JP5897708B2 - 哺乳類細胞培養物 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳類細胞を培養するための方法を提供する。本方法は、より高い細胞増殖制御を提供し、高産物力価の細胞培養物を得る。

より多くの量の治療用組換えタンパク質に対する需要が徐々に高まっているため、細胞増殖、生存率、およびタンパク質産生の顕著な増加は、細胞発生、培地最適化、およびプロセス制御パラメータを改善する新たな方法を実装することによって模索されている。現在、プロセス最適化、具体的には、細胞培養物を成長させ、それに流加し、かつその産生を維持するための方法および戦略に対する多大な努力がなされている。

大規模細胞培養プロセスの費用、ならびにより多くの量およびより低価の生物学的産物に対する高まる需要を考慮すると、組換えタンパク質産生における均一かつ漸進的な改善を提供する新たな細胞培養方法が有益である。

より高い産生レベルにつながり、したがって、タンパク質治療薬の製造に関連する費用を削減し得る細胞培養プロセス、組換えポリペプチド発現、力価、および細胞生存率の改善が必要とされている。本発明は、タンパク質産生を増加させながら、細胞増殖を制御する単純かつ簡単な安価の方法を提供することによって、これらの要求を満たす。

本発明は、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養物における細胞増殖を停止させる方法を提供し、本方法は、バイオリアクター内の無血清培養培地中に哺乳類細胞培養物を確立することと、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって細胞増殖停止を誘導することと、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって哺乳類細胞を増殖停止した状態に維持することとを含む。

本発明は、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養物における組換えタンパク質産生を増加させる方法も提供し、本方法は、バイオリアクター内の無血清培養培地中に哺乳類細胞培養物を確立することと、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって細胞増殖停止を誘導することと、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって哺乳類細胞を増殖停止した状態に維持することとを含む。関連実施形態において、哺乳類細胞培養物における組換えタンパク質産生は、細胞がＬ−アスパラギンによって誘導される細胞増殖停止に供されない培養物と比較して、増加する。

本発明は、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養物を所望の血中血球容積に制限する方法も提供し、本方法は、バイオリアクター内の無血清培養培地中に哺乳類細胞培養物を確立することと、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって細胞増殖停止を誘導することと、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって哺乳類細胞を増殖停止した状態に維持することとを含む。

本発明の一実施形態において、上述の方法のうちのいずれかにおいて、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流は、培養の３日目または３日目よりも前に始まる。別の実施形態では、上述の方法のうちのいずれかにおいて、細胞増殖停止の誘導は、産生期の前に起こる。別の実施形態では、上述の方法のうちのいずれかにおいて、細胞増殖停止の誘導は、産生期中に起こる。別の実施形態では、上述の方法のうちのいずれかにおいて、細胞増殖停止は、Ｌ−アスパラギン欠乏によって誘導される。さらに別の実施形態において、上述の方法のうちのいずれかは、３６℃から３１℃への温度変化をさらに含む。別の実施形態では、上述の方法のうちのいずれかは、３６℃から３３℃への温度変化をさらに含む。関連実施形態において、温度変化は、増殖期と産生期との間の遷移時に生じる。さらに別の実施形態において、温度変化は、産生期中に生じる。別の実施形態では、上述の方法は、産生期中に３５％以下の血中血球容積をさらに含む。関連実施形態において、産生期中の血中血球容積は、３５％以下である。

本発明は、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を培養する方法も提供し、本方法は、バイオリアクター内の無血清培養培地中に哺乳類細胞培養物を確立することと、増殖期中の哺乳類細胞を成長させて、培養培地を無血清流加培地の複数回のボーラス流加で補充することと、無血清灌流培地での灌流によって産生期中の哺乳類細胞を維持することとを含み、産生期中の血中血球容積は、３５％以下である。本発明の一実施形態において、灌流は、細胞培養の５日目または５日目頃〜９日目または９日目頃に始まる。関連実施形態において、灌流は、細胞培養の５日目または５日目頃〜７日目または７日目頃に始まる。一実施形態において、灌流は、細胞が産生期に達したときに始まる。別の実施形態では、本方法は、Ｌ−アスパラギン欠乏によって細胞増殖停止を誘導し、その後、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地で灌流することをさらに含む。さらに別の実施形態において、方法は、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって細胞増殖停止を誘導することをさらに含む。

本発明の一実施形態において、無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの濃度は、５ｍＭ以下である。別の実施形態では、無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの濃度は、４．０ｍＭ以下である。別の実施形態では、無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの濃度は、３．０ｍＭ以下である。さらに別の実施形態において、無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの濃度は、２．０ｍＭ以下である。さらに別の実施形態において、無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの濃度は、１．０ｍＭ以下である。さらに別の実施形態において、無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの濃度は、０ｍＭである。別の実施形態では、灌流は、１日当たり０．２５作業量（産生期中）から１日当たり１．０作業量（細胞培養中）に増加する速度で行われる。関連実施形態において、灌流は、細胞培養の９日目〜１１日目に１日当たり１．０作業量に達する速度で行われる。別の関連実施形態において、灌流は、細胞培養の１０日目に１日当たり１．０作業量に達する速度で行われる。さらに別の実施形態において、無血清流加培地の複数回のボーラス流加は、細胞培養の３日目または４日目に始まる。本発明の別の実施形態では、本方法は、３６℃から３１℃への温度変化をさらに含む。別の実施形態では、本方法は、３６℃から３３℃への温度変化をさらに含む。関連実施形態において、温度変化は、増殖期と産生期との間の遷移時に生じる。関連実施形態において、温度変化は、産生期中に生じる。

本発明の一実施形態において、細胞培養培地のＬ−アスパラギン濃度は、Ｌ−アスパラギン欠乏の前およびＬ−アスパラギン欠乏中に監視される。

本発明の一実施形態において、血中血球容積は、３５％以下である。関連実施形態において、血中血球容積は、３０％以下である。

本発明の一実施形態において、３５％以下の血中血球容積での哺乳類細胞培養物の生存細胞密度は、１０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜８０×１０^６生存細胞／ｍＬである。関連実施形態において、哺乳類細胞培養物の生存細胞密度は、２０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜３０×１０^６生存細胞／ｍＬである。

本発明の一実施形態において、灌流は、連続灌流を含む。

本発明の一実施形態において、灌流の速度は、一定である。

本発明の一実施形態において、灌流は、１日当たり１．０作業量以下の速度で行われる。

本発明の別の実施形態では、哺乳類細胞培養物は、バイオリアクターに無血清培養培地中の少なくとも０．５×１０^６〜３．０×１０^６細胞／ｍＬを播種することによって確立される。関連実施形態において、哺乳類細胞培養物は、バイオリアクターに無血清培養培地中の少なくとも０．５×１０^６〜１．５×１０^６細胞／ｍＬを播種することによって確立される。

本発明の別の実施形態では、灌流は、交互接線流によって達成される。

本発明の別の実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。関連実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。さらに別の関連実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。

本発明の別の実施形態では、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

本発明の別の実施形態では、組換えタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群から選択される。

本発明の別の実施形態では、上述の方法のうちのいずれかは、細胞培養によって産生される組換えタンパク質を回収するステップをさらに含む。

本発明の別の実施形態では、細胞培養によって産生される組換えタンパク質は、精製され、薬学的に許容される製剤に製剤化される。

流加バッチ開始：中実正方形（■）および中実円（●）バッチ開始：中空正方形（□）および中空円（○）。Ａ：生存細胞密度、Ｂ：生存率、Ｃ：力価 バッチ開始：中空円（○）、高撹拌で流加バッチ開始：中空正方形（□）Ａ 生存細胞密度、Ｂ 生存率、Ｃ 力価、Ｄ アスパラギン濃度 開始灌流量１．０、温度変化なし：中実円。開始灌流量１．０、温度変化あり：中空円（○）。開始灌流量０．７５、温度変化なし：中実正方形（■）。開始灌流量０．７５、温度変化あり：中空正方形（□）。Ａ 生存細胞密度、Ｂ 生存率、Ｃ 力価 低アスパラギン量でバッチ開始：中空三角形（Δ）。対照Ｌ−アスパラギン量でバッチ開始：中実三角形（▲）。低Ｌ−アスパラギン量で流加バッチ開始：中空ひし形（◇）。対照Ｌ−アスパラギン量で流加バッチ開始：中実ひし形（◆）。ドリルパイプで散布：実線。焼結スパージャーで散布：点線。Ａ 生存細胞密度、Ｂ 生存率、Ｃ ＰＣＶ調整力価 １７．３ｍＭまたは５ｍＭのＬ−アスパラギンおよび４．６ｍＭまたは１０ｍＭのＬ−グルタミンを含有した培地中で成長した培養物。１７．３ｍＭのＬ−アスパラギンおよび４．６ｍＭのＬ−グルタミン：中実ひし形（◆）、または５ｍＭのＬ−アスパラギン、１０ｍＭのＬ−グルタミン：中空ひし形（◇）。Ａ 生存細胞密度。Ｂ 力価。Ｃ 血中血球容積（ＰＣＶ）。Ｄ ＰＣＶ調整力価。Ｅ 生存率。 ２Ｌのベンチ規模および５００Ｌのパイロット規模で、５ｍＭのＬ−アスパラギン、１０ｍＭのＬ−グルタミンでの培養物。２Ｌのベンチ規模で５ｍＭのＬ−アスパラギン、１０ｍＭのＬ−グルタミンを含有する培地は、中実ひし形（◆）で表され、５００Ｌのパイロット規模は、中空ひし形（◇）で表される。Ａ 生存細胞密度。Ｂ 力価。Ｃ 血中血球容積（ＰＣＶ）。Ｄ ＰＣＶ調整力価。Ｅ 生存率。Ａ 生存細胞密度。Ｂ 力価。Ｃ 血中血球容積（ＰＣＶ）。Ｄ ＰＣＶ調整力価。Ｅ 生存率。

