KR20040039472A - 진핵 세포에서 재조합체 단백질의 제조 방법 - Google Patents
진핵 세포에서 재조합체 단백질의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 진핵 세포에서 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 (ⅰ) 상기 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건과 설정 온도에서 미세담체에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 배양물을 상기 설정 이하로정해진 온도로 냉각하는 단계;(ⅲ) 미세담체를 침강시키는 단계; (ⅳ) 배지의 모두 또는 일부를 수거하는 단계를 포함한다.
Description
미세담체 배양은 세포 배양 영역에서 널리 사용된다. 미세담체 배양에서, 세포는 고체 미세담체의 표면에 부착하거나 대공성 미세담체의 내부 구조에 부착 또는 물리적 구속에 의해 고정된다. 미세담체 배양을 사용할 때, 배양 상청액을 수거하는 동안 배양 용기에서 세포를 가진 담체를 보유하기 위한 방법이 필요하다. 미세담체에 근거한 한 공정 유형은 배양 상청액이 연속적으로 회수되고 새로운 배지가 연속적으로 첨가되는 연속적 관주 공정이다. 이 공정 유형에서, 미세 담체는 전형적으로 중력 침강장치 또는 내부 필터에 의해 배양 용기에 보유된다. 또다른 미세담체에 기초를 둔 공정 유형은 배양 상청액의 배치식 수거와 새로운 배지의 첨가가 규칙적인 간격으로 수행되는 반-연속적 공정이다. 이 공정 유형에서, 미세담체는 배양 용기의 교반기를 멈추고 이로써 용기의 바닥에서 세포 침강물이 있는 담체를 초래함으로써 가장 쉽게 보유된다. 세포를 함유하는 담체가 배양물의 일부를 침강시켰을 때, 상청액을 수거하고 새로운 배지로 치환하는데 그 후 교반기를 다시작동한다. 하지만, 침강동안에 교반이 잘 되지 않으면 세포를 산소 또는 양분이 부족하게 하는 위험이 있다. 본 발명은 세포가 조건을 견디는 능력을 개선시키는 한편 그것들이 용기의 바닥에 침강되고 따라서 배양의 전체적 성능에 긍정적 효과를 미치는 개선된 방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 세포를 배양하는 개선된 방법, 구체적으로 원하는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하는데 이는 담체의 침강과 산물을 함유하는 배양 상청액의 수거 전에 냉각 단계를 포함하는 것이 특징이다.
한 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법을 제공하는데, (ⅰ) 상기 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건과 설정 온도에서 미세담체에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 배양물을 상기 설정 이하로 정해진 온도로 냉각하는 단계;(ⅲ) 미세담체를 침강시키는 단계; (ⅳ) 배지의 모두 또는 일부를 수거하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 상기 수거 후에 신선한 배지를 배양 용기에 첨가하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 상기 폴리펩티드를 수거된 배양 배지로부터 회수하는 단계를 더 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 (ⅰ) 배양물을 유지하기에 적절한 조건과 설정 온도에서 미세담체에서 세포를 배양; (ⅱ) 배양물을 상기 설정 이하로정해진 온도로 냉각;(ⅲ) 미세담체를 침강; (ⅳ) 배지의 모두 또는 일부를 수거하는 단계를 포함하는 진핵 세포를 배양하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 방법은 상기 수거 후에 신선한 배지를 배양 용기에 첨가하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 대규모 또는 산업적 규모 방법이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (ⅰ) 배양물을 배양의 설정 이하로정해진 온도로 냉각;(ⅲ) 미세담체를 침강시키는 단계를 포함하는 미세담체 배양물에서 자라는 진핵 세포에 의해 생산되는 폴리펩티드를 수거하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 담체를 침강물로 옮기기 전에, 배양물을 성장 온도로부터 배양의 온도 설정 이하로 약 5℃ 내지 30℃ 온도 또는 설정 이하로 약 5℃ 내지 20℃ 온도 또는 설정 이하로 약 5℃ 내지 15℃ 온도 또는 배양의 온도 설정 이하의 5℃, 10℃, 15℃ 또는 20℃로 냉각한다.
일부 구체예에서, 담체를 침강물로 옮기기 전에, 배양물을 약 18℃ 내지 32℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃ 또는 약 22℃ 내지 28℃ 또는 약 24℃ 내지 28℃ 또는 25℃ 내지 27℃로 냉각한다.
일부 구체예에서, 사용된 세포는 곤충 세포이다. 일부 구체예에서, 사용된 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 사용된 세포는 BHK 세포이다. 다른 구체예에서, 사용된 세포는 CHO 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 HEK 세포이다. 다른 구체예에서, 사용된 세포는 COS 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 HeLa 세포이다. HEK와 CHO세포가 바람직하고 특히 CHO세포가 바람직하다.
일부 구체예에서, 세포는 바람직한 폴리펩티드, 바람직하게, 응고 인자와 가장 바람직하게 인간 인자 Ⅶ 또는 인간 인자 Ⅶ-관련된 폴리펩티드 제한하지 않고 야생형 인자 VII, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L3051-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII ; S52A-인자 VII, S60A-인자 VII ; R152E-인자 VII, S344A-인자 VII, Gla 도메인이 없는 인자 Vlla; P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/Nl45T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ; 233 Thr 부터 240Asn까지 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 삭제된 FVII, 304 Arg부터 329Cys까지 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 삭제된 FVII를 생산한다.
일부 구체예에서, 발현된 단백질은 인간인자 VII이다. 다른 구체예에서, 발현된 단백질은 야생형FVII와 비교하여 실질적으로 같거나 향상된 생물학적 활성을 가진 인자 VII이다. 다른 구체예에서, 발현된 단백질은 야생형FVII와 비교하여 변경된 또는 감소된 생물학적 활성을 가진 인자 VII-관련된 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서 , 발현된 단백질은 FVIII, FIX, FX, FⅡ, 단백질C, 플라스미노겐 활성제 (t-PA, u-PA), PDGF, VEGF, 성장 호르몬, 인슐린, 인터루킨, 인터페론 또는 항체 또는 상기 단백질의 단편이다.
일부 구체예에서, 배양된 진핵 세포는 시험관 내 유전자 재조합에 의해 준비된 벡터로 형질전환 또는 전달감염된 재조합체세포이다. 일부 구체예에서, 세포는내부 인자 VII 유전자를 발현하는 인간 세포이다.
