成本高、安全风险高和生产工艺不稳定等问题，无血清培养基的应用仍面临以下两个问题：其一，从无血清培养基的商业化产品而言，进口品牌效果虽好，但价格昂贵且配方不明，不利于大规模生产使用；国内少有的几款产品效果参差不齐，在支持细胞高密度生长和产物高表达方面有待提高。其二，从无血清培养基的配方来看，目前存在培养基专利都有成本较高、成分过多(60-70种)、配制方法复杂(制备乳剂)等问题，阻碍专利的转化应用。

所以本领域急需提供一种组分种类少、制备方法简单，能支持昆虫细胞高密度扩增、产物高表达的无血清培养基。

发明内容

本发明的目的是提供一种组分种类少、制备方法简单，且能支持昆虫细胞高密度扩增、产物高表达的无血清培养基。

本发明第一方面，提供了一种无血清培养基，所述培养基包括：

(A).碳水化合物，所述碳水化合物包括葡萄糖；

(B).氨基酸或其盐，所述氨基酸包括：二十种天然氨基酸以及L-羟基脯氨酸；

(C)维生素或其盐，所述维生素包括：生物素(Biotin)、泛酸钙(D-Capantothenate)、氯化胆碱(Cholin chlorid)、叶酸(Folic acid)、肌醇(Myo-Inositol)、尼克酰胺(Nicotinamide)、吡哆醇(Pyridoxine)、核黄素(Riboflavin)、硫胺素(Thiamine)和钴胺素(Vitamin B12)；

(D)无机盐，所述无机盐包括：钙盐(如氯化钙)、钾盐(如氯化钾)、镁盐(如硫酸镁)、钠盐(如氯化钠)和磷酸盐(如磷酸二氢钠)；

(E)微量金属离子，所述微量金属离子包括：Cu²⁺、Fe²⁺(或Fe³⁺)、Mn²⁺和Zn²⁺；

(F)核苷类，所述核苷包括：腺苷(Adenosine)、胞苷(Cytidine)、鸟苷(Guanosine)、尿苷(Uridine)和胸苷(Thymidine)；

(G)有机酸，所述有机酸选自下组：富马酸(Fumaric acid)、α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid)、L-苹果酸(L-Malice acid)、琥珀酸(Succinic acid)，或其组合；

(H)水解物，所述水解物包括：酵母水解物和植物蛋白水解物；

(I)脂类，所述脂类选自下组：胆固醇(Cholesterol)、生育酚(Tocopherol)，或其组合；

(J)非离子表面活性剂；

(K)保护剂；

和(L)碳酸氢钠，且

所述培养基的最终pH为6.2±0.5。

在另一优选例中，所述培养基的溶剂为水或基本为水，较佳地，所述溶剂的含水量≥90wt％，较佳地≥95wt％，更佳地≥98wt％。

在另一优选例中，所述培养基的最终pH为6.2±0.2，较佳地，6.2±0.1。

在另一优选例中，所述培养基的pH使用盐酸或氢氧化钠调节。

在另一优选例中，所述(A)中包括下述的碳水化合物，浓度以培养基总体积计：

(C1)葡萄糖(D(+)-Glucose)：4000-9000mg/L，较佳地，7200-8000mg/L，更佳地，7400-7800mg/L。

在另一优选例中，所述(B)中包含下组，浓度以培养基总体积计：

(C2)L-盐酸半胱氨酸(L-Cysteine.HCl)：50-300mg/L，较佳地，100-200mg/L，更佳地，120-180mg/L；

(C3)L-酪氨酸(L-Tyrosine，优选L-酪氨酸二钠)：50-220mg/L，较佳地，100-200mg/L，更佳地，120-180mg/L；

(C4)β-丙氨酸(β-Alanine)：200-600mg/L，较佳地，400-550mg/L，更佳地，450-520mg/L；

(C5)L-精氨酸(L-Arginine，优选L-盐酸精氨酸)：750-2000mg/L，较佳地，1100-1500mg/L，更佳地，1200-1400mg/L；

(C6)L-天冬酰胺(L-Asparagine)：800-2400mg/L，较佳地，1000-1400mg/L，更佳地，1100-1300mg/L；

(C7)L-天冬氨酸(L-Aspartatic acid)：800-2400mg/L，较佳地，1500-2100mg/L，更佳地，1800-2000mg/L；

(C8)L-谷氨酸(L-Glutaminic acid)：800-2400mg/L，较佳地，1500-2100mg/L，更佳地，1800-2000mg/L；

(C9)L-谷氨酰胺(L-Glutamine)：800-2400mg/L，较佳地，1500-2100mg/L，更佳地，1800-2000mg/L；

(C10)甘氨酸(Glycine,free base)：100-700mg/L，较佳地，400-600mg/L，更佳地，450-550mg/L；

(C11)L-组氨酸(L-Histidine)：100-700mg/L，较佳地，400-600mg/L，更佳地，450-550mg/L；

(C12)L-异亮氨酸(L-Isoleucine)：500-1500mg/L，较佳地，600-800mg/L，更佳地，650-750mg/L；

(C13)L-亮氨酸(L-Leucine)：300-900mg/L，较佳地，600-800mg/L，更佳地，650-750mg/L；

(C14)L-赖氨酸(L-Lysine，优选L-盐酸赖氨酸)：300-900mg/L，较佳地，500-700mg/L，更佳地，550-650mg/L；

(C15)L-蛋氨酸(L-Methionine)：700-2000mg/L，较佳地，900-1100mg/L，更佳地，950-1050mg/L；

(C16)L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)：700-2000mg/L，较佳地，900-1100mg/L，更佳地，950-1050mg/L；