組換えタンパク質産生中、細胞が増殖して所望の密度になり、その後、細胞の生理学的状態が、より多くの細胞を作製する代わりに、細胞がエネルギーおよび基質を使用して目的とする組換えタンパク質を産生する増殖停止された高生産性状態に切り替えられる制御されたシステムを有することが望ましい。温度変化および小分子誘導物質等の、この目標を達成するための方法は、必ずしも功を奏さず、産物の質に望ましくない影響を与え得る。本明細書に記載されるように、血中血球容積は、低Ｌ−アスパラギン条件に暴露して培養細胞において細胞増殖停止を誘導することによって産生期中に所望のレベルに制限され得る。細胞増殖停止は、Ｌ−アスパラギンの限界濃度を含有する灌流培養培地を使用し、かつ細胞培養において低Ｌ−アスパラギン濃度（５ｍＭ以下）を維持することによって達成および維持され得る。

増殖停止細胞は、増殖停止が低Ｌ−アスパラギンによって、またはＬ−アスパラギン欠乏を介して始まり、その後、増殖停止細胞が細胞培養および５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する灌流培地で維持されたときに生産性の増加を示したことも見出された。

増殖停止した高生産性の産生期は、Ｌ−アスパラギンの濃度を操作することによって達成され得る。本明細書に記載されるように、Ｌ−アスパラギンの枯渇は、増殖停止をもたらした。流加バッチ培養物において、細胞密度が十分に高くなった時点で（例えば、２０×１０^６生存細胞／ｍＬ以上）、培養物は、Ｌ−アスパラギンの消費および／またはＬ−アスパラギン酸塩への変換のため、繰り返しの流加にもかかわらず、Ｌ−アスパラギンを繰り返し欠乏した。細胞培養物において、細胞外Ｌ−アスパラギンは、Ｌ−アスパラギン酸塩およびアンモニアに変換され得る。Ｌ−アスパラギンの枯渇は、細胞周期停止をもたらした。Ｌ−アスパラギンが培養物中に存在する流加バッチ期間中、生産性の増加につながり、Ｌ−アスパラギンが枯渇した期間は、生産性の減少につながる。灌流システムにおいて、Ｌ−アスパラギンは常に供給され、したがって、全体の枯渇が回避され、より高い濃度のＬ−アスパラギンが維持され得、ゆえに、細胞が増殖し続けることを可能にし、かつＬ−アスパラギンの枯渇または制限を有する環境に暴露させない。十分に低い濃度（５ｍＭ以下の濃度等）でＬ−アスパラギンの濃度を制御することで、生存率を維持し、かつ増殖を制限しながら、細胞を高生産性状態に保つことができる。ボーラス流加および灌流流加を有するシステムにおいて、流加培地は、ボーラス流加中の高（成長促進）レベルのＬ−アスパラギンを含有する製剤から、灌流流加中のより低い（増殖停止）レベルのＬ−アスパラギンに切り替えられ得る。低レベルのＬ−アスパラギンを戻し添加することにより、Ｌ−アスパラギンの制限によって増殖停止した細胞培養物を刺激して、高生産性状態にすることができる。

工業規模の細胞培養および生物学的治療薬の製造について、細胞増殖を停止させる能力、および産生期中に細胞を増殖停止した状態で維持する能力が非常に望ましい。増殖停止した状態にあるときに同様に生産性を増加させるように誘導された細胞であり、かつこの生産性の増加を維持することができる細胞を有することは、製造目的に理想的である。

組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養物における細胞増殖を停止させる方法が本明細書に提供される。本方法は、細胞培養物を０ｍＭのＬ−アスパラギンを含む５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清培地に供することにより、哺乳類細胞培養物における細胞増殖停止を誘導することを含む。そのような誘導は、Ｌ−アスパラギン欠乏によって、または培養物を５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地で灌流することによって低Ｌ−アスパラギン環境を作成し、かつ培養物を低Ｌ−アスパラギン環境下で維持することによって始まり得る。その後、細胞培養物は、５ｍＭ以下の濃度のＬ−アスパラギンを有する無血清灌流培地で灌流し、かつ培養物を低Ｌ−アスパラギン環境下で維持することによって、増殖停止した状態に維持される。

哺乳類細胞培養物における低アスパラギン細胞増殖停止を誘導することによって組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養物における組換えタンパク質産生を増加させるための方法も提供される。低アスパラギンで増殖停止した状態に維持された哺乳類細胞は、低アスパラギンで増殖停止しなかった哺乳類細胞よりも高い生産性（ｇタンパク質／細胞／日およびｇタンパク質／細胞塊／日）を呈した。

そのような方法は、哺乳類細胞培養物を所望の血中血球容積に制限する際にも有用である。産生期中の血中血球容積は、産生培養培地中のＬ−アスパラギンレベルを低下させることによって所望のレベルに制限され得る。灌流培地中５ｍＭ以下のアスパラギン濃度は、培養中に細胞増殖を制御し、かつ所望の血中血球容積に制限するのに十分であった。

本明細書に記載の方法は、より高い細胞増殖制御を高産物力価の細胞培養物に提供し、したがって、高バイオマス灌流プロセスと比較して、ガス処理戦略を単純化し得、回収および下流処理中の産物損失を最小限に抑える。

本方法は、産生バイオリアクター内で哺乳類細胞培養物を確立することから始まる。好ましくは、より小さい産生バイオリアクターが使用され、一実施形態において、バイオリアクターは、５００Ｌ〜２０００Ｌである。好ましい実施形態において、１０００Ｌ〜２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。バイオリアクターを播種するために使用される種子細胞密度は、産生される組換えタンパク質のレベルにプラスの影響を与え得る。一実施形態において、バイオリアクターは、無血清培養培地の少なくとも０．５×１０^６〜３．０×１０^６生存細胞／ｍＬ以上で播種される。好ましい実施形態において、播種は、１．０×１０^６生存細胞／ｍＬである。

その後、哺乳類細胞は、指数関数的増殖期を経る。細胞培養物は、所望の細胞密度が得られるまで追加流加なしで維持され得る。一実施形態において、細胞培養物は、追加流加なしで最大３日間維持され、その後、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地で灌流して、低Ｌ−アスパラギン増殖停止を誘導および維持する。別の実施形態では、培養物は、所望の細胞密度で播種されて短時間の増殖期なしで産生期を開始し、細胞培養物を５ｍＭ以下のＬ−アスパラギンを含有する無血清灌流培地で灌流することにより、細胞増殖停止が播種直後に始まり、低Ｌ−アスパラギン増殖停止を誘導および維持する。本明細書における実施形態のうちのいずれかにおいて、増殖期から産生期への切り替わりは、Ｌ−アスパラギン欠乏（細胞を０ｍＭのＬ−アスパラギン環境に供すること）によって始まり得、その後、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する細胞培養培地で灌流して、細胞培養物中のＬ−アスパラギン濃度をそのレベルで維持する。

低Ｌ−アスパラギン増殖停止がどのように誘導されるかにかかわらず、より高い生産性が、低Ｌ−アスパラギン培地で灌流し、かつ細胞培養物を５ｍＭ以下のＬ−アスパラギンレベルで維持することによって維持される増殖停止した細胞において見られる。

本明細書で使用される際、「細胞増殖停止」とも称され得る「増殖停止」は、細胞の数の増加が停止する時点、または細胞周期がもはや進行しない時点である。増殖停止は、細胞培養物の生存細胞密度を決定することにより監視され得る。増殖停止した状態のいくつかの細胞の大きさが増大し得るが、細胞の数は増加せず、そのため、増殖停止した培養物の血中血球容積も増加し得る。増殖停止は、細胞の健康状態が低下しない場合、さらなるＬ−アスパラギンを細胞培養物に添加することによってある程度逆転し得る。