일부 구체예에서, 원하는 폴리펩티드는 배양물의 적어도 약 15 ㎎/l 수준에서 생산된다.
일부 구체예에서, 본 발명을 수행할 때 사용되는 세포는 세포 부착력에 의해 고체 담체의 표면이나 대공성 미세담체의 내부 구조에 부착된 부착 의존적 세포이다. 다른 구체예에서, 본 발명을 수행할 때 사용되는 세포는 물리적 구속에 의해 대공성 미세담체의 내부 구조내부에 포착된 진탕액 세포이다.
특히 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 인간인자 VII 또는 인간인자 VII-관련된 폴리펩티드를 발현하도록 고안되고 혈청과 다른 동물 유도된 성분이 없을 때 자라도록 변경된 BHK 21 또는 CHO 세포이다.
일련의 구체예에서, 배지는 동물 유도된 성분이 없는 배지이다. 다른 구체예에서, 배지는 동물 유도된 성분이 없고 단백질이 없다("단백질이 없는").
한 구체예에서, 세포는 CHO세포, 폴리펩티드는 인간인자 VII, 담체는 대공성 담체, 배지는 동물 유도된 성분이 없는 단백질이 없는 배지, 세포는 CHO세포, 배양 온도 설정은 약 36 ℃이고 담체를 침강시키기 전에 배양물이 냉각되는 온도는 약 36 ℃이다.
도의 목록
배양물 FFF 1235, FFF 1239, FFF 1242 에서 FVII 역가는 도1에 도표로 제시되어 있다(500 L 배양 용기에서 Cytopore 담체에서 CHO세포로 배양한 것의 개요).
배양물 FFF 1235, FFF 1239, FFF 1242 의 세포 수와 FVII 역가는 도 2 에서도 4에, FFF 1235의 세포 수와 FVII 역가는 (도 2); FFF 1239의 세포 수와 FVII 역가는 (도 3) FFF 1242의 세포 수와 FVII 역가는(도 4)에 제시되어 있다.
본 발명은 진핵 세포를 배양하는 방법과 이러한 세포의 대규모 또는 산업적 규모의 배양으로 재조합체 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 구체적으로 진핵 세포에 의해 발현되는 원하는 폴리펩티드의 대규모 또는 산업적 양을 생산하기 위해 진핵 세포의 미세담체 기초한 배양을 위한 방법을 제공한다. 문제의 배양 공정 유형은 담체를 침강 한 후 배양 상청액의 배치식 수거를 하는 미세담체-기초한 공정 유형이다.
세포를 함유하는 담체를 침강하기 전에 냉각 단계를 적용하면 배양의 전체 성능에 긍정적 효과를 미치는 것이 발견되었다.
과학적 이론에 의존하지 않고, 냉각 단계는 세포가 조건을 견디는 능력을 개선시키는 한편 그것들이 용기의 바닥에 침강되는 것으로 믿어진다. 따라서 이는 배양의 전체적 성능에 긍정적 효과를 미친다. 500 L 배양 용기에서 약 한 시간동안 지속되는 침강 기간 동안에, 산소 조절은 수행될 수 없고 용해된 산소의 농도는 급격히 감소한다.
미세담체 공정의 여기에 기술된 유형을 사용할 때, 배양 용기의 온도 조절 루프는 담체의 침강전에 전통적으로 비활성화된다: 하지만 배양 용기의 활성적 냉각은 수행되지 않는다. 온도 조절 루프를 비활성시키는 유일한 목적은 세포의 국부적 과열을 방지하는 반면 세포는 배양 용기의 바닥에 침강한다. 비활성화는 배양 용기의 실제적 냉각을 초래하지 않고 전형적으로 온도 감소는 1℃ 이하이다. 본 발명에 따른 냉각 단계 즉 26℃ 와 같은 배양의 온도 설정 이하로 10℃를 냉각하면 세포의 산소 요구량(산소 소모량으로 측정됨)은 50%까지 감소된다. 20 ℃로 냉각하면 세포의 산소 요구량은 75%까지 감소된다. 배양물은 배양의 온도 설정 이하로정해진 온도로 냉각된다(즉 약 5 ℃ 내지 30℃, 또는 약 5 ℃ 내지 20 C, 또는 약 5 ℃ 내지 15 ℃, 또는 설정 이하로 약 5 ℃, 10 ℃, 15 ℃ 또는 20 ℃ ).
본 발명에 따른 냉각 단계는 담체의 침강 전에 즉시 응용된다. 여기서 사용된 바와 같이 ,"즉시 전에"는 배양 용기의 내용물이정해진 온도로 냉각됨과 동시에, 냉각은 중단되고 용기의 교반은 중단되어 세포가 있는 담체가 용기의 바닥에 침강하도록 하는 것을 의미한다.
냉각 단계가 지속되는 것은 전형적으로 배양 용기의 크기 , 원하는 온도 저하와 사용된 냉각 방법에 따라 즉, 20 내지 180 분, 또는 30 분 내지 120 분과 같이 10 내지 240 분이 필요하다; 하지만, 지속의 냉각 단계는 본 발명에 포함된다 . 냉각 단계는 따라서 보통 세포-함유 미세담체가 침강하기 전에 약 10 내지 약 240 분에 시작한다. 예를 들어, 냉각수를 배양 용기의 재킷에 공급하여 500L 배양 용기의 온도를 배양 온도 36 ℃ 에서 26 ℃로 낮추는 것은 약 30 분 정도 걸린다. 냉각수를 배양 용기의 재킷에 공급하여 5000L 배양 용기의 온도를 배양 온도 36 ℃ 에서 26 ℃로 낮추는 것은 약 30 분 정도 걸린다.
