KR20180073693A - Cho 세포에서 생산되는 폴리펩티드의 품질 속성을 조작하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따르면, 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 CHO 세포는 폴리펩티드의 단백질 품질 속성을 조작하고/거나 제어하기 위해 아미노산, 비타민, 포스페이트, 지질 및/또는 항산화제 최적화가 사용된 배지에서 성장된다. 본 발명에 따라 발현된 폴리펩티드는 제약 조성물의 제조에 유리하게 사용될 수 있다.

Description

CHO 세포에서 생산되는 폴리펩티드의 품질 속성을 조작하는 방법

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2015년 11월 9일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/252,849의 이익을 주장한다. 언급된 출원의 전체 교시는 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 폴리펩티드의 단백질 품질 속성을 조작 및/또는 제어하기 위해 아미노산, 비타민, 포스페이트, 지질 및/또는 항산화제 최적화가 사용된 배지에서 성장된 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 관한 것이다. 본 발명에 따라 발현된 폴리펩티드는 제약 조성물의 제조에 유리하게 사용될 수 있다.

생물반응기 생산성을 시간 및 부피 둘 다에서 최대화하기 위해 현재 진행되고 있는 노력은 생물반응기 제품군에 필요한 규모 및 자본 투자에 직접적으로 영향을 미친다. 세포가 보다 높은 농도에 보다 신속하게 도달함에 따라 수율은 증가되고; 따라서, 생물반응기의 수 및 규모는 감소될 수 있다. 이를 위해, 세포가 최고 성능에 신속하게 도달하고, 높은 품질의 단백질을 생산하면서 가능한 한 오래 높은 수준을 유지하는 것을 보조하도록 세포 조작뿐만 아니라, 배양 배지 및 관련된 화학적 및 물리적 환경이 사용된다.

재조합적으로 생산된 단백질 생성물은 치유제, 치료제 및 예방제로서 사용하기 위해 의학적으로 및 임상적으로 점점 중요해지고 있다. 따라서, 목적하는 폴리펩티드 속성을 경제적으로 및 효율적으로 달성하는 신뢰할 수 있는 세포 배양 공정의 개발이 관련 기술분야에서 목적으로 하고 필요로 하는 목표이다.

본 발명의 방법은 성장 인자, 포스페이트, Zn, Fe, 아미노산 (Asp, Asn, Cys, Ser), 지질, 비타민 (B1, B2, B3, B9, B12, Bx), 항산화제 (아스코르브산, 글루타티온, 환원된 a-리포산, 비타민 E), 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 세포 배양 배지 성분의 수준을 변화시킴으로써 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되는 재조합 당단백질의 단백질 품질 속성을 제어 및/또는 매개하기 위한 세포 배양 배지의 최적화에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태는 1종 이상의 세포 배양 배지 성분, 예컨대 아스파라긴, 아스파르트산, 아연 및 철의 양을 조정하는 것을 포함하는, CHO 세포에서 발현되는 재조합 당단백질의 단백질 품질 속성을 제어하는 것이며, 여기서 당단백질 응집은 감소된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 1종 이상의 세포 배양 배지 성분, 예컨대 아스파르트산, 포스페이트 및 아연의 양을 조정하는 것을 포함하는, CHO 세포에서 발현되는 재조합 당단백질의 단백질 품질 속성을 제어하는 것이며, 여기서 당단백질의 시알산 함량은 증가된다.

본 발명의 한 실시양태는 1종 이상의 세포 배양 배지 성분, 예컨대 아스파라긴, 아연 및 철의 양을 조정하는 것을 포함하는, CHO 세포에서 발현되는 재조합 당단백질의 단백질 품질 속성을 제어하는 것이며, 여기서 당단백질의 갈락토스 함량은 증가된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 규정된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서 최적화되는 세포 배양 배지는 기초 배지이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 첨가된 혈청 또는 가수분해물을 함유하지 않고/거나, 단백질-무함유일 수 있다.

본 발명의 당단백질은 재조합 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질이다.

도 1은 실험 및 분석 흐름도를 보여준다. ProA : 단백질 A
도 2는 성장 인자 (1 mg/L 인슐린)의 존재 하에 배양된 클론 A, 클론 B 및 클론 G 세포가 그의 부재 하의 배양물과 비교하여 보다 높은 HMW%를 발생시킨다는 것을 보여준다. GF: 성장 인자; GF-무함유: 성장 인자 무함유
도 3A-도 3D는 클론 A에 대한 HMW%의 통계적 분석을 보여준다. 3A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 HMW%의 수준. 3B: 3A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 3C: HMW%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 3D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 HMW% 수준
도 4A- 도 4D는 클론 C에 대한 HMW%의 통계적 분석을 보여준다. 4A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 HMW%의 수준. 4B: 4A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 4C: HMW%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 4D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 HMW% 수준
도 5A - 도 5D는 클론 D에 대한 HMW%의 통계적 분석을 보여준다. 5A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 HMW%의 수준. 5B: 5A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 5C: HMW%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 5D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 HMW% 수준
도 6A- 도 6D는 클론 A에 대한 HMW%의 통계적 분석을 보여준다. 6A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 HMW%의 수준. 6B: 6A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 6C: HMW%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 6D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 HMW% 수준
도 7A - 도 7D는 클론 B에 대한 HMW%의 통계적 분석을 보여준다. 7A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 HMW%의 수준. 7B: 7A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 7C: HMW%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 7D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 HMW% 수준
도 8은 성장 인자 (1 mg/L 인슐린)의 존재 하에 배양된 클론 A, 클론 B 및 클론 D 세포가 그의 부재 하의 배양물과 비교하여 보다 낮은 gal%를 발생시킨다는 것을 보여준다. GF: 성장 인자; GF-무함유: 성장 인자 무함유.
도 9A - 도 9D는 클론 A에 대한 gal%의 통계적 분석을 보여준다. 9A: 프로토타입에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 gal%의 수준. 9B: 9A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 9C: gal%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 9D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 gal% 수준
도 10A - 도 10D는 클론 B에 대한 gal%의 통계적 분석을 보여준다. 10A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 gal%의 수준. 10B: 10A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 10C: gal%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 10D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 gal% 수준
도 11A - 도 11D: 클론 C에 대한 gal%의 통계적 분석. 11A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 gal%의 수준. 11B: 11A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 11C: gal%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 11D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 gal% 수준
도 12A - 도 12D는 클론 D에 대한 gal%의 통계적 분석을 보여준다. A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 gal%의 수준. B: A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. C: gal%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 gal% 수준
도 13A - 도 13D는 클론 A에 대한 gal%의 통계적 분석을 보여준다. 13A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 gal%의 수준. 13B: 13A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 13C: gal%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 13D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 gal% 수준
도 14A - 도 14D는 클론 F에 대한 gal%의 통계적 분석을 보여준다. 14A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 gal%의 수준. 14B: 14A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 14C: gal%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 14D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 gal% 수준
도 15는 클론 B의 경우의 gal%에 대한 성장 인자 및 포스페이트의 효과를 보여준다. 세포를 성장 인자의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도의 포스페이트를 사용하여 배양하였다. GF-무함유 조건의 경우의 gal%는 포스페이트 농도에 관계 없이 GF 조건의 경우의 gal%보다 높다는 것에 주목한다. 포스페이트는 GF 또는 GF-무함유 조건의 경우의 gal%를 감소시켰다. GF: 성장 인자; GF-무함유: 성장 인자 무함유.
도 16은 클론 G의 경우의 gal%에 대한 성장 인자 및 포스페이트의 효과를 보여준다. 세포를 성장 인자의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도의 포스페이트를 사용하여 배양하였다. GF-무함유 조건의 경우의 gal%는 포스페이트 농도가 1.1 g/L 미만일 때 GF 조건의 경우의 gal%보다 높다는 것에 주목한다. 0.5에서 1.1 g/L로 증가된 포스페이트는 GF-무함유 조건의 경우의 gal%를 상승시켰고; 유사하게, 0.5에서 1.4 g/L로 증가된 포스페이트는 GF 조건의 경우에 보다 높은 gal%로 이어졌다. GF: 성장 인자; GF-무함유: 성장 인자 무함유.
도 17은 성장 인자 (1 mg/L 인슐린)의 존재 하에 배양된 클론 B가 그의 부재 하의 배양물과 비교하여 보다 낮은 SA%를 발생시킨다는 것을 보여준다. GF: 성장 인자; GF-무함유: 성장 인자 무함유
도 18A - 도 18D는 클론 B에 대한 SA%의 통계적 분석을 보여준다. 18A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 SA%의 수준. 18B: 18A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 18C: SA%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 18D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 SA% 수준
도 19는 클론 B의 경우의 SA%에 대한 성장 인자 및 포스페이트의 효과를 보여준다. 세포를 성장 인자의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도의 포스페이트를 사용하여 배양하였다. GF-무함유 조건의 경우의 SA%는 포스페이트 농도에 관계 없이 GF 조건의 경우의 SA%보다 높다는 것에 주목한다. 포스페이트는 GF 또는 GF-무함유 조건 둘 다의 경우에 SA%를 감소시켰다. GF: 성장 인자; GF-무함유: 성장 인자 무함유.
도 20A - 도 20D는 클론 B에 대한 SA%의 통계적 분석을 보여준다. 20A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 SA%의 수준. 20B: 20A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 20C: SA%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 20D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 SA% 수준
도 21A - 도 21D는 클론 G에 대한 man5%의 통계적 분석을 보여준다. 21A: 프로토타입 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 단백질에 대한 man5%의 수준. 21B: 21A에 제시된 데이터를 피팅시키기 위해 생성된 수학적 모델에 대한 통계적 요약. 21C: man5%에 대한 인자의 주요 효과 및 수학적 모델에 혼입된 조항의 목록. 21D: 생성된 모델을 사용한 예측 최대 또는 최소 man5% 수준
도 22는 클론 G의 경우의 man5%에 대한 성장 인자 및 포스페이트의 효과를 보여준다. 세포를 성장 인자의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도의 포스페이트를 사용하여 배양하였다. GF-무함유 조건의 경우의 man5%는 포스페이트 농도에 관계 없이 GF 조건의 경우의 man5%보다 낮다는 것에 주목한다. 포스페이트는 GF 또는 GF-무함유 조건 둘 다의 경우에 man5%를 감소시켰다. GF: 성장 인자; GF-무함유: 성장 인자 무함유.
도 23은 성장 인자 (1 mg/L 인슐린)가 클론 D의 경우에 man5%를 감소시켰음을 보여준다. GF: 성장 인자; GF-무함유: 성장 인자 무함유