増殖停止は、培養物の細胞密度が、培養物中のＬ−アスパラギンの濃度が継続的な増殖に対して制限的になるレベルに達したときに、または培養物がＬ−アスパラギンを欠乏するときに、Ｌ−アスパラギンによって始動される。Ｌ−アスパラギン欠乏は、細胞培養培地中のＬ−アスパラギン濃度が有効に０ｍＭであるときに生じる。欠乏は、２４時間以内に増殖停止をもたらし得る。４８時間超の欠乏は、細胞の健康状態にダメージを与え得る。細胞を増殖停止した状態で維持するために、細胞培養物中のＬ−アスパラギン濃度は、５ｍＭ以下で維持されなければならない。細胞増殖を停止させるのに必要とされる細胞培養培地中のＬ−アスパラギン濃度は、自らアスパラギンを作製する細胞の能力に依存している。細胞が自らアスパラギンを作製し得る培養物の場合、より低い濃度、または培地からのＬ−アスパラギンの除去さえも、増殖停止に必要とされ得る。自らアスパラギンを作製することができない培養物、例えば、活性アスパラギンシンテターゼ酵素を欠く細胞の場合、０ｍＭ超〜最大５ｍＭのＬ−アスパラギン濃度を用いて、増殖を停止させることができる。

本明細書で使用される際、「パーセント血中血球容積」（％ＰＣＶ）とも称される「血中血球容積」（ＰＣＶ）は、細胞培養物の全容積に対する細胞が占める容積の比率であり、百分率で表される（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，ｗｔ ａｌ．，（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．Ｄｅｃ２０：９５（６）：１２２８−３３を参照のこと）。血中血球容積は、細胞密度および細胞径の関数であり、血中血球容積の増加は、細胞密度もしくは細胞径の増加のいずれか、またはこれら両方に起因し得る。血中血球容積は、細胞培養物中の固形分の程度である。固形物は、回収および下流精製中に除去される。固形物が多いほど、回収および下流精製ステップ中に固形物質を所望の産物から分離する努力がより必要とされる。また、所望の産物は、固形物中に捕えられ、かつ回収プロセス中に喪失され得るため、産物収率の低下をもたらし得る。宿主細胞の大きさが異なり、かつ細胞培養物が死細胞および死にかけている細胞ならびに他の細胞残屑も含有するため、血中血球容積は、細胞密度または生存細胞密度よりも正確に細胞培養物中の固形分を説明する手段である。例えば、５０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度を有する２０００Ｌの培養物は、細胞の大きさに応じて非常に異なる血中血球容積を有する。加えて、いくつかの細胞は、増殖停止した状態にあるときに、大きさを増加させ、増殖停止前および増殖停止後の血中血球容積は、細胞の大きさの増加の結果としてバイオマスを増加させるため、異なる可能性が高い。

増殖期と産生期との間の遷移時、および産生期中、パーセント血中血球容積（％ＰＣＶ）は、３５％以下である。産生期中に維持される所望の血中血球容積は、３５％以下である。好ましい実施形態において、血中血球容積は、３０％以下である。別の好ましい実施形態では、血中血球容積は、２０％以下である。別の好ましい実施形態では、血中血球容積は、１５％以下である。さらに別の好ましい実施形態では、血中血球容積は、１０％以下である。

本明細書で使用される際、「細胞密度」は、培養培地の所与の容積中の細胞の数を指す。「生存細胞密度」は、標準の生存アッセイ（トリパンブルー色素排除法等）によって決定される、培養培地の所与の容積中の生細胞の数を指す。

増殖期と産生期との間の遷移時の所望の生存細胞密度であり、かつ産生期中に維持される生存細胞密度は、３５％以下の血中血球容積を提供する密度である。一実施形態において、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜８０×１０^６生存細胞／ｍＬである。一実施形態において、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜７０×１０^６生存細胞／ｍＬである。一実施形態において、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜６０×１０^６生存細胞／ｍＬである。一実施形態において、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜５０×１０^６生存細胞／ｍＬである。一実施形態において、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜４０×１０^６生存細胞／ｍＬである。好ましい実施形態において、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜３０×１０^６生存細胞／ｍＬである。別の好ましい実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜２０×１０^６生存細胞／ｍＬである。別の好ましい実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約２０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜３０×１０^６生存細胞／ｍＬである。別の好ましい実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約２０×１０^６生存細胞／ｍＬ〜少なくとも約２５×１０^６生存細胞／ｍＬであり、より好ましくは、少なくとも約２０×１０^６生存細胞／ｍＬである。

産生期中のより少ない血中血球容積は、より高い細胞密度の灌流培養物を妨害し得る溶存酸素散布問題を軽減するのに役立つ。より少ない血中血球容積は、より小さい培地保存容器の使用を可能にするより小さい培地容積も可能にし、より遅い流速と組み合わせられ得る。より少ない血中血球容積は、より高い細胞バイオマス培養物と比較して、回収および下流処理への影響も低い。これらはすべて、組換えタンパク質治療薬の製造に関連する費用を削減する。

典型的には、哺乳類細胞培養物による組換えタンパク質の産生の商業的プロセスにおいて、３つの方法：バッチ培養、流加バッチ培養、および灌流培養が使用される。バッチ培養とは、細胞を固定容積の培養培地中で短時間成長させ、その後、完全に回収する不連続方法である。バッチ方法を用いて成長させた培養物は、最大細胞密度に達するまで細胞密度の増加を経験し、その後、培地成分が消費され、かつ代謝副産物（乳酸塩およびアンモニア等）のレベルが蓄積するときに生存細胞密度が減少する。回収は、典型的には、最大細胞密度（典型的には、５〜１０×１０^６細胞／ｍＬ、培地製剤、細胞株等に応じて）が得られた時点で生じる。バッチプロセスは、最も簡単な培養方法であるが、生存細胞密度は、栄養素利用性によって制限され、細胞が最大密度になった時点で、培養が減退し、産生が低減する。廃棄物の蓄積および栄養枯渇が培養減退に迅速につながるため（典型的には、約３〜７日）、産生期を延長することはできない。

流加バッチ培養は、複数回のボーラス流加または連続培地流加を提供して、消費されたそれらの培地成分を補給することによって、バッチプロセスを改善する。流加バッチ培養物が稼働中にさらなる栄養素を受容するため、バッチ方法と比較して、より高い細胞密度（１０超〜３０×１０^６細胞／ｍＬ、培地製剤、細胞株等に応じて））および産物力価の増加を達成する可能性がある。バッチプロセスとは異なり、二相培養物は、流加戦略および培地製剤を操作して細胞増殖期間を区別し、停止したか、または緩徐な細胞増殖期間（産生期）から所望の細胞密度（増殖期）を得ることによって作成および維持され得る。したがって、流加バッチ培養物は、バッチ培養物と比較して、より高い産物力価を得る可能性がある。典型的には、バッチ方法は増殖期中に使用され、流加バッチ方法は産生期中に使用されるが、流加バッチ流加戦略は、全プロセスを通して使用され得る。しかしながら、バッチプロセスとは異なり、バイオリアクター容積は、流加の量を制限する制限要素である。また、バッチ方法と同様に、代謝副産物蓄積は、産生期の期間を約１．５〜３週間に制限する培養減退につながる。流加バッチ培養物は不連続であり、回収は、典型的には、代謝副産物レベルまたは培養物生存率が所定のレベルに達したときに生じる。

灌流方法は、新鮮な培地を添加し、同時に使用済みの培地を除去することによって、バッチ方法および流加バッチ方法の改善の可能性を提供する。典型的な大規模の商業的な細胞培養戦略は、リアクター容積のほぼ１／３〜１／２超がバイオマスである高細胞密度（６０〜９０（＋）×１０^６細胞／ｍＬ）に達することを目指す。灌流培養で、１×１０^８細胞／ｍＬを超える非常に高い細胞密度が得られており、さらにより高い密度が予測される。典型的な灌流培養は、１日間または２日間続くバッチ培養スタートアップで始まり、その後、培養物に新鮮な流加培地を連続的、段階的、および／または断続的に添加し、使用済みの培地を同時除去し、培養物の増殖期および産生期を通して細胞およびタンパク質等のさらなる高分子量化合物を保持する（フィルタ分子量カットオフに基づいて）。沈降、遠心分離、または濾過等の様々な方法を用いて、細胞密度を維持しながら使用済みの培地を除去することができる。１日当たりのわずかの作業量〜１日当たり多くの複数作業量までの灌流流量が報告されている。灌流プロセスの利点は、産生培養がバッチ培養方法または流加バッチ培養方法よりも長期間維持されることである。しかしながら、培地調製、使用、保存、および廃棄の増加は、長期の灌流培養、特に高細胞密度での灌流培養を支援するのに必要であり、これはさらにより多くの栄養素も必要とし、このすべてが、バッチ方法および流加バッチ方法と比較して、生産費をさらに高くする。加えて、より高い細胞密度は、溶存酸素レベルの維持、ならびにより多くの発泡および消泡戦略への変更の必要性につながるより多くの酸素の供給およびより多くの二酸化炭素の除去を含むガス処理の増加に関連する問題等の産生中の問題を引き起こし得、また、過剰な細胞物質の除去に必要とされる努力が産物の損失をもたらし得るという回収および下流処理中の問題を引き起こし得、細胞塊の増加の結果、力価の増加の利益を打ち消し得る。

