CN105331659B - 改进的细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

提供具有高含量氯化胆碱的细胞培养基。该细胞培养基进一步包含仅中等量的氨基酸，尤其是该细胞培养基中谷氨酰胺的量受限制。该细胞培养基可以用于以细胞培养物大规模产生多肽。虽然使用有限量的氨基酸，该具有高含量氯化胆碱的细胞培养基尤其适合用于补料分批式细胞培养，细胞存活率由此停留在更高的水平更长时间，且具有高多肽效价。

Description

改进的细胞培养基
本申请是申请人于2011年4月25日提交的题为“改进的细胞培养基”的中国专利申请201180021025.4号的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术的一般领域，尤其涉及细胞的培养及其在以工业规模生产多肽中的用途。
本发明提供具有高含量氯化胆碱的细胞培养基，其允许以高细胞存活率(viability)培养细胞延长的时间。在用于通过以CHO细胞培养系统重组表达多肽来产生多肽时(尤其是以工业规模来产生多肽时)，本发明的细胞培养基进一步允许获得高多肽生产力和/或改善的产物质量。
背景技术
在过去二十年中，用重组技术制备多肽已发展为标准方法。通过克隆编码各多肽的基因、然后用该待表达的基因转化适宜的表达宿主、最后产生和纯化所获得的重组多肽产物来获得重组多肽提供了一类全新的通过生物学设计和产生的药物。
在重组DNA技术后使用生物工程领域中发展的产生方法，制药产业中已制备了数目越来越多的药物活性化合物。
这类生物产物包括单克隆抗体，其已发展为包括自身免疫病、炎性障碍、免疫抑制、肿瘤学等的多种医学领域中重要的治疗选择。
这类生物来源药物的发展需要以工业规模生产，从而提供大量重组多肽。优选的表达系统是哺乳动物细胞培养物，其优于大多数其他基于昆虫细胞、酵母等的真核系统，或甚至传统的原核表达系统。
但是，尤其是在工业规模，哺乳动物细胞培养包括巨大的挑战。用于哺乳动物细胞培养的生产设施需要彻底优化许多方法条件。
用于控制总体产生方法的最重要的方法参数之一是在其中培养细胞的培养基。适宜的细胞培养基必须为细胞培养物提供所有必需营养物，这在不向培养基中加入动物来源的成分(如血清或蛋白质，例如生长因子)时尤其困难。
另外，哺乳动物细胞培养物在多肽产生方法的不同阶段需要特定的补充成分。因此，细胞培养基必须在以下期间提供必需底物：a)宿主细胞在较低密度下起始生长和增殖；b)随后培养细胞至高密度；c)多肽在培养细胞中形成的实际过程。
用于产生重组多肽的总体方法优选包括扩大期和生产期。在扩大期期间，通过使用生长培养基来将宿主细胞培养至高密度，以最大化随后的多肽产生。在生产期期间，通过使用生产培养基来达到希望的多肽的大量的实际形成。为了满足细胞在总体多肽产生方法的各阶段中的具体的代谢需要，分别为扩大期和生产期设计了不同的培养基组合物。例如，生产培养基通常包含量比生长培养基高的氨基酸。
因此，过去已进行了大量的努力来研发特别强调它们在多肽的大规模产生中的用途的细胞培养基。然而，细胞培养基的持续改进仍然是重要目标，以进一步就产物质量和数量产率最大化多肽产生。
过去已就其在多肽产生中的作用研究了细胞培养基的许多成分。可能的靶标是无机盐、氨基酸、碳源(如葡萄糖)或维生素。
例如，已显示补充如维生素、氯化胆碱或氨基酸的化合物可以增加在无蛋白质条件下培养的细胞的存活率和生产力(Kim do Y等,Cytotechnology 2005,47,37-49)。
氯化胆碱是细胞培养基的标准成分，其作为细胞的磷脂前体。被细胞摄取并加工后，它作为细胞膜中除磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇外的称为磷脂酰胆碱的主要磷脂之一终止。
如D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)和D-MEM/F-12的常用细胞培养基已广泛用于培养广范围的哺乳动物细胞系。这些培养基分别包含4mg/L和8.98mg/L的氯化胆碱量。
其他市售培养基，如Ham’s F-12(可从BioConcept购得)和MEM(可从HyClone购得)也分别包含13.96mg/L和56mg/L的低量氯化胆碱。
US 6,180,401公开了改进的用于在动物细胞培养物中产生多肽的方法。一个目标是增加终产物浓度。修改了包括葡萄糖浓度、重量摩尔渗透压浓度(osmolality)和谷氨酰胺浓度的几个参数来最大化生产期中的产物产率。US 6,180,401公开了具有50.86mg/L的氯化胆碱含量的细胞培养基。
US 5,122,469公开了用于繁殖多种哺乳动物细胞系，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的培养基，其允许以适合用于哺乳动物细胞的小规模和大规模繁殖的单层或悬浮形式高密度培养细胞。另一个优势是增强的产物产率。该培养基是包含提高水平的某些氨基酸的化学成分确知培养基。氯化胆碱含量是50.86mg/L。