본 발명은 성장 인자, 포스페이트, Zn, Fe, 아미노산 (Asp, Asn, Cys, Ser), 지질, 비타민 (B1, B2, B3, B9, B12, Bx), 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 배지 성분의 수준을 변화시킴으로써 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양에서 생산되는 폴리펩티드의 단백질 품질 속성을 조작 및/또는 제어하기 위한 신규 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 바와 같은, 다양한 배지가 본 발명에 포괄된다.

본원에 사용된 용어 "기초 배지" 및 "기초 배지들"은 배양을 시작하기 위해 세포에 첨가되는 출발 배지를 지칭한다. 기초 배지는 성장하는 세포에 영양을 공급하는 영양소를 함유하는 용액이다. 전형적으로, 기초 배지는 세포의 최소한의 성장 및/또는 생존에 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질, 및 미량 원소를 제공한다. 기초 배지는 또한 성장 및/또는 생존을 최소 속도를 초과하여 증진시키는, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 특정한 이온 (예컨대 소듐, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소 (통상적으로 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질 및/또는 글루코스 또는 다른 에너지원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 보충 성분을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 기초 배지는 유리하게는 재조합 폴리펩티드 품질 속성, 예컨대 퍼센트 고분자량 (HMW%), 퍼센트 갈락토스 (Gal%), 퍼센트 시알산 (SA%) 및 퍼센트 만노스 (Man%)를 조작 및/또는 유지하도록 만들어진다. 예시적인 기초 배지 성분을 표 1에 제시한다.

본원에 사용된 용어 "아미노산"은 폴리펩티드의 형성에 통상적으로 사용되는 20종의 자연 발생 아미노산, 그러한 아미노산의 유사체 또는 유도체 중 임의의 것 또는 임의의 비-자연 발생 아미노산을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 아미노산은 세포 배양 배지에 제공된다. 배지에 제공되는 아미노산은 염으로서 또는 수화물 형태로 제공될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "규정된 배지"는 배지의 조성이 공지되었을 뿐만 아니라 제어된 배지를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기초 배지는 규정된 배지이다.

본원에 사용된 용어 "당단백질"은 1개 이상의 공유 연결된 올리고사카라이드 쇄를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 올리고사카라이드 쇄는 단일 당 잔기, 당 잔기의 단일 비분지형 쇄, 또는 1회 이상 분지화된 당 잔기의 쇄로 구성될 수 있다. 올리고사카라이드 쇄는 N-연결 또는 O-연결될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "글리코실화 패턴"은 주어진 당단백질 또는 당단백질들의 관찰되는 글리코실화를 지칭한다. 그의 올리고사카라이드 쇄(들)에 보다 많은 수의 공유 연결된 당 잔기를 갖는 당단백질은 증가된 또는 보다 광범위한 글리코실화 패턴을 갖는 것으로 언급된다. 반대로, 그의 올리고사카라이드 쇄(들)에 보다 적은 수의 공유 연결된 당 잔기를 갖는 당단백질은 감소된 또는 덜 광범위한 글리코실화 패턴을 갖는 것으로 언급된다. 본원에 사용된 용어 "글리코실화 패턴"은 또한 본 발명의 교시에 따라 발현된 개별 당단백질 상의 여러 상이한 글리코실화 패턴의 특징적 분포를 지칭한다. 이러한 의미에서, 증가된 글리코실화 패턴은 발현된 당단백질의 글리코실화 패턴의 특징적 분포에서의 증가를 지칭한다.

본원에 사용된 "재조합적으로 발현된 폴리펩티드" 및 "재조합 폴리펩티드"는 그러한 폴리펩티드를 발현하도록 인간의 손에 의해 조작된 숙주 세포로부터 발현된 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포이다. 특정 실시양태에서, 이러한 조작은 1개 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 발현시키고자 하는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 이종 유전자의 도입에 의해 유전자 변형될 수 있다. 재조합적으로 발현된 이종 폴리펩티드는 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 폴리펩티드와 동일 또는 유사할 수 있다. 재조합적으로 발현된 이종 폴리펩티드는 또한 숙주 세포에 대해 외래일 수 있고, 예를 들어 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 폴리펩티드에 대해 이종일 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합적으로 발현된 이종 폴리펩티드는 키메라이다. 예를 들어, 폴리펩티드의 일부는 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 폴리펩티드와 동일 또는 유사한 아미노산 서열을 함유할 수 있는 한편, 다른 일부는 숙주 세포에 대해 외래인 아미노산 서열을 함유한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 폴리펩티드는 둘 다 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 것인 2개 이상의 상이한 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 둘 다 숙주 세포에 대해 외래인 2개 이상의 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 1개 이상의 내인성 유전자의 활성화 또는 상향조절에 의해 유전자 변형된다. 특정 실시양태에서, 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 항체 단편 (dAb)이다.

배지 성분의 스크리닝

배지 성분은 화학적 화합물에 대한 기능 또는 특성에 기초하여 아미노산, 비타민, 지질, 항산화제, 및 포스페이트로 그룹화된다. 그룹은 이어서 반응 표면 통계적 설계 접근법을 사용하여 실시예 2에 제시된 프로토타입 배지 조건을 생성하는데 사용되는 연구 인자이다. 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 임의의 성장 인자의 부재 하의 프로토타입 배지에서 세포가 배양된다.

