CN114008191A

CN114008191A - 哺乳动物细胞培养物产生的神经胚素抗体

Info

Publication number: CN114008191A
Application number: CN201980091137.3A
Authority: CN
Inventors: 艾伦·吉尔伯特; 凯尔·麦克莱尼; 特伦斯·迈克尔·多布罗夫斯基; 拉希米·罗希特·克什萨加尔
Original assignee: Gloriana Therapy
Current assignee: Gloriana Therapy
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-02-01
Also published as: JP2024050574A; EP3898940A4; WO2020132583A1; JP2022516053A; CA3124660A1; US20220048984A1; EP3898940A1

Abstract

本公开涉及经遗传修饰以在培养物中表达神经胚素抗体多肽或其片段并且在培养物中表达神经胚素抗体多肽或其片段的哺乳动物细胞培养物，以及涉及神经胚素抗体多肽或其片段，其由经遗传修饰以表达所述神经胚素抗体多肽或其片段并且表达所述神经胚素抗体多肽或其片段的哺乳动物细胞培养物制备。

Description

哺乳动物细胞培养物产生的神经胚素抗体

发明领域

本申请要求2018年12月21日提交的美国申请第16/230,216号的优先权，美国申请第16/230,216号是2016年10月12日提交的美国申请第15/291,257号的部分继续申请，美国申请第15/291,257号是2015年7月9日提交的美国申请第14/760,182号的继续申请，美国申请第14/760,182号是2014年1月10日提交的PCT/US14/11130的35U.S.C371国家阶段申请，PCT/US14/11130要求2013年1月10日提交的美国临时申请第61/751,067号的权益，其公开通过引用整体并入本文。

本发明涉及包含硫酸葡聚糖或硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的混合物的细胞培养基，以及使用方法。本发明还涉及在大规模细胞培养物中产生目的蛋白的方法，在哺乳动物细胞中产生神经胚素(neublastin)抗体的方法，以及在哺乳动物细胞培养物中产生的神经胚素抗体。

背景技术

在过去的几十年中，多项研究集中于重组蛋白(例如单克隆抗体)的生产，并且该工作采用了多种角度。虽然文献中的许多工作已经利用了含有血清或水解产物的培养基，但是也开发了化学上确定的培养基，以便消除复杂组分的成问题的批次间变化(Luo和Chen,Biotechnol.Bioeng.97(6):1654-165.9(2007))。对细胞培养的改进的理解已经允许转移到化学上确定的培养基而不损害生长，活力，滴度等。迄今为止，已经报道了具有高达7.5-10g/升的滴度的优化的化学上确定的方法(Huang等人，Biotechnology Progress 26(5):1400-1410(2010)；Ma等人，Biotechnol.Prog.25(5):1353-1363(2009)；Yu等人，Biotechnol.Bioeng.108(5):1078-1088(2011)。通常，高滴度化学上确定的方法是补料分批方法，培养时间为11-18天。已经实现了该方法的强化，而不会损害产品质量，同时保持相对较高的活力。

实现稳健的，可规模化的生产方法包括不止增加产品滴度同时保持高产品质量。该方法还必须可预见地需要主要的碳水化合物源，使得补料策略不需要在规模上改变。由于许多方法使用葡萄糖作为主要的碳水化合物，并且乳酸盐和铵作为主要的副产物，所以这三种关键化学品的时间过程也应该按比例调整。

Ma和同事最近进行的代谢组学研究(Ma等人，Biotechnol.Prog.25(5):1353-1363(2009))提示TCA循环中的阻断，导致柠檬酸盐的早期分泌和随后的柠檬酸盐消耗。Ma所用的方法随后也可以导致高LPR：如果活力允许该方法的进一步延伸。在杂交瘤细胞的连续培养中，丙酮酸(0.02M)的补料显示抗体生产增加43％(Omasa等人，Bioproc.Biosys.Engin.33(1):117-125(2010))。在相同的培养系统中补料柠檬酸盐(0.05M和0.01M)仅导致抗体产生增加约5-10％。Bai最近报道了在化学上确定的CHO细胞培养物中增加的抗体生产，该培养物补充了高浓度的化学上确定的铁和高浓度的柠檬酸盐的组合(Bai等人，Biotechnol.Prog.27(1):209-219(2011))。然而，单独补充柠檬酸盐根本不能支持稳定的细胞生长。

本领域需要进一步改进重组蛋白生产方法以消除批次间代谢变化性。本文提供了防止或减少在重组蛋白生产细胞培养物中遇到的代谢变化性的组合物和方法。

发明概述

本发明涉及在培养基中培养细胞的方法，其包括用包含足量的硫酸葡聚糖的补料补充培养基。本发明还涉及在培养基中培养细胞的方法，其包括用含有硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的混合物的补料补充培养基。

在一实施方案中，培养基和/或补料包含足以使培养基中硫酸葡聚糖的浓度增加约0.1g/L至约5g/L的量的硫酸葡聚糖。在另一实施方案中，培养基和/或补料包含足以使培养基中柠檬酸铁的浓度提高约1mM至约50mM的量的柠檬酸铁。

本发明还涉及包含硫酸葡聚糖或硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的混合物的细胞培养基。

本发明还提供了细胞培养物组合物，其包含能够表达目的多肽的细胞和包含硫酸葡聚糖或硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的混合物的培养基。

本发明还涉及通过本文公开的方法生产的条件细胞培养基。在一实施方案中，条件培养基包含通过本文公开的方法产生的目的多肽。在一具体的实施方案中，根据本发明的条件培养基包含抗体。在另一具体的实施方案中，根据本发明的条件培养基包含转化生长因子(TGF)β超家族信号传导分子。在另一具体的实施方案中，根据本发明的条件培养基包含凝血因子。

在另一方面，本公开提供了包含哺乳动物细胞系的细胞培养物，所述哺乳动物细胞系已经被遗传修饰以在细胞培养基中表达神经胚素抗体多肽或其片段。在某些实施方案中，哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。在一些实施方案中，神经胚素抗体多肽或其片段包含SEQ ID NO:2或其部分，和/或SEQ ID NO:4或其部分。在具体的实施方案中，细胞已经适应于在无血清培养基，无动物蛋白培养基或化学上确定的培养基中生长。

在一些实施方案中，哺乳动物细胞培养物是灌注培养物或补料分批培养物。在某些实施方案中，细胞培养基是无血清培养基，无动物蛋白培养基或化学上确定的培养基。

在另一方面，本公开提供了在哺乳动物细胞培养物中产生的神经胚素抗体多肽或其片段，所述培养物包含经遗传修饰以在哺乳动物细胞培养物中表达神经胚素抗体多肽或其片段并且在哺乳动物细胞培养物中表达神经胚素抗体多肽或其片段的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系是CHO细胞系。在一些实施方案中，神经胚素抗体多肽或其片段包含SEQ ID NO:2或其部分，和/或SEQ ID NO:4或其部分。在具体的实施方案中，细胞已经适应于在无血清培养基，无动物蛋白培养基或化学上确定的培养基中生长。在一些实施方案中，神经胚素抗体多肽或其片段已经从哺乳动物细胞培养物中分离。

在另一方面，本公开提供了包含神经胚素抗体多肽或其片段的药物制剂，所述神经胚素抗体多肽或其片段已经从哺乳动物细胞培养物中分离，所述哺乳动物细胞培养物包含经遗传修饰以在哺乳动物细胞培养物中表达所述神经胚素抗体多肽或其片段的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞培养物是CHO细胞培养物。在具体的实施方案中，神经胚素抗体多肽包含SEQ ID NO:2或其部分，和/或SEQ ID NO:4或其部分。

附图简述

当结合附图阅读以下描述时，可以更全面地理解本公开的前述和其它目的，其各种特征以及本公开本身，其中：

图1A-1B是添加柠檬酸铁和硫酸葡聚糖维持乳酸盐水平并降低铵产生后柠檬酸盐(A)和铵产生(B)的图示；

图2A-2B是在将硫酸葡聚糖添加至摇瓶后的VC/ML(A)和活力(B)的图示；

图3A-3B是在向生物反应器接种物菌株培养物中添加硫酸葡聚糖后培养物的VCD(A)和活力的图示；

图4A-4B是使用硫酸葡聚糖接种的生产生物反应器中的细胞培养物的活细胞密度(A)和活力(B)的图示；

图5A是包括信号肽的神经胚素抗体重链的氨基酸序列的图示；

图5B是神经胚素抗体重链的氨基酸序列的图示；

图5C是包括信号肽的神经胚素抗体轻链的氨基酸序列的图示；

图5D是神经胚素抗体轻链的氨基酸序列的图示；

图6是在尺寸排阻色谱(SEC)柱上的神经胚素抗体的代表性洗脱曲线；

图7是来自图6中所示的SEC柱的峰材料的聚丙烯酰胺凝胶的代表图；和

图8是神经胚素抗体的重链和轻链以及具有信号肽的重链和轻链的DNA序列的示意图；

图8A是神经胚素重链的示意图(SEP ID NO:5)，所述重链具有以“MDSRLNLVFL”(SEQ ID NO:1的残基1至10)开始的信号肽；

图8B是神经胚素重链的简并反向翻译的示意图(SEQ ID NO:6)；

图8C是神经胚素重链的反向翻译的示意图(SEQ ID NO:7)，其显示了最可能的密码子，所述重链没有以“EVKWESGGG”(SEQ ID NO:2的残基1至10)开始的信号肽；

图8D是神经胚素重链的简并反向翻译的示意图(SEQ ID NO:8)；

图8E是神经胚素轻链的反向翻译的示意图(SEQ ID NO:9，所述轻链具有以“MKSOTQVFVF”(SEP ID NO:31的残基1至10)开始的信号肽；

图8F是神经胚素轻链的简并反向翻译的示意图(SEQ ID NO:10)；

图8G是神经胚素轻链的反向翻译的示意图(SEQ ID NO:11)，其显示了最可能的密码子，所述轻链以“SIYMTQTPKF”(SEQ ID NO:4的残基1至10)开始；和

图8H是神经胚素轻链的简并反向翻译的示意图(SEQ ID NO:12)。

详细描述

本说明书中提到的所有文献，文章，出版物，专利和专利申请都通过引用并入本文中，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指出通过引用并入一样。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，否则为本文的一个基团或术语提供的初始定义适用于整个说明书中的该基团或术语，单独地或作为另一个基团的一部分。

I.定义

术语“抗体”用于指免疫球蛋白分子，其通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标或抗原，例如蛋白，多肽，肽，碳水化合物，多核苷酸，脂质或前述的组合等。本文所用的这一术语涵盖完整的多克隆抗体，完整的单克隆抗体，抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)，单链Fv(scFv)突变体，多特异性抗体如从至少两种完整抗体产生的双特异性抗体，单价或单特异性抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体显示所需的生物活性即可。抗体可以是五种主要类型的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基于它们的重链恒定结构域的同一性，分别被称为α、δ、ε、γ和μ。

本文所用的术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文所用的术语“基础培养基制剂”或“基础培养基”是指未通过补充或通过选择性去除某种组分而被改良的用于培养细胞的任何细胞培养基。

本文所用的术语“分批培养”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始时提供最终用于培养细胞的所有组分，包括培养基(参见下文“培养基”的定义)以及细胞本身。分批培养通常在某点停止，收集培养基中的细胞和/或组分并任选地进行纯化。

本文所用的术语“生物反应器”是指用于哺乳动物细胞培养物生长的任何容器。生物反应器可以是任何大小的，只要它可用于哺乳动物细胞的培养。通常，生物反应器将是至少1升，并且可以是10、50、100、250、500、1000、2000、2,500、3000、5000、8000、10,000、12,000、15,000、20,000、30,000升或更大，或它们之间的任何体积。例如，生物反应器将是10至5,000升、10至10,000升、10至15,000升、10至20,000升、10至30,000升、50至5,000升、50至10,000升、50至15,000升、50至20,000升、50至30,000升、1,000至5,000升、或1,000至3,000升。通常在培养期间控制生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度。生物反应器可以由任何适于在本发明的培养条件下保持悬浮在培养基中的哺乳动物细胞培养物的材料组成，包括玻璃，塑料或金属。本文所用的术语“生产生物反应器”是指用于生产目的多肽或蛋白的最终生物反应器。大规模细胞培养生产生物反应器的体积通常为至少500升，并且可以是1000、2000、2500、5000、8000、10,000、12,0000、15,000升或更大，或它们之间的任何体积。例如，大规模细胞培养反应器将为约500升至约20,000升、约500升至约10,000升、约500升至约5,000升、约1,000升至约30,000升、约2,000升至约30,000升、约3,000升至约30,000升、约5,000升至约30,000升、或约10,000升至约30,000升，或大规模细胞培养反应器将为至少约500升、至少约1,000升、至少约2,000升、至少约3,000升、至少约5,000升、至少约10,000升、至少约15,000升、或至少约20,000升。本领域技术人员将知道并且将能够选择用于实施本发明的合适的生物反应器。