现有技术中仅已知很少几种具有高氯化胆碱含量的培养基。Waymouth描述了可以用来培养小鼠L929成纤维细胞结缔组织细胞系的细胞培养基(C.Waymouth,J.Natl.Cancer.Inst.,1959,22,1003-1017)。此培养基是无血清、化学成分确知的合成培养基，且具有250mg/L的氯化胆碱含量。此培养基以Waymouth’s Medium MB 752/1名称购得(BioConcept和Sigma-Aldrich)。已知的适用性限于全器官培养、从胸腔积液(pleuraleffusion)建立癌细胞系、以及在其体内评估前培养可能致瘤的细胞。
WO 02/101019公开了分别具有101.72mg/L和209.40mg/L的相对高的氯化胆碱含量的两种培养基组合物。用这些培养基来研究谷氨酰胺和谷氨酸对重组蛋白质产生的影响。但是，两种培养基都仍包含高量的谷氨酰胺。
从现有技术仅可获得关于培养基中的氯化胆碱含量对多肽产生的作用的有限的信息。US 6,048,728简要讨论了细胞培养基中的氯化胆碱含量对用杂交瘤细胞产生生物产物的作用。在表达抗体的细胞的情况下，在包含与Primary Supplement的其他试剂组合的高于4mg/L且优选约4至75mg/L的胆碱补充物的培养基中观察到了最大量的抗体分泌。在这些浓度下，将胆碱描述为非限制性的，且无明显毒性。
生产用细胞培养基，尤其是设计用于重组多肽的工业大规模产生的那些需要增加量的成分，例如氨基酸。
但是，高度浓缩的细胞培养基显示选定培养基成分的有限的溶解度。有限的溶解度代表了技术上的不足，因为用于大规模生产的高度浓缩的培养基具有单个成分例如在生产期期间，尤其是在保存期间沉淀的风险。这可以导致培养基组成的变化及细胞培养条件在产物形成的关键点劣化。
作为进一步的结果，沉淀导致从实际产生方法有效地去除了宝贵的培养基成分。设计用于克服这类缺点的附加再循环方法在技术上难以实现，就资源和时间而言需要进一步的努力。在多肽产生中同等地有效时，浓缩程度较低的细胞培养基可允许在工业生产方法中达到显著的成本降低。
鉴于以上挑战和现有不足，工业生物技术领域中存在对改进的培养基的持续需要，该培养基允许以甚至更高的产率(即，改善的比生产力(specific productivity)和总体生产力及提高的产物质量)以工业规模产生重组多肽。尤其希望得到改进的细胞培养基来改善生产期期间的生产力。
多肽产生方法的一个具体的技术目标是在产生方法结束时保持更高的细胞存活率，以最大化多肽的最终产率，尤其是由于产生时间的延长。此外，减少所形成的重组多肽的聚集及尤其是就翻译后修饰(如糖基化模式)改善产物质量也是重要的技术目标。
最后，希望得到用于多肽的大规模产生的改进的生产培养基，其包含降低量的成分，同时就细胞生长、多肽生产力、重组多肽质量和多肽功能性而言同等地有效或甚至更好。
发明概述
为了克服上文提到的技术挑战，本发明提供具有高含量氯化胆碱的细胞培养基，其尤其是在生物技术产生方法的后期导致细胞比生产力和细胞存活率的意外改善。此外，使用该细胞培养基还可以令人惊奇地改善重组产物的质量。本发明的细胞培养基尤其适于在生产期期间使用。因此，本发明允许从CHO细胞产生重组多肽。
该细胞培养基尤其可以用作生产培养基来在生产期期间达到高细胞生长、高活细胞密度和高多肽效价。还发现，可以通过使用本发明的细胞培养基来改善就较少的聚集和/或更好的翻译后修饰而言的产物质量，如重组产物的改善的糖基化模式。
在本发明中，优选使用氯化胆碱。但是，其他胆碱来源，例如氢氧化胆碱、酒石酸/酒石酸氢胆碱、硫酸胆碱、磷酸胆碱或基于不同平衡离子的使用的任意其他胆碱化合物也适合用于本发明的细胞培养基中。如果使用这类其他胆碱化合物，则优选选择它们的量来达到与用上文给出的浓度范围和浓度值的氯化胆碱达到的摩尔胆碱浓度相同的摩尔胆碱浓度，即，其他胆碱盐优选以等同于所列出的氯化胆碱浓度的浓度存在。这也适用于下文提到的具体的方面和实施方案。
根据本发明的第一方面，提供具有60mg/L至2500mg/L范围内的氯化胆碱含量的细胞培养基。该细胞培养基中的氯化胆碱含量可以是80mg/L或更高、备选地160mg/L或更高、200mg/L或更高、或220mg/L或更高。该细胞培养基中的氯化胆碱含量限于2500mg/L、备选地1000mg/L、840mg/L、500mg/L或300mg/L。氯化胆碱可以以约240mg/L的浓度存在。
本发明的第一方面的细胞培养基进一步包含表示为20至57mmol/L的总氨基酸浓度的仅有限含量的氨基酸。备选地，该总氨基酸浓度高于25mmol/L、高于30mmol/L、高于35mmol/L或甚至高于40mmol/L。此外，该总氨基酸浓度可以低于54mmol/L。该总氨基酸浓度可以是例如约51mmol/L。
此外，该细胞培养基任选包含降低含量的谷氨酰胺。具体而言，谷氨酰胺以500至1400mg/L、备选地800至1400mg/L或甚至900至1200mg/L的浓度存在。
本发明的第一方面的细胞培养基中的氨基酸含量可以任选按以下用mmol/l表示的浓度包含以下氨基酸：
精氨酸 4.0-6.0，优选4.5-5.5
天冬酰胺 3.0-6.0，优选4.0-5.5
天冬氨酸 2.5-4.0，优选3.0-3.6
甘氨酸 0.3-0.8，优选0.5-0.7
组氨酸 0.6-1.0，优选0.7-0.9
异亮氨酸 2.0-5.0，优选3.0-4.0
亮氨酸 3.0-7.0，优选3.5-6.0
赖氨酸 2.0-4.0，优选2.5-3.5
甲硫氨酸 1.0-1.5，优选1.2-1.4
