KR20140031375A

KR20140031375A - 포유동물 세포 배양

Info

Publication number: KR20140031375A
Application number: KR1020147001985A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 디. 폴스태드; 레베카 이. 맥코이; 아르비아 이. 모리스
Original assignee: 암젠 인크
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2014-03-12
Also published as: JP5897708B2; KR101662412B1; AU2018203972A1; WO2013006479A3; KR101857380B1; SI2837680T1; JP2014520534A; PL2726600T3; CY1123146T1; HUE049119T2; CL2016001190A1; SI2726600T1; KR20240005106A; US20200407427A1; KR20160075814A; EA201391826A1; LT2837680T; US20220185869A1; EA039023B1; IL278430B

Abstract

본 발명은 포유동물 세포를 배양하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 고산물 역가 세포 배양을 달성하기 위한 세포 성장에 대한 더 큰 제어를 제공한다.

Description

포유동물 세포 배양 {MAMMALIAN CELL CULTURE}

발명의 분야

발명의 배경

치료학적 재조합 단백질의 더욱 더 많은 양에 대한 요구가 증가하기 때문에, 세포 발달, 배지 최적화 및 공정 제어 파라미터를 개선시키기 위해 새로운 방법을 시행함으로써 세포 성장, 생존력 및 단백질 생산에서의 양성 증가가 추구되고 있다. 현재 공정 최적화, 특히 생산 세포 배양물을 성장, 공급, 그리고 유지시키는 위한 방법 및 전략에 많은 노력을 두고 있다.

대규모 세포 배양 공정의 비용 및 생물학적 산물의 더 많은 양과 상기 산물에 대한 더 낮은 비용에 대한 요구 증가를 고려해 볼 때, 재조합 단백질 생산에서 심지어 증가하는 개선을 제공하는 새로운 세포 배양 방법은 가치가 있다.

더 높은 생산 수준을 야기할 수 있고, 따라서 단백질 치료제를 제조하는 것과 연관된 비용을 감소시키는 세포 배양 공정, 재조합 폴리펩티드 발현, 역가 및 세포 생존력에 대한 개선이 필요하다. 본 발명은 세포 성장을 제어하면서 단백질 생산을 증가시키는 단순하고, 쉽고 그리고 저렴한 방법을 제공함으로써 이들 필요성을 충족시킨다.

발명의 요약

본 발명은 생물반응기 내 무-혈청 배양 배지 중에 포유동물 세포 배양물을 확립하는 단계; 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계; 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 성장-저지 상태의 포유동물 세포를 유지시키는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물에서의 세포 성장을 저지하는 방법을 제공한다.

본 발명은 생물반응기 내 무-혈청 배양 배지 중에 포유동물 세포 배양물을 확립하는 단계; 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계; 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 성장-저지 상태의 포유동물 세포를 유지시키는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물에서의 재조합 단백질 생산을 증가시키는 방법을 또한 포함한다. 관련된 구체예에서, 포유동물 세포 배양물에서의 재조합 단백질 생산은 세포가 L-아스파라긴에 의해 유도된 세포 성장-저지를 받지 않는 배양물과 비교하여 증가된다.

본 발명은 생물반응기 내 무-혈청 배양 배지 중에 포유동물 세포 배양물을 확립하는 단계; 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계; 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 성장-저지 상태의 포유동물 세포를 유지시키는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물을 원하는 충전 세포 용적(packed cell volume)으로 제한하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 상기 방법 중 어느 하나에서, 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류는 배양 제3일에 또는 그 전에 시작한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법 중 어느 하나에서, 세포 성장-저지의 유도는 생산 단계 이전에 발생한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법 중 어느 하나에서, 세포 성장-저지의 유도는 생산 단계 동안 발생한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법 중 어느 하나에서, 세포 성장-저지는 L-아스파라긴 고갈에 의해 유도된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법 중 어느 하나는 36℃에서 31℃로의 온도 전환을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법 중 어느 하나는 36℃에서 33℃로의 온도 전환을 추가로 포함한다. 관련된 구체예에서, 온도 전환은 성장 단계와 생산 단계 사이의 전이시에 발생한다. 또 다른 구체예에서, 온도 전환은 생산 단계 동안 발생한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 생산 단계 동안 35% 이하의 충전 세포 용적을 추가로 포함한다. 관련된 구체예에서, 생산 단계 동안의 충전 세포 용적은 35% 이하이다.

본 발명은 생물반응기 내 무-혈청 배양 배지 중에 포유동물 세포 배양물을 확립하는 단계; 성장 단계 동안 포유동물 세포를 성장시키고, 배양 배지에 무-혈청 공급 배지의 볼러스(bolus) 공급물을 보충하는 단계, 및 생산 단계 동안 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 포유동물 세포를 유지시키고, 여기서 생산 단계 동안의 충전 세포 용적은 35% 이하인 단계를 포함하는 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 관류는 세포 배양 제5일 또는 약 제5일 내지 제9일 또는 약 제9일에 시작한다. 관련된 구체예에서, 관류는 세포 배양 제5일 또는 약 제5일 내지 제7일 또는 약 제7일에 시작한다. 한 가지 구체예에서, 관류는 세포가 생산 단계에 도달했을 때 시작한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 L-아스파라긴 고갈, 그 다음 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도는 5 mM 이하이다. 또 다른 구체예에서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도는 4.0 mM 이하이다. 또 다른 구체예에서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도는 3.0 mM 이하이다. 또 다른 구체예에서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도는 2.0 mM 이하이다. 또 다른 구체예에서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도는 1.0 mM 이하이다. 또 다른 구체예에서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도는 0 mM이다. 또 다른 구체예에서, 관류는 세포 배양 동안 1일 당 0.25 작업 용적(working volume)에서 1일 당 1.0 작업 용적으로 생산 단계 동안 증가하는 속도로 수행된다. 관련된 구체예에서, 관류는 세포 배양 제9일 내지 제11일에 1일 당 1.0 작업 용적에 도달하는 속도로 수행된다. 또 다른 관련된 구체예에서, 관류는 세포 배양 제10일에 1일 당 1.0 작업 용적에 도달하는 속도로 수행된다. 또 다른 구체예에서, 무-혈청 공급 배지의 볼러스 공급은 세포 배양 제3일 또는 제4일에 시작한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 방법은 36℃에서 31℃로의 온도 전환을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 36℃에서 33℃로의 온도 전환을 추가로 포함한다. 관련된 구체예에서, 온도 전환은 성장 단계와 생산 단계 사이의 전이시에 발생한다. 관련된 구체예에서, 온도 전환은 생산 단계 동안 발생한다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 세포 농도 배지의 L-아스파라긴 농도는 L-아스파라긴 고갈 이전 및 상기 고갈 동안 모니터링된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 충전 세포 용적은 35% 이하이다. 관련된 구체예에서, 충전 세포 용적은 30% 이하이다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 35% 이하의 충전 세포 용적의 포유동물 세포 배양물 중 생세포 밀도는 10×10⁶개 생세포/mL 내지 80×10⁶개 생세포/mL이다. 관련된 구체예에서, 포유동물 세포 배양물 중 생세포 밀도는 20×10⁶개 생세포/mL 내지 30×10⁶개 생세포/mL이다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 관류는 연속 관류를 포함한다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 관류 속도는 일정하다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 관류는 1일 당 1.0 작업 용적 이하의 속도로 수행된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포 배양물은 무-혈청 배양 배지 중 적어도 0.5×10⁶ 내지 3.0 x 10⁶개 세포/mL를 생물반응기에 접종함으로써 확립된다. 관련된 구체예에서, 포유동물 세포 배양물은 무-혈청 배양 배지 중 적어도 0.5×10⁶ 내지 1.5×10⁶개 세포/mL를 생물반응기에 접종함으로써 확립된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 관류는 교대 접면 유동(alternating tangential flow)에 의해 달성된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물반응기는 적어도 500 L의 용량을 갖는다. 관련된 구체예에서, 생물 반응기는 적어도 500 L 내지 2000 L의 용량을 갖는다. 또 다른 관련된 구체예에서, 생물반응기는 적어도 1000 L 내지 2000 L의 용량을 갖는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 재조합 단백질은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질, 또는 사이토카인으로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 방법 중 어느 하나는 세포 배양에 의해 생산된 재조합 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 세포 배양에 의해 생산된 재조합 단백질은 정제되고 제약학적으로 허용가능한 제제로 조제된다.

도면의 간단한 설명

도 1 유가식(Fed-batch) 시작: 속이 찬 사각형 (■) 및 속이 찬 원형 (●) 회분식(batch) 시작: 비어 있는 사각형 (□) 및 비어 있는 원형 (○).

도 1A: 생세포 밀도, 도 1B: 생존력, 도 1C: 역가

도 2 회분식 시작: 비어 있는 원형 (○), 고도 교반과 함께 유가식 시작: 비어 있는 사각형 (□)

도 2A 생세포 밀도, 도 2B 생존력, 도 2C 역가, 도 2D 아스파라긴 농도

도 3 1.0 시작 관류 용적, 온도 전환 없음: 속이 찬 원형. 1.0 시작 관류 용적, 온도 전환: 비어 있는 원형 (○). 0.75 시작 관류 용적 관류 용적, 온도 전환 없음: 속이 찬 사각형 (■). 0.75 시작 관류 용적, 온도 전환: 비어 있는 사각형 (□).

도 3A 생세포 밀도, 도 3B 생존력, 도 3C 역가

도 4 낮은 아스파라긴 양으로 회분식 시작: 비어 있는 삼각형 (△). 대조군 L-아스파라긴 양으로 회분식 시작: 속이 찬 삼각형 (▲). 낮은 L-아스파라긴 양으로 유가식 시작: 비어 있는 마름모형 (◇). 대조군 L-아스파라긴 양으로 유가식 시작: 속이 찬 마름모형 (◆). 구멍이 뚫린 파이프를 이용한 살포: 실선. 소결된 스파저(sparger)를 이용한 살포: 파선.

도 4A 생세포 밀도, 도 4B 생존력, 도 4C PCV 조정 역가

도 5 17.3 mM 또는 5 mM L-아스파라긴 및 4.6 mM 또는 10 mM L-글루타민을 함유한 배지에서 성장한 배양물. 17.3 mM L-아스파라긴 및 4.6 mM L-글루타민 속이 찬 마름모형 (◆) 또는 5 mM L-아스파라긴, 10 mM L-글루타민 비어 있는 마름모형 (◇).

도 5A 생세포 밀도. 도 5B 역가. 도 5C 충전 세포 용적 (PCV). 도 5D PCV-조정 역가. 도 5E 생존력.