本文所用的术语“细胞密度”是指在给定体积的培养基中存在的细胞的数目。

本文所用的术语“培养物”、“细胞培养物”和“真核细胞培养物”是指在适于细胞群存活和/或生长的条件下悬浮在培养基(参见下文“培养基”的定义)中的真核细胞群。如本领域技术人员将清楚的，本文所用的这些术语可指包含哺乳动物细胞群和悬浮该群的培养基的组合。

本文所用的术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的某个时间向培养物提供另外的组分。可以使用基础培养基开始补料分批培养。在培养过程开始后的某个时间用其向培养物提供另外的组分的培养基是补料培养基。所提供的组分通常包含用于在培养过程中已经耗尽的细胞的营养补充物。在一实施方案中，本文所述的补料培养基包含硫酸葡聚糖或硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的混合物。在另一实施方案中，本文所述的补料培养基由硫酸葡聚糖或硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的混合物组成。补料分批培养通常在某点停止，收获培养基中的细胞和/或组分并任选纯化。

细胞培养物的“生长阶段”是指指数细胞生长的时期(对数阶段)，其中细胞通常快速分裂。在该阶段，培养细胞一段时间，通常培养1-4天，并且在使细胞生长最大化的条件下培养。宿主细胞生长周期的测定可以在不进行过度实验的情况下对预想的宿主细胞进行测定。“时间段和在细胞生长最大化这种条件下”等是指对于细胞系而言被确定为细胞生长和分裂最佳的那些培养条件。在生长阶段期间，通常在约25℃至40℃下，在湿润的受控气氛中，在含有必要添加剂的营养培养基中培养细胞，从而实现细胞系的最佳生长。细胞维持在生长阶段约1-4天，通常2-3天的时间。细胞的生长阶段的长度可以在不进行过度实验的情况下确定。例如，如果培养物维持在生长条件下，生长阶段的长度将是足以允许特定细胞繁殖至最大可能活细胞密度的约20％-80％范围内的活细胞密度的时间段。

细胞培养物的“生产阶段”是指细胞生长已经平稳的时间段。在生产阶段，对数细胞生长已经结束并且蛋白生产是主要的。在该时间段内，通常补充培养基以支持持续的蛋白生产并获得所需的糖蛋白产物。

本文所用的术语“表达”是指在宿主细胞内发生的转录和翻译。产物基因在宿主细胞中的表达水平可以基于存在于细胞中的相应mRNA的量或由细胞产生的产物基因编码的蛋白的量来确定。例如，从产物基因转录的mRNA理想地通过Northern杂交定量。Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.pp.7.3-7.57(Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)。产物基因编码的蛋白可以通过测定蛋白的生物活性或通过使用独立于这种活性的测定(例如蛋白印迹或使用能够与蛋白反应的抗体的放射免疫测定)来定量。Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,pp.18.1-18.88(ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)。

本文所用的术语“杂交瘤”是指通过来源于免疫源的永生化细胞和产生抗体的细胞的融合而产生的细胞。所得杂交瘤是产生抗体的永生化细胞。用于产生杂交瘤的单个细胞可以来自任何哺乳动物来源，包括但不限于大鼠，猪，兔，绵羊，猪，山羊和人。该术语还涵盖三源杂交瘤细胞系，其在异源杂交骨髓瘤融合物的后代随后与浆细胞融合时产生，该融合物是人细胞和鼠骨髓瘤细胞系之间融合的产物。此外，该术语旨在包括产生抗体的任何永生化杂交细胞系，例如，四源杂交瘤(quadromas)(参见，例如，Milstein等人，Nature，537：3053(1983)。

本文所用的术语“培养基”、“细胞培养基”和“生长培养基”是指含有滋养生长的真核细胞的营养物的溶液。通常，这些溶液提供细胞最低生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸，维生素，能量源，脂质和微量元素。所述溶液还可以含有提高生长和/或存活到最小速率以上的组分，包括激素和生长因子。将溶液配制成对于细胞存活和增殖而言最佳的pH和盐浓度。培养基也可以是“确定的培养基”或“化学上确定的培养基”，它是不含蛋白，水解产物或未知组成的组分的无血清培养基。确定的培养基不含动物来源的组分，并且所有组分都具有已知的化学结构。本领域技术人员理解，确定的培养基可包含重组多肽或蛋白，例如但不限于激素，细胞因子，白细胞介素和其它信号传导分子。

本文所用的术语“灌注培养”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后连续或半连续地向培养物提供另外的组分。所提供的组分通常包含在培养过程中已经耗尽的用于细胞的营养补充剂。培养基中的细胞和/或组分的一部分通常在连续或半连续的基础上收获并任选地纯化。

本文所用的术语“多肽”或“蛋白”是指通过肽键连接在一起的连续的氨基酸链。该术语用于指任何长度的氨基酸链，但是本领域技术人员将理解该术语不限于长链，并且可以指包含通过肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如果单条多肽是离散的功能单元并且确实需要与其它多肽永久的物理结合以形成离散的功能单元，则本文所用的术语“多肽”和“蛋白”可互换使用。如果离散的功能单元由一种以上的相互物理结合的多肽组成，本文所用的术语“蛋白”是指物理偶联并一起作为离散单元起作用的多条多肽。

本文所用的“重组表达的多肽”和“重组多肽”是指由宿主细胞表达的多肽，所述宿主细胞已被遗传工程改造以表达该多肽。重组表达的多肽可以与在哺乳动物宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似。重组表达的多肽对于宿主细胞而言也可以是外来的，即是哺乳动物宿主细胞中正常表达的肽异源的。或者，重组表达的多肽可以是嵌合的，其中多肽的一部分含有与哺乳动物宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其它部分对于宿主细胞而言是外来的。如本文所用，术语“重组表达的多肽”和“重组多肽”也涵盖由杂交瘤产生的抗体。

本文所用的术语“接种”是指向生物反应器或另一容器提供细胞培养物的过程。在一实施方案中，细胞先前已经在另一个生物反应器或容器中增殖。在另一实施方案中，细胞已经被冷冻并且在将细胞提供给生物反应器或容器之前立即解冻。该术语是指任何数量的细胞，包括单个细胞。

本文所用的术语“滴度”是指由细胞培养物产生的重组表达的多肽或蛋白的总量除以给定量的培养基体积。滴度通常以每毫升培养基中的多肽或蛋白的毫克数为单位来表示，或以每升培养基中的多肽或蛋白的克数为单位来表示。

如本公开和权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。

应当理解，每当本文用语言“包含”描述实施方案时，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的其它类似的实施方案。

II.细胞培养基及其使用方法

本发明涉及细胞培养基及其使用方法。本发明的培养基减少了与向乳酸盐产生的代谢转变相关的批次间代谢变化性。根据本发明的培养基可用于分批培养，补料分批培养或灌注培养。在一实施方案中，本发明的培养基是基础培养基。在另一实施方案中，本发明的培养基是补料培养基。

在一实施方案中，根据本发明的培养基包含硫酸葡聚糖。培养基可包含足够量的硫酸葡聚糖以将培养物中硫酸葡聚糖的浓度增加约0.01g/L至约5g/L。在一实施方案中，本文所述的补料培养基包含足够量的硫酸葡聚糖以将培养物中硫酸葡聚糖的浓度增加约0.01g/L至约5g/L、约0.01g/L至约4g/L、约0.01g/L至约3g/L、约0.01g/L至约2g/L、约0.01g/L至约1g/L、约0.01g/L至约0.5g/L、约0.01g/L至约0.25g/L、约0.05g/L至约5g/L、约0.05g/L至约4g/L、约0.05g/L至约3g/L、约0.05g/L至约2g/L、约0.05g/L至约1g/L、约0.05g/L至约0.5g/L、约0.05g/L至约0.25g/L、约0.1g/L至约5g/L、约0.1g/L至约4g/L、约0.1g/L至约3g/L、约0.1g/L至约2g/L、约0.1g/L至约1g/L、约0.1g/L至约0.5g/L、约0.1g/L至约0.25g/L、约0.2g/L至约5g/L、约0.2g/L至约4g/L、约0.2g/L至约3g/L、约0.2g/L至约2g/L、约0.2g/L至约1g/L、约0.2g/L至约0.5g/L、约0.2g/L至约0.25g/L、约0.25g/L至约5g/L、约0.25g/L至约4g/L、约0.25g/L至约3g/L、约0.25g/L至约2g/L、约0.25g/L至约1g/L或约0.25g/L至约0.5g/L。在另一实施方案中，本文所述的补料培养基包含足够量的硫酸葡聚糖以将培养物中硫酸葡聚糖的浓度增加约0.01g/L、约0.02g/L、约0.03g/L、约0.04g/L、约0.04g/L、约0.05g/L、约0.06g/L、约0.07g/L、约0.08g/L、约0.09g/L、约0.1g/L、约0.15g/L、约0.2g/L、约0.25g/L、约0.5g/L、约0.6g/L、约0.7g/L、约0.8g/L、约0.9g/L、约1g/L、约1.5g/L、约2g/L、约2.5g/L、约3g/L、约3.5g/L、约4g/L、约4.5g/L或约5g/L。本领域技术人员容易理解，由细胞培养物的补料培养基补充的硫酸葡聚糖的绝对量可以从添加到培养物的补料培养基的体积和补料培养基的硫酸葡聚糖的浓度来计算。

在一实施方案中，根据本发明的培养基包含硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的混合物。培养基可以包含足够量的柠檬酸铁以将培养物中的柠檬酸铁的浓度增加约1mM至约50mM。在一实施方案中，本文所述的补料培养基包含足够量的柠檬酸铁以将培养物中的柠檬酸铁的浓度增加约1mM至约50mM、约1mM至约40mM、约1mM至约35mM、约1mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约14mM、约1mM至约13mM、约1mM至约12mM、约1mM至约11mM、约1mM至约10mM、约2mM至约50mM、约3mM至约50mM、约4mM至约50mM、约5mM至约50mM、约10mM至约50mM、约15mM至约50mM、约20mM至约50mM、或约30mM至约50mM。在另一实施方案中、本文所述的补料培养基包含足够量的柠檬酸铁以将培养物中的柠檬酸铁的浓度增加约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM。本领域技术人员容易理解，由细胞培养物的补料培养基补充的柠檬酸铁的绝对量可以从添加到培养物的补料培养基的体积和补料培养基的柠檬酸铁的浓度来计算。

在一实施方案中，本文所述的培养基是无血清培养基，无动物蛋白培养基或化学上确定的培养基。在一具体的实施方案中，本文所述的培养基是化学上确定的培养基。

本发明还提供了包含本文所述的培养基和细胞的细胞培养物组合物。

在一实施方案中，根据本发明的细胞培养物组合物可以是分批培养物、补料分批培养物或灌注培养物。在一具体的实施方案中，本发明的细胞培养物组合物是补料分批培养物。

在一实施方案中，本文所述的细胞培养物组合物包含哺乳动物细胞，例如但不限于CHO细胞、HEK细胞、NSO细胞、PER.C6细胞、HeLa细胞和MDCK细胞。在一具体的实施方案中，本文所述的细胞培养物组合物包含CHO细胞。在另一具体的实施方案中，本文所述的细胞培养物组合物包含HEK细胞。在另一具体的实施方案中，本文所述的细胞培养物组合物包含杂交瘤细胞。

本文所述的细胞培养物组合物可以包含已经适应于在无血清培养基，无动物蛋白培养基或化学上确定的培养基中生长的细胞。可选地，它可以包含已经被遗传修饰以增加其培养寿命的细胞。在一实施方案中，细胞已经被修饰以表达抗凋亡基因。在一具体的实施方案中，细胞已经被修饰以表达bcl-xL抗凋亡基因。可根据本发明使用的其它抗凋亡基因包括但不限于E1B-9K、Aven、Mc1。