苯丙氨酸 1.0-2.0，优选1.3-1.8
脯氨酸 2.5-6.0，优选3.0-5.5
丝氨酸 3.0-8.0，优选4.0-7.0
苏氨酸 2.0-3.5，优选2.5-3.1
色氨酸 0.4-1.0，优选0.5-0.8
缬氨酸 2.5-5.0，优选3.0-4.5
酪氨酸 1.0-2.0，优选1.2-1.8
半胱氨酸 0.5-1.0，优选0.6-0.8
该细胞培养基优选无血清且无蛋白质。优选地，它们还可以无蛋白质水解物。
根据本发明的第二方面，提供用于产生重组多肽的方法，其包括生产期，其中将重组CHO细胞培养在本发明的第一方面的细胞培养基中。
所制备的重组多肽尤其是重组抗体。
在本发明的方法中，优选以补料分批方法培养细胞。
附图简述
在图1至图8中，三种培养基是低胆碱生长培养基(◆(菱形)；对照1)、生产培养基(▲(三角形)；对照2)和高胆碱生长培养基，即，补充了200mg/l的附加量的氯化胆碱的低胆碱生长培养基(■(正方形))。
图1作为时间的函数描绘摇瓶中培养在三种不同细胞培养基中的表达mAb1的细胞的归一化活细胞密度(实验1)。
图2作为时间的函数描绘摇瓶中培养在三种不同细胞培养基中的表达mAb1的细胞的存活率(实验1)。
图3作为时间的函数描绘摇瓶中以三种不同细胞培养基培养表达mAb1的细胞后获得的归一化多肽效价(实验1)。
图4作为时间的函数描绘摇瓶中培养在三种不同细胞培养基中的表达mAb2的细胞的归一化活细胞密度(实验2)。
图5作为时间的函数描绘摇瓶中培养在三种不同细胞培养基中的表达mAb2的细胞的存活率(实验2)。
图6作为时间的函数描绘摇瓶中以三种不同细胞培养基培养表达mAb2的细胞后获得的归一化多肽效价(实验2)。
图7作为时间的函数描绘摇瓶中培养在三种不同细胞培养基中的表达mAb3的细胞的归一化活细胞密度(实验3)。
图8作为时间的函数描绘摇瓶中培养在三种不同细胞培养基中的表达mAb3的细胞的存活率(实验3)。
图9作为时间的函数描绘摇瓶中以三种不同细胞培养基培养表达mAb3的细胞后获得的归一化多肽效价(实验3)。
图10描绘摇瓶中培养7天后产生的mAb3的聚集率(aggregation rate)。通过大小排阻层析(SEC)来测量聚集率。误差棒是三个生物学重复的标准差。
图11作为时间的函数描绘在生物反应器中补料分批运行培养在三种不同细胞培养基中的表达mAb3的细胞的归一化活细胞密度(实验4)。
图12作为时间的函数描绘在生物反应器中补料分批运行培养在三种不同细胞培养基中的表达mAb3的细胞的存活率(实验4)。
图13作为时间的函数描绘用三种不同培养基在生物反应器补料分批运行中用表达mAb3的细胞获得的归一化多肽效价(实验4)。
图14描绘13天的细胞培养后获得的归一化mAb3抗体效价，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图15描绘表达mAb3的细胞在细胞培养的第13天的存活率，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图16描绘表达mAb3的细胞从第3天(100％)至第13天的归一化活细胞密度，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图17描绘表达mAb3的细胞从第3天至第13天的存活率，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图18描绘mAb3抗体效价从培养的第3天至第13天的归一化发展，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图19描绘表达mAb4的细胞从第0天至第17天的归一化活细胞密度，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图20描绘表达mAb4的细胞从第0天至第17天的存活率，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图21描绘表达mAb4的细胞在第17天的存活率，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图22描绘从第7天至第17天的归一化mAb4抗体效价，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图23描绘第17天的归一化mAb4抗体浓度，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低胆碱生长培养基。
图24描绘在细胞培养的17天内获得的表达mAb4的细胞的归一化平均细胞比生产力(qP)，使用补充了不同浓度氯化胆碱的低氯化胆碱生长培养基。
发明详述
用于培养细胞和随后从这些细胞培养物产生多肽的常规细胞培养基仅包含低量的氯化胆碱。只有现有技术中描述的非常少的几种培养基包含中量或甚至高量的氯化胆碱。但是，尚未就高量的氯化胆碱对细胞比生产力、细胞生长和产物质量的作用系统地研究过那些培养基(尤其是在生产期期间使用时)。
根据本发明，与具有较低量的氯化胆碱的培养基相比，在用包含高量氯化胆碱的细胞培养基作为生产培养基培养CHO细胞时，观察到了细胞比生产力(或多肽表达)的意外改善。本文表明，在补充高量的氯化胆碱时，甚至生长培养基也可以令人惊奇地用作有效的生产培养基，该生产培养基用于在生产期期间培养CHO细胞，从而获得大量的多肽，优选通过细胞培养物中的重组多肽表达获得的多肽。