(C17)L-丝氨酸(L-Serine)：700-2000mg/L，较佳地，800-1000mg/L，更佳地，850-950mg/L；

(C18)L-苏氨酸(L-Threonine)：300-900mg/L，较佳地，500-700mg/L，更佳地，550-650mg/L；

(C19)L-色氨酸(L-Tryptophan)：50-200mg/L，较佳地，60-100mg/L，更佳地，70-90mg/L；

(C20)L-缬氨酸(L-Valine)：600-1800mg/L，较佳地，750-950mg/L，更佳地，800-900mg/L；

(C21)L-脯氨酸(L-Proline)100-800mg/L，较佳地，200-400mg/L，更佳地，250-350mg/L；

(C22)L-羟基脯氨酸(L-Hydroxy-L-Proline)：300-1500mg/L，较佳地，400-600mg/L，更佳地，450-550mg/L。

在另一优选例中，所述(C)中包含以下的维生素或其盐，浓度以培养基总体积计：

(C23)生物素(Biotin)：0.03-0.3mg/L，较佳地，0.05-0.15mg/L，更佳地，0.08-0.12mg/L；

(C24)泛酸钙(D-Ca pantothenate)：0.04-0.4mg/L，较佳地，0.1-0.2mg/L，更佳地，0.12-0.18mg/L；

(C25)氯化胆碱(Cholin chlorid)：5-25mg/L，较佳地，15-24mg/L，更佳地，18-22mg/L；

(C26)叶酸(Folic acid)：0.1-0.8mg/L，较佳地，0.2-0.3mg/L，更佳地，0.22-0.28mg/L；

(C27)肌醇(Myo-Inositol)：0.08-0.5mg/L，较佳地，0.25-0.35mg/L，更佳地，0.28-0.32mg/L；

(C28)尼克酰胺(Nicotinamide)：0.05-0.45mg/L，较佳地，0.15-0.25mg/L，更佳地，0.18-0.22mg/L；

(C29)吡哆醇(Pyridoxine，优选盐酸吡哆醇)：0.8-5mg/L，较佳地，1.5-2.5mg/L，更佳地，1.8-2.2mg/L；

(C30)核黄素(Riboflavin)：0.3-3mg/L，较佳地，1-2mg/L，更佳地，1.2-1.8mg/L；

(C31)硫胺素(Thiamine，优选盐酸硫胺素)：0.03-0.1mg/L，较佳地，0.05-0.12mg/L，更佳地，0.06-0.10mg/L；

(C32)钴胺素(Vitamin B12)：0.1-1mg/L，较佳地，0.5-0.1mg/L，更佳地，0.6-0.8mg/L。

在另一优选例中，所述(D)中包含下组，浓度以培养基总体积计：

(C33)氯化钙(CaCl₂)：50-400mg/L，较佳地，300-380mg/L，更佳地，320-360mg/L；

(C34)氯化钾(KCl)：500-3000mg/L，较佳地，1400-1800mg/L，更佳地，1500-1700mg/L；

(C35)硫酸镁(MgSO₄)：500-3000mg/L，较佳地，1000-1400mg/L，更佳地，1100-1300mg/L；

(C36)氯化钠(NaCl)：2500-6000mg/L，较佳地，4500-5200mg/L，更佳地，4700-5000mg/L；

(C37)一水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.H₂O)：4000-9000mg/L，较佳地，1600-2000mg/L，更佳地，1700-1900mg/L。

在另一优选例中，所述(E)中的微量元素来自下组，浓度以培养基总体积计：

(C38)五水硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)：0.05-0.2mg/L，较佳地，0.06-0.15mg/L，更佳地，0.08-0.12mg/L；

(C39)七水硫酸亚铁(FeSO₄.7H₂O)：4-12mg/L，较佳地，6-12mg/L，更佳地，7-10mg/L；

(C40)四水氯化锰(MnCl₂.4H₂O)：0.05-0.4mg/L，较佳地，0.15-0.25mg/L，更佳地，0.18-0.22mg/L；

(C41)七水硫酸锌(ZnSO₄.7H₂O)：0.08-1.6mg/L，较佳地，0.6-1.5mg/L，更佳地，0.8-1.2mg/L。

在另一优选例中，所述(F)中包含下组，浓度以培养基总体积计：

(C41)腺苷(Adenosine)：1-5mg/L，较佳地，2-4mg/L，更佳地，2.5-3.5mg/L；

(C42)胞苷(Cytidine)：1-5mg/L，较佳地，2-4mg/L，更佳地，2.5-3.5mg/L；

(C43)鸟苷(Guanosine)：1-5mg/L，较佳地，2-4mg/L，更佳地，2.5-3.5mg/L；

(C44)尿苷(Uridine)：1-5mg/L，较佳地，2-4mg/L，更佳地，2.5-3.5mg/L；和

(C45)胸苷(Thymidine)：1-5mg/L，较佳地，2-4mg/L，更佳地，2.5-3.5mg/L。

在另一优选例中，所述G中包含一种或多种选自下组的有机酸，浓度以培养基总体积计：

(C46)富马酸(Fumaric acid)：1-10mg/L，较佳地，2-8mg/L，更佳地，3-6mg/L；

(C47)α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid)：2-20mg/L，较佳地，10-18mg/L，更佳地，12-16mg/L；

(C48)L-苹果酸(L-Malice acid)：10-50mg/L，较佳地，30-48mg/L，更佳地，35-45mg/L；和/或

(C49)琥珀酸(Succinic acid):1-10mg/L，较佳地，3-8mg/L，更佳地，4-7mg/L。

在另一优选例中，所述G中包含C47、C48、C49和任选的C49。

在另一优选例中，所述(H)中包含选自以下的水解物，浓度以培养基总体积计：

(C50)酵母水解物：80-1000mg/L，较佳地，90-200mg/L，更佳地，100-120mg/L，如80mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L或、900mg/L；和/或

(C51)植物蛋白水解物：500-6000mg/L，较佳地，4500-5500mg/L，更佳地，4800-5200mg/L。

在另一优选例中，所述植物蛋白水解物选自下组：大豆水解物、小麦水解物，或其组合。

在另一优选例中，所述大豆水解物：小麦水解物＝1:0.2-5；较佳地，1:0.5-2。

在另一优选例中，所述培养基包括：

(C51-1)大豆水解物，500-3000mg/L，较佳地，2300-2700mg/L，更佳地，2400-2600mg/L；和/或

(C51-2)小麦水解物，500-3000mg/L，较佳地，2300-2700mg/L，更佳地，2400-2600mg/L。

在另一优选例中，所述(I)中包含一种或多种选自下组的脂类物质，浓度以培养基总体积计：

(C52)胆固醇(Cholesterol)：5-15mg/L，较佳地，6-12mg/L，更佳地，7-10mg/L；和/或

(C53)生育酚(Tocopherol)：5-15mg/L，较佳地，8-15mg/L，更佳地，9-12mg/L。

在另一优选例中，所述(J)中包含，浓度以培养基总体积计：

(C54)非离子表面活性剂，40-80mg/L，较佳地，55-75mg/L，更佳地，60-70mg/L；

在另一优选例中，所述非离子表面活性剂为吐温80。

在另一优选例中，所述(K)中包含，浓度以培养基总体积计：

(C54)保护剂：400-800mg/L，较佳地，700-780mg/L，更佳地，720-770mg/L。

在另一优选例中，所述保护剂选自下组：(C54-1)Pluronic F-68(F68)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素，或其组合，较佳地，Pluronic F-68(F68)。