在另一实施方案中，本公开还提供了一种细胞培养物组合物，其包含适于产生神经胚素抗体或其片段的哺乳动物细胞。还提供了用于该目的的有用细胞(包括但不限于CHO细胞和视网膜来源的细胞)，以及在哺乳动物细胞中产生的神经胚素抗体或其片段。

本发明提供了培养细胞的方法，其包括使细胞与本文公开的培养基接触。

细胞培养物可以以分批培养，补料分批培养或灌注培养进行培养。在一实施方案中，根据本发明的方法的细胞培养是分批培养。在另一实施方案中，根据本发明的方法的细胞培养是补料分批培养。在另一实施方案中，根据本发明的方法的细胞培养是灌注培养。

在一实施方案中，根据本发明方法的细胞培养物是无血清培养物。在另一实施方案中，根据本发明的方法的细胞培养物是化学上确定的培养物。在另一实施方案中，根据本发明的方法的细胞培养物是无动物蛋白的培养物。

在一实施方案中，在培养物的生长阶段，将细胞培养物与本文所述的培养基接触。在另一实施方案中，在培养物的生产阶段，将细胞培养物与本文所述的培养基接触。

在一实施方案中，在培养物的生产阶段，将根据本发明的细胞培养物与本文所述的补料培养基接触。在一实施方案中，在第二时间段，向培养物补充约1至约25次的补料培养基。在另一实施方案中，在第一时间段，向培养物补充约1至约20次、约1至约15次、或约1至约10次的补料培养基。在另一实施方案中，向培养物补充至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少20次、至少25次的补料培养基。在一具体的实施方案中，培养是补料分批培养。在另一具体的实施方案中，培养是灌注培养。

可以以规律的间隔将根据本发明的培养物与本文所述的补料培养基接触。在一实施方案中，规律的间隔为约一天一次、约每两天一次、约每三天一次、约每4天一次或约每5天一次。在一具体的实施方案中，培养是补料分批培养。在另一具体的实施方案中，培养是灌注培养。

可以基于培养物的代谢状态根据需要将根据本发明的培养物与本文所述的补料培养基接触。在一实施方案中，在用本文所述的补料培养基补充培养物之前测量补料分批培养物的代谢标志物。在一实施方案中，代谢标志物选自：乳酸盐浓度、铵浓度、丙氨酸浓度、谷氨酰胺浓度、谷氨酸盐浓度、细胞特异性乳酸盐产生速率与细胞特异性葡萄糖摄取速率比(LPR/GUR比)和Khodarnine 123特异性细胞荧光。在一实施方案中，LPR/GUR值>0.1表明需要用本文所述的补料培养基补充培养物。在另一具体的实施方案中，乳酸盐浓度>3g/L表明需要用本文所述的补料培养基补充培养物。在另一实施方案中，当培养物的LPR/GUR值>0.1或当培养物的乳酸盐浓度>3g/L时，用本文所述的补料培养基补充根据本发明的培养物。在一具体的实施方案中，培养是补料分批培养物。在另一具体的实施方案中，培养是灌注培养。

在一实施方案中，本文所述的培养基是用于补料分批细胞培养的补料培养基。本领域技术人员理解，可以将补料分批细胞培养物与补料培养基接触一次以上。在一实施方案中，将补料分批细胞培养物仅与本文所述的培养基接触一次。在另一实施方案中，将补料分批细胞培养物与本文所述的培养基接触一次以上，例如至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次或至少十次。

根据本发明，添加到细胞培养物中的补料培养基的总体积应该最优地保持在最小的量。例如，添加到细胞培养物中的补料培养基的总体积可以是添加补料培养基之前细胞培养物体积的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

细胞培养物可以生长以获得特定的细胞密度，这取决于从业者的需要和细胞本身的要求，然后与本文所述的培养基接触。在一实施方案中，使细胞培养物以以下活细胞密度与本文所述的培养基接触：最大活细胞密度的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一具体的实施方案中，培养基是补料培养基。

在将细胞培养物与本文所述的培养基接触之前，可以使细胞培养物生长确定的时间段。在一实施方案中，在细胞培养物的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，将细胞培养物与本文所述的培养基接触。在另一实施方案中，在细胞培养物的第1、2、3、4、5、6、7或8周，将细胞培养物与本文所述的培养基接触。在一具体的实施方案中，培养基是补料培养基。

细胞培养物可以在生产阶段培养确定的时间段。在一实施方案中，在生产阶段的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，将细胞培养物与本文所述的补料培养基接触。

根据本发明的培养物可以在生产阶段维持约1天至约30天。在一实施方案中，培养物在生产阶段维持约1天至约30天、约1天至约25天、约1天至约20天、约1天至约15天、约1天至约14天、约1天至约13天、约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约2天至约25天、约3天至约25天、约4天至约25天、约5天至约25天、约6天至约25天、约7天至约25天、约8天至约25天、约9天至约25天、约10天至约25天、约15天至约25天、约20天至约25天、约2天至约30天、约3天至约30天、约4天至约30天、约5天至约30天、约6天至约30天、约7天至约30天、约8天至约30天、约9天至约30天、约10天至约30天、约15天至约30天、约20天至约30天、或约25天至约30天。在另一实施方案中，培养物在生产阶段维持至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约15天、至少约20天、至少约25天、或至少约30天。在另一实施方案中，培养物在生产阶段维持约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约15天、约20天、约25天或约30天。

本发明还提供了预防或减少细胞培养物中代谢失衡的方法。代谢失衡可以通过测量细胞培养物中代谢物的水平来监测。例如，代谢失衡可通过监测细胞培养物中的乳酸盐产生、铵产生、细胞特异性乳酸盐产生速率(LPR)与细胞特异性葡萄糖摄取速率(GUR)比、丙氨酸消耗或谷氨酰胺消耗来检测。在一实施方案中，代谢失衡通过增加乳酸盐产生，增加铵产生或增加细胞特异性乳酸盐产生速率与细胞特异性葡萄糖摄取速率比(“LPR/GUR比”)来发信号。在另一实施方案中，代谢失衡通过丙氨酸消耗的增加或通过谷氨酰胺消耗的增加来发信号。

在一实施方案中，根据本发明的培养细胞的方法在指数生长阶段预防或减少线粒体功能障碍或代谢失衡。在另一实施方案中，根据本发明的培养细胞的方法在细胞通过指数生长阶段后预防或减少线粒体功能障碍或代谢失衡。在另一实施方案中，根据本发明的培养细胞的方法在生产阶段预防或减少线粒体功能障碍或代谢失衡。

本发明还提供了一种减少细胞培养物的乳酸盐产生的方法，包括使细胞培养物与本文所述的培养基接触。在一实施方案中，在本文所述的细胞培养基中维持的细胞的乳酸盐产生低于在基本上不含硫酸葡聚糖或柠檬酸铁的培养基中维持的细胞的乳酸盐产生约5％至约90％、约5％至约80％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、或约50％至约90％、或至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、或至少约90％、或约5％、约10％、约20％、约30％、约50％或约90％。在一实施方案中，本文所述的细胞培养物包含约0.1g/L至约6g/L、约0.1g/L至约5g/L、约0.1g/L至约4g/L、或约0.1g/L至约3g/L的乳酸盐。在另一实施方案中，本文所述的细胞培养物包含少于约6g/L、约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L或约1g/L的乳酸盐。

本发明还提供了一种减少细胞培养物的铵产生的方法，包括将细胞培养物与本文所述的培养基接触。在一实施方案中，在本文所述的细胞培养基中维持的细胞的铵产生低于在基本上不含硫酸葡聚糖或柠檬酸铁的培养基中维持的细胞的铵产生约5％至约90％、约5％至约80％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、或约50％至约90％、或至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、或至少约90％、或约5％、约10％、约20％、约30％、约50％或约90％。在一实施方案中，本文所述的细胞培养物包含约0.1mM至约20mM、约0.1mM至约15mM、约0.1mM至约14mM、约0.1mM至约13mM、约0.1mM至约12mM、约0.1mM至约11mM、约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约9mM、约0.1mM至约8mM、约0.1mM至约7mM、约0.1mM至约6mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约4mM、约0.1mM至约3mM、约0.1mM至约2mM、约0.1mM至约1mM、约0.5mM至约20mM、约0.5mM至约15mM、约0.5mM至约14mM、约0.5mM至约13mM、约0.5mM至约12mM、约0.5mM至约11mM、约0.5mM至约10mM、约0.5mM至约9mM、约0.5mM至约8mM、约0.5mM至约7mM、约0.5mM至约6mM、约0.5mM至约5mM、约0.5mM至约4mM、约0.5mM至约3mM、约0.5mM至约2mM、约0.5mM至约1mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约14mM、约1mM至约13mM、约1mM至约12mM、约1mM至约11mM、约1mM至约10mM、约1mM至约9mM、约1mM至约8mM、约1mM至约7mM、约1mM至约6mM、约1mM至约5mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM、或约1mM至约2mM的铵。在另一实施方案中，本文所述的细胞培养物包含小于约20mM、约19mM、约18mM、约17mM、约16mM、约15mM、约14mM、约13mM、约12mM、约11mM、约10mM、约9mM、约8mM、约7mM、约6mM、约5mM、约4mM、约3mM、约2mM、约1mM或约0.5mM的铵。

本发明还提供了一种产生目的蛋白或多肽的方法，包括在包含本文所述培养基的培养物中培养能够产生目的蛋白或多肽的细胞；和从培养物中分离所述蛋白或多肽。在一实施方案中，目的蛋白或多肽是重组蛋白或多肽。在一实施方案中，目的蛋白或多肽是酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原或结合剂。在一具体的实施方案中，蛋白是抗体，其可以是但不限于神经胚素抗体，例如单克隆抗体。

在本发明的一实施方案中，包含本文所述的培养基的细胞培养物可以比不包含外源硫酸葡聚糖的细胞培养物更长久地维持在生产阶段。本领域技术人员容易理解，延长的生产阶段可导致细胞培养物生产的多肽总量的增加。在一实施方案中，根据本发明的生产目的多肽的方法比通过不包括在包含外源硫酸葡聚糖的培养物中维持能够生产所述多肽的细胞的方法产生的量产生更多的多肽。在一实施方案中，根据本发明的方法产生多约5％至约500％、约5％至约250％、约5％至约100％、约5％至约80％、约5％至约50％、约5％至约30％、约10％至约500％、约20％至约500％、约30％至约500％、约50％至约500％、或约100％至约500％的蛋白或多肽。在另一实施方案中、根据本发明的方法产生多至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约70％、至少约90％、或至少约100％的蛋白或多肽。在另一实施方案中，根据本发明的方法产生多至少约2倍、3倍、4倍、5倍或10倍的蛋白或多肽。在一具体的实施方案中，蛋白或多肽是抗体。

在一实施方案中，根据本发明的生产目的多肽的方法在细胞培养物中产生比通过不包括在包含硫酸葡聚糖的培养物维持细胞的方法产生的滴度更高的多肽滴度。在一实施方案中，根据本发明的方法产生高约5％至约500％、约5％至约250％、约5％至约100％、约5％至约80％、约5％至约50％、约5％至约30％、约10％至约500％、约20％至约500％、约30％至约500％、约50％和约500％、或约100％和约500％的滴度。在另一实施方案中，根据本发明的方法产生高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约70％、至少约90％或至少约100％的滴度。在另一实施方案中，根据本发明的方法产生高至少约2倍、3倍、4倍、5倍或10倍的滴度。在一具体的实施方案中，蛋白或多肽是抗体。

在一具体的实施方案中，根据本发明的生产目的多肽的方法产生至少约2g/升、至少约2.5g/升、至少约3g/升、至少约3.5g/升、至少约4g/升、至少约4.5g/升、至少约5g/升、至少约6g/升、至少约7g/升、至少约8g/升、至少约9g/升、或至少约10g/升的最大蛋白或多肽滴度。在另一实施方案中，根据本发明的方法产生约1g/升至约10g/升、约1.5g/升至约10g/升、约2g/升至约10g/升、约2.5g/升至约10g/升、约3g/升至约10g/升、约4g/升至约10g/升、约5g/升至约10g/升、约1g/升至约5g/升、约1g/升至约4.5g/升、或约1g/升至约4g/升的最大蛋白或多肽滴度。在一具体的实施方案中，蛋白或多肽是抗体。在另一实施方案中，蛋白或多肽是凝血因子。