増殖期中の流加バッチ流加、その後、産生期中の連続灌流を合わせた大規模細胞培養戦略も提供される。本方法は、細胞培養物が３５％以下の血中血球容積で維持される産生期を標的にする。本方法は、低アスパラギンによる細胞増殖停止の開始および維持も提供する。

流加バッチ培養とは、哺乳類細胞からのタンパク質の大規模産生において広く実践されている培養方法である。例えば、Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（２００１），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１８０−８７を参照されたい。哺乳類細胞の流加バッチ培養は、培養物が連続的または周期的のいずれかで流加される培養であり、濃縮流加培地は、栄養素を含有する。流加は、例えば、毎日、２日に１回、３日に１回等の所定のスケジュールで生じ得る。流加が生じないバッチ培養と比較すると、流加バッチ培養は、より大量の組換えタンパク質を産生し得る。例えば、米国特許第５，６７２，５０２号を参照されたい。

一実施形態において、複数回ボーラス流加された流加バッチ培養物を用いて、増殖期中に細胞培養物を維持する。その後、灌流流加は、産生期中に用いられ得る。一実施形態において、灌流は、細胞が産生期に達したときに始まる。別の実施形態では、灌流は、細胞培養の５日目または５日目頃〜９日目または９日目頃に始まる。別の実施形態では、灌流は、細胞培養の５日目または５日目頃〜７日目または７日目頃に始まる。。

別の実施形態では、流加バッチ培養物における細胞増殖停止の開始は、流加バッチ培養物をＬ−アスパラギン欠乏にある期間供し、その後、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地で灌流することによって始まり得る。一実施形態において、細胞培養培地のＬ−アスパラギン濃度は、Ｌ−アスパラギン欠乏前およびＬ−アスパラギン欠乏中に監視される。別の実施形態では、流加バッチ培養物における細胞増殖停止の開始は、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって達成され得る。

増殖期中にボーラス流加法を用いることで、細胞が産生期に移行することを可能にし、産生期の開始および制御の手段となる温度変化への依存度の低下をもたらすが、３６℃から３１℃への温度変化は、増殖期と産生期の間に起こり得る。好ましい実施形態において、温度変化は、３６℃から３３℃である。

本明細書に記載されるように、バイオリアクターは、無血清培養培地中の少なくとも０．５×１０^６〜３．０×１０^６生存細胞／ｍＬ以上、好ましくは、１．０×１０６生存細胞／ｍＬを播種され得る。

灌流培養は、同時に使用済みの培地を除去しながら、細胞培養物が新鮮な灌流流加培地を受容する培養である。灌流は、連続的、段階的、断続的、またはこれらのうちのいずれかもしくはこれらのうちのすべての組み合わせであり得る。灌流量は、１日当たりの１つの作業量未満〜多くの作業量であり得る。好ましくは、細胞は、培養物中に保持され、除去される使用済みの培地は、細胞を実質的に含まないか、または培養物よりもはるかに少ない細胞を有する。細胞培養によって発現される組換えタンパク質も、培養物中に保持され得る。灌流は、遠心分離、沈降、または濾過を含むいくつかの手段によって達成され得、例えば、Ｖｏｉｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ８２：７５１−６５を参照されたい。好ましい濾過方法は、交互接線流濾過である。交互接線流は、中空糸フィルタモジュールを通して培地をポンピングすることによって維持される。例えば、米国特許第６，５４４，４２４号、Ｆｕｒｅｙ（２００２）Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ．２２（７），６２−６３を参照されたい。

本明細書で使用される際、「灌流流量」は、バイオリアクターを通過する（添加および除去される）培地の量であり、典型的には、所与の時間内のいくらかの作業量または複数の作業量で表される。「作業量」は、細胞培養に使用されるバイオリアクター容積の量を指す。一実施形態において、灌流流量は、１日当たり１作業量以下である。灌流流加培地は、灌流栄養濃度を最大化し、灌流量を最小限に抑えるように製剤化され得る。

「細胞培養」または「培養」とは、多細胞生物または組織外での細胞の増殖および繁殖を意味する。哺乳類細胞に好適な培養条件は、当技術分野において既知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい。哺乳類細胞は、懸濁液中で培養され得るか、または固体基質に付着される間に培養され得る。マイクロキャリアの有無にかかわらず、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコ、または攪拌槽バイオリアクターが使用され得る。一実施形態において、５００Ｌ〜２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。好ましい実施形態において、１０００Ｌ〜２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。

本発明の目的のために、細胞培養培地は、生体外細胞培養における哺乳類細胞等の動物細胞の増殖に好適な培地である。細胞培養培地製剤は、当技術分野において周知である。典型的には、細胞培養培地は、緩衝液、塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、および微量必須元素から成る。「無血清」は、ウシ胎仔血清等の動物血清を含有しない細胞培養培地に適用される。定義された培養培地を含む様々な組織培養培地が市販されており、例えば、以下の細胞培養培地：とりわけ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコブ変法ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ-１５培地、およびＥＸ−細胞（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）等の無血清培地のうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせが使用され得る。そのような培養培地の無血清バージョンも利用可能である。細胞培養培地は、培養される細胞の要件および／または所望の細胞培養パラメータに応じて、アミノ酸、塩、糖類、ビタミン、ホルモン、成長因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素等のさらなる成分または増加した濃度の成分を補充され得る。

細胞培養物は、細胞培養物の産生期の経過中に消費される栄養素およびアミノ酸等の成分を含有する濃縮流加培地を補充され得る。濃縮流加培地は、ほぼすべての細胞培養培地製剤に基づき得る。そのような濃縮流加培地は、細胞培養培地の成分の大半、例えば、それらの通常の量の約５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、またはさらには約１０００倍を含有し得る。濃縮流加培地は、多くの場合、流加バッチ培養プロセスにおいて使用される。

本発明に従う方法を用いて、多段階培養プロセスにおける組換えタンパク質の産生を改善することができる。多段階プロセスにおいて、細胞は、２つ以上のはっきりと異なる段階で培養される。例えば、細胞は、最初に、細胞増殖および生存率を最大限にする環境条件下の１つ以上の増殖期で培養され、その後、タンパク質産生を最大限にする条件下の産生期に移行する。哺乳類細胞によるタンパク質の産生のための商業的プロセスにおいて、最終産生培養の前に異なる培養容器内で生じる、通常、複数、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の増殖期が存在する。増殖期および産生期は、１つ以上の遷移期に先導されるか、またはそれによって分けられ得る。多段階プロセスにおいて、本発明に従う方法を、商業的細胞培養物の最終産生期の少なくとも増殖期および産生期中に用いることができるが、前増殖期で用いることもできる。産生期は、大規模に行われ得る。大規模プロセスは、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００リットルの容積で行われ得る。好ましい実施形態において、産生は、５００Ｌ、１０００Ｌ、および／または２０００Ｌのバイオリアクター内で行われる。増殖期は、産生期よりも高い温度で生じ得る。例えば、増殖期は、約３５℃〜約３８℃の第１の温度で生じ得、産生期は、約２９℃〜約３７℃、任意に、約３０℃〜約３６℃または約３０℃〜約３４℃の第２の温度で生じ得る。加えて、例えば、カフェイン、酪酸塩、およびヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）等のタンパク質産生の化学誘導物質は、温度変化と同時に、温度変化の前に、かつ／または温度変化の後に添加され得る。誘導物質が温度変化後に添加される場合、それらは、温度変化の１時間〜５日間後、任意に、温度変化の１〜２日後に添加され得る。細胞培養物は、細胞が所望のタンパク質（複数を含む）を産生する間、数日間またはさらには数週間維持され得る。

細胞培養物由来の試料は、当技術分野で既知の分析技法のうちのいずれかを用いて監視および評価され得る。組換えタンパク質および培地の質および特性を含む様々なパラメータは、培養期間中監視され得る。試料が採取され、リアルタイムまたは約リアルタイムの連続監視を含む、望ましい頻度で断続的におよび監視され得る。一実施形態において、細胞培養培地のＬ−アスパラギン濃度は、Ｌ−アスパラギン欠乏前およびＬ−アスパラギン欠乏中に監視される。

典型的には、最終産生培養（Ｎ−ｘ〜Ｎ−１）前の細胞培養物を用いて、産生バイオリアクターであるＮ−１培養物を播種するために使用される種子細胞を生成する。種子細胞密度は、産生される組換えタンパク質のレベルにプラスの影響を与え得る。産物レベルは、種子密度の増加を伴って増加する傾向がある。力価の改善は、より高い種子密度に関係するのみならず、産生される細胞の代謝および細胞周期状態に影響される可能性が高い。