在另一优选例中，所述培养基中包括，浓度以培养基总体积计：

(C55)碳酸氢钠：400-800mg/L，较佳地，450-550mg/L，更佳地，480-520mg/L。

在另一优选例中，所述(A)中包括下述的碳水化合物：

(C1)葡萄糖(D(+)-Glucose)：4000-9000重量份，较佳地，7200-8000重量份，更佳地，7400-7800重量份。

在另一优选例中，所述(B)中包含下组：

(C2)L-盐酸半胱氨酸(L-Cysteine.HCl)：50-300重量份，较佳地，100-200重量份，更佳地，120-180重量份；

(C3)L-酪氨酸(L-Tyrosine，优选L-酪氨酸二钠)：50-220重量份，较佳地，100-200重量份，更佳地，120-180重量份；

(C4)β-丙氨酸(β-Alanine)：200-600重量份，较佳地，400-550重量份，更佳地，450-520重量份；

(C5)L-精氨酸(L-Arginine，优选L-盐酸精氨酸)：750-2000重量份，较佳地，1100-1500重量份，更佳地，1200-1400重量份；

(C6)L-天冬酰胺(L-Asparagine)：800-2400重量份，较佳地，1000-1400重量份，更佳地，1100-1300重量份；

(C7)L-天冬氨酸(L-Aspartatic acid)：800-2400重量份，较佳地，1500-2100重量份，更佳地，1800-2000重量份；

(C8)L-谷氨酸(L-Glutaminic acid)：800-2400重量份，较佳地，1500-2100重量份，更佳地，1800-2000重量份；

(C9)L-谷氨酰胺(L-Glutamine)：800-2400重量份，较佳地，1500-2100重量份，更佳地，1800-2000重量份；

(C10)甘氨酸(Glycine,free base)：100-700重量份，较佳地，400-600重量份，更佳地，450-550重量份；

(C11)L-组氨酸(L-Histidine)：100-700重量份，较佳地，400-600重量份，更佳地，450-550重量份；

(C12)L-异亮氨酸(L-Isoleucine)：500-1500重量份，较佳地，600-800重量份，更佳地，650-750重量份；

(C13)L-亮氨酸(L-Leucine)：300-900重量份，较佳地，600-800重量份，更佳地，650-750重量份；

(C14)L-赖氨酸(L-Lysine，优选L-盐酸赖氨酸)：300-900重量份，较佳地，500-700重量份，更佳地，550-650重量份；

(C15)L-蛋氨酸(L-Methionine)：700-2000重量份，较佳地，900-1100重量份，更佳地，950-1050重量份；

(C16)L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)：700-2000重量份，较佳地，900-1100重量份，更佳地，950-1050重量份；

(C17)L-丝氨酸(L-Serine)：700-2000重量份，较佳地，800-1000重量份，更佳地，850-950重量份；

(C18)L-苏氨酸(L-Threonine)：300-900重量份，较佳地，500-700重量份，更佳地，550-650重量份；

(C19)L-色氨酸(L-Tryptophan)：50-200重量份，较佳地，60-100重量份，更佳地，70-90重量份；

(C20)L-缬氨酸(L-Valine)：600-1800重量份，较佳地，750-950重量份，更佳地，800-900重量份；

(C21)L-脯氨酸(L-Proline)100-800重量份，较佳地，200-400重量份，更佳地，250-350重量份；

(C22)L-羟基脯氨酸(L-Hydroxy-L-Proline)：300-1500重量份，较佳地，400-600重量份，更佳地，450-550重量份。

在另一优选例中，所述(C)中包含以下的维生素或其盐：

(C23)生物素(Biotin)：0.03-0.3重量份，较佳地，0.05-0.15重量份，更佳地，0.08-0.12重量份；

(C24)泛酸钙(D-Ca pantothenate)：0.04-0.4重量份，较佳地，0.1-0.2重量份，更佳地，0.12-0.18重量份；

(C25)氯化胆碱(Cholin chlorid)：5-25重量份，较佳地，15-24重量份，更佳地，18-22重量份；

(C26)叶酸(Folic acid)：0.1-0.8重量份，较佳地，0.2-0.3重量份，更佳地，0.22-0.28重量份；

(C27)肌醇(Myo-Inositol)：0.08-0.5重量份，较佳地，0.25-0.35重量份，更佳地，0.28-0.32重量份；

(C28)尼克酰胺(Nicotinamide)：0.05-0.45重量份，较佳地，0.15-0.25重量份，更佳地，0.18-0.22重量份；

(C29)吡哆醇(Pyridoxine，优选盐酸吡哆醇)0.8-5重量份，较佳地，1.5-2.5重量份，更佳地，1.8-2.2重量份；

(C30)核黄素(Riboflavin)：0.3-3重量份，较佳地，1-2重量份，更佳地，1.2-1.8重量份；

(C31)硫胺素(Thiamine，优选盐酸硫胺素)：0.03-0.1重量份，较佳地，0.05-0.12重量份，更佳地，0.06-0.10重量份；

(C32)钴胺素(Vitamin B12)：0.1-1重量份，较佳地，0.5-0.1重量份，更佳地，0.6-0.8重量份。

在另一优选例中，所述(D)中包含下组：

(C33)氯化钙(CaCl₂)：50-400重量份，较佳地，300-380重量份，更佳地，320-360重量份；

(C34)氯化钾(KCl)：500-3000重量份，较佳地，1400-1800重量份，更佳地，1500-1700重量份；

(C35)硫酸镁(MgSO₄)：500-3000重量份，较佳地，1000-1400重量份，更佳地，1100-1300重量份；

(C36)氯化钠(NaCl)：2500-6000重量份，较佳地，4500-5200重量份，更佳地，4700-5000重量份；

(C37)一水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.H₂O)：4000-9000重量份，较佳地，1600-2000重量份，更佳地，1700-1900重量份。