虽然本发明优选使用氯化胆碱，但其他胆碱来源，例如氢氧化胆碱、酒石酸/酒石酸氢胆碱、硫酸胆碱、磷酸胆碱或基于不同平衡离子的使用的每种其他胆碱化合物也同等地适合用于本发明的细胞培养基中。
本发明的细胞培养基在产生多肽中的用途一般涉及培养用于多肽的重组表达的CHO细胞。优选将该细胞培养基用于多肽的大规模产生。多肽的大规模产生涉及用于制备治疗活性生物药物的重组多肽的工业生产通常所需的量。至少500L体积、至少1000L、至少5000L或甚至更高体积的细胞培养物通常代表大规模产生应用。
本发明的用于多肽产生的细胞培养基中氯化胆碱的量显著高于从之前使用的用于大规模多肽产生的细胞培养基已知的氯化胆碱含量。
因此，本发明适合用于重组多肽的产生，其使用包含高含量氯化胆碱的CHO细胞，如60mg/L或更高、80mg/L或更高、160mg/L或更高、200mg/L或更高、或220mg/L或更高。细胞培养基中氯化胆碱的含量限于2500mg/L、1000mg/L、840mg/L、500mg/L或甚至300mg/L。氯化胆碱可以以约240mg/L的浓度存在。
氯化胆碱浓度越高，培养基的成本越高。因此，从成本角度看，太高的氯化胆碱浓度是不利的。此外，氯化胆碱含量有助于培养基的重量摩尔渗透压浓度。太高的氯化胆碱浓度可以是不利的，因为它们可以与其他培养基成分一起导致高于所希望的重量摩尔渗透压浓度的总重量摩尔渗透压浓度。尤其是在补料分批方法中，不希望使用太高的起始重量摩尔渗透压浓度，因为这可以对流加策略(feeding strategy)施加限制。
由于以上原因，发明人认为最适氯化胆碱浓度在本文所示的极限之内。
如果使用氯化胆碱之外的胆碱化合物，则以等同浓度利用它们。等同浓度意指达到与按以上范围内的浓度使用氯化胆碱时所达到的胆碱浓度范围相同的范围内的胆碱摩尔浓度。
根据本发明的第一方面，细胞培养基仅包含表示为总氨基酸浓度的有限含量的氨基酸。更具体而言，本发明的第一方面的细胞培养基的特征在于20至57mmol/L的总氨基酸浓度。总氨基酸浓度可以高于25mmol/L、高于30mmol/L、高于35mmol/L或甚至高于40mmol/L。此外，总氨基酸浓度可以低于54mmol/L。总氨基酸浓度可以是例如约51mmol/L。
同时，氯化胆碱浓度如上文所述，即，在60mg/L至2500mg/L的范围内，优选的范围和值也如上文所述。
本发明的第一方面的细胞培养基尤其可以用作生产培养基来在生产期期间达到高细胞生长、高活细胞密度和高多肽效价。此外，达到重组产物的更高的产物质量，尤其是就更少的聚集和/或更好的翻译后修饰而言，如改善的糖基化模式。
近年已对氨基酸谷氨酰胺对细胞培养物的生长和得到的多肽生产率的作用进行了广泛的研究。已发现，谷氨酰胺不仅是用于多肽合成的重要构件，还代表了哺乳动物细胞的初级能源。因此，通常在用于多肽产生的细胞培养基中包含高浓度的谷氨酰胺。尤其是在工业规模，细胞培养基中高量的谷氨酰胺对细胞生长和多肽表达很重要。
然而，谷氨酰胺代谢导致谷氨酰胺的分解和铵离子的累积，已知铵离子对细胞生长和多肽产生是有毒性的副产物。因此，希望限制细胞培养物中谷氨酰胺的量。现有技术中已提出了几种谷氨酰胺替代剂，例如谷氨酸。但是，已描述了在补料分批方法中用谷氨酸替代谷氨酰胺导致较少的副产物形成，但也导致较低的生产力(Doverskog等,J.Biotechnol.,1997,59,103-115)。因此，希望得到包含降低量的谷氨酰胺，同时仍允许高细胞生长和高多肽生产力的细胞培养基。
已发现，高量氯化胆碱的加入允许尤其是在生产期期间使用与一些已知培养基相比包含降低量的谷氨酰胺的培养基，同时细胞的生产力保持基本不受影响。
因此，根据本发明的第一方面，提供进一步包含最适量的谷氨酰胺的细胞培养基，与来自现有技术的培养基相比，该最适量显著降低。该细胞培养基还可以无谷氨酰胺替代剂，如谷氨酸等。该细胞培养基任选以500至1400mg/L、800至1400mg/L或900至1200mg/L的浓度包含谷氨酰胺。
同时，氯化胆碱浓度如上文所述，即，在60mg/L至2500mg/L的范围内，优选的范围和值也如上文所述。此外，同时细胞培养基中的总氨基酸浓度为20至57mmol/L，优选的范围和值也如上文所述。
根据本发明的第一方面的另一可选的修改，单种氨基酸各自的量如下文所定义。
这类中等量的氨基酸仍然高于如DMEM或RPMI的常规细胞培养基中所包含的氨基酸的量，但同时显著低于用于大规模生产的典型生产培养基中所包含的氨基酸的量。
尤其是在以大规模或甚至工业规模进行多肽产生时，认为增加生产培养基中氨基酸的量对高生产力和高产物质量很重要。现已发现，尤其是在生产期期间使用的细胞培养基中，高量氯化胆碱的存在允许限制单种氨基酸的量。
本发明的第一方面的此可选的修改的细胞培养基中单种氨基酸的含量按以下用mmol/L表示的量包含以下氨基酸：
精氨酸 4.0-6.0，优选4.5-5.5
天冬酰胺 3.0-6.0，优选4.0-5.5
天冬氨酸 2.5-4.0，优选3.0-3.6
甘氨酸 0.3-0.8，优选0.5-0.7
组氨酸 0.6-1.0，优选0.7-0.9
异亮氨酸 2.0-5.0，优选3.0-4.0