本发明还提供了通过本文所述方法生产的条件细胞培养基。

在一实施方案中，根据本发明的条件细胞培养基包含重组蛋白或多肽。在一具体的实施方案中，根据本发明的条件细胞培养基包含重组蛋白或多肽，其滴度为至少约2g/升、至少约2.5g/升、至少约3g/升、至少约3.5g/升、至少约4g/升、至少约4.5g/升、至少约5g/升、至少约6g/升、至少约7g/升、至少约8g/升、至少约9g/升、或至少约10g/升、或滴度为约1g/升至约10g/升、约1.5g/升至约10g/升、约2g/升至约10g/升、约2.5g/升至约10g/升的升、约3克/升至约10克/升、约4克/升至约10克/升、约5克/升至约10克/升、约1克/升至约5克/升、约1克/升至约4.5克/升、或约1克/升至约4克/升。在另一实施方案中，根据本发明的条件细胞培养基包含的重组蛋白或多肽的滴度高于不使用本文所述培养基获得的滴度。在一具体的实施方案中，蛋白或多肽是抗体。

多肽类

可以根据本发明产生在宿主细胞中可表达的任何多肽。多肽可以从宿主细胞内源的基因表达，或者从通过基因工程改造导入宿主细胞的基因表达。多肽可以是自然界中存在的多肽，或者可以可选地具有由人的手工程改造或选择的序列。工程改造的多肽可以从自然界中单独存在的其它多肽片段组装，或者可以包括一个或多个非天然存在的片段。

根据本发明可以理想地表达的多肽通常基于感兴趣的生物学或化学活性来选择，例如，本发明可以用于表达任何药学或商业相关的酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原、结合剂等。

特别有用的多肽是高度带负电荷的那些。高度带负电荷的多肽的实例包括但不限于神经胚素和因子VIII。

抗体类

根据本发明，考虑到目前正在使用或正在研究的大量抗体作为药物或其它商业试剂，抗体的产生是特别令人感兴趣的。抗体是具有特异性结合特定抗原的能力的蛋白。可以在宿主细胞中表达的任何抗体都可以根据本发明使用。在一实施方案中，待表达的抗体是单克隆抗体。

例如，可通过制备并表达编码所记载的氨基酸序列的合成基因或通过突变人种系基因以提供编码所记载的氨基酸序列的基因来制备特定抗体。此外，可以产生这些抗体，例如，使用一种或多种以下方法产生这些抗体。

多种方法可用于获得抗体，特别是人抗体。一种示例性方法包括筛查蛋白表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。描述了噬菌体展示，例如，美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science 228:1315-1317；WO92/18619；WO91/17271；WO92/20791；和WO90/02809。Fab’s在噬菌体上的展示描述于例如美国专利5,658,727；5,667,988；和5,885,793中。

除了使用展示文库之外，还可以使用其它方法来获得抗体。例如，蛋白或其肽可用作非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠、仓鼠或大鼠)中的抗原。

在一实施方案中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能用人Ig基因座的大片段工程改造小鼠抗体生产缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以产生和选择来自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSE^TM,Green等人，(1994)Nature Genetics 7:13-21,U.S.2003-0070185,WO 96/34096和WO 96/33735。

在另一实施方案中，从非人动物获得单克隆抗体，然后修饰，例如人源化或去免疫。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性CDR移植方法(美国专利号5,225,539)。特定人抗体的所有或一些CDR可以被非人抗体的至少一部分替换。在一实施方案中，仅需要替换这些CDR中结合或结合决定簇所需的CDR以获得有用的能结合抗原的人源化抗体。

人源化抗体可以通过用人Fv可变区的等同序列替换Fv可变区中不直接参与抗原结合的序列来产生。用于产生人源化抗体的一般方法由以下提供：Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202-1207，Oi等人(1986)BioTechniques 4:214以及美国专利号5,585,089；美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；美国专利号5,859,205；和美国专利号6,407,213。这些方法包括分离、操纵和表达核酸序列，所述核酸序列编码来自重链或轻链中的至少一条的免疫球蛋白Fv可变区的全部或部分。这种核酸的来源是本领域技术人员熟知的，例如，可以从如上所述的产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤，从种系免疫球蛋白基因，或从合成构建体获得。然后可以将编码人源化抗体的重组DNA克隆到适当的表达载体中。在一实施方案中，表达载体包含编码谷氨酰胺合成酶多肽的多核苷酸。(参见，例如，Porter等人,Biotechnol Prog 26(5):1446-54(2010)。

抗体可以包括人Fc区，例如野生型Fc区或包括一个或多个改变的Fc区。在一实施方案中，恒定区被改变，例如突变，以改变抗体的性质(例如，增加或减少以下的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能)。例如，人IgG恒定区可以在一个或多个残基处，例如残基234和237中的一个或多个处突变。抗体可以在重链的CH2区中具有减少或改变效应子功能的突变，例如Fc受体结合和补体激活。例如，抗体可以具有突变，如美国专利号5,624,821和5,648,260中描述的那些。抗体还可以具有稳定免疫球蛋白的两条重链之间的二硫键的突变，例如IgG14的铰链区中的突变，如本领域所公开的(例如，Angal等人，(1993)Mol.Immunol.30:105-08)。还参见例如U.S.2005-0037000。

在其它实施方案中，抗体可以被修饰以具有改变的糖基化模式(即，从原始或天然糖基化模式改变)。如本上下文所用，“改变的”是指使一个或多个碳水化合物部分缺失，和/或使一个或多个糖基化位点添加到原始抗体。通过改变氨基酸序列以包含糖基化位点共有序列，可以实现向本公开的抗体添加糖基化位点；这种技术在本领域中是公知的。增加抗体上碳水化合物部分的数量的另一种方法是将糖苷化学或酶促偶联到抗体的氨基酸残基上。这些方法描述于例如WO87/05330以及Aplin和Wriston(1981)CRC Crit,Rev.Biochem.22:259-306。抗体上存在的任何碳水化合物部分的去除可以如本领域所述化学或酶促完成(Hakimuddin等人，(1987)Arch.Biochem.Biophys.259:52；Edge等人，(1981)Anal.Biochem.118:131；和Thotakura等人，(1987)Meth.Enzymol，138：350)，对于通过提供拯救受体(salvage receptor)结合表位而增加体内半衰期的修饰，参见，例如，美国专利号5,869,046。

抗体可以是全长抗体的形式，或者是抗体片段的形式，例如Fab、F(ab')2、Fd、dAb和scFv片段。另外的形式包括包含单个可变结构域，例如骆驼科动物或骆驼化结构域的蛋白。参见，例如，U.S.2005-0079574和Davies等人，(1996)Protein Eng.9(6):531-7。

在一实施方案中，抗体是全长抗体的抗原结合片段，例如Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段。通常，抗体是全长抗体。抗体可以是单克隆抗体或单特异性抗体。

在另一实施方案中，抗体可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体、嵌合抗体、突变抗体、亲和成熟抗体、去免疫抗体、合成抗体或其它体外产生的抗体及以上的组合。

抗体的重链和轻链可以基本上是全长的。蛋白可包括至少一条，优选两条完整重链，和至少一条，优选两条完整轻链，或可包括抗原结合片段(例如Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段)。在其它实施方案中，抗体具有选自例如IgG1、IgG2、IgG13、IgG4、IgM、IgGA1、IgA2、IgD和IgE；特别地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别地，选自IgG1(例如IgG1)的重链恒定区。通常，重链恒定区是人恒定区或人恒定区的修饰形式。在另一实施方案中，抗体具有选自例如κ或λ，特别是κ(例如人κ)的轻链恒定区。

受体类

另一类已显示有效作为药物和/或商业试剂的多肽包括受体。受体通常是通过识别细胞外信号传导配体起作用的跨膜糖蛋白。除了配体识别结构域之外，受体通常还具有蛋白激酶结构域，其通过在结合配体时使靶细胞内分子磷酸化而启动信号传导途径，从而导致细胞内的发育或代谢变化。在一实施方案中，目的受体被修饰以去除跨膜和/或胞内结构域，其被代替而可以任选地连接Ig结构域。在一实施方案中，根据本发明产生的受体是受体酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包括对于多种细胞类型的多种功能至关重要的受体(参见，例如，Yarden和Ullrich，Ann.Rev.Biochem.57:433-478,1988；Ullrich和Schlessinger(1990)Cell61:243,254)。RTK的非限制性实例包括成纤维细胞生长因子(FGF)受体家族成员、表皮生长因子受体(EGF)家族成员、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、具有免疫球蛋白和EGF同源结构域-1(TIE-1)和TIE-2的酪氨酸激酶受体(Sato等人,Nature 376(6535):70-74(1995)，通过引用并入本文)和c-Met受体，其中一些已经显示直接或间接促进血管生成(Mustonen和Alitalo,J.Cell Biol.129:895-898,1995)。RTK的其它非限制性实例包括胎肝激酶1(FLK-1)(有时称为含有激酶插入结构域的受体(KDR))(Terman等人,Oncogene 6:1677-83,1991)或血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2))、fins样酪氨酸激酶-1(Flt-1)(DeVries等人，Science 255:989-991,1992；Shibuya等人,Oncogene 5:519-524,1990)(有时称为血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1))、神经纤毛蛋白-1、内皮糖蛋白、内皮唾液蛋白和Axl。本领域技术人员将知道可根据本发明表达的其它受体。

生长因子和其他信号传导分子

另一类已显示有效作为药物和/或商业试剂的多肽包括生长因子和其它信号传导分子。生长因子通常是糖蛋白，其由细胞分泌并结合和活化其它细胞上的受体，从而引发受体细胞中的代谢或发育变化。

哺乳动物生长因子和其它信号传导分子的非限制性实例包括细胞因子；表皮生长因子(EGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)，例如aFGF和bFGF；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-1和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(TL)，例如IL-1至IL-10；肿瘤坏死因子(TNF)α和β；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激激素；降钙素；黄体生成激素；胰高血糖素；抗凝血因子，例如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶，造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(在正常表达和分泌的T细胞活化时调节)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；米勒管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；神经营养因子如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β。本领域技术人员将知道可根据本发明表达的其它生长因子或信号分传导分子。

凝血因子

在一些实施方案中，目的蛋白包含凝血因子。本文所用的“凝血因子”是指在患有止血病症的受试者中预防或减少流血事件的持续时间的任何分子或其类似物。例如，本发明的凝血因子可以是全长凝血因子，成熟凝血因子或嵌合凝血因子。换句话说，它是指具有凝血活性的任何分子。本文所用的凝血活性是指参与生化反应级联的能力，所述生化反应级联在形成纤维蛋白凝块中达到顶点和/或降低出血或流血事件的严重性，持续时间或频率。凝血因子的实例可以在美国专利号7,404,956中找到。

在一实施方案中，凝血因子是因子VIII、因子IX、因子XI、因子XII、纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X、因子XIII或维勒布兰德因子。凝血因子可以是参与外在途径的因子。凝血因子可以是参与内在途径的因子。或者，凝血因子可以是既参与外在途径又参与内源性途径的因子。

在一实施方案中，凝血因子可以是非人凝血因子或例如衍生自非人灵长类，猪或任何哺乳动物的非人凝血因子。凝血因子可以是嵌合凝血因子，例如，凝血因子可以包括人凝血因子的一部分和猪凝血因子的一部分，或第一非人凝血因子的一部分和第二非人凝血因子的一部分。

在另一实施方案中，凝血因子可以是活化的凝血因子。可选地，凝血因子可以是凝血因子的非活性形式，例如，酶原。在与免疫球蛋白恒定区的至少一部分连接后，非活性凝血因子可以经历活化。非活性凝血因子可以在施用于受试者后被活化。可选地，可以在施用前活化非活性凝血因子。

在某些实施方案中，凝血因子是因子VIII蛋白。除非另有说明，本文所用的“因子VIII蛋白”或“FVIII蛋白”是指在凝血中起正常作用的功能性因子VIII蛋白。因此，术语FVIII包括功能性的变体蛋白。在一实施方案中，FVIII蛋白是人，猪，犬，大鼠或海洋生物FVIII蛋白。功能性FVIII蛋白可以是融合蛋白，例如但不限于包含完全或部分B结构域缺失的FVIII，免疫球蛋白恒定区的至少一部分(例如Fc结构域)或两者的融合蛋白。已经构建了无数的功能性FVIII变体，并且可以用作如本文所述的重组FVIII蛋白，参见PCT公开号WO2011/069164 A2、WO2012/006623 A2、WO2012/006635 A2或WO2012/006633 A2，其全部通过引用整体并入本文。