단계는 전형적으로 다음과 같이 수행된다: 예를 들어 배양 용기의 자킷에 대한 냉각수의 밸브를 항상 열어 배양 용기의 온도 조절 루프는 비활성화되고 배양 용기는 냉각된다. 온도는 연속적으로 조정되고, 배양 용기의 내용물이 배양의 설정 이하의 즉 10 ℃와 같은 설정 온도 이하로정해진 온도에 도달할 때, 냉각 은 중단된다. 그 후에, 배양 용기의 교반기는 중단되고 그에 따라 세포-함유담체가 침강한다. 침강 후에 배양 상청액 또는 배지의 일부를 수거하고 수거된 배지를 치환하기 위해 신선한 배지를 배양 용기에 첨가한다. 배양 상청액을 수거하고
새로운 배지를 첨가할 때, 교반기를 시작하고 온도 조절 루프를 활성화시켜서 온도는 배양의 설정된 지점으로 다시 조정된다. 첨가되는 신선한 배지는 전형적으로 배양의 설정된 지점과 근접한 온도까지 즉 실제 설정된 지점에 따라 약 30℃ 또는 그 이상까지 이전에 가열된다.
본 발명을 실행할 때, 배양물을 냉각하기 위한 효과적인 방법이 사용된다. 예를 들어, 충분한 기간동안 원하는 온도에 도달할 때까지 배양 용기의 자켓에 냉각수를 공급하여 배양 용기를 냉각시키거나 또는 배양 용기는 홀로 사용되거나 또는 자켓의 상기 언급된 냉각과 조합한 냉각 코일이 갖추어져 있다.
세포 배양 공정: 본 발명의 세포 배양은 혼합된 배양 용기 시스템에서 수행되고 미세담체-기초한 공정 유형이 사용된다. 미세담체-기초한 공정에서, 세포는 담체(대공성 담체)의 내부 구조로 이동하거나 담체(고체 담체)의 표면에 자신을 부착시키거나 또는 두가지 경우 다 해당된다. 미세담체-기초한 공정에서 진핵 세포, 미세담체, 배양 배지가 처음에 배양 용기에 공급된다. 배양 부피가 시작부터 용기의 최종 작동 부피에 근접하지 않으면, 다음 날 추가 배양 배지를 공급한다. 다음 기간동안, 배양이 최종적으로 종결될 때까지 산물-함유 배양 상청액의 수거와 새로운 배지로 치환이 수행된다. 산물-함유 상청액을 수거하는 동안, 배양물의 교반,즉, 혼합이 중단되고 세포-함유 담체는 침강하고 그 후 산물함유 배양 배지의 일부를 제거한다.
증식 단계: 추가 하류 공정에 대한 산물-함유 배양 상청액의 정규적 수거가 수행되는 생산 단계에 도달하기 전에, 문제의 특정 세포에 적합한 계획 또는 경로에 따라 세포는 증식된다. 증식 단계는 단일 단계 또는 복합 단계 과정이다. 단일 단계 증식 과정에서 세포는 저장물로부터 제거되고 생산이 진행 되는 미세담체를 함유하는 배양 용기에 직접적으로 접종한다. 복합 단계 증식 과정에서 세포는 저장물로부터 제거되고 생산이 진행되는 미세담체를 함유하는 최종 배양 용기에 도달할 때까지 점차적으로 증가하는 크기의 많은 배양 용기를 통해 증식한다. 증식 단계 동안에, 세포는 성장에 적합한 조건에서 자란다. 온도, pH, 용해된 산소와 같은 배양 조건은 특정 세포에 적합한 것으로 알려져 있고 이 영역 내의 능숙한 사람 또는 장인에게 명백하다. (참조, 즉,Animal Cell Culture: A Practical Approach 2ndEd., Rickwood, D. 와 Hames, B. D.,eds., Oxford University Press, New York (1992)).
본 발명의 한 구체예에서, 세포 배양 공정은 한 배양 용기에서 작동된다 : 세포는 직접적으로 생산이 진행되고 있는 미세담체 함유 배양 용기에 접종한다; 세포는 적절한 세포 밀도에 도달하고 생산 단계가 시작할 때까지 증식한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 세포 배양 공정은 적어도 두 개의 분명한 배양 용기에서 작동한다: 하나 또는 그 이상의 씨드 배양 용기(들) (첫번째 증식 단계 (s))에 후속하여 생산 배양 용기(마지막 증식 단계에 후속한 생산 단계). 첫번째 증식 단계에서, 원하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 배양 배지를 함유하는 씨드 배양 용기에 접종하고 세포가 최소-씨드ing 밀도에 도달할 때까지 증식한다.
그 후에, 증식된 씨드 배양물을 (a) 배양 배지와 (b) 미세담체를 함유하는 생산 배양 용기에 전달한다. 이 배양 용기에서, 고체 담체의 표면이나 대공성 담체의 외부와 내부 표면으로 이동하는 조건에서 세포를 배양하고 대공성 담체의 외부와 내부 표면에서 계속 자라며, 담체가 세포에 의해 완전히 콜로니를 형성할 때까지 이 마지막 증식 단계에서 계속 자란다. 이 마지막 증식 단계에서 미세담체가 배양 용기의 바닥에 침강하도록 하여 배지 교환을 수행하고 그 후 탱크 부피의정해진 퍼센트을 제거하고 신선한 배지의 해당 퍼센트 탱크 부피를 용기에 첨가한다. 미세담체는 배지에 재현탁하고 배지 제거와 치환의 이 과정은정해진 간격으로 예를 들어 24시간 간격으로 반복된다. 치환된 배지의 양은 세포 밀도에 의존하고 전형적으로 하기 표1에 제시된 바와 같이 탱크 부피의 10-95%, 바람직하게 25% 내지 80%이다.
증식 단계가 복합 단계 과정인 공정에서, 점진적으로 증가하는 크기의 배양 용기에서 최종배양 용기에 들어가기에 충분한 수의 세포가 획득될 때까지 증식됨이 이해되어야 한다. 예를 들어, 5 l, 50 l, 100 l 또는 500 l의 하나 또는 그 이상의 씨드 배양 용기는 연속적으로 사용된다. 씨드 배양 용기는 전형적으로 5 l 와 1000 l 사이의 용량을 가진다. 전형적으로, 세포를 약 0.2 내지 0.4 × 106세포/ml의 초기 밀도에서 씨드 배양 용기에 접종하고 배양물이 세포 밀도 약 1.0 × 106세포/ml에 도달할 때까지 증식한다. 전형적으로, 최소 교차 씨딩 밀도는 0.8 과 약 1.5 × 106세포/ml이다.