亮氨酸 3.0-7.0，优选3.5-6.0
赖氨酸 2.0-4.0，优选2.5-3.5
甲硫氨酸 1.0-1.5，优选1.2-1.4
苯丙氨酸 1.0-2.0，优选1.3-1.8
脯氨酸 2.5-6.0，优选3.0-5.5
丝氨酸 3.0-8.0，优选4.0-7.0
苏氨酸 2.0-3.5，优选2.5-3.1
色氨酸 0.4-1.0，优选0.5-0.8
缬氨酸 2.5-5.0，优选3.0-4.5
谷氨酰胺 6.0-10.0，优选7.5-9.0
酪氨酸 1.0-2.0，优选1.2-1.8
半胱氨酸 0.5-1.0，优选0.6-0.8
同时，氯化胆碱浓度如上文所述，即，在60mg/L至2500mg/L的范围内，优选的范围和值也如上文所述。此外，同时细胞培养基中的总氨基酸浓度为20至57mmol/L，优选的范围和值也如上文所述。
由于高含量的氯化胆碱，各氨基酸的量可以显著低于用于多肽的大规模产生的其他细胞培养基中所使用的量。换言之，高量氯化胆碱的加入允许显著降低大多数氨基酸的量而不劣化细胞生长、细胞存活率和多肽效价。这具有这样的技术优势，可以使用所包含的大多数氨基酸的浓度较低的细胞培养基，从而避免溶解性较差的细胞培养基成分的沉淀问题。此外，就细胞培养基而言可以达到显著的成本降低，但多肽产物的总体质量和产率未受影响或甚至可以得到改善。如下文所述，可以通过使用本发明的细胞培养基来减少重组多肽产物的聚集。此外，还获得了更好的翻译后修饰(如改善的糖基化模式)或其他蛋白质质量属性(如重组多肽的更低的聚集)。在一些情况下，本发明公开的细胞培养基的修改甚至有助于改善细胞存活率和细胞生长，以及得到的多肽效价。
术语“细胞培养基”指营养物的水溶液，其可以用来培养细胞延长的时期。通常，细胞培养基包含以下成分：能量来源，其通常将是糖类化合物，优选葡萄糖；氨基酸，优选碱性组的氨基酸，包括所有必需和非必需氨基酸；维生素和/或以低浓度需要的其他有机化合物；游离脂肪酸；无机化合物，包括痕量元素，无机盐；缓冲化合物；及核苷和碱基。
术语“生长培养基”指通常在总体产生方法的扩大期期间使用的细胞培养基。扩大期是总体培养/产生方法的第一时期，其主要表征为高细胞生长和较少的多肽产生。扩大期服务于扩大细胞的目的，扩大细胞意指产生足够数目的处于指数生长期的细胞来接种生产用生物反应器。
术语“生产培养基”指通常在总体产生方法的生产期期间使用的细胞培养基。生产期是总体培养/产生方法的第二时期，其服务于产生高量产物的目的。在生产期期间，应尽可能长地将细胞维持在存活和高产的模式中。
由于安全性和污染问题，细胞培养基在制药工业领域中，例如在产生治疗活性重组多肽中的用途一般不允许使用任何动物来源的材料。因此，本发明的细胞培养基优选是无血清和/或无蛋白质培养基。术语“无血清和/或无蛋白质培养基”代表化学成分完全确知的培养基，其不包含来自动物来源的添加剂，如组织水解物、胎牛血清等。此外，还优选不向本发明的细胞培养物中加入蛋白质，尤其是生长因子，如胰岛素、转铁蛋白等。优选地，本发明的细胞培养基也不补充水解蛋白质来源，如大豆、小麦或水稻蛋白胨或酵母水解物等。
本发明的细胞培养基可以用于多种细胞培养方法中。可以以贴壁培养，例如以单层培养，或优选以悬浮培养来进行细胞的培养。
可以例如通过工业生物技术中建立的多种发酵方法来使用细胞的大规模培养。使用本发明的细胞培养基，可以利用不连续和连续的细胞培养方法，如灌流和恒化器。不连续的方法(包括反复补料分批和反复分批)是一个优选的实施方案。
分批细胞培养包括补料分批培养或简单分批培养。术语“补料分批细胞培养”指这样的细胞培养，最初在培养瓶中提供细胞和细胞培养基，并在培养过程中连续地或以离散增加的形式向培养物中流加附加的培养营养物，在培养结束前定期收集或不收集细胞和/或产物。术语“简单分批培养”指这样的方法，其中在起始培养过程时在培养瓶中提供包括细胞和细胞培养基的所有用于细胞培养的成分。
在本发明的细胞培养基中培养的细胞是CHO细胞。
可以从细胞培养物和本发明的细胞培养基产生的多肽不受限制。多肽可以是重组的或不是重组的。本文所用的术语“多肽”涵盖由通过肽键连接的超过两个氨基酸的链组成的分子；包含两条或多条这类链的分子；包含例如通过糖基化额外修饰的一条或多条这类链的分子。术语多肽旨在涵盖蛋白质。
通过细胞培养物和本发明的细胞培养基产生的多肽的优选种类是重组抗体。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、纳米抗体(nanobody)、修饰抗体、抗体的亚基、抗体衍生物、人工抗体、抗体与蛋白质的组合、及长度足以显示希望的生物学活性的抗体片段。本文使用的单克隆抗体可以是人抗体。
但是，也可以用细胞培养物和本发明的细胞培养基来产生抗体以外的多肽，例如多肽，如跨膜蛋白质、受体、激素、生长因子、蛋白酶、凝固和抗凝固蛋白质、抑制蛋白质、白细胞介素、转运因子、融合蛋白质等。该细胞培养基还可以用来产生病毒。
从这类细胞培养方法获得的产物可以用于制备药物制剂。术语“药物制剂”指适宜或适合对哺乳动物，尤其是对人施用的组合物。此外，本发明的一种或多种蛋白质可以与生物活性剂的其他成分一起施用，所述其他成分如可药用表面活性剂、赋形剂、载体(carrier)、稀释剂和介质(vehicle)。