许多功能性FVIII变体是已知的。此外，已经在血友病患者中鉴定了FVIII中的数百个非功能性突变。参见例如Cutler等人,Hum.Mutat.19：274-8(2002)，其通过引用整体并入本文中。此外，来自人和其它物种的FVIII之间的比较已经鉴定出功能可能需要的保守残基。参见，例如，Cameron等人,Thromb.Haernost.79:317-22(1998)和US 6,251,632，其通过引用整体并入本文。

在某些方面，本发明的重组FVIII蛋白是嵌合的。本文所用的“嵌合蛋白”或“嵌合多肽”是指在其中包括来自不同来源的至少两个氨基酸片段的蛋白或多肽，例如包含异源部分的FVIII蛋白。在一实施方案中，异源部分可以是半衰期延长部分。异源部分的实例包括但不限于免疫球蛋白恒定区或其片段，例如Fc区或FeRn结合伴侣、VWF分子或其片段、白蛋白、白蛋白结合多肽、Fc、PHS、人绒毛膜促性腺激素的C端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或以上的组合。在一些实施方案中，嵌合蛋白是FVIII单体二聚体杂合体。

用于本发明的长效或持久FIX多肽是包含FIX多肽和FcRn结合伴侣的嵌合多肽。除非另有说明，本发明的FIX多肽包含在凝血中具有其正常作用的功能性因子IX多肽。因此，FIX多肽包括功能性的变体多肽和编码这种功能性变体多肽的多核苷酸。在一实施方案中，FIX多肽是人、牛、猪、犬、猫和鼠FIX多肽。FIX的全长多肽和多核苷酸序列是已知的，这些是许多功能性变体，例如片段，突变体和修饰形式。FIX多肽包括全长FIX、全长FIX减去N-末端的Met、全长FIX减去信号序列、成熟FIX(减去信号序列和前肽)，以及在N-末端具有额外Met的成熟FIX。FIX可以通过重组方法(“重组因子IX”或“rFIX”)进行，即，它不是天然存在的或不是衍生自血浆。

凝血因子还可以包括FIX蛋白或其任何变体，类似物或功能性片段。许多功能性FIX变体是已知的。国际公开号WO02/040544 A3(其通过引用整体并入本文中)在第4页第9-30行和第15页第6-31行公开了对肝素抑制显示出抗性增加的突变体。国际公开号WO03/020764 A2(其通过引用整体并入本文中)在表2和3(第14-24页)以及第12页第1-27行中公开了具有降低的T细胞免疫原性的FIX突变体。国际公开号WO2007/149406 A2(其通过引用整体并入本文中)在第4页第1行至第19页第11行公开了功能性突变FIX分子，其显示出增加的蛋白稳定性、增加的体内和体外半衰期和增加的对蛋白酶的抗性。WO2007/149406 A2也在第19页第12行至第20页第9行公开了嵌合和其它变异FIX分子。国际公开号WO08/118507A2(其通过引用整体并入本文中)在第5页第14行至第6页第5行公开了显示出增加的凝血活性的FIX突变体。国际公开号WO09/051717 A2在第9页第11行至第20页第2行公开了具有增加数量的N-连接和/或O-连接糖基化位点的FIX突变体，其导致增加的半衰期和/或回收。国际公开号WO09/137254 A2(其通过引用整体并入本文中)在第2页第[006]段至第5页第[011]段和第16页第[044]段至第24页第[057]段，还公开了具有增加数量的糖基化位点的因子IX突变体。国际公开号WO09/130198 A2(其通过引用整体并入本文中)在第4页第26行至第12页第6行公开了具有增加数量的糖基化位点的功能性突变FIX分子，其导致增加的半衰期。国际公开号WO09/140015 A2(其通过引用整体并入本文中)在第11页第[0043]段至第13页第[0053]段公开了具有增加数量的Cys残基(其可用于聚合物(例如,PEG)缀合)的功能性FIX突变体。2011年7月11日提交的并于2012年1月12日作为WO2012/006624公布的国际申请号PCT/US2011/043569也通过引用整体并入本文。

此外，在血友病患者中已经鉴定出FIX中的数百个非功能性突变，其中许多在国际公开号WO09/137254 A2(其通过引用整体并入本文中)的第11-14页的表1中公开。这样的非功能性突变不包括在本发明中，而是对哪些突变或多或少可能导致功能性FIX多肽提供额外的指导。

在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白是FIX单体二聚体杂合体。单体-二聚体杂合体可以包含两条多肽链，一条链包含FIX多肽和第一Fc区，另一条链包含第二Fc区，基本上由第二Fc区组成或由第二Fc区组成。在某些方面，FIX单体二聚体杂合体基本上由两条多肽链组成或由两条多肽链组成，第一条链基本上由FIX多肽组成或由FIX多肽组成，第二条链基本上由第二Fc区组成或由第二Fc区组成。

在一些实施方案中，凝血因子是成熟形式的因子VII或其变体。因子VII(F-VII，F7；也称为因子7、凝血因子VII、血清因子VII、血清凝血酶原转化促进剂、SPCA、前转化素和eptacogα)是作为凝血级联的一部分的丝氨酸蛋白酶。FVII包括Gla结构域，两个EGF结构域(EGF-1和EGF-2)和丝氨酸蛋白酶结构域(或肽酶S1结构域)，其在丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族的所有成员(例如胰凝乳蛋白酶)中高度保守。FVII以单链酶原，活化的酶原样双链多肽和完全活化的双链形式存在。

示例性FVII变体包括具有增加的比活性的那些变体，例如，通过提高FVII的酶促活性(Kcat或Km)来提高其活性的突变。这种变体已在本领域中描述，包括例如以下所描述的分子的突变形式：Persson等人，2001,PNAS 98:13583；Petrovan和Ruf.2001.J.Biol,Chem.276:6616；Persson等人，2001 J.Biol.Chem.276:29195；Soejima等人，2001.J.Biol.Chem.276:17229；Soejima等人，2002,J.Biol.Chem.247:49027。

在一实施方案中，FVII的变体形式包括突变。示例性突变包括V158D-E296V-M298Q。在另一实施方案中，-FVII的变体形式包括用来自胰蛋白酶170环的氨基酸EASYPGK替换FVII成熟序列的氨基酸608-619(LQQSRKVGDSPN，对应于170环)。FIX的高比活变体也是本领域已知的。例如，Simioni等人，(2009N.E.J.of Med.361:1671)描述了R338L突变。Chang等人(1988JBC 273:12089)和Pierri等人(20.09Human Gene Therapy 20:479)描述了R338A突变。其它突变是本领域已知的并且包括例如在Zogg和Brandstetter.2009Structure 17:1669；Sichler等人，2003.J.Biol.Chem.278:4121；和Sturzebecher等人，1997.FEBS Lett 412:29(这些参考文献的内容通过引用并入本文中)中描述的那些。

在从酶原样形式构象变化时发生的完全活化在与辅因子组织因子结合时发生。而且，可以引入突变，这导致在不存在组织因子的情况下发生构象变化。因此，提及FVIIa包括其两种双链形式：酶原样形式(例如可活化的FVII)，和完全活化的双链形式。

公开了用于本发明的凝血因子的实例的各种专利或申请通过引入并入本文。例如，US7,404,945、US7,348,004、US7,862,820、US8,329,182和US7,820,162(通过引用整体并入本文中)中公开了包含凝血因子(FVII、FIX和FVIII)的各种单体二聚体杂合体构建体。美国申请号61/734,954或61/670,553(通过引用整体并入本文中)另外公开了FVIII嵌合蛋白的实例。FVII嵌合蛋白的实例公开于美国申请号61/657,688中。

G蛋白偶联受体

另一类已显示有效作为药物和/或商业试剂的多肽包括生长因子和其它信号传导分子。G-蛋白偶联受体(GPCR)是具有7个跨膜结构域的蛋白。当配体与GPCR结合时，细胞内的信号被转导，这导致细胞的生物学或生理学特性的变化。

GPCR以及G-蛋白和效应子(由G-蛋白调节的细胞内酶和通道)是将细胞内第二信使的状态连接到细胞外输入的模块化信号传导系统的组分。这些基因和基因产物是疾病的潜在病原体。

GPCR蛋白超家族现在含有超过250种类型的旁系同源物(即代表由基因复制(或其它过程)产生的变体的受体)，其与直系同源物(即来自不同物种的相同受体)相反。该超家族可以被分成五个家族；家族I，以视紫红质和β2-肾上腺素能受体为代表的受体，目前由超过200个独特成员表示；家族II，最近表征的甲状旁腺激素/降钙素/分泌素受体家族；家族III，哺乳动物中的代谢型谷氨酸受体家族；家族IV，cANIP受体家族，在盘基网柄菌(D.discoideum)的趋化性和发育中是重要的；和家族V，真菌交配信息素受体，例如STE2。

病毒类

此外，本发明还提供了根据病毒学领域技术人员已知的方法使用细胞培养物生产病毒的方法。根据本发明产生的病毒可以选自已知感染培养的细胞类型的病毒。例如，当利用哺乳动物细胞培养物时，病毒可以选自正粘病毒属、副粘病毒属、呼肠孤病毒属、小核糖核酸病毒属、黄病毒属、沙粒病毒属、疱疹病毒属、痘病毒属、冠状病毒属和腺病毒属。所用的病毒可以是野生型病毒、减毒病毒、重排病毒(reassortant virus)或重组病毒。此外，代替用病毒感染细胞的实际病毒体，可以根据病毒学领域技术人员已知的感染性克隆转染方法使用感染性核酸克隆。在一实施方案中，产生的病毒是流感病毒。

细胞

根据本发明，可以利用易于细胞培养的任何真核细胞或细胞类型。例如，根据本发明可以使用植物细胞、酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞。在一实施方案中，真核细胞能够表达重组蛋白或能够产生重组或重排病毒。

可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NS0/1,ECACC No:85110503)；人成视网膜细胞(PER,C6(CruCell,Leiden,TheNetherlands))；经SV40转化的猴肾CVI系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞±DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.,Natl.Acad,Sci.USA,77:4216(1980))；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL5 1)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。在一实施方案中，本发明用于从CHO细胞系培养和表达多肽。在一具体的实施方案中，CHO细胞系是DG44 CHO细胞系。在一具体的实施方案中，CHO细胞系包含含有编码谷氨酰胺合成酶多肽的多核苷酸的载体。在另一具体的实施方案中，CHO细胞系表达外源谷氨酰胺合成酶基因。(参见，例如，Porter等人,Biotechnol Prog 26(5):1446-54(2010))。在其它实施方案中，CHO细胞系包含含有编码神经胚素抗体或其片段的多核苷酸的载体。

另外，可以根据本发明使用任何数量的表达多肽或蛋白的市售和非市售杂交瘤细胞系。本领域技术人员将理解杂交瘤细胞系可能具有不同的营养需求和/或可能需要不同的培养条件以进行最佳生长和多肽或蛋白表达，并且将能够根据需要改变条件。

根据本发明的真核细胞可以被选择或工程改造以产生高水平的蛋白或多肽，或产生大量的病毒。通常，对细胞进行遗传工程改造以产生高水平的蛋白，例如通过引入编码目的蛋白或多肽的基因和/或通过引入调节编码目的多肽的基因(无论是内源的还是引入的)的表达的控制元件。

也可选择或工程改造真核细胞，使其在培养物中存活延长的时间段。例如，可以对细胞进行遗传工程改造以表达在细胞上赋予延长存活的一种或多种多肽。在一实施方案中，真核细胞包含编码Bcl-2多肽或其变体的转基因。参见，例如，US7,785,880。在一具体的实施方案中，细胞包含编码bol-xL多肽的多核苷酸。参见例如Chiang GG,SiskWP.2005.Biotechnology and Bioengineering 91(7):779-792。

也可选择或工程改造真核细胞以修饰其翻译后修饰途径。在一实施方案中，选择或工程改造细胞以修饰蛋白糖基化途径。在一具体的实施方案中，选择或工程改造细胞以表达无糖基化的蛋白，例如无糖基化的重组抗体。在另一具体的实施方案中，选择或工程改造细胞以表达无岩藻糖基化的蛋白，例如无岩藻糖基化的重组抗体。