도 6. 5 mM L-아스파라긴, 10 mM L-글루타민으로, 2L 벤치 규모(bench scale) 및 500 L 파일럿 규모(pilot scale)에서 배양. 2L 벤치 규모에서 5 mM L-아스파라긴, 10 mM L-글루타민을 함유한 배지는 속이 찬 마름모형 (◆)으로 나타나고 500 L 파일럿 규모는 비어 있는 마름모형 (◇)으로 나타난다.

도 6A 생세포 밀도. 도 6B 역가. 도 6C 충전 세포 용적 (PCV). 도 6D PCV-조정 역가. 도 6E 생존력.

발명의 상세한 설명

재조합 단백질 생산 동안에, 제어되는 시스템을 갖는 것이 바람직하며 여기서 세포가 원하는 밀도까지 성장하고 이후 세포의 생리학적 상태가 성장-저지, 고생산성 상태로 전환되고 여기서 세포는 더 많은 세포를 만들기보다는 관심 재조합 단백질을 생산하기 위해 에너지와 기질을 이용한다. 온도 전환 및 소분자 유도물질과 같은 이러한 목적을 달성하기 위한 방법은 항상 성공적이지 않고 산물의 품질에서 바람직하지 않은 효과를 가질 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 충전 세포 용적은 낮은 L-아스파라긴 조건으로의 노출에 의해 배양된 세포에서 세포 성장-저지를 유도함으로써 생산 단계 동안 원하는 수준으로 제한될 수 있다. 제한된 농도의 L-아스파라긴을 함유하는 관류 배양 배지를 이용함으로써 그리고 세포 배양에서 낮은 농도의 L-아스파라긴 (5 mM 이하)을 유지시킴으로써 세포 성장-저지가 달성되고 유지될 수 있다.

성장-저지는 낮은 L-아스파라긴으로 또는 L-아스파라긴 고갈을 통하여 개시되고 차후 성장-저지된 세포는 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 세포 배양 및 관류 배지로 유지되었을 때 성장-저지된 세포가 증가된 생산성을 보여주었다는 것으로 또한 밝혀졌다.

성장-저지된, 고 생산성 생산 단계는 L-아스파라긴의 농도를 조작함으로써 달성될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, L-아스파라긴의 고갈은 성장-저지를 야기하였다. 유가식 배양에서, 일단 세포 밀도가 충분히 높을 때 (예를 들어 ≥20×10⁶개 생세포/mL), 반복된 공급에도 불구하고 L-아스파라긴의 소모 및/또는 L-아스파르테이트로의 전환에 때문에 배양물은 반복적으로 L-아스파라긴이 고갈되었다. 세포 배양에서, 세포외 L-아스파라긴은 L-아스파르테이트 및 암모니아로 전환될 수 있다. L-아스파라긴 고갈은 세포 주기 저지를 야기하였다. 유가식 동안에, L-아스파라긴이 배양내 존재할 때 기간은 증가된 생산성을 야기하였고 그리고 L-아스파라긴이 고갈되었을 때 기간은 감소된 생산성을 야기하였다. 관류된 시스템에서, L-아스파라긴은 지속적으로 제공되고 따라서 전체 고갈은 방지되고, 그리고 더 높은 농도의 L-아스파라긴이 지속될 수 있으며, 따라서 세포가 계속 증대되도록 그리고 고갈된 또는 제한된 L-아스파라긴을 가진 환경에 노출되지 않도록 한다. 충분하게 낮은 농도 (가령 5 mM 이하의 농도)로 L-아스파라긴의 농도를 제어하는 것은 생존력을 유지하고 성장을 제한하면서 고생산성 상태로 세포를 유지할 수 있다. 볼러스 및 관류 공급을 갖는 시스템에서, 공급 배지는 볼러스 공급 동안 높은 (성장 촉진) 수준의 L-아스파라긴을 함유하는 제제에서 관류 공급 동안에 더 낮은 (성장-저지) 수준의 L-아스파라긴으로 전환될 수 있다. L-아스파라긴을 제한함으로써 성장-저지된 세포 배양은 낮은 수준의 L-아스파라긴을 다시 첨가함으로써 고생산성 상태로 자극될 수 있다.

상업적 규모의 세포 배양 및 생물학적 치료제의 제조를 위하여, 세포 성장을 저지하는 능력과 생산 단계 동안에 성장-저지된 상태에서 세포를 유지할 수 있는 것은 매우 바람직할 것이다. 성장-저지 상태에 있는 동안 생산성을 증가시키는 것으로 또한 유도되는 세포를 가지는 것과 이 증가된 생산성을 유지할 수 있는 것이 제조 목적을 위해 이상적이다.

재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물에서의 세포 성장을 저지하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 상기 방법은　0 mM L-아스파라긴을 비롯하여 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 배지에서 세포를 배양함으로써 포유동물 세포 배양물에서의 세포 성장-저지를 유도하는 단계를 포함한다). 이러한 유도는 L-아스파라긴 고갈에 의해 또는 5 mM 이하의 L-아스파라긴을 갖는 무-혈청 관류 배지로 배양을 관류하고 낮은 L-아스파라긴 환경에서 배양을 유지시킴으로써 낮은 L-아스파라긴 환경을 만듦에 의해 개시될 수 있다. 이후 세포 배양은 5 mM 이하 농도의 L-아스파라긴으로 무-혈청 관류 배지를 관류하고 낮은 L-아스파라긴 환경에서 배양을 유지시킴으로써 성장-저지 상태가 유지된다.

포유동물 세포 배양에서 낮은 아스파라긴 세포 성장-저지를 유도함으로써 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물에서의 재조합 단백질 생산을 증가시키기 위한 방법이 또한 제공된다. 낮은 아스파라긴 성장-저지 상태에서 유지된 포유동물 세포는 낮은 아스파라긴 성장-저지 상태가 아닌 것보다 더 큰 생산성 (g 단백질/세포/일 및 g 단백질/세포 질량/일)을 나타내었다.

이러한 방법은 포유동물 세포 배양물을 원하는 충전 세포 용적으로 제한하는 데에 또한 유용하다. 생산 단계 동안의 충전 세포 용적은 생산 배양 배지에서 L-아스파라긴 수준을 감소시킴으로써 원하는 수준으로 제한될 수 있다. 관류 배지에서 5 mM 이하의 아스파라긴 농도는 배양 동안 세포 성장을 제어하고 원하는 충전 세포 용적으로 제한하는 데에 충분하였다.

본 명세서에서 설명된 방법은 고산물 역가 세포 배양을 위해 세포 성장에 대한 더 큰 제어를 제공한다; 그리고 그렇게 하는 것은 높은 바이오매스 관류 공정과 비교하여 가스발생 전략을 단순화할 수 있고 수확 및 다운스트림 가공처리 동안의 산물 손실을 최소화할 수 있다.

상기 방법은 생산 생물반응기에서 포유동물 세포 배양물을 확립하는 것으로 시작한다. 바람직하게, 더 작은 생산 생물반응기가 이용되고, 한 가지 구체예에서 생물반응기는 500 L 내지 2000 L이다. 바람직한 구체예에서, 1000 L - 2000 L 생물반응기가 이용된다. 생물반응기에 접종시키는 데에 이용된 시드(seed) 세포 밀도는 생산된 재조합 단백질의 수준에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 한 가지 구체예에서, 생물반응기는 무-혈청 배양 배지 중 적어도 0.5 x10⁶ 내지 3.0 x10⁶개 생세포/mL 이상으로 접종된다. 바람직한 구체예에서, 접종은 1.0×10⁶개 생세포/mL이다.

이후 포유동물 세포는 기하급수적인 성장 단계를 겪는다. 세포 배양은 원하는 세포 밀도가 달성될 때까지 보충적인 공급 없이 유지될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 세포 배양은 낮은 L-아스파라긴 성장-저지를 유도하고 유지하기 위해 보충적인 공급 그 다음 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지에 의한 관류 없이 최대 3일 동안 유지된다. 또 다른 구체예에서, 배양은 낮은 L-아스파라긴 성장-저지를 유도하고 유지하기 위해 5 mM 이하의 L-아스파라긴을 함유하는 무-혈청 관류 배지를 이용하여 세포 배양을 관류함으로써 접종시 바로 개시되는 세포 성장-저지로 간략한 성장 단계 없이 생산 단계를 시작하기 위해 원하는 세포 밀도로 접종될 수 있다. 본 명세서의 구체예 중 어느 하나에서, L-아스파라긴 고갈 (0 mM L-아스파라긴 환경에서 세포를 처리) 그 다음 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖고 그리고 그 수준의 세포 배양에서 L-아스파라긴의 농도를 유지하는 세포 배양 배지를 이용한 관류에 의해 성장 단계에서 생산 단계로의 전이가 또한 개시될 수 있다.

어떻게 낮은 L-아스파라긴 성장-저지가 유도되는 지에 상관없이, 낮은 L-아스파라긴 배지로 관류하고 5 mM 이하의 L-아스파라긴 수준으로 세포 배양을 유지시킴으로써 유지되는 성장-저지된 세포에서 더 높은 생산성이 확인된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "세포 성장-저지"라고도 언급될 수 있는. "성장-저지"는 세포가 수의 증가를 멈추거나 또는 세포 주기가 더 이상 진행되지 않는 시점이다. 성장-저지는 세포 배양물 중 생세포 밀도를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 성장-저지된 상태의 몇몇 세포는 크기가 증가할 수는 있지만 수에서는 그렇지 않으며, 따라서 성장-저지된 배양물의 충전 세포 용적이 증가할 수 있다. 세포는 건강이 쇠약해지고 있는 것이 아니라면, 세포 배양물에 추가적인 L-아스파라긴을 첨가함으로써 성장-저지를 어느 정도까지 뒤바꿀 수 있다.