種子細胞は、任意の培養方法によって産生され得る。好ましい方法は、交互接線流濾過を用いた灌流培養である。Ｎ−１バイオリアクターは、交互接線流濾過を用いて稼働され、高密度の細胞を提供して、産生バイオリアクターを播種し得る。Ｎ−１段階を用いて、９０×１０^６細胞／ｍＬを超える密度まで細胞を増殖させることができる。Ｎ−１バイオリアクターは、ボーラス種子培養物を生成するために使用され得るか、または複数の産生バイオリアクターを高種子細胞密度で播種するために維持され得るローリング種子ストック培養物として使用され得る。産生の増殖期の期間は、７〜１４日間の範囲であり得、産生バイオリアクターの播種前に細胞を指数関数的増殖状態に維持するように設計され得る。灌流量、培地製剤、およびタイミングは、細胞を増殖させ、かつそれらの産生の最適化を最も助長する状態でそれらを産生バイオリアクターに送達するように最適化される。１５×１０^６細胞／ｍＬを超える種子細胞密度は、産生バイオリアクターを播種するために得られ得る。播種時のより高い種子細胞密度は、所望の産生密度に達するのに必要とされる時間を減少させるか、またはさらには削減し得る。

本発明は、細胞培養プロセスを介して細胞増殖、生存率、および／またはタンパク質産生を改善するときに、特有の有用性を見出す。本発明において使用される細胞株（「宿主細胞」とも称される）は、商業または科学目的のポリペプチドを発現するように遺伝子操作される。細胞株は、典型的には、培養中に無限に維持され得る初代培養物から生じる系統に由来する。細胞株の遺伝子操作は、細胞を組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクト、形質転換、もしくは形質導入すること、および／またはさもなければ宿主細胞に所望の組換えポリペプチドを発現させるように変化させること（例えば、相同組換え、および非組換え細胞での組換え細胞の遺伝子活性化または融合によって）を含む。細胞および／または細胞株を遺伝子操作して目的とするポリペプチドを発現するための方法およびベクターは、当業者に周知であり、例えば、様々な技法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、および四半期更新版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｋａｕｆｍａｎ、Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９において説明されている。

動物細胞株は、先祖が多細胞動物から派生した細胞に由来する。動物細胞株の一種には、哺乳類細胞株がある。培養における増殖に好適な多種多様の哺乳類細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）および商業的供給者から入手可能である。当業界において一般に使用される細胞株の例には、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞は、複合組換えタンパク質、例えば、サイトカイン、凝固因子、および抗体の産生に広く使用されている（Ｂｒａｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｂｌｏｏｄ８８：２００４−２０１２、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６３：６３５２−６３６２、ＭｃＫｉｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ６：２３１−２３９、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３０１１−３０１６）。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠乏変異体細胞株（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７７：４２１６−４２２０）、ＤＸＢ１１、およびＤＧ−４４は、効率的なＤＨＦＲ選択可能および増幅可能な遺伝子発現システムが、これらの細胞における高レベルの組換えタンパク質発現を可能にするため（Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．（１９９０），Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ１８５：５３７−５６６）、望ましいＣＨＯ宿主細胞株である。加えて、これらの細胞は、付着または懸濁培養物として操作が容易であり、比較的良好な遺伝的安定性を呈する。これらの細胞において組換え的に発現されるＣＨＯ細胞およびタンパク質は、広く特徴付けられており、管理機関によって臨床的かつ商業的製造における使用が承認されている。

本発明の方法を用いて、目的とする組換えタンパク質を発現する細胞を培養することができる。発現された組換えタンパク質は、それらが回収および／または収集され得る培養培地に分泌され得る。加えて、タンパク質は、既知のプロセスおよび商業的供給者から入手可能な製品を用いて、そのような培養物または成分から（例えば、培養培地から）精製されるか、または部分的に精製され得る。その後、精製されたタンパク質は「製剤化され」得、これは、緩衝液が交換され、滅菌され、バルク包装され、かつ／または最終使用者用に包装されることを意味する。薬学的組成物に好適な製剤には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．１９９５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載の製剤が含まれる。

本明細書で使用される際、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書を通して同義に使用され、ペプチド結合によって相互に連結される２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰリボース化を含むが、これらに限定されない修飾も含む。ポリペプチドは、タンパク質ベースの薬物を含む、科学的または商業的目的のポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、とりわけ、抗体、融合タンパク質、およびサイトカインを含む。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、細胞培養方法を用いて組換え動物細胞株によって産生され、「組換えペプチド」、「組換えポリペプチド」、および「組換えタンパク質」と称され得る。発現されたタンパク質（複数を含む）は、細胞内で産生され得るか、またはそれが回収および／もしくは収集され得る培養培地に分泌され得る。

本発明の方法を用いて産生され得るポリペプチドの例には、以下のタンパク質のうちの１つのすべてもしくは一部と同一であるか、または実質的に類似したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｆｌｔ３リガンド（国際公開第９４／２８３９１号）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７（５３２２）：５５−６０）、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子のリガンド（ＲＡＮＫＬ、国際公開第０１／３６６３７号）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、国際公開第９７／０１６３３号）、胸腺間質誘導リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、豪国特許第５８８８１９号）、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（米国特許第６，２０４，３６３号）、上皮細胞増殖因子、ケラチノサイト成長因子、巨核球成長および発達因子、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトフィブリノゲン様２タンパク質（ＦＧＬ２、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６８２、Ｒｕｅｇｇ ａｎｄ Ｐｙｔｅｌａ（１９９５）、Ｇｅｎｅ１６０：２５７−６２）成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、およびコンセンサスインターフェロンを含むインターフェロン（米国特許第４，６９５，６２３号および同第４，８９７４７１号）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ １−５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、白血病抑制因子、ならびにオンコスタチン−Ｍ。本発明の方法に従って産生され得るタンパク質の説明は、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、全巻（Ａｇｇａｒｗａｌ ａｎｄ Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ，ｅｄｓ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９８）、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙ ａｎｄ Ｌｅｉｇｈ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）、およびＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｖｏｌｓ．１ ａｎｄ ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｔｚｅ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００３）において見い出され得る。

さらに、本発明の方法は、上述のタンパク質のうちのいずれかの受容体のアミノ酸配列のすべてもしくは一部を含むタンパク質、そのような受容体もしくは上述のタンパク質のうちのいずれかに対するアンタゴニスト、および／またはそのような受容体またはアンタゴニストに実質的に類似したタンパク質の産生に有用であろう。これらの受容体およびアンタゴニストには、両方の形態の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ、ｐ５５およびｐ７５と称される、米国特許第５，３９５，７６０号および米国特許第５，６１０，２７９号）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型およびＩＩ型、欧州特許第０４６０８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号、および米国特許第５，７６７，０６４号）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２号）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（米国特許第５，９８１，７１３号、同第６，０９６，７２８号、および同第５，０７５，２２２号）ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許第０ ３６７ ５６６号よび米国特許第５，８５６，２９６号）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、Ｆｃ受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子受容体、ＮＦ−κＢ受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、国際公開第０１／３６６３７号および米国特許第６，２７１，３４９号）、オステオプロテゲリン（米国特許第６，０１５，９３８号）、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４を含む）、ならびにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）等の死ドメインを含む受容体が含まれる。

本発明を用いて産生され得る他のタンパク質には、分化抗原（ＣＤタンパク質と称される）もしくはそれらのリガンドのアミノ酸配列のすべてもしくは一部を含むタンパク質、またはそれらのいずれかに実質的に類似したタンパク質が含まれる。そのような抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｋｏｂｅ，，Ｊａｐａｎ，１９９６）に開示されている。同様のＣＤタンパク質がそれに続くワークショップに開示されている。そのような抗原の例には、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド等）が含まれる。ＣＤ抗原のうちのいくつかは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、４１ＢＢおよびＯＸ４０も含む。リガンドは、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドであるように、多くの場合、ＴＮＦファミリーのメンバーである。

酵素活性タンパク質またはそれらのリガンドを、本発明を用いて産生することもできる。例には、以下のタンパク質もしくはそれらのリガンドのうちの１つのすべてもしくは一部を含むタンパク質、または以下のうちの１つに実質的に類似したタンパク質が挙げられる：ＴＮＦα変換酵素を含むジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメインファミリーメンバー、様々なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α-１抗トリプシン、上述の酵素のうちのいずれかのリガンド、ならびに多数の他の酵素およびそれらのリガンド。