也可选择或工程改造真核细胞以允许在无血清培养基中培养。

培养基

本发明的细胞培养物可在适合于所培养的特定细胞的任何培养基中制备。在一些实施方案中，培养基含有例如无机盐、碳水化合物(例如糖，例如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖或果糖)、氨基酸、维生素(例如B族维生素(例如B12)、维生素A、维生素E、核黄素、硫胺素和生物素)；脂肪酸和脂质(例如胆固醇和类固醇)、蛋白和肽(例如白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白和胎球蛋白)、血清(例如包含白蛋白、生长因子和生长抑制剂的组合物，例如胎牛血清、新生牛血清和马血清)、微量元素(例如锌、铜、硒和三羧酸中间体)、水解产物(源自植物或动物来源的水解蛋白)及以上的组合。可商购的培养基如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基([MEM],Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基([DMEM],Sigma)是示例性的营养溶液。此外，在以下当中描述的任何培养基可以用作培养基：Ham和Wallace,(1979)Meth.Enzymol.58:44；Barnes和Sato,(1980)Anal.Biochem.102:255；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469或4,560,655；国际公开号WO 90/03430；和WO87/00195；所有这些文献的公开内容通过引用并入本文。这些培养基中的任何一种可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)、脂质(例如亚油酸或其它脂肪酸)及其合适的载体，和葡萄糖或等同的能源。在一些实施方案中，营养培养基是无血清培养基，无蛋白培养基或化学上确定的培养基。也可包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必要的补充剂。

在一实施方案中，哺乳动物宿主细胞是CHO细胞，并且合适的培养基含有基础培养基组分，例如基于DMEM/HAM F-12的制剂(对于DMEM和HAM F12培养基的组成，参见美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录，第六版，1988，第346-349页中的培养基制剂)，其具有改变浓度的一些组分，例如氨基酸、盐、糖和维生素，并且任选地含有甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷；重组人胰岛素、水解蛋白胨，例如Primatone HS或Primatone RL(Sheffield,England)，或其等同物；细胞保护剂，例如Pluronic F68或等效的Pluronic多元醇；庆大霉素；和微量元素。

本发明提供了多种培养基制剂，当根据本文所述的其它培养步骤使用时，所述培养基制剂最小化，防止或逆转培养物中的代谢失衡，所述代谢失衡将导致乳酸盐和铵的产生增加。

已经显示对代谢平衡，细胞生长和/或活力或对多肽或蛋白的表达具有有益作用的本发明的培养基制剂包含硫酸葡聚糖。本领域技术人员将理解，本发明的培养基制剂涵盖确定的和非确定的培养基。

细胞培养过程

通过分批和补料分批培养制备用于生产蛋白或多肽的哺乳动物细胞的各种方法是本领域熟知的。足以实现表达的核酸(通常是含有编码目的多肽或蛋白的基因和任何可操作地连接的遗传控制元件的载体)可以通过许多熟知的技术导入宿主细胞系。通常，筛选细胞以确定哪个宿主细胞实际上已经吸收了载体并表达了目的多肽或蛋白。检测哺乳动物细胞表达的特定目的多肽或蛋白的传统方法包括但不限于免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微镜检查、SDS-PAGE、蛋白印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、高效液相色谱(HPLC)技术、生物学活性测定和亲和层析。本领域技术人员将知道用于检测表达的多肽或蛋白的其它合适的技术。如果多个宿主细胞表达目的多肽或蛋白，则可使用所列技术中的一些或全部来确定哪个细胞以最高水平表达该多肽或蛋白。

一旦鉴定了表达目的多肽或蛋白的细胞，就通过本领域技术人员熟知的各种方法中的任一种使细胞在培养物中增殖。表达目的多肽的细胞通常通过在有利于细胞存活，生长和活力的温度和培养基中生长而增殖。初始培养物体积可以是任何大小，但通常小于用于最终生产目的多肽或蛋白的生产生物反应器的培养体积，并且通常在接种生产生物反应器之前在增加体积的生物反应器中使细胞传代数次。可以搅动或摇动细胞培养物以增加培养基的氧合作用和营养物向细胞的分散。可选地或另外地，可使用本领域熟知的特殊喷射装置来增加和控制培养物的氧合作用。根据本发明，本领域技术人员将理解，控制或调节生物反应器的某些内部条件可以是有益的，包括但不限于pH、温度、氧合作用等。

可用于本发明方法的细胞密度可由本领域技术人员选择。根据本发明，细胞密度可以低至每培养体积一个细胞。在本发明的一些实施方案中，起始细胞密度的范围可以为约2×10²个活细胞/mL至约2×10³个、2×10⁴个、2×10⁵个、2×10⁶个、5×10⁶个或10×10⁶个活细胞/mL及更高。

根据本发明，细胞培养物大小可以是适于生产多肽的任何体积。在一实施方案中，细胞培养物的体积为至少500升。在其它实施方案中，生产细胞培养物的体积为10、50、100、250、1000、2000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更大，或它们之间的任何体积。例如，细胞培养物将是10至5,000升、10至10,000升、10至15,000升、50至5,000升、50至10,000升、或50至15,000升、100至5,000升、100至10,000升、100至15,000升、500至5,000升、500至10,000升、500至15,000升、1,000至5,000升、1,000至10,000升或1,000至15,000升。可选地，细胞培养物将为约500升至约30,000升、约500升至约20,000升、约500升至约10,000升、约500升至约5,000升、约1,000升至约30,000升、约2,000升至约30,000升、约3,000升至约30,000升、约5,000升至约30,000升、或约10,000升至约30,000升，或者细胞培养物将为至少约500升、至少约1,000升、至少约2,000升、至少约3,000升、至少约5,000升、至少约10,000升、至少约15,000升、或至少约20,000升。

本领域技术人员将知道并能够选择用于实施本发明的合适的培养物大小。用于培养的生产生物反应器可以由任何有助于细胞生长和活力的材料构成，所述材料不干扰所产生的多肽或蛋白的表达或稳定性。

细胞培养物的温度将主要基于细胞培养物保持存活的温度范围来选择。例如，在初始生长阶段，CHO细胞在37℃下良好生长。通常，大多数哺乳动物细胞在约25℃至42℃的范围内良好生长。

在本发明的一实施方案中，初始生长阶段的温度维持在单一的恒定温度。在另一实施方案中，初始生长阶段的温度维持在一定温度范围内。例如，在初始生长阶段，温度可以稳定地升高或降低。可选地，在初始生长阶段，温度可以在不同的时间升高或降低离散的量。本领域技术人员将能够确定是否应该使用单个或多个温度，以及是否应该稳定地或通过离散的量来调节温度。

细胞可以在初始生长阶段生长更长或更短的时间，这取决于从业者的需要和细胞本身的要求。在一实施方案中，使细胞生长足以实现活细胞密度的时间段，该活细胞密度是如果允许生长不受干扰的话，细胞最终将达到的最大活细胞密度的给定百分比。例如，细胞可以生长足以实现最大存活细胞密度的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的期望存活细胞密度的时间段。

在另一实施方案中，允许细胞生长确定的时间段。例如，取决于细胞培养物的起始浓度、细胞生长的温度和细胞的固有生长速率，细胞可以生长0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天。在一些情况下，可以允许细胞生长一个月或更长。在一实施方案中，生长阶段为约1天至约20天、约1天至约15天、约1天至约14天、约1天至约13天、约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约2天至约15天、约3天至约15天、约4天至约15天、约5天至约15天、约6天至约15天、约7天至约15天、约8天至约15天、约9天至约15天、约10天至约15天、约2天至约20天、约3天至约20天、约4天至约20天、约5天至约20天、约6天至约20天、约7天至约20天、约8天至约20天、约9天至约20天、约10天至约20天、或约10天至约20天。在另一实施方案中，生长阶段是至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约15天、或至少约20天。在另一实施方案中、生长阶段为约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约15天或约20天。

如果细胞在种子生物反应器中在初始生长阶段温度下的生长足以使生产生物反应器中的活细胞密度在其接种时已经处于最大活细胞密度的所需百分比，则细胞将在生产生物反应器中生长0天。本发明的从业者将能够根据多肽或蛋白生产的要求和细胞本身的需要选择初始生长阶段的持续时间。

在初始培养阶段，细胞培养物可以被搅动或摇动，以增加氧合作用和营养物向细胞的分散。根据本发明，本领域技术人员将理解，在初始生长阶段控制或调节生物反应器的某些内部条件可以是有益的，包括但不限于pH、温度、氧合作用等。例如，可以通过供应适量的酸或碱来控制pH，并且可以用本领域熟知的喷射装置来控制氧合作用。

在一实施方案中，在初始生长阶段结束时，变换至少一个培养条件，从而应用第二组培养条件。培养条件的变换可以通过改变细胞培养物的温度、pH、渗透压或化学诱导物水平来实现。在一实施方案中，通过变换培养物的温度来变换培养条件。

当变换培养物的温度时，温度变换可以是相对逐渐的。例如，可以花费几个小时或几天来完成温度变化。可选地，温度变换可以是相对突然的。例如，温度变化可以在少于几个小时内完成。考虑到合适的生产和控制设备，例如在多肽或蛋白的商业大规模生产中是标准的，温度变化甚至可以在不到1小时内完成。

在随后的生长阶段中细胞培养物的温度将主要基于细胞培养物保持存活并以商业上适当的水平表达重组多肽或蛋白的温度范围来选择。通常，大多数哺乳动物细胞在约25℃至42℃的范围内保持存活并且以商业上适当的水平表达重组多肽或蛋白。在一实施方案中，哺乳动物细胞在约25℃至35℃的范围内保持存活并且以商业上适当的水平表达重组多肽或蛋白。本领域技术人员将能够选择生长细胞的一个或多个合适的温度，这取决于细胞的需要和从业者的生产要求。

根据本发明，一旦细胞培养物的条件如上所述发生变换，在第二组培养条件下将细胞培养物维持随后的生产阶段，所述第二组培养条件有助于细胞培养物的存活和活力，并适于以商业上适当的水平表达所需的多肽或蛋白。

如上所述，可以通过变换多种培养条件中的一种或多种来变换培养物，所述培养条件包括但不限于温度、pH、渗透压和丁酸钠水平。在一实施方案中，变换培养物的温度。根据该实施方案，在随后的生产阶段，培养物维持在低于初始生长阶段的温度或温度范围的温度或温度范围。例如，在随后的生产阶段，CHO细胞在25℃至35℃的范围内良好地表达重组多肽和蛋白。

根据本发明，细胞可以维持在随后的生产阶段直到达到所需的细胞密度或生产滴度。在一实施方案中，细胞维持在随后的生产阶段直到重组多肽或蛋白的滴度达到最大值。在其它实施方案中，可以在这一点之前收获培养物，这取决于从业者的生产要求或细胞本身的需要。例如，可将细胞维持足以实现最大活细胞密度的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的活细胞密度的时间段。在一些情况下，需要使活细胞密度达到最大值，然后在收获培养物之前使活细胞密度下降到某种水平。在一个极端的例子中，在收获培养物之前允许活细胞密度接近或达到零可以是合乎需要的。

在本发明的另一个实施方案中，允许细胞在随后的生产阶段生长确定的时间段。例如，取决于随后生长阶段开始时细胞培养物的浓度、细胞生长的温度和细胞的固有生长速率，细胞可以生长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更长。在一些情况下，可以允许细胞生长一个月或更长。本发明的从业者将能够根据多肽或蛋白生产的要求和细胞本身的需要来选择随后生产阶段的持续时间。

在某些情况下，在生长和/或随后的生产阶段用已被细胞耗尽或代谢的营养物或其它培养基组分补充细胞培养物可以是有益的或必需的。例如，用观察到已被耗尽的营养物或其它培养基组分补充细胞培养物可能是有利的。可选地或另外地，在随后的生产阶段之前补充细胞培养物可能是有益的或必需的。作为非限制性实例，用激素和/或其它生长因子，特别是离子(例如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质或葡萄糖或其它能源补充细胞培养物可以是有益的或必需的。

这些补充组分，包括氨基酸，都可以一次加入细胞培养物中，或者它们可以一系列添加的方式提供给细胞培养物。在本发明的一实施方案中，以成比例的量多次向细胞培养物提供补充组分。在另一实施方案中，可取的是最初只提供某些补充组分，并且在稍后的时间提供其余组分。在本发明的另一实施方案中，细胞培养物被连续补料这些补充组分。

根据本发明，添加到细胞培养物中的总体积应该最优地保持在最小的量。例如，添加到细胞培养物中的含有补充组分的培养基或溶液的总体积可以是提供补充组分之前的细胞培养物体积的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