배양내 L-아스파라긴의 농도가 지속된 성장에 대해 제한되는 수준으로 배양물의 세포 농도가 도달할 때 또는 배양물은 L-아스파라긴이 고갈될 때 성장-저지가 L-아스파라긴에 의해 개시된다. L-아스파라긴 고갈은 세포 배양 배지 중 L-아스파라긴 농도가 효과적으로 0 mM일 때 발생한다. 고갈은 24시간 이내에 성장-저지를 야기할 수 있다. 48시간보다 더 오랫동안의 고갈은 세포의 건강을 손상시킬 수 있다. 성장-저지된 상태에서 세포를 유지시키기 위하여, 세포 배양물 중 L-아스파라긴 농도는 5 mM 이하로 유지되어야만 한다. 세포 성장을 저지하기 위해 요구되는 L-아스파라긴의 세포 배양 배지는 세포 자체의 아스파라긴을 만들기 위한 세포의 능력에 의존한다. 세포가 그들 자체의 아스파라긴을 만들 수 있는 배양의 경우, 더 낮은 농도, 또는 심지어 배지로부터 L-아스파라긴의 제거가 성장-저지를 위해 요구될 수 있다. 그들 자체의 아스파라긴을 만들 수 없는 배양의 경우, 예를 들어, 활성 아스파라긴 신시타아제(synthetase) 효소가 고갈된 세포, 0 이상 내지 최대 5 mM까지의 L-아스파라긴 농도가 성장을 저지하는 데에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "충전 세포 용적 퍼센트" (PCV%)라고도 언급되는 "충전 세포 용적" (PCV)은 퍼센트로 표현되는, 세포에 의해 차지되는 용적 대 세포 배양의 전체 용적의 비이다 (Stettler, wt al., (2006) Biotechnol Bioeng. Dec 20:95(6):1228-33을 참고). 충전 세포 용적은 세포 밀도 및 세포 지름의 함수이고; 충전 세포 용적에서의 증가는 세포 밀도 또는 세포 지름 중 하나 또는 둘 모두에서의 증가에서 발생할 수 있다. 충전 세포 용적은 세포 배양물내 고형분(solid content)의 척도이다. 고체는 수확 및 다운스트림 정제 동안 제거된다. 더욱 고체인 것은 수확 및 다운스트림 정제 단계 동안에 원하는 산물로부터 고형 물질을 분리시키기 위한 더 많은 노력을 의미한다. 또한, 원하는 산물은 고체 안에 갇힐 수 있고 그리고 수확 공정 동안에 손실될 수 있으며, 이는 감소된 산물 산출량을 야기한다. 숙주 세포가 크기에서 각기 다르고 세포 배양물은 죽은 및 죽어가는 세포 그리고 기타 세포 잔해를 또한 함유하므로, 충전 세포 용적은 세포 밀도 또는 생세포 밀도 보다 세포 배양물내 고형분을 설명하는 데에 더욱 정확한 방식이다. 예를 들어, 50 x 10⁶개 세포/mL의 세포 밀도를 갖는 2000 L 배양물은 세포 크기에 따라서 매우 상이한 충전 세포 용적을 가질 것이다. 추가적으로, 몇몇 세포는, 성장-저지된 상태에 있을 때, 크기가 증가할 것이고, 따라서 성장-저지 이전 및 성장-저지 후 충전 세포 용적은 세포 크기 증가에 대한 결과로서 바이오매스의 증가 때문에, 상이할 가능성이 있을 것이다.

성장 단계와 생산 단계 사이의 전이시에, 그리고 생산 단계 동안에, 충전 세포 용적 퍼센트 (PCV%)는 35% 이하이다. 생산 단계 동안 유지되는 원하는 충전 세포 용적은 35% 이하이다. 바람직한 구체예에서, 충전 세포 용적은 30% 이하이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 충전 세포 용적은 20% 이하이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 충전 세포 용적은 15% 이하이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 충전 세포 용적은 10% 이하이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "세포 밀도"는 배양 배지의 주어진 용적내 세포 수를 나타낸다. "생세포 밀도"는 표준 생존력 어세이(assay) (가령 트립판 블루 염색 배제법)에 의해 측정된 바와 같은, 배양 배지의 주어진 용적내 생세포 수를 나타낸다.

성장 단계와 생산 단계 사이의 전이시에 그리고 생산 단계 동안에 유지된 원하는 생세포 밀도는 35% 이하의 충전 세포 용적을 제공하는 밀도이다. 한 가지 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 10×10⁶개 생세포/mL 내지 80×10⁶개 생세포/mL이다. 한 가지 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 10×10⁶개 생세포/mL 내지 70×10⁶개 생세포/mL이다. 한 가지 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 10×10⁶개 생세포/mL 내지 60×10⁶개 생세포/mL이다. 한 가지 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 10×10⁶개 생세포/mL 내지 50×10⁶개 생세포/mL이다. 한 가지 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 10×10⁶개 생세포/mL 내지 40×10⁶개 생세포/mL이다. 바람직한 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 10×10⁶개 생세포/mL 내지 30×10⁶개 생세포/mL이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 10×10⁶개 생세포/mL 내지 20×10⁶개 생세포/mL이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 20×10⁶개 생세포/mL 내지 30×10⁶개 생세포/mL이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 생세포 밀도는 적어도 약 20×10⁶개 생세포/mL 내지 적어도 약 25×10⁶개 생세포/mL, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20×10⁶개 생세포/mL이다.

생산 단계 동안에 더 낮은 충전 세포 용적은 더 높은 세포 밀도 관류 배양을 방해할 수 있는 용존 산소 살포 문제점을 완화시키는 것을 보조한다. 또한 더 낮은 충전 세포 용적은 더 작은 배지 저장 용기의 사용을 허용하고 더 느린 유속으로 결합될 수 있는 더 작은 배지 용적을 허용한다. 더 낮은 충전 세포 용적은 더 높은 세포 바이오매스 배양물과 비교하여 수확 및 다운스트림 가공처리에 영향을 덜 미친다. 이들 모두는 재조합 단백질 치료제를 제조하는 것과 연관된 비용을 감소시킨다.

포유동물 세포 배양에 의한 재조합 단백질의 생산을 위한 상업적 공정에서 세 가지 방법이 전형적으로 이용된다: 회분식 배양, 유가식 배양, 및 관류 배양. 세포가 짧은 기간 동안 고정된 용적의 배양 배지에서 성장하는 비연속적 방법인,　회분식 배양이 전체 수확 후 이어졌다. 회분식 방법을 이용하여 성장한 배양물은 최대 세포 밀도에 도달할 때까지 세포 밀도의 증가를 겪고, 그 다음 배지 성분이 소모되고 대사 부산물 (락테이트 및 암모니아)의 수준이 쌓이면서 생세포 밀도의 감소를 겪는다. 수확은 최대 세포 밀도가 달성되는 (배지 제제, 세포 주 등에 따라 전형적으로 5-10×10⁶개 세포/mL) 시점에 전형적으로 발생한다. 회분식 공정은 가장 간단한 배양 방법이지만, 생세포 밀도는 영양소 이용도에 의해 제한되고 일단 세포가 최대 밀도가 되면, 배양이 감소되고 생산물이 줄어든다. 노폐물의 축적 및 영양소 고갈이 빠르게 배양 감소, (전형적으로 약 3 내지 7일)를 야기하기 때문에 생산 단계를 연장할 수 있는 능력이 없다.

유가식 배양은 소모되었던 이들 배지 성분을 다시 채우기 위해 볼러스 또는 지속적인 배지 공급을 제공함으로써 회분식 공정을 개량한다. 유가식 배양이 운용 내내 추가적인 영양소를 받기 때문에, 그들은 회분식 배양물과 비교할 때, 더 높은 세포 밀도 (배지 제제, 세포주 등에 따라, >10 내지 30×10⁶개 세포/mL)) 및 증가된 산물 역가를 달성할 잠재력을 갖는다. 회분식 공정과는 다르게, 2상(biphasic) 배양은 원하는 세포 밀도를 달성하기 위한 세포 증식 기간 (성장 단계)을 지연된 또는 느린 세포 성장 기간 (생산 단계)와 구별하기 위해 공급 전략 및 배지 제제를 조작함으로써 형성되고 지속될 수 있다. 따라서, 유가식 배양은 회분식 배양물과 비교하여 더 높은 산물 역가를 달성할 잠재력을 갖는다. 전형적으로 회분식 방법이 성장 단계 동안에 이용되고 유가식 방법이 생산 단계 동안에 이용되지만, 유가식 공급 전략은 전체 공정 내내 이용될 수 있다. 하지만, 회분식 공정과는 다르게, 생물반응기 용적은 공급량을 제한하는 제한 요인이다. 또한, 회분식 방법과 마찬가지로, 대사 부산물 축적은 생산 단계 지속기간을 약 1.5 내지 3 주로 제한하는, 배양 감소를 야기할 것이다. 유가식 배양은 비연속적이고 수확은 전형적으로 대사 부산물 수준 또는 배양 생존력이 예정된 수준에 도달할 때 발생한다.

관류 방법은 신선한 배지를 첨가하고 동시에 소모된 배지를 제거함으로써 회분식 및 유가식 방법보다 잠재적인 향상을 제공한다. 전형적으로 대규모 상업적 세포 배양 전략은 거의 삼분의 일 내지 절반 이상의 반응기 부피가 바이오매스인 60 - 90(+) x 10⁶개 세포/mL의 높은 세포 밀도에 도달하기 위해 분투한다. 관류 배양에 대해, >1 x 10⁸개 세포/mL의 과도한 세포 밀도가 달성되었고 심지어 더 높은 밀도가 예측된다. 전형적인 관류 배양은 1일 또는 2일 동안 지속되는 회분식 배양 스타트-업(start-up)으로 시작하고, 그 다음 배양의 성장 및 생산 내내 배양물에 신선한 공급 배지의 지속적인, 단계별 및/또는 간헐적인 첨가 그리고 세포 및 추가적인 고분자량 화합물 가령 단백질 (여과 분자량 컷오프(cutoff)에 기반하여)을 보유한 소모 배지의 동시 제거가 이어진다. 다양한 방법, 가령 침전, 원심분리, 또는 여과는 세포 밀도는 유지하면서 소모된 배지를 제거하는 데에 이용될 수 있다. 1일 당 1 작업 용적(a working voulume) 내지 1일 당 다수의 작업 용적까지의 분획물의 관류 유속이 보고되었다. 관류 공정의 이점은 생산 배양이 회분식 또는 유가식 배양 방법보다 더 긴 시간 동안 유지될 수 있다는 점이다. 하지만, 증가된 배지 제조, 용도, 저장 및 폐기는 장기간 관류 배양, 특히 높은 세포 밀도를 가진 것들을 지원하기 위해 필수적이며, 이는 심지어 더 많은 영양소를 또한 필요로 하고, 그리고 이들 모두 회분식 및 유가식 방법과 비교하여, 훨씬 더 높은 생산 비용을 야기한다. 추가적으로,　더 높은 세포 밀도는　생산 동안　용존 산소 수준을 유지하는 것과 같은 문제 및 더 많은 산소를 공급하고 더 많은 이산화탄소를 제거하는 것을 포함한 증가된 가스발생의 문제, 이는 더 많은 기포발생 및 항기포 전략에 대한 변경의 필요성을 야기할 것임;　뿐만 아니라, 과잉의　세포 물질을 제거하기 위해 요구되는 노력이 산물의 손실을 야기할 수 있는　수확 및 다운스트림 가공처리 동안,　증가된 세포 질량으로 인한 증가된 역가의 혜택을　무효화하는　문제를 야기할 수 있다.