표 1 그룹화된 성분, 수준 및 그의 농도 범위 (실시예 2)

HMW%에 영향을 미치는 인자

최종 생성물 내의 응집된 단백질은 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있고 유해한 면역학적 반응의 발생과 연관되어 왔기 때문에, 응집은 생물학적 제조에서의 관심사이다 (Rosenberg AS. Effects of Protein Aggregates: An Immunologic Perspective. AAPS J 2006; 8 (3) E501-7).

하기 표 2는 상이한 클론에 걸친 퍼센트 고분자량 (HMW%)에 대한 단일 인자의 효과를 요약한다.

표 2 HMW%에 대한 단일 인자의 효과

NE: 효과 없음 NM: 측정 불가

성장 인자의 첨가는 일반적으로 HMW%를 증가 (↑)시키는 반면에, 아연의 첨가는 일반적으로 HMW%를 감소 (↓)시킨다. 클론 D에서, 아미노산, 포스페이트 또는 항산화제의 첨가는 HMW%를 증가시켰고 지질 또는 비타민의 첨가는 HMW%를 감소시켰다.

하기 표 3은 연구된 클론 중 3종에서 HMW%에 대한 효과를 갖는 조합 인자를 요약한다. 예측은 상대적 범위에 기초한다: -1은 하부 범위이고, 0은 중간이고, +1은 상부 범위이다. 모든 범위는 배지 제제 중의 성분에 상대적이다.

표 3 HMW%에 대한 조합 인자의 효과

클론 A의 경우에, HMW% 수준은 4.72%의 평균 값으로 최소화될 수 있고, 95% 확률로 HMW%는 4.26 내지 5.18의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 아미노산, 지질 또는 항산화제에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, HMW%는 8.11%만큼 높게 증가될 수 있다.

클론 C의 경우에, HMW% 수준은 4.56%의 평균 값으로 최소화될 수 있고, 95% 확률로 HMW%는 4.07 내지 5.04의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 아미노산 또는 포스페이트에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, HMW%는 6.42%만큼 높게 증가될 수 있다.

클론 D의 경우에, HMW% 수준은 3.85%의 평균 값으로 최소화될 수 있고, 95% 확률로 HMW%는 3.17 내지 4.52의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 아미노산, 지질, 항산화제 또는 비타민에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, HMW%는 11.03%만큼 높게 증가될 수 있다.

하기 표 4는 특정 원료가 클론 A 및 B에서 HMW%에 대해 갖는 효과를 요약한다.

표 4 HMW%에 대한 조합 인자의 효과

클론 A의 경우에, HMW% 수준은 아연, Asn 및 Asp가 각각 1, 1, -1로 제어된 경우에 3.13%의 평균 값으로 최소화될 수 있고, 95% 확률로 HMW%는 2.87 내지 3.39의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, Asn, Asp 또는 아연에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, HMW%는 8.95%만큼 높게 증가될 수 있다.

클론 B의 경우에, HMW% 수준은 아연, FeSO4 및 Asp가 각각 1, 0.04, -1로 제어된 경우에 1.39%의 평균 값으로 최소화될 수 있고, 95% 확률로 HMW%는 0 내지 2.81의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, Asp, 아연 또는 FeSO4에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, HMW%는 7.54%만큼 높게 증가될 수 있다.

글리코실화

글리코실화는 단백질의 가장 흔한 번역후 변형이다. 이는 많은 기능적 단백질을 수반하고 매우 다양한 탄수화물-단백질 결합 및 글리칸 구조를 발생시키는 복잡한 공정이다. 일부 단백질의 글리코실화는 그의 구조, 기능, 안정성 및 혈청 클리어런스율에 큰 영향을 갖고, 이는 모두 효능에 영향을 미친다.

구조적으로, 당단백질은 탄수화물 모이어티에 공유 결합된 폴리펩티드로 이루어진다. 탄수화물은 총 단백질 질량의 1 퍼센트 미만 내지 80 퍼센트 초과를 구성할 수 있다. 글리칸으로서 지칭되는 사카라이드 쇄는 2가지의 주요 방식으로 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 당단백질의 제1 부류는 O-연결된 글리칸이다. 이들은 통상적으로 트레오닌 또는 세린의 O-말단에 글리코시드 결합을 통해 부착된 N-아세틸갈락토사민을 함유한다. 당단백질의 다른 부류는 N-연결된 글리칸이다. 이들은 N-아세틸글루코사민과 아스파라긴 잔기의 N-말단 사이에 글리코시드 결합을 수반한다 (Schulz, Georg E. And R.H. Schirmer. Principles of Protein Structure. Springer-Verlag: New York, 1979. P.228-230).

N-아세틸갈락토사민 또는 N-아세틸글루코사민에는 1개 이상의 만노스 및 갈락토스 잔기가 부착되고, 시알산 잔기는 올리고사카라이드 쇄의 말단 위치를 차지한다.

Gal%에 영향을 미치는 인자

하기 표 5는 상이한 클론에 걸친 퍼센트 갈락토스 (Gal%)에 대한 단일 인자의 효과를 요약한다.

표 5 Gal%에 대한 단일 인자의 효과

NE: 효과 없음 NM: 측정 불가

아미노산, 특히 Asn 또는 성장 인자의 첨가는 일반적으로 Gal%를 감소 (↓)시키는 반면에, 아연, 비타민 및 항산화제의 첨가는 일반적으로 Gal%를 증가 (↑)시킨다. 클론 D에서, 포스페이트, 비타민 또는 항산화제의 첨가는 Gal%를 증가시키고, 지질 또는 성장 인자의 첨가는 Gal%를 감소시킨다.

하기 표 6은 클론 A-D에서 Gal%에 대한 효과를 갖는 조합 인자를 요약한다. 예측은 상대적 범위에 기초한다: -1은 하부 범위이고, 0은 중간이고, +1은 상부 범위이다. 모든 범위는 배지 제제 중의 성분에 상대적이다.

표 6 Gal%에 대한 조합 인자의 효과

클론 A의 경우에, Gal% 수준은 34.14%의 평균 값으로 최대화될 수 있고, 95% 확률로 Gal%는 31.34 내지 36.96%의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 아미노산, 포스페이트 또는 지질에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, Gal%는 6.26%만큼 낮게 감소될 수 있다.

클론 B의 경우에, Gal% 수준은 116.77%의 평균 값으로 최대화될 수 있고, 95% 확률로 Gal%는 113.22 내지 120.33%의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 아미노산 또는 포스페이트에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, Gal%는 103.26%만큼 낮게 감소될 수 있다.

클론 C의 경우에, Gal% 수준은 17.74%의 평균 값으로 최대화될 수 있고, 95% 확률로 Gal%는 16.19 내지 19.29%의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 아미노산 또는 지질에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, Gal%는 8.50%만큼 낮게 감소될 수 있다.

클론 D의 경우에, Gal% 수준은 38.56%의 평균 값으로 최대화될 수 있고, 95% 확률로 Gal%는 36.75 내지 40.37%의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 지질, 항산화제 또는 비타민에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, Gal%는 12.63%만큼 낮게 감소될 수 있다.

하기 표 7은 특정 원료가 클론 A, B 및 F에서 Gal%에 대해 갖는 효과를 요약한다.

표 7 Gal%에 대한 조합 인자의 효과

클론 A의 경우에, Gal% 수준은 아연, Asn 및 FeSO4가 각각 1, -1, -1로 제어된 경우에 22.82%의 평균 값으로 최대화될 수 있고, 95% 확률로 Gal%는 20.51 내지 25.13%의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 아연, Asn, 및 FeSO4에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, Gal%는 4.62%만큼 낮게 감소될 수 있다.