高量的氯化胆碱在本发明的细胞培养基中的存在允许降低细胞培养基中氨基酸的含量而不负面影响培养基在高密度下支持细胞生长的能力，同时使得能够获得高多肽效价。此作用对总体产生方法的生产期尤其重要。
大多数实验甚至已显示，与常规生产培养基相比，通过本发明的细胞培养基达到了甚至更好的性能参数，该常规生产培养基包含仅与低量氯化胆碱组合的较高浓度的选定氨基酸。
虽然不受限于某种理论，但假定磷脂前体胆碱的浓度与重要的细胞膜成分磷脂酰胆碱的量相关，除其他磷脂外，磷脂酰胆碱是保持细胞膜的完整性和功能性所必需的。可以假定，生长在具有低胆碱含量的培养基中的细胞在培养过程中受限于此底物，从而受限于磷脂酰胆碱，即使胆碱是非必需培养基成分，且细胞应能够独立合成它。但是，失活或限制途径可以是可获得有限量的胆碱来产生足量磷脂酰胆碱的原因。这可以导致膜，尤其是内质网和高尔基复合体的膜的“异常”组成。这可以负面影响这些膜的功能，并降低多肽表达速率或细胞内的多肽转运。Testerink等(2009；Journal of Lipid Research,50卷,2182-2192)显示了磷脂酰胆碱缺失的CHO细胞中多肽从高尔基复合体向质膜转运的抑制。可以通过加入外源磷脂酰胆碱来拯救此缺陷。
几个重要的优势源自本发明的细胞培养基的具体组成。
第一，本发明的细胞培养基中总氨基酸含量的降低允许用就细胞生长、活细胞密度及多肽生产力而言相似或甚至改善的技术性能参数来进行细胞培养方法，同时，由于考虑到就细胞培养基而言的成本降低，细胞培养物中总氨基酸含量或一些选定氨基酸的含量的降低导致产生方法的更好的总体经济平衡。
第二，本发明的细胞培养基避免了包含在细胞培养基中的成分，尤其是以相对高的浓度包含在培养基中的疏水性氨基酸沉淀的风险。这在培养基的保存期间尤其有利。对于这些成分，降低的浓度有助于避免在细胞生长和多肽产生期间供给必需底物的劣化。这在总体产生方法的生产期期间尤其有利。
第三，本发明的细胞培养基允许产生具有更高质量的重组多肽。减少了所形成的多肽的聚集，细胞能够产生具有更好的翻译后修饰的多肽，糖基化模式也得到改善。
形成的多肽在重组表达期间的聚集是导致降低的产物产率的技术问题。此外，聚集使得更难以纯化具有功能活性的多肽产物。因此，希望在实际产生方法中尽可能多地减少所形成的多肽产物的聚集。已发现，与典型生产培养基相比，本发明的细胞培养基导致重组多肽产物的减少的聚集。
许多多肽经历翻译后修饰，尤其是多肽糖基化。产生的多肽包含共价连接的寡糖链。已知糖基化是多肽功能性的重要介体。因此，用于重组多肽产生的宿主细胞系统正确模拟内源糖基化结构的能力是产物质量的重要方面。施用错误糖基化的多肽后，由于免疫原性特性和降低的体内半衰期，不正确的多肽糖基化可以强烈影响重组多肽的治疗功效。
通常，尤其是在重组抗体领域，认为甘露糖基化是重组多肽产生中的关键方面。避免多肽的高甘露糖基化是重组多肽产生中的一般目标。因此，在重组多肽的产生中尽可能多地减少高甘露糖基化是重要目标。
本发明的细胞培养基允许产生具有非常低的高甘露糖基化程度的重组多肽。对典型生产培养基而言，此技术作用尤其显著。例如，与生产培养基相比，从使用本发明的细胞培养基的表达获得的具有高甘露糖基化的高甘露糖基化重组多肽对重组多肽总量的相对量优选降低约50％。
此外，已令人惊奇地发现，相对于用常规生长培养基或生产培养基获得的对应的多肽，用本发明的细胞培养基获得的重组多肽具有更高百分比的β-半乳糖基化。
具有高胆碱浓度的培养基的另一优势是，它允许仅有一种培养基用于生产期和扩大期，节约了时间和资源。
实施例
以下实验旨在进一步说明本申请中定义的发明。
细胞培养基的描述
测试了以下三种培养基：
低胆碱生长培养基，即，具有40mg/L的氯化胆碱含量(对照1)；
生产培养基(对照2)；
高胆碱生长培养基，即，补充了200mg/L的附加量的氯化胆碱，导致氯化胆碱的总含量为240mg/L的低胆碱生长培养基。
前两种培养基(低胆碱生长培养基和生产培养基)仅用于比较的目的，而具有高含量氯化胆碱的第三种培养基代表本发明的培养基。
低胆碱生长培养基是设计用于细胞培养物的生长和增殖的典型培养基。此培养基允许培养细胞直至达到细胞的高密度，高密度是进行大规模多肽产生的重要要求。但是，低胆碱生长培养基并不是设计用于从细胞培养物产生多肽，因为考虑到培养基中的总氨基酸浓度为51.1mmol/L，许多氨基酸的含量为低至中等。
低胆碱生长培养基的氨基酸组成如下：
氨基酸 毫克/升培养基 浓度(mmol/L)
L-精氨酸，HCl 1053 5.0
L-天冬酰胺一水合物 616 4.1
L-天冬氨酸 461 3.5
甘氨酸 38 0.5
L-组氨酸HCl H<sub>2</sub>O 168 0.8
L-异亮氨酸 394 3.0
L-亮氨酸 500 3.8
L-赖氨酸HCl 622 3.4
L-甲硫氨酸 180 1.2
L-苯丙氨酸 264 1.6
L-脯氨酸 368 3.2
L-丝氨酸 432 4.1
L-苏氨酸 334 2.8
L-色氨酸 102 0.5
L-缬氨酸 375 3.2
L-谷氨酰胺 1170 8.0
L-酪氨酸 278*) 1.5
L-半胱氨酸 200*) 0.8
总含量 51.0
*)用贮存液向低胆碱生长培养基中加入L-酪氨酸和L-半胱氨酸来达到上文所示的酪氨酸和半胱氨酸的浓度。