在随后的生产阶段，细胞培养物可以被搅动或摇动，以增加氧合作用和营养物向细胞的分散。根据本发明，本领域技术人员将理解，在随后的生长阶段控制或调节生物反应器的某些内部条件可是有益的，包括但不限于pH、温度、氧合作用等。例如，可以通过供应适量的酸或碱来控制pH，并且可以用本领域熟知的喷射装置来控制氧合作用。

在本发明的某些实施方案中，从业者可以发现定期监测生长中的细胞培养物的特定条件是有益的或必需的。监测细胞培养条件允许从业者确定细胞培养物是否以次优水平生产重组多肽或蛋白，或者培养物是否即将进入次优生产阶段。

为了监测某些细胞培养条件，有必要取出培养物的小等分试样进行分析。本领域技术人员将理解，这种取出可能潜在地将污染引入细胞培养物中，并且将适当小心以最小化这种污染的风险。

作为非限制性实例，监测表达的多肽或蛋白的温度、pH、细胞密度、细胞活力、整合的活细胞密度、乳酸盐水平、铵水平、渗透压或滴度可以是有益的或必需的。许多技术在本领域中是熟知的，这些技术允许本领域技术人员测量这些条件。例如，可使用血细胞计数器，库尔特计数器或细胞密度检查(CEDEX)测量细胞密度。活细胞密度可以通过用台盼蓝染色培养样品来确定。因为只有死亡的细胞吸收台盼蓝，所以可以通过计数细胞总数，将吸收染料的细胞数除以细胞总数，并取倒数来确定活细胞密度。HPLC可用于测定乳酸盐，铵或表达的多肽或蛋白的水平。可选地，表达的多肽或蛋白的水平可以通过标准分子生物学技术，例如SDS-PAGE凝胶的考马斯染色，蛋白印迹，Bradford测定，Lowry测定，Biuret测定和UV吸光度来测定。监测表达的多肽或蛋白的翻译后修饰，包括磷酸化和糖基化也可以是有益的或必要的。

从业者也可以监测细胞培养物的代谢状态，例如，通过监测细胞培养物中的葡萄糖，乳酸盐，铵和氨基酸浓度，以及通过监测细胞培养物的氧产生或二氧化碳产生。例如，可通过使用NOVA Bioprofile100或400(NOVA Biomedical,WA)来分析细胞培养条件。另外，从业者可以通过监测线粒体的活性来监测细胞培养物的代谢状态。在一实施方案中，线粒体活性可通过使用罗丹明123监测线粒体膜电位来监测。Johnson等人，1980.P.N.A.S.77(2):990-994。

表达的多肽的分离

一般来说，分离和/或纯化根据本发明表达的蛋白或多肽通常是可取的。在一实施方案中，表达的多肽或蛋白被分泌到培养基中，因此细胞和其它固体可以被去除，例如通过离心或过滤，作为纯化过程中的第一步。

可选地，表达的多肽可以结合到宿主细胞的表面。在该实施方案中，去除培养基，并将表达多肽或蛋白的宿主细胞裂解来作为纯化过程中的第一步。哺乳动物宿主细胞的裂解可以通过本领域技术人员熟知的许多方法实现，包括通过玻璃珠的物理破坏和暴露于高pH条件。

多肽可以通过标准方法分离和纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟基磷灰石层析)、凝胶过滤、离心、或差异溶解度、乙醇沉淀、或通过用于纯化蛋白的任何其它可用技术(参见，例如，Scope,(编辑)，Protein Expression:A Practical Approach,Oxford Univ.Press,1999；和Deutscher,M,P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编辑).Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,Vol 182),Academic Press,1997，其全部通过引用并入本文。具体而言，对于免疫亲和层析，可以通过将蛋白结合到亲和柱上来分离蛋白，所述亲和柱包含针对该蛋白产生并被附到固定的支持物上的抗体。可选地，亲和标签如流感衣壳序列，多聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶可以通过标准重组技术连接到蛋白上，以允许通过合适的亲和柱容易地纯化。可以在任何或所有阶段加入蛋白酶抑制剂如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽，抑胃酶肽或抑肽酶，以便在纯化过程中降低或消除多肽或蛋白的降解。当细胞必须裂解以分离和纯化表达的多肽或蛋白时，特别需要蛋白酶抑制剂。本领域技术人员将理解，确切的纯化技术将根据待纯化的多肽或蛋白的特征，表达多肽或蛋白的细胞的特征，以及细胞在其中生长的培养基的组成而变化。

药物组合物

治疗目的的多肽，例如抗体或其片段，或病毒可以被配制为用于向受试者施用的药物组合物，例如，以治疗或预防病症或疾病。

通常，药物组合物包括药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。组合物可以包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见例如Berge,S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。在一实施方案中，药物组合物是包含根据本文所述的方法产生的病毒的免疫原性组合物。

药物配制是建立完备的技术，并在例如以下当中有进一步描述：Gennaro(编辑),Remington.The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,第7版,Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；和Kibbe(编辑),Handbook of Pharmaceutical.Excipients AmericanPharmaceutical Association,第3版(2000)(ISBN:091733096X)。

药物组合物可以是各种形式。这些包括，例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。该形式可取决于预期的施用模式和治疗应用。通常，用于本文所述的药剂的组合物呈可注射或可输注溶液的形式。

在一实施方案中，用赋形剂材料，例如氯化钠，七水磷酸氢二钠，磷酸二氢钠和稳定剂配制抗体。其可以例如在缓冲溶液中以合适的浓度提供，并且可以在2-8℃储存。

这种组合物可以通过肠胃外模式(例如，静脉内，皮下，腹膜内或肌内注射)施用。本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用的”是指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外及胸骨内注射及输注。

组合物可以配制成溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或其它适于在高浓度下稳定储存的有序结构。无菌可注射溶液可以通过将本文所述的试剂以所需的量与上文列举的成分中的一种或组合(根据需要)并入在适当的溶剂中，随后过滤灭菌来制备。通常，通过将本文所述的试剂并入到含基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌过滤的溶液中得到本文所述的试剂加上任何额外的所需成分的粉末。溶液的适当流动性可以例如通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。

在某些实施方案中，多肽可以用保护化合物免于快速释放的载体制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的，生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法是已专利的或通常是已知的，参见，例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。

前面的描述应理解为仅是代表性的，而不是旨在限制性的。用于实施本发明的替代方法和材料以及另外的应用对于本领域技术人员将是显而易见的，并且旨在包括在所附的权利要求书中。

除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学，细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这样的技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook等人编辑,Cold Spring Harbor Laboratory.Press(1989)；MolecularCloning:A Laboratory Manual,Sambrook等人编辑,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1992),DNA Cloning,D.N.Glover Volumes I and II(1985)；OligonucleotideSynthesis,M.J.Gait编辑,(1984)；Mullis等人，美国专利号：4,683,195；Nucleic AcidHybridization,B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)；Transcription and Translation:B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)；Culture Of Animal Cells,R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,(1987)；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,(1986)；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；论文Methods In Enzymology,AcademicPress,Inc.,N.Y；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells,J.H.Miller和M.P.Calos编辑,Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology,Vols.154和155(Wu等人编辑)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology,Mayer和Walker编辑,Academic Press,London(1987)；Handbook OfExperimental Immunology Volumes-I-IV,D.M,Weir和C.C,Blackwell编辑,(1986)；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,(1986)；以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,.Maryland(1989)。

在Antibody Engineering,第2版,C.A.K.Borrebaeck编辑,Oxford Univ.Press(1995)中阐述了抗体工程改造的一般原则。在Protein Engineering,A PracticalApproach,Rickwood,D.等人编辑,Oxford Univ,Press的IRL Press,Oxford,Eng.(1995)中阐述了蛋白工程改造的一般原则。抗体和抗体-半抗原结合的一般原则在Nisonoff,A.,Molecular Immunology,第2版,Sinauer Associates,Sunderland,MA(1984)；以及Steward,M,W.,Antibodies,Their Structure and Function,Chapman和Hall,New York,NY(1984)中阐述。另外，本领域已知的和没有具体描述的免疫学中的标准方法一般按照Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York；Stites等人(编辑),Basic and Clinical-Immunology(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)以及Mishell和Shiigi(编辑),Selected Methods in Cellular Immunology,W.H.Freeman和Co.,New York(1980)。

阐述免疫学的一般原则的标准参考文献包括Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,New York；Klein,J.,Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination,John Wiley&Sons,New York(1982)；Kennett,R.等人编辑,Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses,PlenumPress,New York(1980)；Campbell,A.,“Monoclonal Antibody Technology”，Burden,R.等人编辑,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Vol.13,Elsevier Amsterdam(1984)中,Kuby Immunology第4版,Richard A.编辑Goldsby,ThomasJ..Kindt和Barbara A.Osborne,H.Freemand&Co,(2000)；Roitt,I.,Brostoff,J.和MaleD.,Immunology第6版,London:Mosby(2001)；Abbas A.Abul,A.和Lichtman,A.,Cellularand Molecular Immunology第5版,Elsevier Health Sciences Division(2005)；Kontermann和Dubel,Antibody Engineering,Springer Verlan(2001)；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Mammal,Cold Spring Harbor Press(2001)；Lewin,Genes VIII,Prentice Hall(2003)；Harlow和Lane,Antibodies；A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press(1988)；Dieffenbach和Dveksler,PCR Primer ColdSpring Harbor Press(2003)。

以上引用的所有参考文献以及本文中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。

现在将参考说明本公开的具体实施例。应当理解，提供实施例以说明示例性实施方案，并且在此没有旨在限制本公开的范围。

实施例

实施例1

硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的添加维持乳酸盐水平并降低铵产生

材料和方法

细胞系：用于本研究的细胞系产生神经胚素多肽。使用适于在无血清培养基中生长的DG44构建细胞系(Prentice,2007)。

培养基：用于本实验的基础培养基和补料培养基都是先前在Huang,2010和Kshirsagar,2012中描述的专有的内部培养基。两种培养基都是化学上确定的。简言之，基础培养基CM3用于所有维持阶段。将CND的改良形式(称为CM3V2)与另外的柠檬酸铁和硫酸葡聚糖用于生产阶段。该培养基含有葡萄糖，氨基酸，维生素，矿物质和哺乳动物细胞稳健培养所必需的微量元素。补料培养基是基础培养基的更浓缩的形式，其营养含量被优化以最大化生长和生产率。在补料培养基中不存在乳酸盐。同样，柠檬酸盐作为螯合剂包含在补料培养基中，但以2.4mM柠檬酸盐存在于补料培养基中。基础培养基和补料培养基都包含柠檬酸铁，硫酸葡聚糖以0-10g/升硫酸葡聚糖包含在补料培养基中。

细胞培养方法：如先前的报道中那样解冻和维持细胞(Kshirsagar等人2012Biotechnol Bioeng,Huang等人Biotechnology Progress 26(5):1400-1410(2010))。用于解冻和传代的基础培养基与先前报道(Kshirsagar/Huang)中的相同。简言之，将细胞解冻并维持在具有1L工作体积的3L摇瓶(Corning Life Sciences,Corning,NY)中，并每2天进行传代。为了维持培养物，将培养箱设定在36℃和5％CO2。

生物反应器培养条件：使用Finesse TruBio DV控制器(Finesse Solutions,SanJose,CA)，在初始工作体积为2-2.5L的S L玻璃Applikon容器中，进行补料分批培养。生物反应器以4×10⁵个细胞/ml的恒定种子密度接种。在第3天，5天和收获后每天递送浓缩的补料培养基。将温度维持在36℃，并通过添加1M碳酸钠或二氧化碳将pH控制在7.1+/-0.2。使用钻孔喷射器通过空气和氧气喷射将溶解氧维持在30％。在整个培养过程中，搅动维持在200-400RPM以限制总气流，而覆盖维持在0.005-0.04vvm。

离线分析：在大多数天进行取样并用各种设备分析。使用Cedex(Roche InnovatisAG，Germany)，利用台盼蓝排除标准技术测量细胞密度和活力，使用NOVA Bioprofile 100或400(NOVA Biomedical,WA)收集葡萄糖，乳酸盐，铵，钾和钠数据。

为了研究硫酸葡聚糖和柠檬酸铁对细胞培养物中乳酸盐和铵水平的影响，将0.25g/L硫酸葡聚糖和2.3mM柠檬酸铁在第0天添加到生产培养基中。在一些情况下，不提供另外的硫酸葡聚糖。在一些情况下，通过补料添加另外的硫酸葡聚糖。