성장 단계 동안 유가식 공급 그 다음 생산 단계 동안 연속 관류를 결합한 대규모 세포 배양 전략이 또한 제공된다. 방법은 세포 배양이 35% 이하의 충전 세포 용적으로 유지되는 생산 단계를 표적한다. 방법은 낮은 아스파라긴에 기인한 세포 성장-저지의 개시 및 유지를 또한 제공한다.

유가식 배양은 포유동물 세포로부터의 단백질의 대규모 생산을 위한 광범위하게-실시되는 배양 방법이다. 가령, Chu and Robinson (2001), Current Opin. Biotechnol. 12: 180-87을 참조. 포유동물 세포의 유가식 배양은 영양소를 함유한 농축된 공급 배지로 지속적으로 또는 주기적으로 배양물이 공급되는 배양이다. 공급은 예를 들어, 매일, 이틀에 한번, 삼일에 한번 등의 예정된 일정에서 발생할 수 있다. 공급이 발생하지 않은 회분식 배양와 비교할 때, 유가식 배양은 더 많은 양의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 가령, 미국 특허 번호 제5,672,502호를 참조.

한 가지 구체예에서, 볼러스 공급물로의 유가식 배양은 성장 단계 동안에 세포 배양을 유지하는 데에 이용된다. 이후 관류 공급이 생산 단계 동안에 이용될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 관류는 세포가 생산 단계에 도달했을 때 시작한다. 또 다른 구체예에서, 관류는 세포 배양의 제5일 또는 약 제5일 내지 제9일 또는 약 제9일에 시작한다. 또 다른 구체예에서, 관류는 세포 배양의 제5일 또는 약 제5일 내지 제7일 또는 약 제7일에 시작한다.

또 다른 구체예에서, 유가식 배양내 세포 성장-저지의 개시는 유가식 배양이 L-아스파라긴 고갈 그 다음 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류의 단계를 겪음으로써 개시될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 세포 배양 배지의 L-아스파라긴 농도는 L-아스파라긴 고갈 이전 및 상기 고갈 동안 모니터링된다. 또 다른 구체예에서, 유가식 배양내 세포 성장-저지의 개시는 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무혈청 관류 배지를 이용한 관류에 의해 달성될 수 있다.

성장 단계 동안 볼러스 공급을 이용하는 것은 세포가 생산 단계로 전이하는 것을 허용하며, 이는 생산 단계를 개시하고 통제하는 수단으로서의 온도 전환에 대한 더 적은 의존성을 야기하지만, 36℃에서 31℃로의 온도 전환은 성장 단계와 생산 단계 사이에서 발생할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 전환은 36℃에서 33℃가 된다.

본 명세서에서 설명된 바와 같이, 생물반응기는 무-혈청 배양 배지 중 적어도 0.5 x10⁶ 내지 3.0 x10⁶개 생세포/mL 이상, 바람직하게는 1.0 x106개 생세포/mL로 접종될 수 있다.

관류 배양은 세포 배양이 신선한 관류 공급 배지를 받고 동시에 소모된 배지를 제거하는 배양이다. 관류는 연속적이거나, 단계별이거나, 간헐적이거나, 또는 이들 중 임의 또는 모든 것의 조합이다. 관류 속도는 1일 당 1 미만의 작업 용적 내지 많은 작업 용적이 될 수 있다. 바람직하게 세포는 배양물에서 보유되고 그리고 제거된 소모된 배지는 실질적으로 무세포이거나 또는 배양물보다 상당히 더 적은 세포를 갖는다. 세포 배양에 의해 발현되는 재조합 단백질은 배양물에서 또한 보유될 수 있다. 관류는 원심분리, 침전, 또는 여과를 포함하여 다수의 수단에 의해 완수될 수 있다, 가령, Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65를 참조. 바람직한 여과 방법은 교대 접면 유동 여과이다. 교대 접면 유동은 중공-섬유 여과 모듈(module)을 통하여 배지를 펌핑(pumping)함으로써 유지된다. 가령, 미국 특허 번호 제6,544,424호; Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63을 참조.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, "관류 유속"은 생물반응기로부터 빠져나가는 (첨가된 및 제거된) 배지의 양이며, 이는 주어진 시간에서, 작업 용적의 일부분 또는 다수의 작업 용적으로서 전형적으로 발현된다. "작업 용적"은 세포 배양을 위해 이용되는 생물반응기 용적의 양을 나타낸다. 한 가지 구체예에서, 관류 유속은 1일 당 1 작업 용적 이하이다. 관류 공급 배지는 관류 영양소 농도를 최대화하기 위해 제조되어 관류 속도를 최소화할 수 있다.

"세포 배양" 또는 "배양"은 다세포 유기체 또는 조직 밖에서의 세포의 성장 또는 증식을 의미한다. 포유동물 세포를 위한 적합한 배양 조건은 해당 분야에서 공지된다. 가령, Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992)을 참조. 포유동물 세포는 현탁액에서 또는 고형 기질에 부착되어 있는 동안 배양될 수 있다. 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 회전 병, 진탕 플라스크, 또는 교반형 탱그 생물반응기가, 마이크로담체와 함께 또는 이들 없이, 이용될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 500 L 내지 2000 L 생물반응기가 이용된다. 바람직한 구체예에서, 1000 L 내지 2000 L 생물반응기가 이용된다.

본 발명의 목적을 위하여, 세포 배양 배지는 시험관내 세포 배양에서, 동물 세포, 가령 포유동물 세포의 성장을 위해 적합한 배지이다. 세포 배양 배지 제제는 해당 분야에서 잘 공지된다. 전형적으로, 세포 배양 배지는 완충제, 염, 탄수화물, 아미노산, 비타민 및 미량 필수 원소로 구성된다. "무-혈청"은 동물 혈청, 가령 소태아 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. 정의된 배양 배지를 포함한, 다양한 조직 배양 배지는 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어 다음 세포 배양 배지 중 임의의 하나 또는 이들의 조합이 이용될 수 있다: 그 중에서도, RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코(Dulbecco)의 변경된 이글(Eagle)의 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 이글, F-12K 배지, 햄(Ham)의 F12 배지, 이스코브(Iscove)의 변경된 둘베코의 배지, 맥코이(McCoy)의 5A 배지, 레이보비츠(Leibovitz)의 L-15 배지, 및 무-혈청 배지, 가령 EX-CELL™ 300 시리즈 (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). 무-혈청 버전의 이러한 배양 배지가 또한 이용가능하다. 세포 배양 배지는 배양되어야 할 세포의 필수조건 및/또는 원하는 세포 배양 매개변수에 따라서 추가적인 또는 증가된 농도의 성분, 가령 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장 인자, 완충제, 항생제, 지질, 미량 원소 등으로 보충될 수 있다.

세포 배양은 영양소 및 아미노산과 같은 성분을 함유한 농축된 공급 배지로 보충될 수 있으며, 상기 성분은 세포 배양의 생산 단계 과정 동안에 소모된다. 농축된 공급 배지는 거의 모든 임의의 세포 배양 배지 제제에 기반할 수 있다. 이러한 농축된 공급 배지는 세포 배양 배지의 대부분의 성분을 예들 들어, 약 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, 또는 심지어 약 1000X의 그들 정상량으로 함유할 수 있다. 농축된 공급 배지는 유가식 배양 공정에서 종종 이용된다.

본 발명에 따른 방법은 다수의 단계 배양 공정에서 재조합 단백질의 생산을 개선시키는 데에 이용될 수 있다. 다수의 단계 공정에서, 세포는 둘 이상의 구별되는 단계로 배양된다. 예를 들어 세포는 세포 증식 및 생존력을 최대화하는 환경 조건 하에, 하나 이상의 성장 단계로 우선 배양될 수 있고, 이후 단백질 산물을 최대화하는 조건 하에, 생산 단계로 이동된다. 포유동물 세포에 의한 단백질 생산을 위한 상업적 공정에서, 일반적으로 다수의, 예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 성장 단계가 있으며, 상기 단계는 최종 산물 배양 이전에 상이한 배양 용기에서 발생한다. 하나 이상의 전이 단계 다음에 성장 및 생산 단계가 있거나, 상기 전이 단계에 의해 성장 및 생산 단계가 분리된다. 다수의 단계 공정에서, 본 발명에 따른 방법은 선행하는 성장 단계에서도 활용될 수 있지만, 적어도 상업적인 세포 배양의 최종 생산 단계의 성장 및 생산 단계 동안 활용될 수 있다. 생산 단계는 대규모로 수행될 수 있다. 대규모 공정은 적어도 약 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10,000, 15,000, 20,000 리터의 용적에서 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 생산은 500 L, 1000 L 및/또는 2000 L 생물반응기에서 수행된다. 성장 단계는 생산 단계보다 더 높은 온도에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 성장 단계는 약 35℃ 내지 약 38℃의 일차 온도에서 발생할 수 있고, 그리고 생산 단계는 약 29℃ 내지 약 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 약 36℃ 또는 약 30℃ 내지 약 34℃의 이차 온도에서 발생할 수 있다. 추가적으로, 단백질 산물의 화학적 유도물질, 가령, 카페인, 뷰티레이트 및 헥사메틸렌 비스아세트아미드 (HMBA)는 온도 전환과 같은 시간에, 그 전에 및/또는 그 후에 첨가될 수 있다. 유도물질이 온도 전환 후에 첨가된다면, 상기 유도물질은 온도 전환 후 1시간 내지 5일에, 선택적으로 온도 전환 후 1 내지 2일에 첨가될 수 있다. 세포가 원하는 단백질(들)을 생산하는 동안에 세포 배양은 수일 동안 또는 심지어 수주 동안 유지될 수 있다.

세포 배양으로부터의 샘플은 해당 분야에서 공지된 임의의 분석적인 기술을 이용하여 모니터링되고 평가될 수 있다. 재조합 단백질 및 배지 품질 및 특징을 포함하여 여러 가지 매개변수는 배양의 지속기간 동안 모니터링될 수 있다. 샘플은 채취되어 지속적인 모니터링, 실시간 또는 근 실시간을 포함하여 바람직한 빈도로 간헐적으로 모니터링 될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 세포 배양 배지의 L-아스파라긴 농도는 L-아스파라긴 고갈 이전 및 상기 고갈 동안 모니터링된다.