클론 F의 경우에, Gal% 수준은 Asn 및 FeSO4가 각각 -1, 1로 제어된 경우에 20.76%의 평균 값으로 최대화될 수 있고, 95% 확률로 Gal%는 19.64 내지 21.98의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, Asn 및 FeSO4에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, Gal%는 8.562%만큼 낮게 감소될 수 있다.

SA%에 영향을 미치는 인자

하기 표 8은 클론 B에서 퍼센트 시알산 (SA%)에 대한 단일 인자의 효과를 요약한다.

표 8 SA%에 대한 단일 인자의 효과

NE: 효과 없음

아미노산 및 아연의 첨가는 일반적으로 SA%를 증가 (↑)시키는 반면에, 포스페이트, Asp 및 성장 인자의 첨가는 일반적으로 SA%를 감소 (↓)시킨다.

하기 표 9는 클론 B에서 SA%에 대한 효과를 갖는 조합 인자를 요약한다. 예측은 상대적 범위에 기초한다: -1은 하부 범위이고, 0은 중간이고, +1은 상부 범위이다. 모든 범위는 배지 제제 중의 성분에 상대적이다.

표 9 SA%에 대한 조합 인자의 효과

클론 B의 경우에, SA% 수준은 36.74%의 평균 값으로 최대화될 수 있고, 95% 확률로 SA%는 35.70 내지 37.78%의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 아미노산 또는 포스페이트에 대한 수준이 적절하게 설정되지 않으면, SA%는 28.36%만큼 낮게 감소될 수 있다.

하기 표 10은 특정 원료가 클론 B에서 SA%에 대해 갖는 효과를 요약한다.

표 10 SA%에 대한 조합 인자의 효과

클론 B의 경우에, SA% 수준은 Asp가 -1로 제어된 경우에 47.39%의 평균 값으로 최대화될 수 있고, 95% 확률로 SA%는 42.55 내지 52.23%의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, Asp의 수준이 적절하게 설정되지 않으면, SA%는 6.03%만큼 낮게 감소될 수 있다.

Man5%에 영향을 미치는 인자

하기 표 11은 클론 D 및 G에서 퍼센트 만노스 5 (Man5%)에 대한 단일 인자의 효과를 요약한다. 아스파라긴 또는 성장 인자의 첨가는 일반적으로 Man5%를 증가 (↑)시키는 반면에, 포스페이트 또는 아연의 첨가는 일반적으로 Man5%를 감소 (↓)시킨다.

표 11 Man5%에 대한 단일 인자의 효과

NE: 효과 없음

세포, 단백질 및 세포 배양

본 발명의 세포 배양 공정 또는 방법에서, 세포는 다양한 세포 배양 배지, 즉 관련 기술분야에 통상적으로 공지되어 있는 기초 배양 배지에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 방법은 영양소 등이 보충될 수 있는 세포 배양 배지 내에 유지되어 있는 큰 부피의 세포와의 사용을 위해 적용될 수 있다. 전형적으로 "세포 배양 배지" (또한 "배양 배지"로도 불림)는 관련 기술분야의 실무자가 이해하는 용어이고, 세포, 바람직하게는 동물 또는 포유동물 세포가 성장하고, 일반적으로 하기로부터의 적어도 1종 이상의 성분이 제공된 영양소 용액을 지칭하는 것으로 공지된다: 에너지원 (통상적으로 탄수화물, 예컨대 글루코스 형태); 모든 필수 아미노산, 및 일반적으로 20종의 염기성 아미노산, 플러스 시스테인; 전형적으로 저농도로 요구되는 비타민 및/또는 다른 유기 화합물; 지질 또는 유리 지방산, 예를 들어, 리놀레산; 및 전형적으로 매우 저농도로, 통상적으로 마이크로몰 범위로 요구되는 미량 원소, 예를 들어, 무기 화합물 또는 자연 발생 원소. 세포 배양 배지는 또한 다양한 임의적인 성분, 예컨대 호르몬 및 다른 성장 인자, 예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 혈청 등; 염, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트, 및 완충제, 예를 들어, HEPES; 뉴클레오시드 및 염기, 예를 들어, 아데노신, 티미딘, 하이포크산틴; 및 단백질 및 조직 가수분해물, 예를 들어, 가수분해된 동물 단백질 (동물 부산물, 정제된 젤라틴 또는 식물 물질로부터 수득될 수 있는 펩톤 또는 펩톤 혼합물); 항생제, 예를 들어, 겐타마이신; 및 세포 보호제, 예를 들어, 플루로닉(Pluronic) 폴리올 (플루로닉 F68)을 함유하도록 보충될 수 있다. 혈청-무함유 및 동물 기원의 생성물 또는 원료 무함유이고 화학적으로 규정된 세포 영양 배지가 바람직하다.

실무자가 인지하는 바와 같이, 동물 또는 포유동물 세포는 특정한 세포가 배양되기에 적합한 배지에서 배양되고, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 과도한 실험 없이 결정할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지가 사용될 수 있고, 예를 들어, 최소 필수 배지 (MEM, 시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스); 햄(Ham) F10 배지 (시그마); 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 시그마); RPMI-1640 배지 (시그마); 하이클론 세포 배양 배지 (하이클론(HyClone), 유타주 로간); 및 특정한 세포 유형을 위해 제제화된 화학적으로 규정된 (CD) 배지를 포함할 수 있다. 상기 예시적인 배지에, 필요에 따라 또는 목적하는 바에 따라, 상용 기술을 사용하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 알고 있고 실시할 바와 같이, 임의적인 성분을 포함한 상기-기재된 보충 성분 또는 원료를 적절한 농도 또는 양으로 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 적합한 세포 배양 조건은 세포의 회분식, 유가식, 또는 연속 배양에 전형적으로 사용되고 그에 대해 공지되어 있는 것이며, 온도 (약 30℃ 내지 37℃)에 더하여 pH (예를 들어, 약 6.5 내지 약 7.5), 용존 산소 (O₂) (예를 들어, 공기 포화의 약 5-90% 사이), 이산화탄소 (CO₂) (예를 들어, 약 10-150mmHg 사이), 교반 (약 50 내지 200 rpm) 및 습도가 주목된다. 예시적이지만 비제한적인 예로서, 본 발명의 유가식 공정에 적합한 세포 배양 배지는 화학적으로 규정된 기초 및 공급 배지를 포함하며, 바람직하게는 하나 또는 둘 다가 본 발명의 항산화제를 함유한다 (예를 들어, 실시예 1).

동물 세포, 포유동물 세포, 배양된 세포, 동물 또는 포유동물 숙주 세포, 숙주 세포, 재조합 세포, 재조합 숙주 세포 등은 모두 본 발명의 공정에 따라 배양될 수 있는 세포에 대한 용어이다. 이러한 세포는 전형적으로 포유동물로부터 수득되거나 유래된 세포주이고, 적절한 영양소 및/또는 성장 인자를 함유하는 배지 내에 단층 배양물 또는 현탁 배양물로 놓일 때 성장하고 생존할 수 있다. 특정한 세포 배양물의 성장 및 유지를 위해 필요한 성장 인자 및 영양소는, 예를 들어, 문헌 [Barnes and Sato, (1980, Cell, 22:649); Mammalian Cell Culture, Ed. J.P. Mather, Plenum Press, NY, 1984]; 및 미국 특허 번호 5,721,121에 기재된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자가 실험적으로 용이하게 결정할 수 있다.

수많은 유형의 세포가 본 발명의 방법에 따라 배양될 수 있다. 세포는 전형적으로, 다량의 특정한 단백질을 발현하고 배양 배지 내로 분비할 수 있거나 또는 이를 발현하고 분비하도록 분자 조작될 수 있는, 동물 또는 포유동물 세포이다. 숙주 세포에 의해 생산된 단백질은 숙주 세포에 대해 내인성 또는 동종일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 대안적으로 및 바람직하게는, 단백질은 숙주 세포에 대해 이종, 즉 외래이고, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포에 의해 인간 단백질이 생산되고 분비된다.