원하는 폴리펩티드즉 , 인자 VII의 생산에 적합한 일부 설정은 본질적으로 씨드 배양 또는 미세담체에서 세포의 초기 성장에 적합하지 않다. 예를 들어, 온도, DOT, 및/또는 pH가 두 단계에 대해 다르다. 증식 동안에 배지 교환은 하류 공정에 대한 배양 상청액을 수거하기 위해서가 아니라 세포가 살아있고 성장하게 하기 위해서 수행된다. 최종배양 용기 (미세담체를 함유)에서 마지막 증식 단계에 대한 가능한 배양 조건은 하기 표1에 요약되어 있다.
생산 단계: 세포 밀도가 생산 단계의 시작에 적합한 값에 도달할 때, 즉 산물-함유 배양 상청액을 하류-공정하기 위해서, 배양 상청액의 60-95%를, 바람직하게 80%를 24 시간마다 수거한다. 세포 밀도의 이 값은 전형적으로 ml 당 1-12×106세포이다. 설정은 이 지점에서 변하고 원하는 폴리펩티드의 제조에 적합한 값으로 정해진다.
미세담체가 탱크의 바닥에 정착하도록 하여 배지 교환은 수행되고 그 후 탱크 부피의 선택된 퍼센트를 제거하고 신선한 배지의 대응하는 퍼센트 탱크 부피를 용기에 첨가한다. 탱크 부피의 25 와 90%가 전형적으로 치환된다; 바람직하게, 탱크 부피의 80%가 신선한 배지로 치환된다. 미세담체는 그 다음 배지에서 재현탁되고 배지 제거와 치환의 이 공정은 전형적으로 10 내지 48 시간 간격으로 바람직하게, 24 시간 간격으로 반복된다;
공정의 이 양태의 개요는 표2에 제시되어 있다
선택적으로, 생산 단계에 들어갈 때와 생산 단계 동안, 배양의 온도 설정에서 감소가 사용된다.
생산 단계 온도에 들어갈 때, 작동 pH와 배지 교환 빈도는 전형적으로 생산에 최적인 값으로 변경된다. 생장과 생산 단계에서 온도 범위와 값의 예는 각각표 1과 2에서 볼 수 있다. 약 36 ℃의 온도가 생산 단계 동안에 CHO 세포주에 대해 바람직하다.
미세담체: 여기서 사용된 바와 같이, 미세담체는 진탕액 배양에서 사용될 정도로 충분히 작은 입자이다(세포에 상당한 전단 손상을 야기하지 않는 혼합 비율로 ). 미세담체는 고체, 다공성, 또는 표면에 다공성 코팅을 가진 고체 코어가 있다. 미세담체는, 예를 들어, 제한 없이, 셀룰로오스 또는 덱스트란에 기초하고, 표면은 (다공성 담체의 경우에 외부와 내부 표면) 양성 전하를 가진다.
일련의 구체예에서 , 미세담체는 약 150 와 350 ㎛ 사이의 전체 입자 반지름을 가지고; 약 0.8 와 2.0 meq/g사이의 양성 전하 밀도를 가진다. 일련의 구체예에서, 미세담체는 고체 담체이다. 유용한 고체 미세담체는 ,제한 없이, Cytodex 1TM과 Cytodex 2TM(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)를 포함한다. 고체담체는 특히 부착 세포 (고정-의존세포)에 적절하다.
또다른 일련의 구체예에서, 미세담체는 대공성 담체이다. 여기서 사용된 바와 같이, 대공성 담체는, 즉 셀룰로오스-기초한, 다음 성질을 가진 입자이다
a) 진탕액 배양에서 사용될 수 있을만큼 충분히 작고(세포에 상당한 전단 손상을 야기하지 않는 혼합 비율로 ); (b) 세포를 입자의 내부 공간으로 이동하기 위해서 이들은 충분한 크기의 구멍과 내부 공간을 가진다. 이들의 표면(외부와 내부) 은 한 구체예에서 양성으로 하전되어 있다. 일련의 구체예에서, 담체는: (a) 약 150 와 350 ㎛ 사이의 전체 입자 반지름을 가진다; (b) 약 15 과 약 40 ㎛ 사이의 평균 구멍 개방 반지름을 가진 구멍을 가지고; (c) 약 0.8 과 2.0 meq/g 사이의 양성 하전 밀도를 가진다. 일부 구체예에서, 양성 하전은 DEAE (N, N,-디에틸아미노에틸)군에 의해 제공된다. 유용한 대공성 담체는, 제한 없이, Cytopore 1TM과 Cytopore 2TM(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)을 포함한다. 특히 바람직한 것은 230 ㎛의 평균 입자 반지름, 30 ㎛의 평균 구멍크기, 1.1 meq/g의 양성 하전 밀도를 가진 Cytopore 1TM담체이다.
대규모 배양 조건: 여기서 사용된 바와 같이, 대규모 배양 용기는 적어도 약 100l, 바람직하게 적어도 약 500l, 더 바람직하게 적어도 약 1000 l, 가장 바람직하게 적어도 약 5000 l의 용량을 가진다. 세포 배양 공정이 하나 또는 그 이상의 씨드 배양 용기(첫번째 증식 단계에 후속하여 생산 배양 용기(마지막 증식 단계에 후속하여 생산 단계)와 같은 적어도 두 개의 분명한 배양 용기에서 작동하는 경우에, 공정은 전형적으로 증식된 씨드 배양물 약 50 l(약 1.0 × 106세포/ml)을 배양 배지 150 l를 함유하는 500 l 배양 용기로 전달하는 것과 관련된다. 대규모 배양물은 즉, 온도, pH, 용해된 산소 압력 (DOT), 교반 비율과 같은 적절한 조건에서 유지되고 배지를 배양 용기에 첨가하여 부피는 점진적으로 증가한다. 미세담체 공정의 경우에, 배양 용기는 또한 1 내지 10 g/l 범위의 최종미세담체 농도에 대응하는 미세담체의 양을 포함한다. 전달 후에, 세포는 전형적으로 담체의 표면 또는 담체의 내부로 첫번째 24 시간 내에 이동한다. 용어 "대규모 공정"은 용어"산업적규모 공정"과 상호교환적으로 사용된다. 그리고, 용어 "배양 용기"는 "탱크", "반응기","발효기", "생물반응기"와 상호교환적으로 사용된다.