在另一优选例中，所述(E)中的微量元素来自下组：

(C38)五水硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)：0.05-0.2重量份，较佳地，0.06-0.15重量份，更佳地，0.08-0.12重量份；

(C39)七水硫酸亚铁(FeSO₄.7H₂O)：4-12重量份，较佳地，6-12重量份，更佳地，7-10重量份；

(C40)四水氯化锰(MnCl₂.4H₂O)：0.05-0.4重量份，较佳地，0.15-0.25重量份，更佳地，0.18-0.22重量份；

(C41)七水硫酸锌(ZnSO₄.7H₂O)：0.08-1.6重量份，较佳地，0.6-1.5重量份，更佳地，0.8-1.2重量份。

在另一优选例中，所述(F)中包含下组：

(C41)腺苷(Adenosine)：1-5重量份，较佳地，2-4重量份，更佳地，2.5-3.5重量份；

(C42)胞苷(Cytidine)：1-5重量份，较佳地，2-4重量份，更佳地，2.5-3.5重量份；

(C43)鸟苷(Guanosine)：1-5重量份，较佳地，2-4重量份，更佳地，2.5-3.5重量份；

(C44)尿苷(Uridine)：1-5重量份，较佳地，2-4重量份，更佳地，2.5-3.5重量份；和

(C45)胸苷(Thymidine)：1-5重量份，较佳地，2-4重量份，更佳地，2.5-3.5重量份。

在另一优选例中，所述G中包含一种或多种选自下组的有机酸：

(C46)富马酸(Fumaric acid)：1-10重量份，较佳地，2-8重量份，更佳地，3-6重量份；

(C47)α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid)：2-20重量份，较佳地，10-18重量份，更佳地，12-16重量份；

(C48)L-苹果酸(L-Malice acid)：10-50重量份，较佳地，30-48重量份，更佳地，35-45重量份；和/或

(C49)琥珀酸(Succinic acid):1-10重量份，较佳地，3-8重量份，更佳地，4-7重量份。

在另一优选例中，所述(H)中包含选自以下的水解物：

(C50)酵母水解物：80-1000重量份，较佳地，90-200重量份，更佳地，100-120重量份，如80重量份、300重量份、400重量份、500重量份、600重量份、700重量份或、900重量份；和/或

(C51)植物蛋白水解物：500-6000重量份，较佳地，4500-5500重量份，更佳地，4800-5200重量份。

在另一优选例中，所述培养基包括：

(C51-1)大豆水解物，500-3000重量份，较佳地，2300-2700重量份，更佳地，2400-2600重量份；和/或

(C51-2)小麦水解物，500-3000重量份，较佳地，2300-2700重量份，更佳地，2400-2600重量份。

在另一优选例中，所述(I)中包含一种或多种选自下组的脂类物质：

(C52)胆固醇(Cholesterol)：5-15重量份，较佳地，6-12重量份，更佳地，7-10重量份；和/或

(C53)生育酚(Tocopherol)：5-15重量份，较佳地，8-15重量份，更佳地，9-12重量份。

在另一优选例中，所述(J)中包含：

(C54)非离子表面活性剂，40-80重量份，较佳地，55-75重量份，更佳地，60-70重量份；

在另一优选例中，所述非离子表面活性剂为吐温80。

在另一优选例中，所述(K)中包含：

(C54)保护剂：400-800重量份，较佳地，700-780重量份，更佳地，720-770重量份。

在另一优选例中，所述培养基中包括：

(C55)碳酸氢钠：400-800重量份，较佳地，450-550重量份，更佳地，480-520重量份。

本发明第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的无血清培养基的基料组合物，所述基料组合物包括：

(I)脂类添加剂：所述脂类添加剂为将(I)与(J)中的组分溶解在同一有机溶剂中而获得；和

(II)干粉组合物：(A)～(H)和(K)中的组分。

在另一优选例中，所述还包括(L)中的组分。

在另一优选例中，所述有机溶剂为乙醇。

在另一优选例中，所述有机溶剂的量以能溶解所述脂类物质和非离子表面活性剂为准。

在另一优选例中，所述脂类添加剂中脂溶性成分与非离子表面活性剂的浓度与所述无血清培养基中的浓度相比，各自独立地浓缩500-10000倍，较佳地，1000-5000倍。

在另一优选例中，在所述培养基中，有机溶剂为0.05％-0.02％(v/v)，较佳地，0.1％-0.01％。

本发明第三方面，提供了一种无血清培养基套件，所述套件包括第一容器和第二容器，其中，

(i)所述第一容器内包括脂类添加剂，所述脂类添加剂为将(I)与(J)中的组分溶解在同一有机溶剂中而获得；和

(ii)所述第二容器内包括干粉组合物：(A)～(H)和(K)中的组分。

在另一优选例中，所述套件还包括第三容器，所述第三容器内包括(L)中的组分。

在另一优选例中，所述有机溶剂为乙醇。

在另一优选例中，所述第二容器中，所述干粉组合物为(A)～(H)和(K)中的组分通过研磨、混合获得的粉末质地的混合物。

在另一优选例中，所述脂类添加剂中脂溶性成分与非离子表面活性剂的浓度与所述无血清培养基中的浓度相比，浓缩500-10000倍，较佳地，1000-5000倍。

本发明第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述无血清培养基的制备方法，包括步骤：

(1)将(I)与(J)中的组分溶解于有机溶剂，得脂类添加剂；

(2)将(A)～(H)和(K)中的组分溶于水中，得第一混合物；

(3)将(L)中的组分加入所述第一混合物，溶解后加入所述脂类添加剂，加水定容并用调节pH，得到所述无血清培养基。

在另一优选例中，所述第一混合物为(A)～(H)和(K)中的组分溶于水获得的澄清液体。

本发明第五方面，提供了一种昆虫细胞体外培养方法，在本发明第一方面所述的无血清培养基中接种昆虫细胞并提供该种类细胞适宜的体外培养条件。

在另一优选例中，昆虫细胞包括常见的体外建株或建系的昆虫细胞，如粉纹夜蛾(High Five细胞系)和草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf9细胞系和Sf21细胞系)。