전형적으로 최종 생산 배양 (N-1에 대한 N-x)을 선행하는 세포 배양은 생산 생물반응기, N-1 배양을 접종하는 데에 이용될 수 있는 시드 세포를 발생시키는 데에 이용된다. 시드 세포 밀도는 생산된 재조합 단백질의 수준에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 산물 수준은 시드 밀도가 증가함에 따라 증가하는 경향이 있다. 역가에서의 개선은 더 높은 시드 밀도와 결부되어 있는 것뿐만 아니라, 생산에 배치되는 세포의 대사 및 세포 주기 상태에 의해 영향을 받을 가능성이 있다.

시드 세포는 임의의 배양 방법에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 방법은 교대 접면 유동 여과를 이용한 관류이다. N-1 생물반응기는 생산 생물반응기에 접종하기 위해 고밀도로 세포를 제공하기 위해 교대 접면 유동 여과를 이용하여 작동될 수 있다. N-1 단계는 >90 x 10⁶개 세포/mL의 밀도까지 세포를 성장시키는 데에 이용될 수 있다. N-1 생물반응기는 볼러스 시드 배양물을 만들어 내는 데에 이용될 수 있거나 또는 높은 시드 세포 밀도로 다수의 생산 생물반응기를 시딩하기 위해 유지될 수 있었던 회전 시드 스톡(stock) 배양으로서 이용될 수 있다. 생산의 성장 단계의 지속기간은 7 내지 14일의 범위일 수 있고 그리고 생산 생물반응기의 접종 이전에 기하급수적인 성장에서 세포를 유지하기 위하여 설계될 수 있다. 관류 속도, 배지 제제 및 시기선택은 세포 생산을 최적화하는 데에 가장 도움이 되는 상태에서 세포를 성장시키고 그들을 생산 생물반응기로 전달하기 위해 최적화된다. >15×10⁶개 세포/mL의 시드 세포 밀도는 생산 생물반응기를 시딩하기 위해 달성될 수 있다. 접종에서 더 높은 시드 세포 밀도는 원하는 생산 밀도에 도달하기 위해 필요되는 시간을 감소시키거나 또는 심지어 없앨 수 있다.

본 발명은 세포 배양 공정을 통한 세포 성장, 생존력 및/또는 단백질 생산을 개선하는 것에서의 특정한 유용성을 알아낸다. 본 발명에서 이용된 세포주 ("숙주 세포"라고도 언급됨)는 상업적 또는 과학적 관심의 폴리펩티드를 발현하기 위해 유전적으로 조작된다. 세포주는 제한되지 않은 시간 동안 배양에서 유지될 수 있는 일차 배양물로부터 발생된 계통으로부터 전형적으로 파생된다. 세포주를 유전적으로 조작하는 것은 재조합 폴리 뉴클레오티드 분자로 세포를 형질감염, 형질전환 또는 형질도입하는 것, 및/또는 그렇지 않으면 숙주 세포가 원하는 재조합 폴리펩티드를 발현하도록 유발하기 위하여 변형시키는 것 (가령, 상동 재조합 및 유전자 활성화 또는 비-재조합 세포와 재조합 세포의 융합으로)을 포함한다. 관심의 폴리펩티드를 발현하도록 세포 및/또는 세포주를 유전적으로 조작하기 위한 방법 및 벡터는 해당 분야에서 통상의 기술자에게 잘 공지된다; 예를 들어, 다양한 기술이 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, 및 분기별 최신판); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69에서 설명된다.

동물 세포주는 세포의 전구체가 다-세포 동물로부터 파생되었던 세포로부터 파생된다. 동물 세포주의 한 가지 유형은 포유동물 세포주이다. 배양에서 성장을 위해 적합한 매우 다양한 포유동물 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, Va.) 및 상업적 판매자로부터 이용가능하다. 산업에서 일반적으로 이용되는 세포주의 예시는 VERO, BHK, HeLa, CV1 (Cos를 포함), MDCK, 293, 3T3, 골수종 세포주 (가령, NSO, NS1), PC12, WI38 세포, 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다. CHO 세포는 복합 재조합 단백질, 가령 사이토카인, 응고 인자, 및 항체의 생산을 위해 널리 이용된다 (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol. 145:3011-3016). 디히드로엽산 환원효소 (DHFR)-결핍 돌연변이 세포주 (Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 및 DG-44는 바람직한 CHO 숙주 세포인데, 그 이유는 유전자 발현 시스템을 선택할 수 있고 증폭시킬 수 있는 효과적인 DHFR이 이들 세포에서 높은 수준의 재조합 단백질 발현을 허용하기 때문이다 (Kaufman R.J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). 추가적으로, 이들 세포는 부착 또는 현탁 배양으로서 조작하고 비교적 양호한 유전적 안정성을 나타내기 쉽다. CHO 세포 및 그들 안에서 재조합적으로 발현되는 단백질은 규제 기관에 의해 광범위하게 특성화되었고 임상적, 상업적 제조에서 이용하기 위해 승인되었다.

본 발명의 방법은 관심의 재조합 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 데에 이용될 수 있다. 발현되는 재조합 단백질은 그들이 회수될 수 있고 및/또는 수집될 수 있는 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 추가적으로, 단백질은 공지된 공정을 이용하여 이러한 배양물 또는 성분으로부터 (가령, 배양 배지로부터) 정제될 수 있거나, 또는 부분적으로 정제될 수 있고, 산물은 상업적 판매자로부터 이용가능하다. 이후 정제된 단백질은 "조제"될 수 있고, 이는 최종 사용자를 위해 완충제 교환되고, 멸균되고, 대용량-포장되고 및/또는 포장되는 것을 의미한다. 제약학적 조성물을 위한 적합한 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA에서 설명된 것들을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 내내 상호교환적으로 이용되고 펩티트 결합에 의해 서로 결합된 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 나타낸다. 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 변경을 포함한다. 폴리펩티드는 단백질-기반 약물을 포함하여, 과학적 또는 상업적 관심이 될 수 있다. 폴리펩티드는 다른 것 중에서도, 항체, 융합 단백질 및 사이토카인을 포함한다. 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 세포 배양 방법을 이용하여 재조합 동물 세포주에 의해 생산되고 "재조합 펩티드", "재조합 폴리펩티드" 및 "재조합 단백질"이라고 언급될 수 있다. 발현되는 단백질(들)은 세포내로 생산될 수 있거나 또는 상기 단백질이 회수될 수 있고 및/또는 수집될 수 있는 배양 배지 내로 분비될 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여 생산될 수 있는 폴리펩티드의 예시는 다음 단백질 중 하나의 전부 또는 일부와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다: 종양 괴사 인자 (TNF), flt3 리간드 (WO 94/28391), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 칼시토닌, IL-2, 안지오포이에틴-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60), NF-카파 B의 수용체 활성자에 대한 리간드 (RANKL, WO　01/36637), 종양 괴사 인자 (TNF)-관련된 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL, WO 97/01633), 흉선 기질-유래된 림포포이에틴, 과립구 집락 자극 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF, 호주 특허 번호 제588819호), 비만 세포 성장 인자, 줄기 세포 성장 인자 (미국 특허 번호 제6,204,363호), 표피 성장 인자, 케라틴세포 성장 인자, 거핵세포 성장 및 발달 인자, RANTES, 인간 피브리노겐-유사 2 단백질 (FGL2; NCBI 기탁번호 제NM_00682호; Ruegg and Pytela (1995), Gene 160:257-62) 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린-유사 성장 인자, 부갑상선 호르몬, α-인터페론, γ-인터페론, 및 공통 인터페론을 포함한 인터페론 (미국 특허 번호 제4,695,623호 및 제4,897471호), 신경 성장 인자, 뇌-유래 신경영양 인자, 시냅토타그민-유사 단백질 (SLP 1-5), 뉴로트로핀-3, 글루카곤, 인터루킨, 집락 자극 인자, 림포톡신-β, 백혈병 억제 인자, 및 온코스타틴-M. 발명의 방법에 따라 생산될 수 있는 단백질의 설명은 예를 들어, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, all volumes (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); 및 The Cytokine Handbook, Vols. 1 and 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003)에서 찾을 수 있다.

추가적으로 본 발명의 방법은 임의의 상기-언급된 단백질에 대한 수용체, 이러한 수용체 또는 임의의 상기-언급된 단백질에 대한 길항제, 및/또는 이러한 수용체 또는 길항제와 실질적으로 유사한 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함한 단백질을 생산하는 데에 유용할 것이다. 이들 수용체 및 길항제는 다음을 포함한다: 종양 괴사 인자 수용체의 둘 모두의 형태 (TNFR, p55 및 p75라고 언급됨, 미국 특허 번호 제5,395,760호 및 미국 특허 번호 제5,610,279호), 인터루킨-1 (IL-1) 수용체 (유형 I 및 II; 유럽 특허 번호 제0460846호, 미국 특허 번호 제4,968,607호, 및 미국 특허 번호 제5,767,064호,), IL-1 수용체 길항제 (미국 특허 번호 제6,337,072호), IL-1 길항제 또는 저해제 (미국 특허 번호 제5,981,713호, 제6,096,728호, 및 제5,075,222호) IL-2 수용체, IL-4 수용체 (유럽 특허 번호 제0 367 566호 및 미국 특허 번호 제5,856,296호), IL-15 수용체, IL-17 수용체, IL-18 수용체, Fc 수용체, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 수용체, 과립구 집락 자극 인자 수용체, 온코스타틴-M 및 백혈병 억제 인자에 대한 수용체, NF-카파 B (RANK, WO 01/36637 및 미국 특허 번호 제6,271,349호)의 수용체 활성자, 오스테오프로테게린 (미국 특허 번호 제6,015,938호), TRAIL에 대한 수용체 (TRAIL 수용체 1, 2, 3, 및 4를 포함), 및 사망 도메인, 가령 Fas 또는 아폽토시스-유도 수용체 (AIR)를 포함하는 수용체.

본 발명을 이용하여 생산될 수 있는 다른 단백질은 분화 항원 (CD 단백질이라고 언급됨) 또는 그들의 리간드 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질을 포함한다. 이러한 항원은 Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japan, 1996)에서 개시된다. 유사한 CD 단백질은 차후 연구회에서 개시된다. 이러한 항원의 예시는 CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, 이의 리간드 (CD27 리간드, CD30 리간드, 등)를 포함한다. 여러 가지 CD 항원은 TNF 수용체 패밀리의 구성원이고, 이는 또한 41BB 및 OX40을 포함한다. 리간드는 종종 41BB 리간드 및 OX40 리간드와 같은, TNF 패밀리의 구성원이다.