세포: 본 발명을 실행할 때, 배양되는 세포는 바람직하게 진핵 세포, 더바람직하게, 제한 없이, CHO (즉 , ATCC CCL 61), COS-1 (즉 , ATCC CRL 1650), 어린 햄스터 신장 (BHK), HEK293 (즉 , ATCC CRL 1573; Graham et al.,J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) 세포주를 포함하는 설정된 진핵세포 세포주이다. 바람직한 BHK 세포주는 여기서 BHK 570세포로 언급되는 tk-ts13 BHK 세포주(Waechter 와 Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110,1982)이다. BHK 570 세포주 는 the American유형 Culture Collect이온, 12301 Parklawn Dr., RockVIIle, MD 20852에서 ATCC access이온 number CRL 10314로 구입가능하다. tk'ts13 BHK 세포주 는 또한 ATCC under access이온 number CRL 1632로 구입가능하다.
바람직한 CHO 세포주는 ATCC accession number CCI61로 구입가능한 CHO K1 세포주이다.
다른 적절한 세포주는 제한 없이, Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) ; DUKX 세포(CHO 세포주) (Urlaub 와 Chasin, Proc Nat/. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220,1980) (DXB11세포로 언급되는 DUKX세포), DG44 (CHO 세포주) (Cell, 33: 405,1983, 와Somatic Cell 와 Molecular Genetics12: 555,1986)를 포함한다. 3T3세포, Namalwa세포, 골수종, 골수종과 다른 세포의 융합도 또한 유용하다. 일부 구체예에서, 세포는 유도된 세포 유형과 단백질의 번역후 변경을 촉매하는 효소가 질적 또는 양적으로 다른 스펙트럼을 발현하는 세포와 같은 변이체 또는 재조합체세포이다(즉, 글리코실 트랜스퍼라아제 및/또는 글리코시다아제와 같은 글리코실레이션 효소 또는 프로펩티드와 같은 공정 효소). 적절한 곤충 세포주는 또한 제한 없이, Spodoptera frugiperda세포 또는 Trichoplusia ni cells (US 5,077, 214 참조)와 같은 Lepidoptera 세포주를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명을 수행할 때 사용되는 세포는 진탕액 배양에서 자랄 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 진탕액 -적격한 세포는 크고, 고정된 집단을 만들지 않고 진탕액 에서 자랄 수 있는 것들 즉, 단일 분산 또는 집단 당 소수의 세포와 함께 느슨한 집단에서 자라는 세포이다. 진탕액 -적격한 세포는 제한 없이, 변경 또는 조작하지 않고 진탕액 에서 자랄 수 있는 세포(즉 , 조혈세포 또는 림프모양세포와 같은)와 (즉, 상피 또는 섬유모세포 세포와 같은)부착의존세포를 진탕액 성장으로 점진적으로 변경하여 진탕액 -적격하게 만들어진 세포를 포함한다.
본 발명을 수행할 때 사용되는 세포는 부착세포 (고정-의존 또는 부착-의존세포로 알려진)이다. 여기서 사용된 바와 같이, 부착세포는 증식과 성장을 위한 적절한 표면에 자신을 부착 또는 고정하는 것이 필요한 것들이다. 본 발명의 한 구체예에서, 사용된 세포는 부착세포이다. 이러한 구체예에서, 증식 단계와 생산 단계는 미세담체의 사용을 포함한다. 사용된 부착세포는 증식 단계동안 담체로 이동할 수 있어야 하고(대공성 담체가 사용되면 담체의 내부구조로) 생산 생물반응기로 전달될 때 새로운 담체로 이동할 수 있어야 한다. 부착세포가 스스로 새로운 담체로 충분히 이동할 수 없다면, 세포-함유 미세담체와 단백질 분해 효소 또는 EDTA와 접촉하여 담체로부터 방출된다. 사용된 배지(특히 동물-유도된 성분이 없을 때)는 더 부착세포를 지지하기 위한 적절한 성분; Sigma 와 같은 상업적 제공자로부터 구입가능한 부착세포의 배양에 적절한 배지를 포함해야 한다.
세포는 또한 진탕액 -변경된 또는 진탕액 -적격한 세포이다. 그러한 세포가 사용되면, 세포의 증식은 진탕액 에서 사용되어, 미세담체는 생산 배양 용기에서 최종증식 단계와 생산 단계에서 오직 사용된다. 진탕액 -변경된 세포의 경우에, 사용된 미세담체는 전형적으로 대공성담체이고 여기서 세포는 담체의 내부 구조에 물리적 구속에 의해 부착된다.
배지: 용어 "세포 배양 배지"와 "배양 배지"는 다음 부류의 하나 또는 그 이상으로부터 적어도 한 성분을 제공하는 진핵세포를 키우기 위해 사용되는 영양분 용액을 말한다: (1) 배지의 삼투도에 기여하는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘의 염; (2) 대개는 글루코스와 같은 탄수화물 형태의 에너지 출처; (3) 모든 필수 아미노산과 대개는 20개 아미노산의 기초 세트; (4) 낮은 농도에서 필요한 비타민 및/또는 다른 유기 화합물; (5) 전형적으로 매우 낮은 농도, 대개는 마이크로몰 범위에서 요구되는 무기 화합물로 정의되는 미량 원소.