在另一优选例中，所述适当生长条件为27±2℃，较佳地，27±1℃。

本发明第六方面，提供了一种通过病毒载体表达系统表达重组蛋白或病毒蛋白的方法，包括步骤：

提供本发明的第一方面所述培养基；

在所述培养基中接种和培养昆虫细胞；

以及接种病毒、扩增和收获产物。

在另一优选例中，所述病毒为杆状病毒。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了Sf9细胞在SFM-01、Con-SFM-01和SF-900III SFM中批培养的结果。

图2显示了High Five细胞在SFM-01和Express Five SFM中批培养的结果。

图3显示了为Sf21细胞在SFM-01中批培养的结果。

图4为在SFM-02、SF-900III SFM和Insect XPRESS中培养Sf9细胞生产病毒蛋白的效价的结果。

图5为利用High Five细胞表达重组蛋白的产物浓度。

图6为High Five细胞表达重组蛋白过程中pH值的维持情况。

图7为Sf9细胞在Con-SFM-02中的批培养结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种综合性能优异的无血清培养基。与现有技术中的无血清培养基相比，本发明的培养基组分种类少、制备方法简单，且能支持昆虫细胞悬浮培养稳定传代和高密度生长，并在病毒载体(如杆状病毒)表达系统中高效表达蛋白产物。

特别地，培养基中核苷类成分的添加，可大幅提高活细胞密度。而且核苷类成分的添加可减少蛋白水解物的添加用量，特别是减少酵母水解物的添加，从而降低水解物对终产品内毒素的影响。

此外，本发明的培养基的优选的缓冲体系、合理的盐类比例，使培养基的pH值和渗透压能够更好的保持动态平衡，始终维持在适当的范围内。

在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“室温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。

如无特别说明，本发明的各组分的浓度单位“mg/L”以所述培养基总体积计；单位“重量份”所指的每单位重量份为相同重量。

本发明所述培养基包含50余种培养基常见的添加成分，如碳水化合物、氨基酸、维生素、无机盐离子、脂类、水解物、保护剂、核苷等，配制方法简便，适用于大规模生产应用。

本发明中，碳水化合物，主要为葡萄糖，是昆虫细胞培养的主要碳源和能源，添加量在4000-9000mg/L，满足细胞需求的同时，减小因乳酸等代谢副产物过量产生而对细胞和产物表达可能造成的负面影响。

本发明中，氨基酸是昆虫细胞培养的主要氮源和产物蛋白的主要组成单位，优选地，包括但不限于以下种类，L-盐酸半胱氨酸、L-酪氨酸二钠盐、L-盐酸精氨酸、β-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸；优选地，添加量在9000-27920mg/L。本发明对导致配制过程复杂化的氨基酸，如胱氨酸、酪氨酸进行了同类型/同功能物质的替代，减少了配制前的准备工作，简化了配制方法。

本发明中，维生素是多种酶的辅酶或辅因子，在昆虫细胞的生长和代谢中发挥重要作用，包括以下种类，生育酚、氯化胆碱、盐酸硫胺素、核黄素、尼克酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醇、生物素、叶酸、肌醇、钴胺素；优选地，添加量在10.56-44.03mg/L。本发明优化了各种维生素的添加浓度，使其更利于昆虫细胞的生长。

本发明中，无机盐离子分两类，一类以调节或提供培养体系的渗透压和pH缓冲体系而存在，包括一水磷酸二氢钠、氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠等；优选地，添加量在5150-15150mg/L；另一类则因添加量极低，被称为微量元素，作用包括作为酶的辅基参与细胞生长和代谢、参与营养成分(如氧)的转运、参与重要物质的合成等，包括五水硫酸铜、七水硫酸锌、四水氯化锰、七水硫酸亚铁，添加量在4.95-10.2mg/L。本发明优化了渗透压和缓冲体系，使细胞培养过程始终维持在适宜的培养条件下；本发明还简化了微量元素的添加种类，使配方组分减少，配制方法更加简单。

本发明中，脂类是昆虫细胞生物膜，如细胞膜、内质网、高尔基体的主要成分，同时还有为细胞供能或作为信号分子参与信号级联的作用，包括胆固醇，添加量在5-15mg/L。本方案简少了脂类成分的种类，简化了脂类的添加方法，仅需要与常见的表面活性剂(如吐温-80)混溶至有机溶剂(如无水乙醇)中得到脂类添加剂，然后直接添加到培养基中即可，脂类添加剂可制作为1000倍-10000倍浓缩液，以尽量减少完全培养基中有机溶剂的引入。在本发明中，术语“脂类”与“脂类物质”可互换使用。

本发明中，水解物为昆虫细胞补充了更多生长所需的氨基酸、短肽、微量元素、核苷等，还包括酵母水解物和植物水解物，添加量在1100-7000mg/L。本发明经过大量的筛选工作，确定了三款最佳的水解物种类，包括酵母水解物、大豆水解物和小麦水解物，两两组合都得到了非常好的培养效果。

令人惊讶地，本发明还发现，添加核苷类物质(包括腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷和胸苷，优选地，添加量在5-25mg/L)对细胞生长具有很好的促进作用，特别地，核苷类物质的添加可以减少水解产物的用量，从而降低水解产物(尤其是酵母水解物)引入的内毒素水平。

本发明中，还添加了其他成分，包括保护剂，如普朗尼克F68(简写F68)，添加量400-800mg/L，具有保护昆虫细胞在悬浮培养过程中免受剪切力或气泡破裂等带来的机械损伤；还包括有机酸，如α-酮戊二酸、富马酸、L-苹果酸、琥珀酸，添加量14-90mg/L。经实验验证，对细胞生长具有明显的促进作用。

本发明的昆虫细胞培养基可以通过单独称量各个组分分别溶解于水中，也可以将固体成分按照质量比称量混合并研磨成粉末混合物后溶解于水中，加入事先配制的脂质添加剂，混合均匀获得澄清液体后使用常见的过滤除菌方式获得无菌完全培养基。