본 발명의 방법에 의해 유리하게 생산될 수 있는 포유동물 단백질의 예는, 비제한적으로, 융합 또는 키메라 단백질을 포함한 시토카인, 시토카인 수용체, 성장 인자 (예를 들어, EGF, HER-2, FGF-α, FGF-β, TGF-α, TGF-β, PDGF. IGF-1, IGF-2, NGF, NGF-β); 성장 인자 수용체를 포함한다. 다른 비제한적 예는 성장 호르몬 (예를 들어, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬); 인슐린 (예를 들어, 인슐린 A 쇄 및 인슐린 B 쇄), 프로인슐린; 에리트로포이에틴 (EPO); 콜로니 자극 인자 (예를 들어, G-CSF, GM-CSF, M-CSF); 인터류킨 (예를 들어, IL-1 내지 IL-12); 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 그의 수용체 (VEGF-R); 인터페론 (예를 들어, IFN-α, β, 또는 γ); 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α 및 TNF-β) 및 그의 수용체, TNFR-1 및 TNFR-2; 트롬보포이에틴 (TPO); 트롬빈; 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP); 응고 인자 (예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자 등); 항-응고 인자; 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA), 예를 들어, 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직 유형 TPA; 여포 자극 호르몬 (FSH); 황체형성 호르몬 (LH); 칼시토닌; CD 단백질 (예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19 등); CTLA 단백질 (예를 들어, CTLA4); T-세포 및 B-세포 수용체 단백질; 골 형태발생 단백질 (BNP, 예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3 등); 신경영양 인자, 예를 들어, 골 유래 신경영양 인자 (BDNF); 뉴로트로핀, 예를 들어, 3-6; 레닌; 류마티스 인자; RANTES; 알부민; 렐락신; 대식세포 억제 단백질 (예를 들어, MIP-1, MIP-2); 바이러스 단백질 또는 항원; 표면 막 단백질; 이온 채널 단백질; 효소; 조절 단백질; 항체; 면역조정 단백질 (예를 들어, HLA, MHC, B7 패밀리); 귀소 수용체; 수송 단백질; 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD); G-단백질 커플링된 수용체 단백질 (GPCR); 신경조정 단백질; 알츠하이머병 연관 단백질 및 펩티드 (예를 들어, A-베타) 및 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 다른 것을 포함한다. 융합 단백질 및 폴리펩티드, 키메라 단백질 및 폴리펩티드, 뿐만 아니라 상기 단백질 및 폴리펩티드 중 임의의 것의 단편 또는 부분, 또는 돌연변이체, 변이체 또는 유사체가 또한 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있는 적합한 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드에 포함된다.

후속 단리 및/또는 정제를 위해 단백질을 보유, 발현 및 생산하기에 적합한 동물 또는 포유동물 숙주 세포의 비제한적 예는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), 예컨대 CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909; 및 WO 01/92337 A2), 디히드로폴레이트 리덕타제 음성 CHO 세포 (CHO/-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), 및 dp12.CHO 세포 (미국 특허 번호 5,721,121)를 포함한다. CHO 세포, 특히, DHFR 또는 GS 유전자 발현 시스템으로 확립된 재조합 CHO 세포주가 바람직하다.

본 발명의 방법 및 공정에서 배양하는데 적합한 세포는 배양 공정에서의 발현 및 생산을 위한 단백질을 코딩하는 코딩 서열 또는 그의 부분을 보유하는, 도입된 (예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염 또는 주사를 통함) 발현 벡터 (구축물), 예컨대 플라스미드 등을 함유할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 잘 알고 있고 실시하는 방법을 사용하여, 생산되는 단백질 및 폴리펩티드를 코딩하는 서열 뿐만 아니라 적절한 전사 및 번역 제어 요소를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 문헌 [J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. 및 F.M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 기재되어 있다.

제어 요소 또는 조절 서열은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역 영역 (예를 들어, 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역)이다. 이러한 요소는 그의 힘 및 특이성 면에서 다를 수 있다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주 세포에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터를 포함한 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 포유동물 세포계에서, 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터가 바람직하다. 단백질 발현 시스템에 사용하기 위한 구축물은 적어도 1개의 프로모터, 인핸서 서열 (임의적, 포유동물 발현 시스템의 경우), 및 적절한 전사 및 유전자 발현의 조절에 필요하거나 요구되는 다른 서열 (예를 들어, 전사 개시 및 종결 서열, 복제 기점 부위, 폴리아데닐화 서열, 예를 들어, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리 A 서열)을 함유하도록 설계된다.

관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 진핵 발현 시스템에서 생산되는 단백질의 적절한 전사, 발현, 및 단리를 위한 적절한 벡터, 성분의 선택은 공지되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 상용적으로 결정되고 실시된다. 본 발명의 방법에 따라 배양된 세포에 의한 단백질의 발현은 프로모터 예컨대 바이러스 프로모터, 예를 들어, 시토메갈로바이러스 (CMV), 라우스 육종 바이러스 (RSV), 포스포글리세롤 키나제 (PGK), 티미딘 키나제 (TK), 또는 α-액틴 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다. 또한, 조절된 프로모터는 특정한 화합물 또는 분자에 의한 유도성을 부여하고, 예를 들어, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV)의 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)는 글루코코르티코이드에 의해 유도된다 (V. Chandler et al., 1983, Cell, 33:489-499). 또한, 조직-특이적 프로모터 또는 조절 요소가 필요에 따라 또는 목적하는 바에 따라 사용될 수 있다 (G. Swift et al., 1984, Cell, 38:639-646).

발현 구축물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 유전자 전달 방법, 예를 들어, 통상적인 유전자 형질감염 방법, 예컨대 인산칼슘 공동-침전, 리포솜 형질감염, 미세주사, 전기천공, 및 감염 또는 바이러스 형질도입에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 방법은 관련 기술분야의 숙련된 실무자의 지식 내에서 선택된다. 세포에서의 발현을 위한 DNA 서열을 보유하는 1종 이상의 구축물로 세포를 형질감염시킬 수 있고 후속해서 발현 생성물이 세포에서 생산되고/거나 그로부터 수득된다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

특정한 측면에서, 적절한 제어 및 조절 서열을 함유하는 포유동물 발현 시스템이 본 발명의 단백질 발현 포유동물 세포에서의 사용을 위해 바람직하다. 포유동물 발현 벡터를 생성하기 위해 통상적으로 사용되는 진핵 제어 서열은 포유동물 세포와 상용성인 프로모터 및 제어 서열 예컨대, 예를 들어, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (CDM8 벡터) 및 조류 육종 바이러스 (ASV) πLN 벡터를 포함한다. 다른 통상적으로 사용되는 프로모터는 원숭이 바이러스 40 (SV40)으로부터의 초기 및 후기 프로모터 (Fiers et al., 1973, Nature, 273:113) 또는 다른 바이러스 프로모터 예컨대 폴리오마, 아데노바이러스 2, 및 소 유두종 바이러스로부터 유래된 것을 포함한다. 유도성 프로모터, 예컨대 hMTII (Karin et al., 1982, Nature, 299:797-802)이 또한 사용될 수 있다.

진핵 숙주 세포에 적합한 발현 벡터의 예는 포유동물 숙주 세포용 벡터 (예를 들어, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (마니아티스(Maniatis)); pIRES (클론테크(Clontech)); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)); pVPakc 벡터, pCMV 벡터, pSG5 벡터 (스트라타진(Stratagene)), 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, pFB 벡터 (스트라타진)), pcDNA-3 (인비트로젠(Invitrogen)), 아데노바이러스 벡터; 아데노-연관 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 효모 벡터 (예를 들어, pESC 벡터 (스트라타진)), 또는 상기 중 임의의 것의 변형된 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 또한 유전자 발현을 최적화하기 위해 프로모터 영역 서열의 상류 또는 하류에 인핸서 서열을 함유할 수 있다.