영양분 용액은 선택적으로 다음 부류의 하나 또는 그 이상으로부터 하나 또는 그 이상의 성분으로 보충된다: (a) 동물 혈청; (b) 예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자와 같은 호르몬과 다른 성장 인자; (c)단백질과 조직의 가수분해물
본 발명은 동물-유도된 성분, 즉 혈청또는 혈청성분, 동물-유도된 성분이 없는 배지를 포함하는 배지에서 진핵 세포를 배양하는 것을 포함한다. 동물유도된 성분 (즉, 소 태아 혈청(FBS)과 같은)을 포함하는 세포 배양 배지는 예를 들어, 0-1% 혈청 또는 0-0.1% 혈청과 같은 5% 이상의 혈청 또는 0-5% 혈청을 포함한다. 동물-유도된 성분이 없는 배지가 바람직하다. 여기서 사용된 바와 같이, "동물-유도된"성분은 완전한 동물에서 생산된 성분(즉, 혈청으로부터 분리되고 정제된 단백질 ), 또는 완전한 동물에서 생산된 성분을 이용하여 생산된 성분이다(즉, 식물 출처 물질을 가수분해하기 위해 동물로부터 분리되고 정제된 효소를 사용하여 만들어진 아미노산). 반면에, 생산된 성분이 없는 배지에서 동물 단백질의 서열을 가지고 있지만(즉, 동물에서 게놈 기원을 가진) 시험관 내 세포 배양(즉, 재조합체 효모 또는 세균 세포 또는 설정된 지속된 진핵세포세포주, 재조합체 또는 비재조합체)에서 생산되고 완전한 동물로부터 분리되고 정제된 단백질은 "동물-유도된"성분이 아니다(즉, 효모 또는 세균 세포에서 생산된 인슐린 또는 Namalwa세포에서 생산된 CHO, BHK 또는 HEK세포, 또는 인터페론과 같은 설정된 포유동물 세포주에서 생산된 인슐린과 같이). 예를 들어, 동물 유도된 성분(효모 또는 세균 세포에서 생산된 인슐린과 같은)이 없는 배지에서 재조합체 세포에서 생산된 동물 단백질의 서열을 가진 단백질(즉, 동물에서 게놈 기원을 가진)은 "동물-유도된 성분"이 아니다. 따라서, 동물 유도된 성분이 없는 세포배양 배지는 재조합체적으로 생산된 동물 단백질을 함유하는 것이다;하지만, 그러한 배지는 동물 혈청으로부터 분리된 동물 혈청또는 단백질 또는 다른 산물을 함유하지 않는다. 그러한 배지는 예를 들어,식물로부터 유도된 하나 또는 그 이상의 성분을 함유한다. 본 발명의 조건에서 세포 성장과 유지를 지지하는 세포 배양 배지, 특히 동물-유도된 성분이 없는 것이 사용된다. 전형적으로, 배지는 물, 삼투도 조절제, 버퍼, 에너지 출처, 아미노산, 무기 또는 재조합체 철 출처, 하나 또는 그 이상의 합성적 또는 재조합체 성장 인자, 비타민, 조효소를 함유한다. 한 구체예에서, 배지는 동물-유도된 성분이 없고 단백질이 없다("단백질이 없는"). 동물-유도된 성분 및/또는 단백질이 없는 배지는 예를 들어, Sigma, JRH Biosciences, Gibco 와 Gemini와 같은 상업적 공급자로부터 구입가능하다.
통상적인 성분에 추가로, 인자 VII 또는 인자 VII-관련된 폴리펩티드를 생산하기에 적절한 배지는 약 0.1-50 mg/litre, 바람직하게 약 0.5-25 mg/litre, 더 바람직하게 약 1-10 mg/litre, 가장 바람직하게 약 5 mg/litre의 농도에서 인자 VII에서 글루탐산 잔기의 γ-카르복시화에 필요한 비타민 K를 함유한다.
본 발명에서 사용하기 위해 적절한 배지는 Gibco 와 JRH Biosciences 같은 상업적 공급자로부터 구입가능하다.
한 구체예에서, 배지는 표3에 제시된 것과 같이 구성되어 있고 선택적으로 표4에 제시된 하나 또는 그 이상의 성분으로 보충되어 있다. 하기 표(표 3)은 본 발명에서 사용하기에 적절한 배지의 조성물이다. 선택적으로, 표 4 에 열거된 하나 또는 그 이상의 성분은 배양 배지에 첨가된다. 바람직한 범위는 표 4에 열거되어 있다. 한 구체예에서, 사용된 배지는 배지 318-X; 다른 구체예에서, 배지 CHO-K이다.
다른 구체예에서, 사용된 배지는 다음 조성을 가진다(318-U 배지):
배지는 바람직하게 동물-유도된 성분이 없는, 또는 동물-유도된 성분이 없는 그리고 단백질이 없는 배지이다("단백질이 없는").
한 구체예에서, 배지는 상업적으로 구입가능한 동물-유도된 성분이 없는 단백질이 없는 CHO 배지(JRH Biosciences)이고 세포주는 CHO 세포이다. 한 구체예에서, 배지는 318-X 배지이고 세포주는 BHK 세포주이다; 다른 구체예에서, 배지는 318-U 배지이고 세포주는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 배지는 CHO-K 배지 이고 세포주는 CHO 세포주이다.
일부 구체예에서, 본 발명을 실행할 때 사용된 세포는 혈청이 없는 배지와 같은 동물-유도된 성분이 없는 배지에서 진탕액 성장으로 변경된다. 그러한 변경 공정은 즉, Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21stCentury, E. C. Beuvery et al. (Eds. ), Kluwer Academic Publishers, pp. 619-623,1995 (BHK 와 CHO cells) ; Cruz, Biotechno/. Tech. 11: 117-120,1997 (insect cells) ; Keen, Cytotechnol. 17: 203211,1995 (myeloma cells) ; Berg et al., Biotechniques 14: 972-978,1993 (human kidney 293 cell)에 기술되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 인간인자 VII을 발현하도록 고안되고 혈청 또는 동물-유도된 성분이 없을 때 자라도록 변경된 BHK 21 또는 CHO세포이다.
배양 용기: 배양 용기는 용기의 바닥으로부터 공기를 도입하여 교반이 되는통상적인 임펠러 유형 또는 에어리프트 반응기를 수단으로 교반되는 통상적 혼합 탱크 반응기이다. 특이적 한계 내에서 조정되는 변수에는 pH, 용해된 산소 압력 (DOT), 온도가 있다. 상부공간 가스에서 이산화탄소(C02) 농도를 변경하고 필요하면 배양액에 염기를 첨가하여 pH를 조절한다. 용해된 산소 압력은 공기 또는 순수 산소 또는 혼합물로 살포하여 유지된다. 온도-조절배지는 필요하면 물로 가열되거나 냉각된다. 물은 용기를 둘러싸는 재킷을 통과하거나 배양물에 담근 파이프 코일을 통해서 통과한다.