与低胆碱生长培养基不同，第二种培养基(生产培养基)是用于用细胞培养物进行大规模多肽产生的培养基。虽然其他成分的量基本相同，但与低胆碱生长培养基相比，此生产培养基包含更高量的大多数氨基酸(培养基中的总氨基酸浓度为90.50mmol/L)。
该生产培养基的氨基酸组成如下：
氨基酸 毫克/升培养基 浓度(mmol/L)
L-精氨酸，HCl 1053 5.0
L-天冬酰胺一水合物 1501 10.0
L-天冬氨酸 461 3.5
甘氨酸 38 0.5
L-组氨酸HCl H<sub>2</sub>O 268 1.3
L-异亮氨酸 894 6.8
L-亮氨酸 1200 9.2
L-赖氨酸HCl 822 4.5
L-甲硫氨酸 280 1.9
L-苯丙氨酸 464 2.8
L-脯氨酸 968 8.4
L-丝氨酸 1232 11.7
L-苏氨酸 534 4.5
L-色氨酸 252 1.2
L-缬氨酸 776 6.6
L-谷氨酰胺 1169 8.0
L-谷氨酸Na盐水合物 182 1.2
L-酪氨酸 423*) 2.3
L-半胱氨酸 305*) 1.3
总含量 90.7
此比较用生产培养基中氯化胆碱的含量也显著高于低胆碱生长培养基。注意到这一点很重要，来自现有技术的已知生产培养基通常包含更低量的氯化胆碱。因此，必须将比较用生产培养基中高含量的氯化胆碱视为与来自现有技术的已知生产培养基的重要差异，来自现有技术的已知生产培养基在其氯化胆碱的含量上通常与已知生长培养基并无不同。
第三种培养基是本发明的培养基，其用高胆碱生长培养基表示，即，补充了200mg/l氯化胆碱，导致氯化胆碱的总含量为240mg/l的低胆碱生长培养基。除更高的氯化胆碱含量外，仍可将本发明的第三种培养基视为典型生长培养基。
实例表明，在生产期期间使用时，通过如低胆碱生长培养基的生长培养基中高量的氯化胆碱达到了显著的改善，使得这类具有高含量氯化胆碱的生长培养基不仅就细胞生长、细胞存活率和多肽效价而言极大地优于补充低氯化胆碱的培养基，还甚至在相同的方面优于具有同等高的氯化胆碱量的生产培养基。加入更高量的氯化胆碱有助于在正常生长培养基中到达更好的细胞生长和存活率及改善的多肽效价。
实验设置
对于实验，使用亲本CHO细胞系，其通过适应无血清、无蛋白质培养基条件衍生自dhfr(+)CHO-K1细胞系ATCC CCL-61(Kao等,Genetics,1967,55,513-524；Kao等,PNAS,1968,60,1275-1281；Puck等,J.Exp.Med.,1985,108,945-959)。分别转染此亲本细胞系的三个整份试样来表达三种不同的单克隆抗体mAb1、mAb2、mAb3。
摇瓶实验(实验1至3)
除培养基外，全部9个摇瓶(每个实验三个)都在相同的条件下运行。条件涉及补料分批培养，第3和5天开始两次每日快速流加，每天的流加率为初始培养体积的2％和0.4％；第5天温度从36.5℃变至33℃；培养箱中10％CO2；摇动速率为150转/分钟(冲程半径(stroke radius)＝25mm)。测定细胞的细胞生长/存活率以及产生的所表达的重组抗体的效价。
a)实验1
图1和2就细胞生长和存活率显示针对实验1中培养的表达mAb1的细胞获得的结果。
如图1和2中所示，与具有低含量氯化胆碱的低胆碱生长培养基相比，本发明的具有高含量氯化胆碱的培养基(高胆碱生长培养基)显示最大活细胞密度的53％的增加和更缓慢的存活率下降。
图3就多肽效价显示针对实验1中培养的细胞获得的结果。
如图3所示，与低胆碱生长培养基(其仅具有低含量的氯化胆碱，且仅代表典型生长培养基)相比，在本发明的具有高含量氯化胆碱的培养基(高胆碱生长培养基)中获得的重组抗体的多肽效价在第13天显示330％的多肽效价增加。
图3还显示，本发明的具有高含量氯化胆碱的培养基甚至允许达到略高于获自生产培养基的效价的多肽效价。
b)实验2
图4和5就细胞生长和存活率显示针对实验2中培养的表达mAb2的细胞获得的结果。
如图4和5所示，与低胆碱生长培养基(其仅具有低含量的氯化胆碱)相比，本发明的具有高含量氯化胆碱的培养基(高胆碱生长培养基)对细胞生长仅具有很小的影响，但在该方法结束时给出显著更高的存活率。
图6就多肽效价显示针对实验2中培养的细胞获得的结果。
图6显示，与低胆碱生长培养基相比，本发明的细胞培养基在第11天的多肽效价增加85％。此外，与在具有同等高的氯化胆碱含量的生产培养基中获得的多肽效价相比，在本发明的细胞培养基中获得的多肽效价甚至更高。
c)实验3
图7和8就细胞生长和存活率显示针对实验3中培养的表达mAb3的细胞获得的结果。
如图7和8所示，与仅包含低量氯化胆碱的比较用细胞培养基(低胆碱生长培养基)相比，在培养方法结束时，用本发明的培养基获得了更高的细胞存活率。
图9就多肽效价显示针对实验3中培养的细胞获得的结果。
图9显示，与比较用培养基(低胆碱生长培养基)相比，在本发明的细胞培养基中获得的多肽效价在第11天增加145％。本发明的细胞培养基的多肽效价甚至略高于用具有高含量氯化胆碱的生产培养基获得的效价。
已进一步通过实验确认，与使用具有240mg/L的标准量的氯化胆碱的生产培养基相比，在生产培养基中使用更高浓度的氯化胆碱并未导致改善的细胞生长或多肽效价。
进行以下附加实验来确定细胞培养基对多肽产物质量的影响。具体而言，分析产物来确定培养基对聚集及对糖基化的影响。
图10显示相对于重组抗体总量的重组抗体产物的百分比聚集率。相对于生产培养基，本发明的细胞培养基中的聚集率降低超过30％。