적절한 선택 배지에서 그의 선택이 가능하도록, 벡터를 보유하는 (바람직하게는, 안정하게 통합된) 세포에 저항성을 부여하기 위해 재조합 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 내에 선택 마커가 또한 사용될 수 있다. 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV TK) (Wigler et al., 1977, Cell, 11:223), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HGPRT), (Szybalska and Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al., 1980, Cell, 22:817) 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 선택 시스템이 사용될 수 있고, 이는 각각 tk-, hgprt-, 또는 aprt- 세포 (APRT)에서 사용될 수 있다.

하기 비제한적인 마커 유전자의 예에 대한 선택의 기초로서 항대사물 저항성이 또한 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357; 및 O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527); 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072); 아미노글리코시드 G418에 대한 저항성을 부여하는 neo (Clinical Pharmacy, 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-21; May, 1993, TIB TECH, 11(5):155-215; 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro (Santerre et al., 1984, Gene, 30:147). 목적하는 재조합 세포 클론을 선택하기 위해 재조합 DNA 기술 분야에 통상적으로 공지되어 있는 방법이 상용적으로 적용될 수 있고, 이러한 방법은, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981. J. Mol. Biol., 150:1]에 기재되어 있다.

또한, 발현된 단백질 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다 (검토를 위해 문헌 [Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987] 참조). 단백질을 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우에, 숙주 세포 배양물 내에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 단백질-코딩 유전자와 연관되기 때문에, 단백질의 생산이 수반되어 증가할 것이다 (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257).

선택 마커로서 글루타민 신타제 (GS) 또는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 코딩 핵산을 보유하는 벡터는 각각 약물 메티오닌 술폭시민 또는 메토트렉세이트의 존재 하에 증폭될 수 있다. 글루타민 신타제 기반 벡터의 이점은 글루타민 신타제 음성인 세포주 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포주, NSO)의 이용가능성이다. 글루타민 신타제 발현 시스템은 내인성 유전자의 기능을 방지하기 위해 추가의 억제제를 제공함으로써 글루타민 신타제 발현 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 또한 기능할 수 있다.

선택 마커로서 DHFR을 발현하는 벡터는 pSV2-dhfr 플라스미드 (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854 (1981)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 선택 마커로서 글루타민 신타제를 발현하는 벡터는 문헌 [Stephens and Cockett, 1989, Nucl. Acids. Res., 17:7110]에 기재된 pEE6 발현 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 글루타민 신타제 발현 시스템 및 그의 성분은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개: W087/04462; W086/05807; W089/01036; W089/10404; 및 W091/06657에 상술되어 있다. 또한, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 글루타민 신타제 발현 벡터는 예를 들어 론자 바이올로직스, 인크.(Lonza Biologics, Inc.) (뉴햄프셔주 포츠머스)를 포함한 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다.

세포 배양의 유형

이해의 목적이지만 비제한적으로, 숙련된 실무자는 단백질 생산을 위한 세포 배양 및 배양 실행이 3가지 일반적 유형; 즉, 연속 배양, 회분식 배양 및 유가식 배양을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 연속 배양에서, 예를 들어, 오래된 배양 배지가 매일 제거되는 한편 신선한 배양 배지 보충물 (즉, 공급 배지)은 배양 기간 동안 세포에 제공되고, 생성물은 예를 들어 매일 또는 연속적으로 수거된다. 연속 배양에서, 공급 배지는 매일 첨가될 수 있고 연속적으로, 즉 적하 또는 주입으로서 첨가될 수 있다. 연속 배양을 위해, 세포가 여전히 살아있고 환경 및 배양 조건이 유지되는 한, 세포는 목적하는 것만큼 오래 배양물 중에 유지될 수 있다.

회분식 배양에서, 세포는 초기에 배지에서 배양되고 이 배지는 제거되거나, 대체되거나, 보충되지 않으며, 즉, 배양 실행 동안 또는 그의 종료 전에 세포에 새로운 배지가 "공급"되지 않는다. 목적하는 생성물은 배양 실행의 종료 시 수거된다.

유가식 배양의 경우에, 배양 실행 시간은 실행 동안 배양 배지에 신선한 배지를 매일 1회 이상 (또는 연속적으로) 보충하는 것에 의해 증가되고, 즉, 배양 기간 동안 세포에 새로운 배지 ("공급 배지")가 "공급'된다. 유가식 배양은 다양한 공급 방식 및 횟수, 예를 들어, 매일, 격일, 2일마다 등, 1일에 1회 초과 또는 1일에 1회 미만 등을 포함할 수 있다. 또한, 유가식 배양물에 공급 배지가 연속 공급될 수 있다. 이어서 목적하는 생성물은 배양/생산 실행의 종료 시 수거된다.

CHO 클론

MDX1100 (클론 A)

또 다른 실시양태에서, CHO-K1 세포는 인간 IgG4 항체를 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위해 GS 유전자 발현 시스템으로 형질감염된다.

항체를 발현하는 형질감염 및 클로닝된 세포는 본 발명의 방법에 따라 배지에서 가변 농도의 시험되는 인자의 존재 하에 성장된다. [실시예 2 내지 5 참조]

클론 A에 의해 생산되는 항체는 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 2005/0191293에 기재되어 있다.

미오스타틴 (클론 G)

또 다른 실시양태에서, dhfr- 음성 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 DG44는 재조합 인간 융합 단백질을 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위해 형질감염된다.

융합 단백질을 발현하는 형질감염 및 클로닝된 CHO DG44 세포는 본 발명의 방법에 따라 배지에서 가변 농도의 시험되는 인자의 존재 하에 성장된다. [실시예 2 내지 5 참조]

클론 G에 의해 생산되는 융합 단백질은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 8, 933,199에 기재되어 있다.

aCD40L (클론 B)

또 다른 실시양태에서, dhfr- 음성 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 DG44는 재조합 인간 융합 단백질을 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위해 형질감염된다.

항체를 발현하는 형질감염 및 클로닝된 CHO DG44 세포는 본 발명의 방법에 따라 배지에서 가변 농도의 시험되는 인자의 존재 하에 성장된다. [실시예 2 내지 5 참조]

클론 B에 의해 생산되는 항체는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 8,895,010에 기재되어 있다.

aLag 3 (클론 C)

또 다른 실시양태에서, dhfr- 음성 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 DG44는 인간 IgG4 항체를 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위해 형질감염된다.

항체를 발현하는 형질감염 및 클로닝된 CHO DG44 세포는 본 발명의 방법에 따라 배지에서 가변 농도의 시험되는 인자의 존재 하에 성장된다. [실시예 2 내지 5 참조]

클론 C에 의해 생산된 항체는 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 WO2014/008218에 기재되어 있다.

MDX1110 (클론 D)

또 다른 실시양태에서, dhfr- 음성 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 CHO- Ms704는 인간 IgG4 항체를 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위해 형질감염된다.

항체를 발현하는 형질감염 및 클로닝된 세포는 본 발명의 방법에 따라 배지에서 가변 농도의 시험되는 인자의 존재 하에 성장된다. [실시예 2 내지 5 참조]

클론 D에 의해 생산된 항체는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 8,383,118에 기재되어 있다.

aKir (클론 F)

또 다른 실시양태에서, CHO-K1 세포는 인간 IgG4 항체를 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위해 GS 유전자 발현 시스템으로 형질감염된다.

항체를 발현하는 형질감염 및 클로닝된 세포는 본 발명의 방법에 따라 배지에서 가변 농도의 시험되는 인자의 존재 하에 성장된다. [실시예 2 내지 5 참조]

클론 F에 의해 생산된 항체는 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 WO2008/084106에 기재되어 있다.