공정 단계: 배지를 배양 용기로부터 제거하면, 원하는 단백질을 획득하기 위해서 제한 없이, 담체에 담그어지지 않은 세포를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과; 친화 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온-교환 크로마토그래피;크기 배제 크로마토그래피; 전기영동공정 (즉, 예비 등전점 전기영동 (IEF), 차별적 용해성 (즉, 암모늄 설페이트 침전), 또는 추출과 그 유사물를 포함한 하나 또는 그 이상의 공정 단계를 거친다. 일반적으로 Scopes, Protein Purificat이온, Springer-Verlag, New York, 1982; 와 Protein Purificat이온, J. -C. Janson 와 Lars Ryden, edit또는s, VCH Publishers, New York, 1989. 참조.
인자 VII 또는 인자 VII-관련된 폴리펩티드의 정제는 항-인자 VII 항체 칼럼에서 친화 크로마토그래피와 (Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097,1986 ; 와 Thim et al., Biochem. 27: 7785,1988 참조) 인자 IXa, 칼리크레인, 인자 Xa, 트롬빈과 같은 트립신 유사 특이성을 가진 인자 Xlla 또는 다른 프로테아제를 사용하여 단백질분해적 절단에 의한 활성화와 관련된다. 즉 Osterud et al., Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, U. S. Patent No. 4,456, 591; 와 Hedner et al., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983) 참조.
대안적으로, 인자 VII은 Mono Q®(Pharmacia) 또는 유사물과 같은 이온-교환크로마토그래피 이온-교환 크로마토그래피 칼럼을 통과하여 활성화된다
대규모 생산을 위한 폴리펩티드: 일부 구체예에서, 본 발명을 실행할 때 사용되는 세포는 내부 인자 VII 유전자를 발현하는 인간세포이다. 이러한 세포에서, 내부 유전자는 완전하거나 원위치에서 변경되거나 내부 인자 VII 유전자의 발현을 변경하기 위해서 인자 VII 유전자 외부의 서열은 원위치에서 변경된다.
다른 구체예에서, 진핵세포출처로부터 세포는 재조합체 유전자로부터 인간인자 VII를 발현하기 위해서 고안된다. 여기서 사용된 바와 같이, "인자 VII"또는"인자 V 폴리펩티드"는 야생형인자 VII (즉, U. S. Patent No. 4,784, 950에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드)와 야생형인자 VII에 상대적으로 같거나 개선된 생물적 활성을 나타내는 인자 VII의 변이체를 포함한다. 용어"인자 VII"는 절단되지 않은 (지모겐)형태에서 인자 VII 폴리펩티드와 인자 Vlla로 지정된 각 생물활성적 형태를 생산하도록 단백질분해적으로 공정된 것을 포함한다. 전형적으로, 인자 VII는 인자 Vlla를 생성하도록 잔기 152 와 153 사이에서 절단된다.
여기서 사용된 바와 같이, "인자 VII-관련된 폴리펩티드"는 인자 Vlla 생물학적 활성이 실질적으로 변경되거나 야생형인자 Vlla의 활성에 대해 감소된 변이체를 포함한 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 제한 없이, 폴리펩티드의 생물활성을 변경 또는 파괴하는 특이적 아미노산 서열 변경이 도입된 인자 VII 또는 인자 Vlla를 포함한다.
혈액 응고에서 인자 Vlla의 생물적활성은 (i) 조직 인자 (TF)에 결합하고 (ii) 활성화된인자 IX 또는 X (인자 IXa 또는 Xa, 각각)을 생산하기 위해 인자 IX또는 인자 X의 단백질 분해를 촉매하는 능력으로부터 유도한다. 본 발명의 목적을 위해서, 인자 Vlla 생물적활성은 즉, U. S. Patent No. 5,997, 864에 기술된 바와 같이 인자 VII-deficient 혈장과 트롬포플라스트를 사용하여 혈액 응고를 촉진하는 제조물의 능력을 평가하여 정량화된다. 이 검정에서, 생물적활성은 조절 샘플에 대한 응고 시간의 감소로서 표현되고 1 unit/ml 인자 VII활성을 함유하는 혼주된 인간혈청 표준과 비교하여 "인자 VII 단위"로 전환된다. 대안적으로, 인자 Vlla 생물적활성은 (i) 지질 막에 파묻힌 TF 와 인자 X를 포함하는 시스템에서 인자 Vlla 가 인자 Xa를 생산하는 능력을 측정하는 단계 (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924,1997) ; (ii) 수용성 시스템에서 인자 X 를 가수분해를 측정; (iii) 표면 플라스몬 공명에 근거한 도구를 사용하여 TF에 대한 물리적 결합을 측정하는 단계(Persson, FEBS Letts. 413: 359-363,1997) 와 (iv) 합성적 기질의 가수분해를 측정하는 단계로 정량화된다.
야생형인자 Vlla에 대해 실질적으로 같거나 개선된 생물적활성을 가진 인자 VII 변이체는 상기 기술된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 응고 검정, 단백질분해 검정 또는 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 같은 세포유형에서 생산된 인자 Vlla의 특이적활성의 적어도 약 25%, 바람직하게 적어도 약 50%, 더바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%을 나타내는 것들을 포함한다. 야생형인자 VIIa에 대해 실질적으로 감소된 생물적활성을 가진 인자 VII 변이체는 상기 기술된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 응고 검정, 단백질분해 검정 또는 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 같은 세포유형에서 생산된 야생형인자 Vlla의 특이적활성의 적어도 약 25% 이하, 바람직하게 약 10% 이하, 더바람직하게 약 5% 이하, 가장 바람직하게 약 1 % 을 나타내는 것들을 포함한다. 야생형인자 VII에 대해 실질적으로 변경된 생물적활성을 가진 인자 VII 변이체는 제한 없이, TF-비의존 인자 X 단백질분해활성을 나타내는 인자 VII 변이체와 TF을 결합하지만 인자 X를 절단하지 않는 것을 포함한다.
야생형인자 VII와 실질적으로 같거나 더 좋은 생물활성을 보이거나, 대안적으로,야생형인자 VII에 대해 실질적으로 변경되거나 감소된 생물활성을 나타내는 인자 VII의 변이체는 제한 없이, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삽입, 삭제, 또는 치환에 의해 야생형 인자 VII의 서열과 다른 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다.