「抗体」という用語は、任意のアイソタイプもしくはサブクラスのグリコシル化免疫グロブリンおよび非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及、または特異的結合について無傷抗体と競合するその抗原結合領域への言及を含み、別途明記されない限り、ヒト、ヒト化、キメラ、多特異的、モノクローナル、ポリクローナル、およびオリゴマー、またはそれらの抗原結合断片を含む。抗原結合断片または領域、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、二量体、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ｓｃＦｖ、二量体、三量体、四量体、および特異的抗原結合を標的ポリペプチドに与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドを有するタンパク質も含まれる。「抗体」という用語は、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離される抗体等の組換え手段によって調製、発現、作成、または単離される抗体を含むが、これらに限定されない。

抗体の例には、上述のタンパク質および／または以下の抗原を含むが、これらに限定されないタンパク質のうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせを認識する抗体が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ−βおよびその類似体（米国特許第５，２７２，０６４号および同第５，１４９，７９２号を参照のこと）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３号を参照のこと）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンγ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ；ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、およびｚＴＮＦ４としても知られており、Ｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｈｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（１）：１９−２５を参照のこと）、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌と関連して発現される遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌および／または膵臓癌を有する患者の血清において上昇したレベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳腺細胞、結腸細胞、扁平上皮細胞、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、および／もしくは腎癌細胞、ならびに／または黒色腫、グリオーマ、もしくは神経芽腫細胞上で発現される癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン付着因子、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、スクレロスチン、Ｌ−セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ミュータンス連鎖球菌、ならびに黄色ブドウ球菌。本発明の方法を用いて産生され得る既知の抗体の具体例には、アダリムマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、ラベツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、レベリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、ザルツムマブ、およびザノリムマブが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明を用いて、例えば、上述のタンパク質のうちのいずれかを含む組換え融合タンパク質を産生することもできる。例えば、上述のタンパク質のうちの１つに加えて、多量体化ドメイン、例えば、ロイシンジッパー、コイルドコイル、免疫グロブリンのＦｃ部分、または実質的に同様のタンパク質を含む組換え融合タンパク質が、本発明の方法を用いて産生され得る。例えば、国際公開第９４／１０３０８号、Ｌｏｖｅｊｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１２８８−１２９３、Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４０１−０５、Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ３７１：８０−８３、Ｈａｋａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ７：２５５−６４を参照されたい。受容体の一部がエタネルセプト（ｐ７５
ＴＮＦＲ：Ｆｃ）およびベラタセプト（ＣＴＬＡ４：Ｆｃ）等の抗体のＦｃ部分に融合されるタンパク質が、そのような組換え融合タンパク質に特異的に含まれる。

本明細書で使用される専門用語は、当技術分野において標準的なものであるが、特許請求の範囲の意味に対する明確さおよび確定性を確実にするために、ある特定の用語の定義が本明細書に提供されている。単位、接頭辞、および記号は、それらのＳＩに認められた形態で示され得る。本明細書に列挙される数値範囲は、その範囲を定義する数を含み、定義された範囲内のそれぞれの整数を含み、かつそれを支援する。本明細書に記載の方法および技法は、概して、別途示されない限り、当技術分野で周知の従来の方法に従って、かつ本明細書を通じて引用され、論じられる様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むが、これらに限定されない本明細書で引用されるすべての文書または文書の一部は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。本発明の実施形態において説明されることは、本発明の他の実施形態と合わせられ得る。

本発明は、本発明の個々の態様の単一説明となるよう意図される本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されず、機能的に同等の方法および成分は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書に示され、かつ記載される修正に加えて、本発明の様々な修正は、前述の記述および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に入るよう意図されている。

［実施例１］
本実験は、バッチまたは流加バッチ流加法を用いた異なる開始条件、その後、交互接線流濾過を用いた連続灌流を比較する。灌流は、灌流前にさらなる流加を伴わない指数関数的増殖期（「バッチ」開始）の初期に、または指数関数的増殖期の終盤のいずれかに始まり、静止期または産生期（「流加バッチ」開始）に入り、灌流前に無血清確定流加培地のいくつかの複数回のボーラス流加を受けた。

０日目に、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞を、２Ｌの産生バイオリアクターに、流加バッチ開始において作業量１５００ｍＬの無血清確定培地中、およびバッチ開始において作業量１８００ｍＬの無血清確定培地中、１×１０^６生存細胞／ｍＬで播種した。培養物を３６℃で、溶存酸素（ＤＯ）を３０％で、撹拌を２１５ｒｐｍで維持した。グルコースを０ｇ／Ｌ超〜８ｇ／Ｌ未満に維持した。

灌流は、バッチ培養物において４日目（０．２５容積／日）に、流加バッチ培養物において７日目（０．７５容積／日）に始まった。灌流を、交互接線流灌流および濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ，５０ｋＤａの中空糸フィルタ）を用いて遂行した。灌流開始前に、流加バッチ培養物は、４日目（７．５％の初期作業量）および６日目（１０％の初期作業量）に濃縮無血清確定流加培地の複数回のボーラス流加を受けた。灌流量が表１に提供される。

培養実行中、試料を毎日採取して培養物を評価した。生存細胞密度（ＶＣＤ）および生存率をＶｉ細胞（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて決定した。力価をＨＰＬＣ分析によって測定した。血中血球容積を、ＶｏｌｕＰＡＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。

生存細胞密度が２０×１０^６生存細胞／ｍＬを超えたときに（バッチ開始条件において７日目、流加バッチ開始条件において１１日目）、温度変化（３６．０℃から３３．０℃）を適用した。

バッチスタートアップ条件において、生存細胞密度は、灌流が始まった後に増加し続け、流加バッチ開始条件において、細胞培養物が定常期または静止期に達した後に灌流が始まり、わずかの増殖しかもたらさなかった。１５日目に、流加バッチの生存細胞密度が２７．７〜３０．７×１０^６生存細胞／ｍＬであった一方で、バッチ培養物の生存細胞密度は、２２．５〜２７．４×１０^６生存細胞／ｍＬであった（図１Ａ）。流加バッチ培養物の生存率が７３．９〜７７．５％であったが、バッチ培養物の生存率は、７２．５〜８３．１％であった（図１Ｂ）。流加バッチ培養物の力価が１５．３〜１６．１ｇ／Ｌであった一方で、バッチ培養物の力価は、１０．６〜１２．３ｇ／Ｌであった（図１Ｃ）。統合された可変細胞密度（ＩＶＣＤ）値が１５日目まで４つすべての培養物において類似したため（約２３０×１０^６細胞／日／ｍＬ）、特定生産性は、流加バッチスタートアップ条件よりも高かった。流加バッチ培養物は、２４日目まで存続した。２０ｇ／Ｌの力価を２０日目に得た。

流加バッチスタートアップでの交互接線流灌流は、生産性の増加をもたらし、バッチ開始方法と比較して、細胞をより生産性の高い状態に維持した。

［実施例２］
０日目に、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞を、２Ｌの産生バイオリアクターに、バッチ開始において作業量１５００ｍＬの無血清確定培地中、および流加バッチ開始において作業量１３００ｍＬの無血清確定培地中、１×１０^６生存細胞／ｍＬで播種した。バッチ培養物の場合、培養物を３６℃で、ＤＯを３０％で、撹拌を２１５ｒｐｍで維持した。流加バッチ培養物を４３０ｒｐｍで攪拌した。灌流前に流加バッチ培養物に７ｇ／Ｌのグルコースを毎日流加し、灌流中、すべての培養物を４ｇ／Ｌグルコース以上で維持した。灌流（交互接線流）は、バッチ培養物において４日目（０．２５容積／日）に、流加バッチ培養において８日目（０．７５容積／日）に始まった。灌流開始前に、流加バッチ培養物は、４日目（７．５％の初期作業量）および６日目（１０％の初期作業量）に、濃縮無血清確定流加培地の複数回のボーラス流加を受けた。灌流流量設定が表２に提供される。培養物を２１日間維持した。

培養実行中、上述のように試料を毎日採取して、培養物を評価した。

実施例１にあるように、生存細胞密度が２０×１０^６生存細胞／ｍＬを超えたときに（６日目）、温度変化（３６．０℃から３３．０℃）をバッチ培養物に適用した。流加バッチ培養物を３６．０℃で培養継続期間維持した。

バッチスタートアップ方法での培養物は、細胞が約２０〜２５×１０^６生存細胞／ｍＬに達し、１０日目を過ぎてからは増殖しなかったという上述の結果と同様の結果を有した。流加バッチ培養物は、培養期間の大半を２０×１０^６生存細胞／ｍＬ未満で費やした後、２０日目に３０×１０^６生存細胞／ｍＬ近くに達した（図２Ａを参照のこと）。生存率はすべて、１０日目まで８０％を超えたままであり、その後、バッチ開始培養物において２０日目までに約４０％に低下し、流加バッチ培養においては６０％に低下した（図２Ｂを参照のこと）。力価は、バッチ開始培養物において１５ｇ／Ｌ近くでピークに達したが、高撹拌流加バッチ培養物においては２０ｇ／Ｌ超に達した（図２Ｃを参照のこと）。バッチ開始培養物が３日目に約３〜４ｍＭのＬ−アスパラギン濃度を有し、アスパラギン制限培養環境に陥らなかったことが観察された。しかしながら、流加バッチ灌流開始培養物は、７日目の灌流開始前の６日目までにＬ−アスパラギン制限環境に陥った。その後、培養物を、２．０ｇ／Ｌ（または１３．３ｍＭ）の濃度のＬ−アスパラギンを含有した培地で灌流し、８日目を過ぎてからはさらなるＬ−アスパラギン制限が生じなかった（図２Ｄ）。グルコース濃度は、主に４〜１０ｇ／Ｌで維持された。