在使用CM3基础培养基的902中，乳酸盐水平在第0天以约0.5g/L开始，在第3天以约2-2.5g/L达到峰值，然后从第10天至第14天迅速降至约0.5g/L(图1A)，乳酸盐水平然后在第15天至第17天再次稍微增加并保持在约0.5-1/L。在硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的存在下，使用CM3v2基础培养基，902培养基中的乳酸盐水平在第3天至第9天良好地维持在约2-2.5g/L，然后在第17天最终降至约1g/L(图1A)。类似地，在使用CM3基础培养基的N65培养物中，在第5天的乳酸盐水平以约2.5g/L达到峰值，然后在第14天迅速降到约1gE。然而，硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的存在在第5天至第17天几乎将N65培养基中的乳酸盐水平维持在约2.5-3g/升，从第7天到第16天仅有非常轻微的下降(图1A)。

细胞培养物中的铵水平在第0天在含有或不含硫酸葡聚糖或柠檬酸铁的培养基中以约0.5mivi开始(图1B)。在902中，使用CM3基础培养基，铵水平在第9天略微增加至约3mM，然后在第13天显著攀升至约8mM，并在第17天达到约9mM。在硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的存在下，902培养基中的铵产生从第0天至第17天显著降低，从第9天至第14天有约1g/L至约3g/L的铵降低(图1B)。在使用0/13基础培养基的N65中，铵水平在第14天从0.5mM增加到接近4mM，然后在第17天略微降低到约2mM。在硫酸葡聚糖和柠檬酸铁的存在下，N65培养基中的铵产生在第0天至第17天良好地维持在2mM或2mM以下(图1B)。

因此，添加硫酸葡聚糖和柠檬酸铁能够维持细胞培养物中的乳酸盐水平并降低铵的产生。

实施例2

硫酸葡聚糖的添加稳定摇瓶维持培养物的活力

为了研究硫酸葡聚糖对摇瓶维持培养物活力的影响，将0.1g/L硫酸葡聚糖添加到缺乏硫酸葡聚糖的市售培养基和CM3 HEKv1(为FIEK293培养物而优化的CM3的再平衡形式)中。尽管包含0.1g/L硫酸葡聚糖的培养基中的活细胞密度与不含硫酸葡聚糖的培养基中的活细胞密度相当(图2A)；硫酸葡聚糖的存在大大增加了活细胞的百分比(图2B)。不含硫酸葡聚糖的维持培养物中的细胞活力从第0天至第32天频繁突然下降，并且在约80％至约95％之间显著变化，但是0.1g/L硫酸葡聚糖的存在在所有时间点将细胞活力的百分比维持在95％以上(图2B)。因此，硫酸葡聚糖的添加能够稳定摇瓶维持培养物的活力。

细胞系：用于本研究的细胞系产生因子VIII多肽。使用适于在无血清培养基中生长的HEK 293构建细胞系。

培养基：用于本实验的基础培养基和补料培养基都是先前在Huang,2010和Kshirsagar,2012中描述的专有的内部培养基的改良形式，其具有再平衡的氨基酸和盐浓度并称为CM3.1-.ILK.yl。两种培养基都是化学上确定的。简言之，基础培养基CM3 I-IEKvI用于所有维持阶段，除非另有说明。补充了硫酸葡聚糖的CM3 HEKv1的改良形式用于维持和生产培养物中的直接胁迫。该培养基含有葡萄糖，氨基酸，维生素，矿物质和哺乳动物细胞稳健培养所必需的微量元素。补料培养基是基础培养基的更浓缩的形式，其营养含量被优化以最大化生长和生产率。在补料培养基中不存在乳酸盐。在补料培养基中不包含硫酸葡聚糖。

细胞培养方法：如先前的报道中那样解冻和维持细胞(Kshirsagar等人2012Biotechnol Bioeng,Huang等人Biotechnology Progress 26(5):1400-1410(2010))。用于解冻和传代的基础培养基CM3HEKv1是先前的报道中使用的具有再平衡的氨基酸和盐浓度的改良形式(Kshirsagar/Huang)。简言之，将细胞解冻并维持在具有0.2L工作体积的1L摇瓶(Corning Life Sciences,Corning,NY)中，并每2-3天进行传代。为了维持培养物，将培养箱设定在37℃和10％CO2。

实施例3

硫酸葡聚糖的添加稳定生物反应器接种物菌株培养物的活力

为了研究硫酸葡聚糖对生物反应器接种物菌株培养物活力的影响，在第0天将0.1g/L硫酸葡聚糖添加到CM3 HEKv1中。虽然硫酸葡聚糖的存在不影响活细胞密度(图3A)，但是其有效地维持生物反应器接种物菌株培养物中活细胞的百分比(图3B)。不含硫酸葡聚糖的接种物菌株培养物中的细胞活力从第0天的约85％下降到第7天的60％以下，并且在第7天后为约60％至约75％、但是添加0.1g/L硫酸葡聚糖在所有时间点，有效地将细胞活力的百分比维持在约95％(图3B)。因此，硫酸葡聚糖的添加能够稳定生物反应器接种物菌株培养物的活力。

生物反应器培养条件：使用Finesse TruBio DV控制器(Finesse Solutions,SanJose,CA)，在初始工作体积为2-2.5L的M 5L玻璃Applikon容器中，进行补料分批培养。生物反应器以4×10个细胞/ml的恒定种子密度接种。将温度维持在37℃，并通过添加1M碳酸钠或二氧化碳将pH控制在7.0.11-0.3。使用钻孔喷射器通过空气和氧气喷射将溶解氧维持在50％。在整个培养过程中，搅动维持在125RPM以限制总气流，而覆盖维持在0.005-0.04vvm。

实施例4

含有硫酸葡聚糖的接种物足以稳定生产生物反应器中的早期培养物活力

为了进一步研究接种物培养物中所含的硫酸葡聚糖的量是否能够稳定生产生物反应器中的细胞活力，在第0天用含有0.1g/L硫酸葡聚糖的接种物培养物接种生物反应器培养物，并且在随后的补料培养基中不添加额外的硫酸葡聚糖。生产生物反应器培养物中硫酸葡聚糖的存在能够再稳定活细胞密度和细胞活力两天(图4A-4B)。在没有硫酸葡聚糖的生物反应器培养物中，在第12天后活细胞密度和细胞活力都急剧降低，但是硫酸葡聚糖的存在推迟了这种降低至第14天(图4B)。此外，当无硫酸葡聚糖的培养物中的活力在80％至约90％之间变化时，硫酸葡聚糖的存在在第0天至第6天还大大维持细胞活力在95％以上(图4B)。因此，用含有硫酸葡聚糖的接种物接种生产培养物足以稳定早期培养物的活力。

生物反应器培养条件：使用Finesse TruBio DV控制器(Finesse Solutions,SanJose,CA)，在初始工作体积为2-2.5L的5L玻璃Applikon容器中，进行补料分批培养。生物反应器以5×10⁵个细胞/ml的恒定种子密度接种。在第3天和收获后每天递送浓缩的补料培养基。将温度维持在35.5℃，并通过添加1M碳酸钠或二氧化碳将pH控制在7.2+1-0.1。使用钻孔喷射器通过空气和氧气喷射将溶解氧维持在30％。在整个培养过程中，搅动维持在200-400RPM以限制总气流，而覆盖维持在0.005-0.04vvm。

实施例5

CHO细胞培养物中神经胚素抗体的生产

将编码鼠IgG1抗-神经胚素单克隆抗体的重链和轻链的DNA(图8)克隆到含有巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子(pGV90)的真核表达载体质粒bXLTBR.9中。克隆之后使用FuGene 6转染试剂(Roche Applied Sciences,Indianapolis IN)，将含有P3B3的质粒转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)-缺陷型DG44i中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞(Cell Line Ref:13805-32(Thermo Fisher,Waltham,MA)(Urlaub和Chasin(1980)P.N.A.S77:4216-4221)。通过使用抗人IgG1单克隆抗体(Brezinsky等人，(2003))的流式辅助的细胞分选(FACS)，通过迭代筛查转染细胞的高特异性生产率鉴定了产生抗神经胚素mAb的克隆细胞系(EAG2659/2660克隆8DG44i)。

该细胞系在含有40μg/ml G418(庆大霉素，Thermo Fisher)的新霉素选择培养基或在适于CHO细胞培养的生长培养基中生长(例如，在具有5％CO2的36.5℃的摇瓶中)。当细胞密度达到3×10⁶个细胞/ml和4×10⁶个细胞/ml时，将细胞以2×10⁵个细胞/ml接种而转移到生产容器中，并在36.5℃下在50％大气压下在溶解的氧中生长，pH设定为7.4。在第3天，密度为2×10⁵个细胞/ml，向容器中补料5％起始培养物体积。在第5天，密度为4×10⁶-5×10⁶个细胞/ml，将温度降至28℃。当活细胞密度降至约88％时(第18天)，通过离心收获细胞。将条件培养基在1000g以上离心20分钟，然后通过0.2pm过滤器过滤以去除细胞并澄清。然后将澄清的培养基在Prescale切向流6ft² 30k mol.wt.截留盒(Millipore,Burington,MA)上浓缩约6x。浓缩上清液可以在-80℃储存1年以上。

使浓缩的细胞上清液达到3M NaCl/1.5M甘氨酸，pH8.9(单链DNA(SS)结合缓冲液，Thermo Fisher Scientific)，并上样到重组蛋白A琼脂糖(recProA Seph)4FF柱(G.E.Lifesciences,Chicago,IL)。用约7柱体积(CV)的SS结合缓冲液(5CV的3M NaCl/25mMNaPCE,pH8.6)洗涤柱子。然后用约3.5CV的2mM NaPCri/100mM NaCl，pH2.8洗脱蛋白。然后将合并的洗脱液透析到20CV的PBS(20mM NAPC>₄/50mM NaCl,pH7.1)四次，每次最少8小时。透析后，将材料无菌过滤0.2μm，并在Superdex200(GE Healthcare Life Sciences,Chicago,IL)(1cm×20cm)上通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析。图6显示了以158K峰洗脱的抗体(P3B3)。在4％-20％SDS-PAGE上运行峰材料(图7)并测试内毒素。抗体重链(SEQ IDNO:2)和轻链(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列如图5B-5D所示。

等同物

本发明在范围上不受所描述的具体实施方案的限制，所述具体实施方案旨在作为本发明的各个方面的单个说明，并且在功能上等同的任何组合物或方法都在本发明的范围内。实际上，从前面的描述和附图中，除了本文显示和描述的那些之外的本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.细胞培养物，其包含哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系经遗传修饰在细胞培养基中表达神经胚素抗体多肽或其片段，并且在细胞培养基中表达神经胚素抗体多肽或其片段。

2.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述神经胚素抗体多肽包含SEQ ID NO:2或其片段。

3.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述神经胚素抗体多肽包含SEQ ID NO:4或其片段。

4.如权利要求3所述的细胞培养物，其中所述神经胚素抗体多肽包含SEQ ID NO:4或其片段。

5.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

6.如权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物，其中所述细胞已经适应于在无血清培养基、无动物蛋白培养基或化学上确定的培养基中生长。

7.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞已经用编码神经胚素抗体多肽或其片段的多核苷酸进行了遗传修饰。

8.如权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物，其中所述培养物是灌注培养物或补料分批培养物。

9.如权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物，其中所述培养基是无血清培养基、无动物蛋白培养基或化学上确定的培养基。

10.在大规模哺乳动物细胞培养物中产生的神经胚素抗体多肽，所述培养物包含哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞经遗传修饰在哺乳动物细胞培养物中表达神经胚素抗体多肽或其片段，并且在哺乳动物细胞培养物中表达神经胚素抗体多肽或其片段。

11.权利要求10的神经胚素抗体多肽，其包含含有SEQ ID NO:2或其片段的重链多肽。

12.如权利要求10所述的神经胚素抗体多肽，其包含含有SEQ ID NO:4或其片段的轻链多肽。

13.如权利要求12所述的神经胚素抗体多肽，其包含含有SEQ ID NO:4或其片段的轻链多肽。

14.如权利要求10所述的神经胚素抗体多肽，其中所述哺乳动物细胞培养物包含表达所述神经胚素抗体多肽或其片段的CHO细胞。

15.如权利要求10所述的神经胚素抗体多肽，其中所述细胞已经适应于在无血清培养基、无动物蛋白培养基或化学上确定的培养基中生长。

16.如权利要求10所述的神经胚素抗体多肽或其片段，其已经从哺乳动物细胞培养物中分离。

17.药物制剂，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求16所述的神经胚素抗体。