在不同细胞培养基中表达mAb3后分析重组抗体的糖基化模式显示，本发明的具有高含量氯化胆碱的生长培养基导致这样的重组抗体，该重组抗体的包含高甘露糖基化(其代表不想要的糖基化模式)的重组产物的总量低。与使用生产培养基相比，就高甘露糖基化而言，使用本发明的培养基导致超过55％的降低。
生物反应器补料分批运行(实验4)
以下实验是生物反应器中的补料分批运行。它对应于以上实验3。使用表达mAb3的细胞。条件如下：2L起始体积；第3和5天开始连续流加两种不同的流加溶液，每天的流加率为最初培养体积的2％和0.4％；第5天温度从36.5℃变至33℃；pO2＝30％；pH＝6.9(死区0.1)；用CO2和0.5M NaOH控制；搅拌速率＝300转/分钟。
图11和12显示在作为生物反应器中的补料分批运行进行的实验4中针对活细胞密度和细胞的存活率百分比获得的结果。
对于细胞的细胞生长和存活率，来自生物反应器中的补料分批运行的结果与摇瓶实验中获得的结果一致。这意味着，生物反应器中的补料分批运行基本上确认了摇瓶实验中获得的结果。
与摇瓶实验中一样，与本发明的具有高含量氯化胆碱的细胞培养基(高胆碱生长培养基)相比，在生产培养基中达到的峰值活细胞密度略高。但是，与仅具有低含量氯化胆碱的未补充的生长培养基相比，在使用本发明的细胞培养基(即，补充了高含量氯化胆碱的培养基)时，存活率的百分比停留在显著更高的水平。
图13显示在作为生物反应器中的补料分批运行进行的实验4中针对多肽效价获得的结果。
与仅具有低量氯化胆碱的比较用生长培养基相比，在第11天测量的本发明的具有高含量氯化胆碱的细胞培养基的多肽效价增加170％。
虽然在摇瓶实验中，用本发明的具有高含量氯化胆碱的细胞培养基获得的多肽效价甚至优于用用于比较目的的生产培养基获得的多肽效价，但生物反应器中的补料分批运行中的实验显示，与生产培养基相比，本发明的具有高含量氯化胆碱的细胞培养基中的多肽效价略低。但是，用本发明的具有高含量氯化胆碱的细胞培养基在生物反应器中获得的多肽效价非常高，且仍处于与用用于比较目的的生产培养基获得的多肽效价相当的水平。
生物反应器中的实验4进一步确认，由于允许达到相当的多肽效价，同时可以显著降低各细胞培养基中氨基酸的总量或选定氨基酸的量，本发明的具有高含量氯化胆碱的细胞培养基代表了常规生产培养基的适宜备选。
生物反应器中的实验4还再次证明，在用生长培养基进行多肽的产生时，增加典型生长培养基中氯化胆碱的含量有助于达到多肽效价的巨大增加。
向生长培养基中加入不同浓度的氯化胆碱
在另一组实验中，以多种浓度(总计40、80、120、160、200、240、500、840、1000、3000和5000mg/l)向粉末生长培养基中加入氯化胆碱。基本按上文所述用这样获得的培养基来分别产生mAb3和mAb4。
图14至图24中进一步描绘mAb3和mAb4的归一化抗体浓度、归一化活细胞密度和存活率，对于mAb4，还描绘了整个培养期间的归一化细胞比生产力(13resp.17天)。
如从这些数据可见，在具有总计40mg/l氯化胆碱的生长培养基中，就存活率和抗体浓度而言，培养13天或17天后达到最低值。3000mg/l及更高的的浓度未负面影响细胞的存活率，但由于细胞在那些培养基中不生长，抗体浓度停留在1以下。对于高于40mg/l的所有胆碱浓度，存活率更高。似乎存在氯化胆碱对存活率的浓度依赖性作用。培养基中氯化胆碱的浓度越高导致培养结束时的存活率越高。

Claims (13)

1.利用CHO细胞培养系统通过重组表达生产多肽的方法，其中在细胞培养基中培养重组CHO细胞并表达重组多肽，其中所述细胞培养基无血清且无蛋白质，包含160至2500mg/L的氯化胆碱或等同量的另一胆碱盐，且具有浓度为500至1400mg/L的谷氨酰胺。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞培养基具有浓度为900至1200mg/L的谷氨酰胺。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞培养基包含220至2500mg/L的氯化胆碱或等同量的另一胆碱盐。
4.权利要求1或2的方法，其中以补料分批方法培养所述细胞。
5.权利要求1或2的方法，其中所述方法是大规模生产方法。
6.权利要求1或2的方法，其中对产生的多肽进行翻译后修饰。
7.权利要求1或2的方法，其中所述重组多肽是重组抗体。
8.权利要求1或2的方法，其中所述细胞培养基按以下用mmol/L表示的浓度包含以下氨基酸：
9.如权利要求3所述的方法，其中以补料分批方法培养所述细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述方法是大规模生产方法。
11.如权利要求9所述的方法，其中产生的多肽进行翻译后修饰。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述重组多肽是重组抗体。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞培养基按以下用mmol/L表示的浓度包含以下氨基酸：
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