高撹拌灌流培養での流加バッチスタートアップは、２０日後に最も高い力価（２０ｇ／Ｌ超）を達成し、バッチスタートアップ培養物よりも５ｇ／Ｌ高く、上述の結果に類似した。より速い撹拌速度のマイナスの効果は観察されなかった。一定温度を維持することは、流加バッチ培養物にマイナスの影響を与えるようには見えなかった。

［実施例３］
本実験は、上述の流加バッチスタートアップでの交互接線流灌流への灌流量および温度変化の影響を特徴付ける。すべての培養物は、灌流が７日目に始まった流加バッチ開始培養物であった。４分の３の作業量から全作業量に、または全作業量から４分の３の作業量に移行した灌流流量を試験した。１４日目の３６℃から３３℃への温度変化も試験した。

０日目に、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞を、２Ｌの産生バイオリアクター内に、作業量１２００ｍＬの無血清確定培地中１×１０^６細胞／ｍＬで播種した。培養物を３６℃で、ＤＯを３０％で維持した。灌流前に、グルコースを毎日流加して７ｇ／Ｌにし、灌流中、グルコースを１ｇ／Ｌ超で維持した。培養物を２０日間維持した。

培養物は、４日目（７．５％の初期作業量）および６日目（１０％の初期作業量）に濃縮無血清確定流加培地の複数回のボーラス流加を受けた。灌流は８日目に始まった。灌流量が表３に提供される。それぞれの群の１つの培養物は１５日目に３６℃から３３℃に温度変化し、他の培養物は、実験期間中、３６℃のままであった。

温度変化および灌流量は、生存細胞密度に影響を与えなかった（図３Ａを参照のこと）。しかしながら、温度変化は、後の時点で培養物の生存率を保つ助けとなるようである。１５日目以降、温度変化条件間で変化があるようである。温度変化した培養物の生存率は、３６℃のままであった培養物よりも緩徐に低下した（図３Ｂを参照のこと）。力価に関して、３つの培養物は、１５日目（１７．１〜１７．９ｇ／Ｌ）、ならびに２０日目（２２〜２４ｇ／Ｌ）に非常に類似した力価を示したが、１つの培養物は、１５日目（２１．５８ｇ／Ｌ）、ならびに２０日目（２８．３３ｇ／Ｌ）により高い力価を有した（図３Ｃを参照のこと）。温度も灌流量も力価産生にいかなる影響も与えなかったようであり、培養物を異なる灌流量で維持することができることを示唆する。

［実施例４］
本実験を、Ｌ−アスパラギン制限培養環境またはＬ−アスパラギン非制限培養環境のいずれかを用いて、産生期中の生存細胞密度への灌流培地アスパラギン濃度および灌流開始条件の影響を調査するように設計した。

０日目に、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞を、２Ｌの産生バイオリアクターに、バッチおよび流加バッチ開始方法の両方において作業量１５００ｍＬ中１×１０^６細胞／ｍＬで播種した。培養物を３６℃で、溶存酸素（ＤＯ）を３０％で、撹拌を４００ｒｐｍで維持した。ドリルパイプまたは焼結スパージャーのいずれかを用いて散布を行った。グルコースを０ｇ／Ｌ超〜８ｇ／Ｌ未満で維持した。

灌流（交互接線流）は、バッチ開始「非アスパラギン制限培養物」において３日目（０．２９容積／日）に、流加バッチ「アスパラギン制限培養物」において７日目（０．４８容積／日）に始まった。バッチ培養培地は、１０ｍＭのＬ−アスパラギンを含有した。灌流開始前に、流加バッチ培養物は、３日目および６日目（７％の初期作業量）に、１１３．４ｍＭのＬ−アスパラギンを含有した濃縮無血清確定流加培地の複数回のボーラス流加を受けた。灌流培地アスパラギン濃度は、対照濃度（無血清確定灌流培地中１７．３ｍＭのＡｓｎ）または低濃度（無血清確定灌流培地中５ｍＭのＡｓｎ）のいずれかであった。灌流を上述のように実行した。灌流量が表４に提供される。

培養実行中、試料を毎日採取して培養物を評価した。生存細胞密度（ＶＣＤ）および生存率を、Ｖｉ細胞（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて決定した。力価をＨＰＬＣ分析によって測定した。すべての培養物を３６．０℃で維持した。

細胞増殖の低下および生産性の改善は、培養培地中のアスパラギンを制限することによって産生期中に達成された。１５日目に、最大生存細胞密度は、低アスパラギンを有する流加バッチ開始培養物において約１７．０×１０^６生存細胞／ｍＬであった（図４Ａ）。対照レベルのアスパラギン培養物は、４０×１０^６生存細胞／ｍＬを超える生存細胞密度（３０％超の血中血球容積）に達した。低アスパラギン流加バッチ培養物の生存率が６７．１％であった一方で、バッチ培養物の生存率は５５．１％であり、対照物は９％であった（図４Ｂ）。低アスパラギン流加バッチ培養物の血中血球容積調整力価が１７．０ｇ／Ｌ（血中血球容積に応じて調整）であった一方で、バッチ培養物の力価は、１５．４ｇ／Ｌであった（図４Ｃ）。対照物は、１０．２〜１２．９ｇ／Ｌ（バッチ開始）および１４．２〜１５．９ｇ／Ｌ（流加バッチ開始）の力価を有した。

産生中にアスパラギンレベルを５ｍＭ以下で維持することで、増殖停止をもたらし、生産性を刺激し、産生期中の生存率を維持した。

［実施例５］
本実験は、灌流中の培地条件を比較する。この２Ｌバイオリアクター実験において、細胞を化学的に定義されたバッチ培地に１．５Ｌの作業量で播種し、３日間培養し、その後、１７．３ｍＭのＬ−アスパラギンおよび４．６ｍＭのＬ−グルタミンまたは５ｍＭのＬ−アスパラギンおよび１０ｍＭのＬ−グルタミンのいずれかを含有した化学的に定義された灌流培地を用いて１２日間灌流した。３０ｋＤａの中空糸フィルタ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を有する交互接線流灌流および濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）を用いて、灌流を達成した。灌流は、１日当たり０．３培養量の速度で３日目に始まった。灌流速度は、以下の表６に示されるように、４日目、９日目、および１１日目に増加した。培養物を３６^ｏＣで、ＤＯを３０％で、ｐＨを７．０で、撹拌を４００ｒｐｍで維持した。

培養実行中、試料を毎日採取して、培養物を評価した。生存細胞密度（ＶＣＤ）および生存率を、Ｖｉ細胞（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて決定した。力価をＨＰＬＣ分析によって測定した。血中血球容積を、ＶｏｌｕＰＡＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。

アスパラギン制限は、より少ない細胞の蓄積および生産性の改善をもたらした。５ｍＭのアスパラギンを含有した培地で灌流された培養物が８．１６×１０^７〜８．５４×１０^７細胞／ｍＬの最大ＶＣＤに達した一方で、１７．３ｍＭのアスパラギンを含有した培地で灌流された培養物は、１１．９×１０^７〜１２．２×１０^７細胞／ｍＬに達した（図５Ａ）。１７．３ｍＭのアスパラギン培養物がより多くの細胞を有したが、５ｍＭのアスパラギン培養物は、より多くの産物を作製した。１７．３ｍＭのアスパラギンを含有した培地で灌流された培養物が６．８９〜７．１８ｇ／Ｌ（４．３３〜４．６７ｇ／Ｌの血中血球容積に調整）になった一方で、５ｍＭのアスパラギンを含有した培地で灌流された培養物は、７．５９〜８．１５ｇ／Ｌ（５．０１〜５．３８ｇ／Ｌの血中血球容積に調整）になった（図５Ｂおよび５Ｄ）。５ｍＭのアスパラギン培養物の最終血中血球容積（ＰＣＶ）は、１７．３ｍＭのアスパラギン培養物よりも傾きがわずかに低く（図５Ｃ）、培養物の生存率の差はなかった（図５Ｅ）。

興味深いことに、本実施例において、グルタミン濃度を低アスパラギン条件下で２倍以上に増加させても（４．６ｍＭ対１０ｍＭのグルタミン）、培養物の成長を停止させる低アスパラギン培地の能力を妨害しなかった。