优选地，碳酸氢钠可与其他固体组分分开包装，本发明中，碳酸氢钠为培养基提供缓冲体系，用于维持培养基pH值，其维持pH值的能力有赖于开放环境中的CO₂水平。当碳酸氢钠直接与其他成分混在一起配制培养基时，会因剧烈搅拌和区别于培养条件的环境CO₂水平使缓冲体系无法快速达到平衡状态，此时调整pH至指定范围，可能导致培养基使用时因真实平衡体系的建立而使pH值再次偏移，因此碳酸氢钠与干粉组合物分开包装，并在其他组分混合后再加入。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的无血清培养基组分种类少，制备方法简单，去除了血清等成分可能引入的不利因素；

(2)本发明的无血清培养基能够支持昆虫细胞系的稳定传代(如Sf21、Sf9、HighFive等细胞系稳定传代20代次以上)、快速增殖和高密度维持(最高活细胞密度：Sf9＞14.5×10⁶cells/ml，High Five＞10×10⁶cells/ml，Sf21＞7×10⁶cells/ml)；

(3)本发明的无血清培养基能够支持昆虫细胞利用杆状病毒载体表达系统高效表达重组蛋白和生产病毒，且病毒滴度和产量高于同类产品；

(4)本发明的无血清培养基应用于生产规模时能很好地维持细胞的高活性和培养环境的稳定，如pH值；

(5)本发明的培养基在保持昆虫活细胞密度高的基础上，水解物用量少，从而能够降低由水解物引起的产品内毒素水平。

(6)本发明的无血清培养基具有昆虫细胞培养的普适性，配制简便、成本可控，容易大规模实施和生产应用。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

昆虫细胞无血清培养基配方如下表1，本实施例制备的培养基命名为SFM-01，单位mg，配制体积10L：

表1

/>

SFM-01的配制方法如下：

1)将55-57号成分溶解于10ml无水乙醇，充分混匀获得脂质添加剂。

2)将1-53号成分称量并于室温下溶解于纯水中，充分搅拌以获得澄清溶液。

3)称量54号成分加入2)中所得澄清溶液，降低搅拌转速，待其全部溶解。

4)将脂质添加剂加入培养基，搅拌5-10min，充分混合，加水定容至10L。

5)检测渗透压(渗透压为360-390mOsm/kg)、pH值和浊度(浊度＜2.00NTU)，必要时，使用5M氢氧化钠或1M HCl调整pH值至6.2±0.1。

6)使用0.22μm孔径的滤器将上述培养基过滤除菌，获得SFM-01。2-8℃、避光保存。

对比例1：与SFM-01成分基本相同，不同的是，不添加核苷类成分(49-53号)的添加，培养基命名为Con-SFM-01。

实施例2

从液氮罐中取一支Sf9、一支Sf21和一支High Five细胞，Sf9和Sf21细胞使用可商购的培养基SF-900III SFM(Gibco产品)复苏重悬，High Five细胞使用Express Five SFM(Gibco产品)复苏重悬，各自调整接种密度为1×10⁶cells/ml并接种于125ml摇瓶中，补加相关培养基至30ml，培养条件为130rpm转速、27℃。

细胞以接种密度1×10⁶cells/ml为标准稀释传代三次，且活率超过95％后，取1×10⁶cells/ml活细胞离心除去原来的培养基，分别使用SFM-01、Con-SFM-01和SF-900IIISFM培养基重悬接种Sf9细胞，使用SFM-01和Express Five SFM培养基重悬接种High Five细胞，使用SFM-01培养基重悬接种Sf21细胞，每天取样记录活细胞密度和细胞活率。

如图1所示，Sf9细胞在SFM-01中批培养的最高活细胞密度可达14.5×10⁶cells/ml，在SF-900III SFM中为12.6×10⁶cells/ml，而在Con-SFM-01中，细胞活细胞最高为9.32×10⁶cells/ml。所有实验组中细胞活率都在95％以上。

如图2所示，High Five细胞在SFM-01中最大细胞密度可达9.7×10⁶cells/ml。而在Express Five SFM中的High Five细胞最高为7.6×10⁶cells/ml。所有实验组中细胞活率都在95％以上。

如图3所示，Sf21细胞能够在SFM-01培养基中正常生长，批培养4天后达到7×10⁶cells/ml的活细胞密度。

实施例3

昆虫细胞无血清培养基配方如下表，其中固体部分除碳酸氢钠(54号)外(1-53号)，制成干粉，为100L用量，54-56号为10L用量。取相应重量的干粉配制10L液体培养基，培养基命名为SFM-02。单位g：

/>

SFM-02的配制方法如下：

1)将55-56号成分溶解于100ml无水乙醇，充分混匀获得脂质添加剂，-20℃避光保存备用。

2)将1-53号成分称量并于磨粉设备中研磨混合，制成干粉，密封、避光、2-8℃保存备用。

3)称取上述干粉培养基407.9g室温下溶解于9.5L纯水中，充分搅拌至澄清。

4)称量54号成分(碳酸氢钠)加入2)中所得澄清溶液，降低搅拌转速，待其全部溶解。

5)将1)中的10ml脂质添加剂加入培养基，搅拌5-10min，充分混合并定容至10L。

6)检测渗透压、pH值和浊度，必要时，使用5M氢氧化钠或1M HCl调整pH值至6.2左右。

7)使用0.22μm孔径的滤器将上述培养基过滤除菌，获得SFM-02。2-8℃、避光保存。

实施例4

取液氮中的一支Sf9细胞，复苏并使用SFM-02在125ml摇瓶中培养，传代3次至细胞状态稳定，培养条件与实施例1相同。按照1×10⁶cells/ml的活细胞密度接种于另一摇瓶中，长到48h时，使用新鲜培养基稀释细胞至活细胞密度为2×10⁶cells/ml，以MOI＝0.1的条件接种杆状病毒，继续培养，第7天收毒，检测病毒效价TCID₅₀。

对比例2：重复实施例4，不同的是，无血清培养基使用SF-900III SFM(Gibco产品)。

对比例3：重复实施例4，不同的是，无血清培养基使用Insect XPRESS(Lonza产品)。

结果如图4所示，Sf9细胞在SFM-02中表达病毒蛋白的滴度达到8.8lgTCID₅₀/ml，高于SF-900III SFM和Insect XPRESS中表达的病毒效价。