효소로 활성인 단백질 또는 그들의 리간드도 또한 본 발명을 이용하여 생산될 수 있다. 예시는 다음 단백질 또는 그들의 리간드 중 하나 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질을 포함한다: 디스인테그린 및 메탈로프로테이나아제 도메인 패밀리 구성원, 가령 TNF-알파 전환 효소, 다양한 키나아제, 글루코세레브로시다아제, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 조직 플라스미노겐 활성자, 인자 VIII, 인자 IX, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 A-I, 글로빈, IL-2 길항제, 알파-1 항트립신, 상기-언급된 효소 중 어느 하나에 대한 리간드, 및 수많은 기타 효소 및 그들의 리간드.

용어 "항체"는 임의의 이소타입 또는 서브클래스(subclass)의 글리코실화 및 비-글리코실화 면역글로불린 둘 모두에 대한 또는 달리 명시되지 않는 한, 인간, 인간화, 키메라, 다중-특이적, 단일클론, 다클론, 및 올리고머 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한, 특이적인 결합을 위한 완전 항체와 경쟁하는 이의 항원-결합 부위에 대한 언급을 포함한다. 항원 결합 단편 또는 부위, 가령 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 디아바디, Fd, dAb, 맥시바디, 단쇄 항체 분자, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 표적 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하는 데에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부분을 함유하는 폴리펩티드를 갖는 단백질이 또한 포함된다. 용어 "항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 형성되거나 또는 단리된 것들, 가령 항체를 발현시키기 위해 형질감염된 숙주세포로부터 단리된 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

항체의 예시는 상기-언급된 단백질 및/또는 다음 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 단백질 중 임의의 하나 또는 조합을 인식하는 것들을 포함하지만, 이제 제한되지 않는다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 서브유닛(subunit), FGL2, PDGF-β 및 이들의 유사체 (미국 특허 번호 제5,272,064호 및 제5,149,792호를 참고), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, EGF 수용체 (미국 특허 번호 제6,235,883호를 참고) VEGF 수용체, 간세포 성장 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인테페론 감마, B 림프구 자극기 (BlyS, 또한 BAFF, THANK, TALL-1, 및 zTNF4로도 공지됨; Do and Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25를 참조), C5보체, IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, LCG (폐암과 연관하여 발현되는 유전자 산물임), HER-2, HER-3, 종양-연관 글리코단백질 TAG-72, SK-1 항원, 결장 및/또는 췌장암을 가진 환자의 혈청에서 상승된 수준으로 존재하는 종양-연관 에피토프, 가슴, 결장, 편평상피 세포, 전립선, 췌장, 폐, 및/또는 신장 암 세포에서 및/또는 흑색종, 신경교종, 또는 신경아세포종 세포에서 발현되는 암-연관 에피토프 또는 단백질, 종양의 괴사 중심, 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, TRAIL 수용체 1, 2, 3, 및 4, RANK, RANK 리간드, TNF-α, 부착 분자 VAP-1, 상피세포 부착 분자 (EpCAM), 세포간 부착 분자-3 (ICAM-3), 류코인테그린 부착소, 혈소판 글리코단백질 gp IIb/IIIa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, rNAPc2 (인자 VIIa-조직 인자의 저해제임), MHC I, 암배아 항원 (CEA), 알파-태아단백질 (AFP), 종양 괴사 인자 (TNF), CTLA-4 (세포독성 T 림프구-연관 항원임), Fc-γ-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, 스클레로스틴, L-셀렉틴, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 간염 B 바이러스 (HBV), 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphlycoccus aureus). 본 발명의 방법을 이용하여 생산될 수 있는 공지된 항체의 특정 예시는 안달리무맙(adalimumab), 베바시주맙(bevacizumab), 인플릭시맙(infliximab), 압식시맙(abciximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 밥피뉴주맙(bapineuzumab), 바실릭시맙(basiliximab), 벨리무맙(belimumab), 브리악키누맙(briakinumab), 카낙키누맙(canakinumab), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 세툭시맙(cetuximab), 코나투무맙(conatumumab), 데노수맙(denosumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 젬투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin), 골리무맙(golimumab), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 라베투주맙(labetuzumab), 마파투무맙(mapatumumab), 마투주맙(matuzumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 모타비주맙(motavizumab), 무로모납(muromonab)-CD3, 나탈리주맙(natalizumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 오말리주맙(omalizumab), 오레고보맙(oregovomab), 팔리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 펨투모맙(pemtumomab), 페르투주맙(pertuzumab), 라니비주맙(ranibizumab), 리툭시맙(rituximab), 로벨리주맙(rovelizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 베톨리조맙(vedolizomab), 잘루투무맙(zalutumumab), 및 자놀리무맙(zanolimumab)을 포함하지만 이제 제한되지 않는다.

본 발명은 예를 들어 임의의 상기-언급된 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질을 생산하는 데에 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기-언급된 단백질 중 하나 플러스 다중체화 도메인, 가령 류신 지퍼, 또꼬인 나선(coiled coil), 면역글로불린의 Fc 일부분, 또는 실질적으로 유사한 단백질을 포함한 재조합 융합 단백질이 본 발명의 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 가령, WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hakansson et al.(1999), Structure 7:255-64를 참조. 이러한 재조합 융합 단백질 중 특이적으로 포함되는 것은 수용체의 일부분이 에타네르셉트 (p75 TNFR:Fc), 및 벨라타셉트 (CTLA4:Fc)와 같은 항체의 Fc 일부분에 융합되는 단백질이다.

본 출원에서 사용된 전문용어가 해당 분야 내에서 표준이지만, 청구범위의 의미에 대한 명확성 및 한정됨을 분명히 하기 위해 특정 용어의 정의가 본 명세서에서 제공된다. 단위, 접두사, 및 기호는 그들의 SI 허용 형식으로 나타날 수 있다. 본 명세서에서 인용된 수 범위는 범위를 정의하는 수를 포함하고 그리고 정의된 범위 내의 정수 각각을 포함하고 지원한다. 본 명세서에서 설명된 방법 및 기술은 해당 분야에서 잘 공지된 기존의 방법에 따라 그리고 달리 명시되지 않는 한 본 명세서를 통하여 인용되고 논의된 다양한 여러 가지 일반적 및 더욱 특이적인 참고문헌에서 설명된 바와 같이 일반적으로 수행된다. 가령, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)를 참조. 특허, 특허 출원, 글, 책, 및 논문을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 출원에서 인용된, 모든 문헌, 또는 문헌의 부분은 참조로서 본 명세서에 명확하게 편입된다. 본 발명의 구체예에서 설명된 것은 본 발명의 다른 구체예와 결합될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 개별적인 측면의 단일 예시로서 의도되는 본 명세서에서 설명된 특정 구체예에 의한 범위에 제한되지 않으며, 그리고 기능적으로 등가의 방법 및 성분은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본 명세서에서 보여주고 설명된 이들 외에도, 본 발명의 다양한 변경은 전술한 설명 및 첨부한 도면으로부터 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이다. 이러한 변경은 첨부된 청구범위의 범위 내로 포함되는 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1

이 실험은 회분식 또는 유가식 공급 방법을 이용하여 그 다음 교대 접면 유동 여과를 이용한 연속 관류를 이용하여 상이한 스타트 업(start up) 조건을 비교한다. 관류는 관류 이전에 추가적인 공급 없이 초기 기하급수적인 성장 단계 ("회분식" 스타트 업) 동안의 초기에 또는 기하급수적인 단계 말에 시작되었고 그리고 관류 이전에 무-혈청 정의된 공급 배지의 여러 가지 볼러스 공급물을 받는 정지 또는 생산 단계 ("유가식" 스타트 업) 내로 진입하였다.

제0일에, 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포를 유가식 시작의 경우 1500 mL 무-혈청 정의된 배지 및 회분식 시작의 경우 1800mL의 작업 용적내 1x10⁶개 생세포/mL로 2L 생산 생물반응기 내로 접종하였다. 배양은 36℃에서 유지시키고, 용존 산소량 (DO)은 30%로, 교반은 215 RPM으로 유지시켰다. 글루코오스는 0 g/L를 초과하고 8 g/L 미만으로 유지시켰다.

관류는 회분식 배양의 경우 제4일 (0.25 용적/일)에 그리고 유가식 배양의 경우 제7일 (0.75 용적/일)에 시작하였다. 교대 접면 유동 관류 및 여과 시스템 (Refine Technologies, Hanover, NJ, 50 kDa 중공 섬유 여과기)을 이용하여 관류를 완수하였다. 관류를 시작하기 이전에 유가식 배양은 제4일 (7.5%의 초기 작업 용적) 및 제6일 (10% 초기 작업 용적)에 농축 무-혈청 정의된 공급 배지의 볼러스 공급물을 받았다. 관류 속도는 표 1에서 제공된다.

배양 운용 동안에, 일일 샘플을 채취하여 배양을 평가하였다. Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA)을 이용하여 생세포 밀도 (VCD) 및 생존력을 측정하였다. HPLC 분석으로 역가를 측정하였다. VoluPAC (Sartorius, Goettingen, Germany)을 이용하여 충전 세포 용적을 측정하였다.

온도 전환 (36.0℃에서 33.0℃로)은 생세포 밀도가 20 x 10⁶개 생세포/mL를 초과하였을 때 적용되었으며, 이는 회분식 및 유가식 시작 조건에 대해 각각 제7일 및 제11일이었다.

회분식 스타트-업 조건의 경우, 생세포 밀도는 관류가 시작되고 난 후에도 계속 증가하였고; 유가식 시작 조건의 경우, 관류는 세포 배양이 거의 성장이 없이 정체기 또는 정지 단계에 도달한 후 시작되었다. 제15일에, 유가식에 대한 생세포 밀도는 27.7 내지 30.7 x 10⁶개 생세포/mL였고 반면에 회분식 배양의 VCD는 22.5 내지 27.4 x 10⁶개 생세포/mL였다 (도 1A). 유가식 배양의 생존력은 73.9 내지 77.5%였고 반면에 회분식 배양의 생존력은 72.5 내지 83.1%였다 (도 1B). 유가식 배양의 역가는 15.3 내지 16.1 g/L였고 반면에 회분식 배양 역가는 10.6 내지 12.3 g/L였다 (도 1C). 통합된 가변 세포 밀도 (IVCD) 값이 제15일까지 모든 네 가지 배양과 유사하였기 때문에 (대략 230 x 10⁶개 세포 일/mL), 특정 생산성은 유가식 스타트-업 조건에서 더욱 높았다. 유가식 배양은 제24일까지 계속 하였다. 20 g/L의 역가가 20일에 달성되었다.