［実施例６］
本実施例は、ベンチ規模およびパイロット規模での成長を制御するために、アスパラギン制限を用いてＡＴＦ灌流プロセスにおいて培養されたクローン抗体発現ＣＨＯ細胞株の能力を比較する。ベンチ規模のモデルは２Ｌバイオリアクターを利用し、パイロット規模のモデルは５００Ｌを利用した。ベンチ規模において、細胞を化学的に定義されたバッチ培地に１．５Ｌの作業量で播種し、パイロット規模において、作業量は、約３７８Ｌであった。細胞をバッチ培地中で３日間培養し、その後、５ｍＭのＬ−アスパラギンおよび１０ｍＭのＬ−グルタミンを含有した化学的に定義された灌流培地を用いて１２日間灌流した。交互接線流灌流および３０ｋＤａの中空糸フィルタ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を有する濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）を用いて、灌流を達成した。灌流は、１日当たり０．３培養量の速度で３日目に始まった。灌流速度は、以下の表７に示されるように、４日目、９日目、および１１日目に増加した。培養物を３６^ｏＣで、ＤＯを３０％、ｐＨを６．９で維持した。

培養実行中、試料を毎日採取して、培養物を評価した。生存細胞密度（ＶＣＤ）および生存率を、ベンチ規模においてＶｉ細胞（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて、パイロット規模においてＣＥＤＥＸ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて決定した。力価をＨＰＬＣ分析によって測定した。血中血球容積を、ＶｏｌｕＰＡＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。

４つのベンチ規模の培養物および２つのパイロット規模の培養物からのデータが提供される。ＶＣＤ曲線は、両方の規模において類似しており、成長制御が達成され（図６Ａ）、全細胞塊（血中血球容積）は、両方の規模において３０％未満で維持された（図６Ｃ）。ＶＣＤが１０日目または１１日目頃にプラトーに達したが、血中血球容積は、１３日目または１４日目頃まで増加し続けた（図６Ｃ）。生産性もこれらの規模の間で類似した。５ｍＭのアスパラギンを含有した培地で灌流された培養物が、２Ｌのベンチ規模において１４．２〜１５．７ｇ／Ｌ（１０．７〜１１．４ｇ／Ｌの血中血球容積に調整）になった一方で、５００Ｌのパイロット規模において１５．０〜１７．３ｇ／Ｌ（１０．６〜１２．８ｇ／Ｌの血中血球容積に調整）になった（図６Ｂおよび６Ｄ）。生存率は、パイロット規模において傾きがわずかに低かった（図６Ｅ）。

Claims (52)

1. 組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養物における細胞増殖を停止させる方法であって、
   バイオリアクター内の無血清培養培地中に哺乳類細胞培養物を確立することと、
   ５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって細胞増殖停止を誘導することと、
   ５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって前記哺乳類細胞を増殖停止した状態に維持することと、を含む、方法。
2. 組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養物における組換えタンパク質産生を増加させる方法であって、
   バイオリアクター内の無血清培養培地中に哺乳類細胞培養物を確立することと、
   ５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって細胞増殖停止を誘導することと、
   ５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって前記哺乳類細胞を増殖停止した状態に維持することと、を含む、方法。
3. 組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養物を所望の血中血球容積に制限する方法であって、
   バイオリアクター内の無血清培養培地中に哺乳類細胞培養物を確立することと、
   ５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって細胞増殖停止を誘導することと、
   ５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって前記哺乳類細胞を増殖停止した状態に維持することと、を含む、方法。
4. ５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での前記灌流は、前記培養の３日目または３日目よりも前に始まる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 細胞増殖停止の誘導は、産生期の前に起こる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
6. 細胞増殖停止の誘導は、産生期中に起こる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
7. 細胞増殖停止は、Ｌ−アスパラギン欠乏によって誘導される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
8. ３６℃から３１℃への温度変化をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
9. ３６℃から３３℃への温度変化をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
10. 前記温度変化は、増殖期と産生期との間の遷移時に生じる、請求項８または９に記載の方法。
11. 前記温度変化は、産生期中に生じる、請求項８または９に記載の方法。
12. 組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞を培養する方法であって、
    バイオリアクター内の無血清培養培地中に哺乳類細胞培養物を確立することと、
    増殖期中に前記哺乳類細胞を増殖させ、前記培養培地を無血清流加培地の複数回のボーラス流加で補充することと、
    無血清灌流培地での灌流によって産生期中に前記哺乳類細胞を維持することと、を含み、前記産生期中の前記血中血球容積は、３５％以下である、方法。
13. 灌流は、前記細胞培養の５日目〜９日目に始まる、請求項１２に記載の方法。
14. 灌流は、前記細胞培養の５日目〜７日目に始まる、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 灌流は、前記細胞が産生期に達したときに始まる、請求項１２に記載の方法。
16. Ｌ−アスパラギン欠乏によって細胞増殖停止を誘導し、その後、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地で灌流することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
17. ５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって細胞増殖停止を誘導することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
18. 前記無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの前記濃度は、５ｍＭ以下である、請求項１〜３、１６、および１７のいずれかに記載の方法。
19. 前記無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの前記濃度は、４．０ｍＭ以下である、請求項１〜３および１６〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの前記濃度は、３．０ｍＭ以下である、請求項１〜３および１６〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの前記濃度は、２．０ｍＭ以下である、請求項１〜３および１６〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの前記濃度は、１．０ｍＭ以下である、請求項１〜３および１６〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記無血清灌流培地中のＬ−アスパラギンの前記濃度は、０ｍＭである、請求項１〜３および１６〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記細胞培養培地の前記Ｌ−アスパラギン濃度は、Ｌ−アスパラギン欠乏前およびＬ−アスパラギン欠乏中に監視される、請求項７または１６に記載の方法。
25. 産生期中の前記血中血球容積は、３５％以下であることをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
26. 前記血中血球容積は、３５％以下である、請求項１２または２５に記載の方法。
27. 前記血中血球容積は、３０％以下である、請求項１２、２５、および２６のいずれかに記載の方法。
28. ３５％以下の血中血球容積での前記哺乳類細胞培養物の生存細胞密度は、１０×１０６生存細胞／ｍＬ〜８０×１０６生存細胞／ｍＬである、請求項１２または２５に記載の方法。
29. 前記哺乳類細胞培養物の生存細胞密度は、２０×１０６生存細胞／ｍＬ〜３０×１０６生存細胞／ｍＬである、請求項２８に記載の方法。
30. 灌流は、連続灌流を含む、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
31. 灌流の速度は、一定である、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
32. 灌流は、１日当たり１．０作業量以下の速度で行われる、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
33. 灌流は、前記産生期中の１日当たり０．２５作業量から前記細胞培養中の１日当たり１．０作業量に増加する速度で行われる、請求項１２に記載の方法。
34. 灌流は、前記細胞培養の９日目〜１１日目に１日当たり１．０作業量に達する速度で行われる、請求項１２に記載の方法。
35. 灌流は、前記細胞培養の１０日目に１日当たり１．０作業量に達する速度で行われる、請求項１２または３４に記載の方法。
36. 前記無血清流加培地の複数回のボーラス流加は、前記細胞培養の３日目または４日目に始まる、請求項１２に記載の方法。
37. 前記哺乳類細胞培養物は、前記バイオリアクターに無血清培養培地中の少なくとも０．５×１０６〜３．０×１０６細胞／ｍＬを播種することによって確立される、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
38. 前記哺乳類細胞培養物は、前記バイオリアクターに無血清培養培地中の少なくとも０．５×１０６〜１．５×１０６細胞／ｍＬを播種することによって確立される、請求項１〜３、１２、および３７のいずれかに記載の方法。
39. ３６℃から３１℃への温度変化をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
40. ３６℃から３３℃への温度変化をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
41. 前記温度変化は、前記増殖期と前記産生期との間の遷移時に生じる、請求項３９または４０に記載の方法。
42. 前記温度変化は、前記産生期中に生じる、請求項３９または４０に記載の方法。
43. 前記灌流は、交互接線流によって達成される、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
44. 前記バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
45. 前記バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する、請求項１〜３、１２、および４４のいずれかに記載の方法。
46. 前記バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する、請求項１〜３、１２、４４、および４５のいずれかに記載の方法。
47. 前記哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
48. 前記組換えタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質、またはサイトカインからなる群から選択される、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
49. 前記細胞培養によって産生される前記組換えタンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
50. 前記細胞培養によって産生される前記組換えタンパク質は、精製され、医薬として許容される製剤に製剤化される、請求項１〜３および１２のいずれかに記載の方法。
51. 前記哺乳類細胞培養物における組換えタンパク質産生は、前記細胞がＬ−アスパラギンによって誘導される細胞増殖停止に供されない培養物と比較して増加する、請求項２に記載の方法。
52. 灌流が、細胞培養中、産生期に１日当たり０．２５作業量から１日当たり１．０作業量に増加する速度で行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

Images