实施例5

High Five细胞表达重组蛋白

本例使用的无血清培养基命名为SFM-03，用于培养High Five细胞表达重组蛋白。SFM-03培养基的配制方法如下：

1)称取上述实施例2中的干粉培养基815.8g室温下溶解于18L纯水中，充分搅拌至澄清。

2)称量54号成分(碳酸氢钠)10g加入1)中所得澄清溶液，降低搅拌转速，待其全部溶解。

3)将实施例2中的脂质添加剂20ml加入培养基，搅拌5-10min，充分混合并定容至20L。

4)检测渗透压、pH值和浊度，必要时，使用5M氢氧化钠或1M HCl调整pH值至6.2左右。

5)使用0.22μm孔径的滤器将上述培养基过滤除菌，获得SFM-03。2-8℃、避光保存。

取液氮罐中的一支High Five细胞，复苏后培养在SFM-03中，培养条件与实施例1相同，边传边扩，使细胞总量达到3×10⁹cells用于后续实验。将细胞以1×10⁶cells/ml活细胞密度接种于15L生物反应器，接种量为3±0.5L。转速设置为70±10rpm，溶氧设置为40±5％，温度设置为27±0.5℃。培养48h后，以MOI＝1的条件接种杆状病毒，并补新鲜SFM-03培养基稀释细胞密度为1.5×10⁶cells/ml，控制总体积约7L，控制参数不变。接毒后第4天留样，使用凝胶蛋白电泳检测病毒蛋白含量。

对比例4：培养条件同实施例5，不同的是，无血清培养基使用Express Five SFM(Gibco产品)。

如图5所示，High Five细胞在SFM-03中表达病毒蛋白浓度最高为59μg/ml，高于Express Five SFM。

同时，如图6所示，使用SFM-03培养High Five细胞并接种病毒后，即使不对反应器的pH值进行控制，培养体系的pH值仍然维持在6.0以上，即处于细胞生长和病毒表达都适宜的条件。而在对比培养基中，pH值下降程度明显增加。这说明本发明的培养基能够形成更稳定的缓冲体系，提高细胞的生长状态和生产病毒的能力。

对比例5：

与实施例1基本相同，区别仅在于，不添加核苷(59-53号组分)，且水解物添加量(mg)如下：

酵母水解物	25000
		大豆水解物	60000

制备10L培养基，培养基命名为Con-SFM-02。如实施例2接种Sf9细胞并进行培养。

结果如图7所示，可以看出，增加培养基中的酵母水解物和植物水解物的量也无法提高所培养细胞的最高密度，而本发明意外地发现，通过添加适量核苷组分，不仅可以显著提高细胞密度，而且与本领域常规技术相比，可以减少水解物的添加量，从而减少培养基中的内毒素水平。

原料是导致培养基内毒素升高的主要原因，尤其是酵母水解物和植物水解物。例如，氨基酸原料的内毒素控制水平通常为＜10或＜20EU/g；而酵母水解物的控制水平为＜500EU/g，植物水解物的控制水平为＜200EU/g。由于水解物的添加对于保持培养基的性能而言是必须的，因此在保证培养基性能的基础上，如果能够降低水解物加入量，则能够有效降低整体培养基的内毒素水平，从而降低生物制药终产物的内毒素水平，提高医药产品的安全性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种无血清培养基，其特征在于，所述培养基由以下组分构成：

(A).碳水化合物，所述碳水化合物包括葡萄糖；

(B).氨基酸或其盐，所述氨基酸包括：二十种天然氨基酸以及L-羟基脯氨酸，浓度以培养基总体积计：

(C2)L-盐酸半胱氨酸：50-300mg/L；

(C3)L-酪氨酸：50-220mg/L；

(C4)β-丙氨酸：200-600mg/L；

(C5)L-精氨酸：750-2000mg/L；

(C6)L-天冬酰胺：800-2400mg/L；

(C7)L-天冬氨酸：800-2400mg/L；

(C8)L-谷氨酸：800-2400mg/L；

(C9)L-谷氨酰胺：800-2400mg/L；

(C10)甘氨酸：100-700mg/L；

(C11)L-组氨酸：100-700mg/L；

(C12)L-异亮氨酸：500-1500mg/L；

(C13)L-亮氨酸：300-900mg/L；

(C14)L-赖氨酸：300-900mg/L；

(C15)L-蛋氨酸：700-2000mg/L；

(C16)L-苯丙氨酸：700-2000mg/L；

(C17)L-丝氨酸：700-2000mg/L；

(C18)L-苏氨酸：300-900mg/L；

(C19)L-色氨酸：50-200mg/L；

(C20)L-缬氨酸：600-1800mg/L；

(C21)L-脯氨酸：100-800mg/L；

(C22)L-羟基脯氨酸：300-1500mg/L；

(C)维生素或其盐，所述维生素包括：生物素、泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、尼克酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素和钴胺素；

(D)无机盐，所述无机盐包括：钙盐、钾盐、镁盐、钠盐和磷酸盐；

其中，所述的磷酸盐为磷酸二氢钠，且所述的磷酸二氢钠的浓度为4000-9000mg/L，浓度以培养基总体积计；

(E)微量金属离子，所述微量金属离子包括：Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺和Zn²⁺；

(F)核苷类，所述核苷包括：腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷和胸苷；

其中，

所述的腺苷的浓度为1-5mg/L；

所述的胞苷的浓度为1-5mg/L；

所述的鸟苷的浓度为1-5mg/L；

所述的尿苷的浓度为1-5mg/L；和

所述的胸苷的浓度为1-5mg/L；浓度以培养基总体积计；

(G)有机酸，所述有机酸选自下组：富马酸、α-酮戊二酸、L-苹果酸、琥珀酸，或其组合；

且所述(G)中包含一种或多种选自下组的有机酸：

(C46)富马酸：1-10重量份；

(C47)α-酮戊二酸：2-20重量份；

(C48)L-苹果酸：10-50重量份；和/或

(C49)琥珀酸:1-10重量份；

其中，所述的酵母水解物的浓度为80-1000mg/L，和

所述的植物蛋白水解物的浓度为500-6000mg/L；浓度以培养基总体积计；

(I)脂类，所述脂类选自下组：胆固醇、生育酚，或其组合；

(J)非离子表面活性剂；

(K)保护剂；

和(L)碳酸氢钠，且

所述培养基的最终pH为6.2±0.5；

所述培养基的溶剂为水或基本为水，且所述溶剂的含水量≥90wt％。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述(B)中包含下组，浓度以培养基总体积计：