유가식 스타트-업을 이용한 교대 접면 유동 관류는 증가된 생산성을 야기하였으며, 이는 회분식 시작 방법과 비교하여 더 생산적인 상태로 세포를 유지하였다.

실시예 2

제0일에, 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포를 회분식 시작의 경우 1500 mL 무-혈청 정의된 배지 및 유가식 시작의 경우 1300mL의 작업 용적내 1x10⁶개 생세포/mL로 2L 생산 생물반응기 내로 접종하였다. 회분식 배양의 경우 배양은 36℃에서 유지시키고, DO는 30%로, 교반은 215 RPM으로 유지시켰다. 유가식 배양은 430RPM으로 교반하였다. 관류 이전에 매일 7 g/L 글루코오스를 유가식 배양에 공급하였고 모든 배양은 관류 동안 4 g/L 이상의 글루코오스로 유지시켰다. 관류 (교대 접면 유동)는 회분식 배양의 경우 제4일 (0.25 용적/일)에 그리고 유가식 배양의 경우제8일 (0.75 용적/일)에 시작하였다. 관류를 시작하기 이전에 유가식 배양은 제4일 (7.5%의 초기 작업 용적) 및 제6일 (10% 초기 작업 용적)에 농축 무-혈청 정의된 공급 배지의 볼러스 공급물을 받았다. 관류 유속 설정은 표 2에서 제공된다. 배양은 21일 동안 유지시켰다.

배양 운용 동안에, 일일 샘플을 상기 설명된 바와 같이 채취하여 배양을 평가하였다.

온도 전환 (36.0℃에서 33.0℃로)은 생세포 밀도가 실시예 1에서와 같이, 20 x 10⁶개 생세포/mL를 초과하였을 때 제6일에 회분식 배양에 적용되었다. 유가식 배양은 배양의 지속기간 동안 36.0℃로 유지시켰다.

회분식 스타트-업 방법 배양은 상기 설명된 것들과 유사한 결과를 가졌으며 여기서 세포는 제10일 후 성장 없이 대략 20 내지 25×10⁶개 생세포/mL에 도달하였다. 유가식 배양은 20 x 10⁶개 생세포/mL 아래로 대부분의 배양 지속기간을 보낸 후 제20일에 거의 30 x 10⁶개 생세포/mL에 도달하였다, 도 2A를 참조. 생존력은 모두 제10일까지 80% 초과로 남아있었으며 이후 회분식 시작 배양의 경우 제20일까지 약 40%로 그리고 유가식 배양의 경우 60%로 하락하였다, 도 2B를 참조. 역가는 회분식 시작 배양의 경우 거의 15 g/L에서 정점에 이르렀지만, 높은 교반 유가식 배양의 경우 역가는 20 g/L 초과하여 도달하였다, 도 2C를 참조. 회분식 시작 배양은 제3일에 약 3 내지 4mM의 L-아스파라긴 농도를 가졌고, 아스파라긴 제한된 배양 환경을 경험하지 않았다는 점을 관찰하였다. 하지만, 유가식 관류 시작 배양은 제7일에 관류 시작 이전에 제6일까지 L-아스파라긴 제한된 환경을 경험하였다. 이후 2.0 g/L (또는 13.3 mM)의 농도의 L-아스파라긴을 함유하는 배지로 배양을 관류하였고 이는 제8일 후 더 이상의 L-아스파라긴 제한을 야기하지 않았다 (도 2D). 글루코오스 농도는 대개 4 내지 10 g/L로 유지시켰다.

높은 교반 관류 배양을 이용한 유가식 스타트-업은 20일 내로 회분식 스타트-업 배양보다 5 g/L 이상 더 높은, 가장 높은 역가 (20 g/L 초과)를 달성하였으며, 이는 상기 설명된 결과와 유사하였다. 더 높은 교반 속도의 부정적인 영향은 관찰되지 않았다. 일정한 온도를 유지하는 것이 유가식 배양에 부정적으로 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

실시예 3

이 실험은 상기 설명된 바와 같이 유가식 스타트-업을 이용한 교대 접면 유동 관류 상에서 관류 용적 및 온도 전환의 효과를 특징화한다. 모든 배양은 제7일에 시작한 관류로 유가식 시작이었다. 4분의 3(three-quarter) 작업 용적 내지 전체 용적으로 또는 전체 작업 용적에서 4분의 3 작업 용적으로 바뀌는 관류 유속을 검사하였다. 제14일에 36℃에서 33℃로의 온도 전환을 또한 검사하였다.

제0일에, 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포를 1200 mL 무-혈청 정의된 배지의 작업 용적내 1x10⁶개 세포/mL로 2L 생산 생물반응기 내로 접종하였다. 배양은 36℃에서 유지시키고, DO는 30%로 유지시켰다. 관류 이전에, 매일 7 g/L로 글루코오스를 공급하였고 관류 동안에 글루코오스는 1 g/L 초과로 유지시켰다. 배양은 20일 동안 유지시켰다.

배양은 제4일 (7.5%의 초기 작업 용적) 및 제6일 (10% 초기 작업 용적)에 농축 무-혈청 정의된 공급 배지의 볼러스 공급물을 받았다. 관류는 제8일에 시작하였다. 관류 속도는 표 3에서 제공된다. 군 각각으로부터의 하나의 배양은 제15일에 36℃에서 33℃의 온도 전환을 가졌고, 다른 배양은 실험 지속기간 동안 36℃로 남아있었다.

온도 전환 및 관류 속도는 생세포 밀도에 영향을 미치지 않았다, 도 3A를 참조. 하지만, 온도 전환은 배양의 후속 시점에 생존력을 보존하는 것을 돕는 것으로 나타난다. 제15일에서부터 시작하여 온도 전환 조건 사이에서 돌출부(break out)가 있는 것으로 나타난다. 온도 전환된 배양의 생존력은 36℃로 남아있는 배양보다 더 느리게 하락하였다, 도 3B를 참조. 역가에 관하여, 세 가지 배양은 제15일 (17.1-17.9 g/L)에 그리고 제20일 (22-24 g/L)에 매우 유사한 역가를 보여주었지만, 한 가지 배양은 제15일 (21.58 g/L)에 그리고 제20일(28.33 g/L)에 더 높은 역가를 가졌다 (도 3C를 참조). 온도 또는 관류 속도 어느 것도 역가 생산에 어떠한 영향을 갖는 것으로 나타나지 않았으며, 이는 배양이 상이한 관류 속도로 유지될 수 있다는 점을 제시한다.

실시예 4

이 실험은 생산 단계 동안 생세포 밀도에서의 L-아스파라긴 제한된 또는 비-제한된 배양 환경 중 하나를 이용한 관류 배지 아스파라긴 농도 및 관류 시작 조건의 효과를 조사하기 위해 설계되었다.

제0일에, 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포를 회분식 및 유가식 시작 방법 둘 모두에 대해 1500 mL의 작업 용적내 1x10⁶개 세포/mL로 2L 생산 생물반응기 내로 접종하였다. 배양은 36℃에서 유지시키고, 용존 산소량 (DO)은 30%로, 교반은 400 RPM으로 유지시켰다. 구멍이 뚫린 파이프 또는 소결된 스파저 중 하나를 이용하여 살포를 수행하였다. 글루코오스는 0 g/L를 초과하고 8 g/L 미만으로 유지시켰다.

회분식 시작 "비-아스파라긴-제한 배지"의 경우 제3일 (0.29 용적/일)에 그리고 유가식 "아스파라긴-제한 배지"의 경우 제7일 (0.48 용적/일)에 관류 (교대 접면 유동)를 시작하였다. 회분식 배양 배지는 10 mM L-아스파라긴을 함유하였다. 관류를 시작하기 이전에 유가식 배양은 113.4mM L-아스파라긴을 함유하여 제3일 및 제6일 (7% 초기 작업 용적)에 농축 무-혈청 정의된 공급 배지의 볼러스 공급물을 받았다. 관류 배지 아스파라긴 농도는 대조군 농도 (무혈청 정의된 관류 배지 중 17.3 mM Asn) 또는 낮은 농도 (무혈청 정의된 관류 배지 중 5 mM Asn) 중 하나였다. 상기 설명된 바와 같이 관류를 수행하였다. 관류 속도는 표 4에서 제공된다.

배양 운용 동안에, 일일 샘플을 채취하여 배양을 평가하였다. Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA)을 이용하여 생세포 밀도 (VCD) 및 생존력을 측정하였다. HPLC 분석으로 역가를 측정하였다. 모든 배양은 36℃로 유지시켰다.

배양 배지에서 아스파라긴을 제한함으로써 생산 단계 동안 세포 성장에서의 감소 및 개선된 생산성을 달성하였다. 제15일에, 최대 생세포 밀도는 낮은 아스파라긴을 갖는 유가식 시작 배양의 경우 약 17.0 x 10⁶개 생세포/mL였다 (도 4A). 대조군 수준 아스파라긴 배양은 40×10⁶개 생세포/mL를 초과하는 생세포 밀도에 도달하였다 (>30% 충전 세포 용적). 낮은 아스파라긴 유가식 배양의 생존력은 67.1%였으며 반면에 회분식 배양 생존력은 55.1%였고 대조군은 69%였다 (도 4B). 낮은 유가식 배양의 충전 세포 용적 조정 역가는 17.0 g/L (충전 세포 용적에 대해 조정됨) 이었고 반면에 회분식 배양 역가는 15.4 g/L였다 (도 4C). 대조군은 10.2 내지 12.9 g/L (회분식 시작) 및 14.2 내지 15.9 g/L (유가식 시작)의 역가를 가졌다.

생산 동안 5 mM 이하로 아스파라긴 수준을 유지하는 것은 성장-저지를 야기하였고, 생산성을 자극하였고 그리고 생산 단계 동안에 생존력을 유지시켰다.

실시예: 5

이 실험은 관류 동안의 배지 조건을 비교한다. 이 2L 생물반응기 실험에서, 세포를 1.5L의 작업 용적으로 화학적으로 정의된 회분식 배지 내로 접종하였고, 3일 동안 배양하였고 그리고 이후 17.3 mM L-아스파라긴 및 4.6 mM L-글루타민 또는 5 mM L-아스파라긴 및 10 mM L-글루타민을 함유한 화학적으로 정의된 관류 배지를 이용하여 12일 동안 관류하였다. 30 kDa 중공 섬유 여과기 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)가 있는 교대 접면 유동 관류 및 여과 시스템 (Refine Technologies, Hanover, NJ)을 이용하여 관류를 완수하였다. 관류는 1일 당 0.3 배양 용적의 속도로 제3일에 시작하였다. 관류 속도는 하기 표 5에서 명시된 바와 같이 제4일, 제9일, 및 제11일에 증가되었다. 배양은 36℃에서 유지시키고, DO는 30%로, pH는 7.0으로, 그리고 교반은 400 rpm으로 유지시켰다.