제약 제제

특정 실시양태에서, 생산되는 폴리펩티드는 제약 활성을 가질 것이고, 약제의 제조에 유용할 것이다. 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 조성물은 대상체에게 투여될 수 있거나, 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 경구, 협측, 설하, 비강, 기관지, 안구, 경피 (국소), 경점막, 직장, 및 질 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 이용가능한 경로에 의한 전달을 위해 먼저 제제화될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 전형적으로 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드, 제약상 허용되는 담체와 조합된 전달 작용제를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여와 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충적 활성 화합물이 또한 본 발명의 조성물에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 생산된 폴리펩티드는 전신 약물요법을 위한 약물, 예컨대 독소, 저분자량 세포독성 약물, 생물학적 반응 조절제, 및 방사성핵종에 접합될 수 있다 (예를 들어, Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, US20040082764 A1 참조). 본 발명에 따른 제약 조성물을 제조하는데 유용한 추가의 원료는, 예를 들어, 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁화제, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 결합제, 정제-붕해제, 캡슐화 물질, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투-조절제, 또는 그의 조합을 포함한다.

대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명에 따라 생산된 폴리펩티드는 1종 이상의 추가의 제약 활성제와 조합되어 (동시에 또는 순차적으로) 투여될 수 있다. 이들 제약 활성제의 예시적인 목록은 문헌 [Physicians' Desk Reference, 55 Edition, published by Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J., 2001]에서 찾아볼 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이들 열거된 많은 작용제에 대한 제약상 유효한 투여량 및 요법은 관련 기술분야에 공지되어 있고; 다수가 문헌 [Physicians' Desk Reference] 그 자체에 제시되어 있다.

고체 제약 조성물은 1종 이상의 고체 담체를 함유할 수 있고, 임의로 1종 이상의 다른 첨가제 예컨대 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁화제, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 결합제 또는 정제-붕해제 또는 캡슐화 물질을 함유할 수 있다. 적합한 고체 담체는, 예를 들어 인산칼슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저융점 왁스 또는 이온 교환 수지 또는 그의 조합을 포함한다. 분말 제약 조성물에서, 담체는 미분된 활성 원료와 혼합된 미분된 고체일 수 있다. 정제에서, 활성 원료는 일반적으로, 필요한 압축 특성을 갖는 담체와 적합한 비율로, 및 임의로, 다른 첨가제와 혼합되고, 목적하는 형상 및 크기로 압축된다.

액체 제약 조성물은 본 발명에 따라 발현된 폴리펩티드, 및 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르 또는 가압된 조성물을 형성하기 위한 1종 이상의 액체 담체를 함유할 수 있다. 제약상 허용되는 액체 담체는, 예를 들어 물, 유기 용매, 제약상 허용되는 오일 또는 지방, 또는 그의 조합을 포함한다. 액체 담체는 다른 적합한 제약 첨가제 예컨대 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 향미제, 현탁화제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투-조절제, 또는 그의 조합을 함유할 수 있다. 액체 제제가 소아과 용도로 의도되는 경우에, 일반적으로 알콜의 함유를 피하거나 그의 양을 제한하는 것이 바람직하다.

경구 또는 비경구 투여에 적합한 액체 담체의 예는 물 (임의로 첨가제 예컨대 셀룰로스 유도체 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 함유), 알콜 또는 그의 유도체 (1가 알콜 또는 다가 알콜 예컨대 글리콜 포함) 또는 오일 (예를 들어, 분별화 코코넛 오일 및 아라키스 오일)을 포함한다. 비경구 투여를 위해 담체는 또한 유성 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 가압된 조성물을 위한 액체 담체는 할로겐화 탄화수소 또는 다른 제약상 허용되는 추진제일 수 있다.

멸균 용액 또는 현탁액인 액체 제약 조성물은 비경구로, 예를 들어, 근육내, 복강내, 경막외, 척수강내, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 경구 또는 경점막 투여를 위한 제약 조성물은 액체 또는 고체 조성물 형태일 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 그의 의도되는 투여 경로와 상용성이도록 제제화된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨에 의해 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 시린지 또는 다중 용량 바이알 내에 봉입될 수 있다.

주사가능한 용도에 적합한 제약 조성물은 전형적으로 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정박테리아 수, 크레모포르 EL(Cremophor EL).TM. (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균이어야 하고, 용이한 시린지성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 유리하게는, 특정 제약 제제는 제조 및 저장 조건 하에 안정하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 일반적으로, 적절한 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 특정 경우에, 조성물에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 유용할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 필요량의 정제된 폴리펩티드를 상기 열거된 원료 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 다음, 필요에 따라 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드를, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 원료를 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 유리한 제조 방법은 활성 원료 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 원료의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조이다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료적 투여의 목적상, 정제된 폴리펩티드는 부형제와 혼입될 수 있고, 정제, 트로키 또는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 경구 조성물은 예를 들어 구강세정제로서의 사용을 위해 유동 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 제약상 상용성인 결합제 및/또는 아주반트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 하기 원료 중 임의의 것 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로텍스; 활택제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제. 이러한 제제는 바람직한 경우에, 예를 들어 소아, 정제를 삼키는 능력이 손상된 개체, 또는 동물에 대한 투여를 용이하게 하기 위해, 혼합된 저작성 또는 액체 제제 또는 식품 물질 또는 액체일 수 있다. 경구 전달을 위한 제제는 유리하게는 위장관 내 안정성을 개선시키고/거나 흡수를 증진시키기 위한 작용제와 혼입될 수 있다.

대안적으로, 화합물은 좌제 또는 페사리 형태로 투여될 수 있거나, 또는 겔, 히드로겔, 로션 또는 다른 글리세리드, 용액, 크림, 연고 또는 산포제 형태로 국소로 적용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드가 신체에서 신속하게 제거되는 것으로부터 보호할 담체와 함께, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조된다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 즉시, 지연, 변형, 지속, 펄스, 또는 제어-방출 전달을 위해 제제화될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 적합한 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액 (바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포에 대해 표적화된 리포솜 포함)이 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같은, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 단위 투여 형태, 예컨대 정제 또는 캡슐로 제공된다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일화를 위해 경구 또는 비경구 조성물을 단위 투여 형태로 제제화하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 형태에서, 조성물은 폴리펩티드의 적절한 양을 함유하는 단위 용량으로 세분된다. 단위 투여 형태는 포장된 조성물, 예를 들어 패킷된 분말, 바이알, 앰플, 사전-충전된 시린지 또는 액체 함유 사쉐일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 치료상 유효한 단위 투여량은 예를 들어 투여 방법, 폴리펩티드의 효력, 및/또는 수용자의 체중 및 제약 조성물 중 다른 성분의 아이덴티티를 포함한 여러 인자에 좌우될 것이다.

본 발명에 따라 발현된 폴리펩티드는 필요에 따라 다양한 간격으로 상이한 기간에 걸쳐, 예를 들어 매일, 매주, 격주, 매월 등으로 투여될 수 있다. 통상의 기술자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 전반적 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 인자가, 대상체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 사용한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 적절한 용량은 폴리펩티드의 효력에 좌우될 수 있고, 임의로 특정한 수용자에 대해서는 예를 들어 사전 선택된 목적하는 반응이 달성될 때까지 증가하는 용량의 투여를 통해 조정될 수 있다는 것이 추가로 이해된다. 임의의 특정한 동물 대상체에 대한 구체적 용량 수준은 사용되는 구체적 폴리펩티드의 활성, 대상체의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 임의의 약물 조합물, 및 조정하고자 하는 발현 또는 활성의 정도를 포함한 다양한 인자에 좌우될 수 있다는 것이 이해된다.

본 발명의 제약 조성물은 투여에 대한 지침서와 함께, 용기, 팩 또는 분배기 내에 포함될 수 있다.