(C2)L-盐酸半胱氨酸：100-200mg/L；

(C3)L-酪氨酸：100-200mg/L；

(C4)β-丙氨酸：400-550mg/L；

(C5)L-精氨酸：1100-1500mg/L；

(C6)L-天冬酰胺：1000-1400mg/L；

(C7)L-天冬氨酸：1500-2100mg/L；

(C8)L-谷氨酸：1500-2100mg/L；

(C9)L-谷氨酰胺：1500-2100mg/L；

(C10)甘氨酸：400-600mg/L；

(C11)L-组氨酸：400-600mg/L；

(C12)L-异亮氨酸：600-800mg/L；

(C13)L-亮氨酸：600-800mg/L；

(C14)L-赖氨酸：500-700mg/L；

(C15)L-蛋氨酸：900-1100mg/L；

(C16)L-苯丙氨酸：900-1100mg/L；

(C17)L-丝氨酸：800-1000mg/L；

(C18)L-苏氨酸：500-700mg/L；

(C19)L-色氨酸：60-100mg/L；

(C20)L-缬氨酸：750-950mg/L；

(C21)L-脯氨酸：200-400mg/L；

(C22)L-羟基脯氨酸：400-600mg/L。

3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述(B)中包含下组，浓度以培养基总体积计：

(C2)L-盐酸半胱氨酸：120-180mg/L；

(C3)L-酪氨酸：120-180mg/L；

(C4)β-丙氨酸：450-520mg/L；

(C5)L-精氨酸：1200-1400mg/L；

(C6)L-天冬酰胺：1100-1300mg/L；

(C7)L-天冬氨酸：1800-2000mg/L；

(C8)L-谷氨酸：1800-2000mg/L；

(C9)L-谷氨酰胺：1800-2000mg/L；

(C10)甘氨酸：450-550mg/L；

(C11)L-组氨酸：450-550mg/L；

(C12)L-异亮氨酸：650-750mg/L；

(C13)L-亮氨酸：650-750mg/L；

(C14)L-赖氨酸：550-650mg/L；

(C15)L-蛋氨酸：950-1050mg/L；

(C16)L-苯丙氨酸：950-1050mg/L；

(C17)L-丝氨酸：850-950mg/L；

(C18)L-苏氨酸：550-650mg/L；

(C19)L-色氨酸：70-90mg/L；

(C20)L-缬氨酸：800-900mg/L；

(C21)L-脯氨酸：250-350mg/L；

(C22)L-羟基脯氨酸：450-550mg/L。

4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述(F)中包含下组，浓度以培养基总体积计：

(C41)腺苷：2-4mg/L；

(C42)胞苷：2-4mg/L；

(C43)鸟苷：2-4mg/L；

(C44)尿苷：2-4mg/L；和

(C45)胸苷：2-4mg/L。

5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述(F)中包含下组，浓度以培养基总体积计：

(C41)腺苷：2.5-3.5mg/L；

(C42)胞苷：2.5-3.5mg/L；

(C43)鸟苷：2.5-3.5mg/L；

(C44)尿苷：2.5-3.5mg/L；和

(C45)胸苷：2.5-3.5mg/L。

6.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述(G)中包含一种或多种选自下组的有机酸：

(C46)富马酸：2-8重量份；

(C47)α-酮戊二酸：10-18重量份；

(C48)L-苹果酸：30-48重量份；和/或

(C49)琥珀酸：3-8重量份。

7.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述(G)中包含一种或多种选自下组的有机酸：

(C46)富马酸：3-6重量份；

(C47)α-酮戊二酸：12-16重量份；

(C48)L-苹果酸：35-45重量份；和/或

(C49)琥珀酸:4-7重量份。

8.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述(H)中包含选自以下的水解物，浓度以培养基总体积计：

(C50)酵母水解物：90-200mg/L；和

(C51)植物蛋白水解物：4500-5500mg/L。

9.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述(H)中包含选自以下的水解物，浓度以培养基总体积计：

(C50)酵母水解物：100-120mg/L；和

(C51)植物蛋白水解物：4800-5200mg/L。

10.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述保护剂选自下组：Pluronic F-68(F68)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素，或其组合。

11.如权利要求10所述的培养基，其特征在于，所述保护剂为Pluronic F-68(F68)。

12.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基由以下构成：所述的培养基体积按10L计，

13.一种如权利要求1所述的无血清培养基的基料组合物，其特征在于，所述基料组合物包括：

(II)干粉组合物：(A)～(H)和(K)中的组分。

14.如权利要求13所述的基料组合物，其特征在于，所述脂类添加剂中脂溶性成分与非离子表面活性剂的浓度与所述无血清培养基中的浓度相比，各自独立地浓缩500-10000倍。

15.如权利要求13所述的基料组合物，其特征在于，所述脂类添加剂中脂溶性成分与非离子表面活性剂的浓度与所述无血清培养基中的浓度相比，各自独立地浓缩1000-5000倍。

16.一种无血清培养基套件，其特征在于，所述套件包括第一容器和第二容器，其中，

(i)所述第一容器内包括脂类添加剂，所述脂类添加剂为将如权利要求1所述(I)与(J)中的组分溶解在同一有机溶剂中而获得；和

(ii)所述第二容器内包括干粉组合物，所述的干粉组合物为如权利要求1所述(A)～(H)和(K)中的组分通过研磨、混合获得的粉末质地的混合物。

17.如权利要求1所述无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)将(I)与(J)中的组分溶解于有机溶剂，得脂类添加剂；

(2)将(A)～(H)和(K)中的组分溶于水中，得第一混合物；

(3)将(L)中的组分加入所述第一混合物，溶解后加入所述脂类添加剂，加水定容并用盐酸或氢氧化钠调节pH，得到所述无血清培养基。

18.一种昆虫细胞体外培养方法，其特征在于，在权利要求1所述的无血清培养基中接种昆虫细胞并提供该种类细胞适宜的体外培养条件。

19.一种通过病毒载体表达系统表达重组蛋白或病毒蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

提供权利要求1所述培养基；

在所述培养基中接种和培养昆虫细胞；

以及接种病毒、扩增和收获产物。