아스파라긴 제한은 더 적은 세포의 축적 및 개선된 생산성을 야기하였다. 5 mM 아스파라긴을 함유한 배지로 관류된 배양은 8.16 x 10⁷ - 8.54 x 10⁷개 세포/mL의 최대 VCD에 도달하였고 반면에 17.3 mM 아스파라긴을 함유한 배지로 관류된 배양은 11.9 x 10⁷ - 12.2 x 10⁷개 세포/mL에 도달하였다 (도 5A). 17.3 mM 아스파라긴내 배양이 더 많은 세포를 가졌지만, 5 mM 아스파라긴내 배양이 더 많은 산물을 만들었다. 17.3 mM 아스파라긴을 함유한 배지로 관류된 배양은 5 mM 아스파라긴을 함유한 배지로 관류된 배양에 대한 7.59-8.15 g/L (5.01 - 5.38 g/L 충전 세포 용적 조정)와 비교하여 6.89-7.18 g/L (4.33 - 4.67 g/L 충전 세포 용적 조정)를 만들었다 (도 5B 및 5D). 5 mM 아스파라긴 배양의 최종 충전 세포 용적 (PCV)은 17.3 mM 아스파라긴 배양보다 약간 더 낮은 경향이 있었고 (도 5C) 그리고 배양 생존력에서는 차이점이 없었다 (도 5E).

흥미롭게도, 이 실시예에서 낮은-아스파라긴 조건에서 두 배 이상까지 글루타민의 농도 증가 (4.6 mM 대 10 mM 글루타민)는 배양의 성장을 저지하기 위한 낮은-아스파라긴 배지의 능력을 방해하지 않았다.

실시예 6

이 실시예는 벤치 및 파일럿 규모에서 성장을 제어하기 위해 아스파라긴 제한을 이용한 ATF 관류 공정에서 배양된 클론, 항체-발현 CHO 세포주의 수행을 비교한다. 벤치-규모 모델은 2L 생물반응기을 이용하였고 파일럿 규모는 500 L였다. 벤치 규모에서, 세포를 1.5L의 작업 용적으로 화학적으로 정의된 회분식 배지 내로 접종하였고 그리고 파일럿 규모에서 작업 용적은 약 378L였다. 세포를 회분식 배지에서 3일 동안 배양하였고 그리고 이후 5 mM L-아스파라긴 및 10 mM L-글루타민을 함유한 화학적으로 정의된 관류 배지를 이용하여 12일 동안 관류하였다. 30 kDa 중공 섬유 여과기 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)가 있는 교대 접면 유동 관류 및 여과 시스템 (Refine Technologies, Hanover, NJ)을 이용하여 관류를 완수하였다. 관류는 1일 당 0.3 배양 용적의 속도로 제3일에 시작하였다. 관류 속도는 하기 표 6에서 명시된 바와 같이 제4일, 제9일, 및 제11일에 증가되었다. 배양은 36℃, 30% DO, 및 pH 6.9로 유지시켰다.

배양 운용 동안에, 일일 샘플을 채취하여 배양을 평가하였다. Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA)을 이용하여 벤치 규모로 그리고 CEDEX (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 이용하여 파일럿 규모로 생세포 밀도 (VCD) 및 생존력을 측정하였다. HPLC 분석으로 역가를 측정하였다. VoluPAC (Sartorius, Goettingen, Germany)을 이용하여 충전 세포 용적을 측정하였다.

네 가지 벤치 규모 배양 및 두 가지 파일럿 규모 배양으로부터의 데이터가 제공된다. VCD 곡선은 둘 모두의 규모에서 유사하였고, 성장 제어가 달성되었고 (도 6A), 그리고 전체 세포 질량 (충전 세포 용적)은 둘 모두의 규모에서 30% 아래로 유지되었다 (도 6C). VCD가 약 제10일 또는 제11일에 정체기에 도달하였지만, 충전 세포 용적은 약 제13일 또는 제14일까지 계속 증가하였다 (도 6C). 생산성은 또한 규모들 사이에서 비슷하였다. 5 mM 아스파라긴을 함유한 배지로 관류된 배양은 500 L 파일럿 규모에서의 15.0 - 17.3 g/L (10.6 - 12.8 g/L 충전 세포 용적 조정)와 비교하여 2L 벤치 규모에서 14.2 - 15.7 g/L (10.7 - 11.4 g/L 충전 세포 용적 조정)를 만들었다 (도 6B 및 6D). 생존력은 파일럿 규모에서 약간 더 낮은 경향이 있었다 (도 6E).

Claims

재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물에서의 세포 성장을 저지하는 방법으로서,
생물반응기 내 무-혈청 배양 배지 중에 포유동물 세포 배양물을 확립하는 단계;
5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계; 및
5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 성장-저지 상태의 포유동물 세포를 유지시키는 단계
를 포함하는 방법.
재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물에서의 재조합 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서,
생물반응기 내 무-혈청 배양 배지 중에 포유동물 세포 배양물을 확립하는 단계;
5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계; 및
5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 성장-저지 상태의 포유동물 세포를 유지시키는 단계
를 포함하는 방법.
재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물을 원하는 충전 세포 용적(packed cell volume)으로 제한하는 방법으로서,
생물반응기 내 무-혈청 배양 배지 중에 포유동물 세포 배양물을 확립하는 단계;
5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계; 및
5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 성장-저지 상태의 포유동물 세포를 유지시키는 단계
를 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류를 배양 제3일에 또는 그 전에 시작하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 성장-저지의 유도를 생산 단계 이전에 수행하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 성장-저지의 유도를 생산 단계 동안 수행하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 성장-저지가 L-아스파라긴 고갈에 의해 유도되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 36℃에서 31℃로의 온도 전환을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 36℃에서 33℃로의 온도 전환을 추가로 포함하는 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 온도 전환을 성장 단계와 생산 단계 사이의 전이시에 수행하는 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 온도 전환을 생산 단계 동안 수행하는 방법.
재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 방법으로서,
생물반응기 내 무-혈청 배양 배지 중에 포유동물 세포 배양물을 확립하는 단계;
성장 단계 동안 포유동물 세포를 성장시키고, 배양 배지에 무-혈청 공급 배지의 볼러스(bolus) 공급물을 보충하는 단계; 및
생산 단계 동안 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 포유동물 세포를 유지시키고, 생산 단계 동안의 충전 세포 용적이 35% 이하인 단계
를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 관류를 세포 배양 제5일에 또는 약 제5일 내지 제9일에 또는 약 제9일에 시작하는 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 관류를 세포 배양 제5일에 또는 약 제5일 내지 제7일에 또는 약 제7일에 시작하는 방법.
제12항에 있어서, 세포가 생산 단계에 도달했을 때 관류를 시작하는 방법.
제12항에 있어서, L-아스파라긴 고갈, 및 이후 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 5 mM 이하의 L-아스파라긴 농도를 갖는 무-혈청 관류 배지를 이용한 관류로 세포 성장-저지를 유도하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도가 5 mM 이하인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도가 4.0 mM 이하인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도가 3.0 mM 이하인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도가 2.0 mM 이하인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도가 1.0 mM 이하인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 무-혈청 관류 배지 중 L-아스파라긴의 농도가 0 mM인 방법.
제7항 또는 제16항에 있어서, 세포 배양 배지의 L-아스파라긴 농도를 L-아스파라긴 고갈 이전 및 상기 고갈 동안 모니터링하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생산 단계 동안의 충전 세포 용적이 35% 이하인 것을 추가로 포함하는 방법.
제12항 또는 제25항에 있어서, 충전 세포 용적이 35% 이하인 방법.
제12항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 충전 세포 용적이 30% 이하인 방법.
제12항 또는 제25항에 있어서, 충전 세포 용적 35% 이하의 포유동물 세포 배양물 중 생세포 밀도가 10×10⁶개 생세포/mL 내지 80×10⁶개 생세포/mL인 방법.
제28항에 있어서, 포유동물 세포 배양물 중 생세포 밀도가 20×10⁶개 생세포/mL 내지 30×10⁶개 생세포/mL인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 관류가 연속 관류를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 관류 속도가 일정한 것인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 관류를 1일 당 1.0 작업 용적(working volume) 이하의 속도로 수행하는 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 동안의 관류를 생산 단계 동안 1일 당 0.25 작업 용적에서 1일 당 1.0 작업 용적으로 증가하는 속도로 수행하는 방법.
제12항에 있어서, 관류를 세포 배양 제9일 내지 제11일에 1일 당 1.0 작업 용적에 도달하는 속도로 수행하는 방법.
제12항 또는 제34항에 있어서, 관류를 세포 배양 제10일에 1일 당 1.0 작업 용적에 도달하는 속도로 수행하는 방법.
제12항에 있어서, 무-혈청 공급 배지의 볼러스 공급을 세포 배양 제3일 또는 제4일에 시작하는 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포 배양물이, 무-혈청 배양 배지 중 적어도 0.5×10⁶ 내지 3.0×10⁶개 세포/mL를 생물반응기에 접종함으로써 확립되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항, 제12항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포 배양물이, 무-혈청 배양 배지 중 적어도 0.5×10⁶ 내지 1.5×10⁶개 세포/mL를 생물반응기에 접종함으로써 확립되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 36℃에서 31℃로의 온도 전환을 추가로 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 36℃에서 33℃로의 온도 전환을 추가로 포함하는 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, 온도 전환을 성장 단계와 생산 단계 사이의 전이시에 수행하는 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, 온도 전환을 생산 단계 동안 수행하는 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 관류가 교대 접면 유동(alternating tangential flow)에 의해 달성되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 적어도 500 L의 용량을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항, 제12항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 적어도 500 L 내지 2000 L의 용량을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항, 제12항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 적어도 1000 L 내지 2000 L의 용량을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) (CHO) 세포인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질이 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질, 또는 사이토카인으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양에 의해 생산된 재조합 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양에 의해 생산된 재조합 단백질을 정제하고 제약학적으로 허용가능한 제제로 조제하는 방법.
제2항에 있어서, 포유동물 세포 배양물에서의 재조합 단백질 생산이, 세포가 L-아스파라긴에 의해 유도된 세포 성장-저지를 받지 않는 배양물과 비교하여 증가되는 것인 방법.