실시예 1

실험 절차: 하나의 바이알의 동결 세포를 성장 인자의 존재 또는 부재 하의 BMS 독점 기초 배지 17I 내로 해동시키고 (각각의 개별 실험에 대한 세부사항 참조) 3 계대 동안 배양하였다. 이어서 세포를 증가 또는 감소된 농도의 영양소 성분을 사용한 상이한 처리에 의해 변형된 17I 프로토타입 배지로 옮겼다 (각각의 개별 실험에 대한 세부사항 참조). 프로토타입 배지의 성능을 평가하기 위해 회분식 배양을 설정하기 전 3 계대 동안 세포를 프로토타입 배지에 적응시켰다. 유가식 배양 12일 째에, 상청액 샘플을 수거하고, proA 크로마토그래피 칼럼에 의해 정제하였다. 이어서 정제된 단백질 샘플을 단백질 품질 속성 분석에 적용시켰다 (도 1 참조).

세포 배양 파라미터: 세포를 25 mm 사정 거리를 갖는 오비탈 진탕기 상에서, 50 ml 스핀 튜브에서 초기 부피 25 ml 및 진탕 속도 300 rpm으로, 또는 500 ml 진탕기 플라스크에서 초기 부피 150 ml 및 진탕 속도 150 rpm으로 배양하였다. 배양 동안 온도를 37℃로 제어하고, CO2는 6%로 제어하였다. 세포를 실험 2의 경우에 스핀 튜브에서 배양하고, 나머지 실험의 경우에는 진탕기 플라스크에서 배양하였다.

고분자량 분석: 고분자량 종을 도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) TSK겔 슈퍼SW3000 칼럼 및 슈퍼SW 가드 칼럼을 갖는 크기 배제 HPLC, 및 수성 완충 이동상을 사용하여 분석하였다.

글리코실화 프로파일 분석: LC-MS에 의한 무손상 질량 분석을 사용하여 단백질 샘플의 글리코실화 프로파일을 비교하였다. 약 0.5 μg의 각각의 단백질 샘플을 20% (v/v) 아세토니트릴 중 0.1% 포름산에 의해 평형화된 포로스(Poros) 역상 2.1 x 100 mm 칼럼 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티) 상에 로딩하고, 25분 내에 0.1% 포름산 함유 20%에서 50% 아세토니트릴의 구배 용리에 의해 0.25 mL/분의 유량으로 분리하였다. 온라인 검출을 위해 용리액을 Q-ToF 울티마(Ultima) 질량 분광계 (워터스(Waters), 매사추세츠주 밀포드) 내로 전기분무하였다. 질량 스펙트럼을 합하고, MaxEnt1 알고리즘 (워터스, 매사추세츠주 밀포드)를 사용하여 디콘볼루션하였다. 피크를 100 ppm 질량 정확도로 할당하였다.

통계적 분석: 맞춤화된 인자 (각각의 인자에 대해 연구된 수준에 따른 부분 또는 반응 표면) 실험 설계 (DOE)를 사용하여 통계 소프트웨어 JMP® 10.0.0 (SAS 인스티튜트 인크.(SAS Institute Inc.))을 사용하는 실행 조건을 생성하였다. 각각의 반응 (예를 들어, HMW%, Gal% 등)을 최소 AICc, 최소 BIC, 또는 p-값 역치 정지 규칙을 갖는 단계적 회귀 방법을 사용하여 분석하였다. 오직 p-값이 0.05 미만인 경우만이 표준 최소 제곱 방법으로 수학적 모델을 생성하기 위해 선택된 조항이었다. 이어서 모델을 사용하여 반응에 대한 인자의 영향을 분석하고, 각각의 반응에 대한 최대 또는 최소 값을 예측하였다.

실시예 2

기초 배지 17I를 표 1에 열거된 성분으로 변형시켰다. 지질 그룹을 제외하고, 각각의 성분에 대한 농도를 17I 중의 성분에 대한 기존 농도에 대한 백분율 증가 또는 감소로서 나타내었다. 지질 그룹에 대한 구체적 성분 및 농도는 하이클론이 독점한다. 변형된 성분을 화학적 화합물에 대한 기능 또는 특성에 기초하여 아미노산, 비타민, 지질, 항산화제 및 포스페이트로 그룹화하였다. 그룹은 이어서 반응 표면 통계적 설계 접근법을 사용하여 표 12에 제시된 프로토타입 배지 조건을 생성하는데 사용된 연구 인자였다. 상기 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 임의의 성장 인자의 부재 하의 프로토타입 배지에서 세포를 배양하였다. 또한, 세포를 성장 인자 (1 mg/L 인슐린)의 존재 하의 프로토타입 배지 #9에서 또한 배양하고, 이를 대조군으로서 제공하여 단백질 품질 속성에 대한 성장 인자의 영향을 비교하였다.

표 12

실시예 3

실험 설명: 상기 실시예 1에 기재된 세포 배양 프로토콜에 따라, 세포를 하기 표 13에 기재된 바와 같이 성장 인자 (1 mg/L 인슐린)의 존재 또는 부재 하의 0.5 내지 1.4 g/L 범위의 상이한 포스페이트 농도를 갖는 17I에서 배양하였다.

표 13

실시예 4

실험 설명: 본 실험을 위한 초기 배지는 수준 "+1"의 추가의 아미노산, 항산화제, 및 포스페이트가 존재하는 기초 배지 17I였다 (표 1 참조). 이어서 배지를 하기 표 14에 열거된 단일 성분 또는 성분 그룹에 대해 변형시켰다.

표 14

그룹은 이어서 맞춤화된 통계적 실험 설계 (DoE) 접근법을 사용하여 표 15에 제시된 프로토타입 배지 조건을 생성하는데 사용된 연구 인자였다. 상기 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 임의의 성장 인자의 부재 하의 프로토타입 배지에서 세포를 배양하였다.

표 15

E: EDTA; 없음: Fe 담체 부재; IC1 & IC2: 농도 1 & 2의 하이클론 독점의 철 담체

실시예 5

실험 설명: 본 실험을 위한 초기 배지는 수준 "+1"의 추가의 아미노산, 항산화제 및 포스페이트가 존재하는 기초 배지 17I였다 (표 1 참조). 이어서 배지를 하기 표 16에 열거된 단일 성분 또는 성분 그룹에 대해 변형시켰다.

표 16

그룹은 이어서 맞춤화된 통계적 실험 설계 (DoE) 접근법을 사용하여 표 17에 제시된 프로토타입 배지 조건을 생성하는데 사용된 연구 인자였다. 상기 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 임의의 성장 인자의 부재 하의 프로토타입 배지에서 세포를 배양하였다. E: EDTA; 없음: Fe 담체 부재; IC1: 하이클론 독점의 철 담체; SC: 시트르산 나트륨.

표 17

Claims (8)

1. 세포 배양 배지 내의 아스파라긴, 아스파르트산, 아연 및 철 중 1종 이상의 양을 조정하는 것을 포함하는, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되는 재조합 당단백질의 단백질 품질 속성을 제어하는 방법이며, 여기서 단백질 품질 속성은 당단백질 응집의 감소인 방법.
2. 세포 배양 배지 내의 아스파르트산, 포스페이트 및 아연 중 1종 이상의 양을 조정하는 것을 포함하는, CHO 세포에서 발현되는 재조합 당단백질의 단백질 품질 속성을 제어하는 방법이며, 여기서 단백질 품질 속성은 당단백질의 시알산 함량의 증가인 방법.
3. 세포 배양 배지 내의 1종 이상의 아스파라긴, 아연 및 철의 양을 조정하는 것을 포함하는, CHO 세포에서 발현되는 재조합 당단백질의 단백질 품질 속성을 제어하는 방법이며, 여기서 단백질 품질 속성은 당단백질의 갈락토스 함량의 증가인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 화학적으로 규정된 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 화학적으로 규정된 세포 배양 배지가 기초 배지인 방법.
6. 제5항에 있어서, 화학적으로 규정된 기초 배지가 첨가된 혈청 또는 가수분해물을 함유하지 않는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 화학적으로 규정된 기초 배지가 단백질-무함유인 방법.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질이 재조합 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질인 방법.

Images