야생형인자 VII와 실질적으로 같은 생물적활성을 가지는 인자 VII 변이체의 비제한적 실시예는 S52A-FVlla, S60A-FVlla (Lino et al., Arch.Biochem. Biophys. 352: 182-192,1998) ; U. S. Patent No. 5,580, 560에 기술된 바와 같이 증가된 단백질분해 안정성을 나타내는 FVlla 변이체; 잔기 290 와 291 사이 또는 잔기 315 와 316 사이에서 단백질분해적으로 절단된 인자 Vlla(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505,1995) ; 인자 Vlla 의 산화된 형태(Kornfelt et al., Arch.Biochem. Biophys. 363: 43-54,1999); PCT/DK02/00189에 기술된 바와 같은 FVII 변이체; WO 02/38162 에 기술된 바와 같이 증가된 단백질분해 안정성을 나타내는 FVII 변이체(Scripps Research Institute) ; WO 99/20767에 기술된 바와 같이 변경된 Gla-도메인을 가지고 향상된 막 결합을 나타내는 FVII 변이체(University of Minnesota); WO 01/58935에 기술된 바와 같은 FVII 변이체 (Maxygen ApS)를 포함한다.
야생형FVlla와 비교하여 증가된 생물적활성을 가지는 FVII 변이체의 비제한적 실시예는 WO 01/83725, WO 02/22776; WO 02/38162에 개시된 바와 같은 FVII 변이체를 포함한다(Scripps Research Institute) ; NN ansogninger 와;JP 2001061479 에 개시된 바와 같이 증가된 활성을 가지는 FVlla 변이체(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.).
야생형 인자 VII와 비교하여 실질적으로 감소되거나 또는 변경된 생물적활성을 가지는 인자 VII 변이체의 비제한적 실시예는 R152E-FVlla을 포함한다(Wildgoose et al., Biochem 29: 3413-3420,1990), S344A-FVlla (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270: 66-72, 1995), FFR-FVlla (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15: 515-520,1998)와 Gla 도메인이 없는 인자 Vlla , (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317: 245-249,1993)를 포함한다.
인자 VII 또는 인자 VII-관련된 폴리펩티드의 실시예는 , 제한 없이,야생형인자 VII, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L3051-FVII, L305T-FVII, F374P FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII,V1 58D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V1 58D/E296V/M298Q/L305V-FVII,V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII ; S52A-인자 VII, S60A-인자 VII ; R152E-인자 VII, S344A-인자 VII,Gla 도메인이 없는 인자Vlla; P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253NFVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/
V317T-FVII ; 233Thr 부터 240Asn까지 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 삭제를 가지는 FVII, 304Arg 부터 329Cys까지 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 삭제를 가지는 FVII을 포함한다.
본 발명은 또한 내부 유전자로부터 또는 단백질을 암호화하는 재조합체 유전자의 세포로 도입하는 것에 후속하여 하나 또는 그 이상의 해당 단백질을 발현하는 진핵 세포의 배양, 바람직하게 대규모 배양을 포함한다. 그러한 단백질은 , 제한 없이, 인자 VIII ; 인자 IX ;인자 X; 단백질C; 조직 인자; 레닌 ; 인간성장 호르몬을 포함한 성장 호르몬; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 파라티로이드 호르몬; 티로이드 자극 호르몬; 지질단백질 ; 알파-1-안티트립신 ; 인슐린 A-체인; 인슐린 B-체인; 전구인슐린 ; 난포자극 호르몬; 칼시토닌 ; 황체형성 호르몬; 글루카곤 ; 심방 나트륨이뇨 인자 ; 폐 표면활성제 ; 우로키나아제 또는 인간뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성제; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파와 베타; 엔케팔리나아제; 인간 대식세포 염증 단백질(MIP-1-알파) ; 인간혈청 알부민과 같은 혈청알부민; 뮬러리안-억제 물질; 리락신 A-체인; 리락신 B체인; 프로리락신 ; 생쥐 생식선자극호르몬-관련된 펩티드; 베타-락타마아제와 같은 미생물 단백질; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스모양 인자; 뼈-유도된 향신경인자 (BDNF), 뉴포트로핀-3,-4,5,또는-6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6) 또는 NGF-ss platelet-유도된 성장 인자 (PDGF)와 같은 신경 성장 인자; a-FGF 와 P-FGF와 같은 섬유모세포 성장 인자 ; 상피 성장 인자 (EGF); TGF-알파 와 TGF-beta와 같은 형질전환 성장 인자 (TGF), 인슐린-유사 성장 인자-I와-II (IGF-I 와 IGF-II); CD-3, CD-4, CD-8, 와 CD-19와 같은 CD 단백질; 적혈구생성인자; 뼈유도인자; 이뮤노톡신; 뼈 형태유전적 단백질(BMP); 인터페론-알파,-베타,-감마와 같은 인터페론; 즉 , M-CSF, GM-CSF, G-CSF와 같은 콜로니 자극 인자 (CSFs); 즉, IL-1 내지 IL-10와 같은 인터루킨s (ILs); 과산소 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부패 가속 인자; 예를 들어, AIDS 엔벨로프의 일부와 같은 바이러스 항원; 이송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절제 단백질; 항체; 상기 폴리펩티드의 단편을 포함한다.
다음 실시예는 본 발명의 비제한적 예시로서 의도된다.
실시예 1: CHO 세포의 제조
인간FVII의 발현을 위한 플라스미드 벡터 pLN174가 (Persson 와 Nielsen. 1996. FEBS Lett. 385: 241-243)에 기술되어 있다. 간략하게, 이는 삽입된 cDNA의 전사에 대한 생쥐 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에 프로펩티드와 선택가능한 마커로서 사용하기 위해 SV40 초기 프로모터의 조절하에 생쥐 디하이드로엽산 리덕타아제 cDNA를 포함하는 인간FVII을 암호화하는 cDNA 뉴클레오티드 서열을 운반한다.
감마-카르복시화 인지 서열을 암호화하는 플라스미드 벡터를 제조하기 위해서,
FVII와 이의 프로펩티드를 암호화하는 cDNA를 함유하는 클로닝벡터 pBluescript 11 KS+ (Strata유전자)가 사용되었다(pLN171)(Persson et al. 1997. J. Biol. Chem. 272: 19919-19924). 스탑 코돈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이, 이 클로닝벡터에서 역 PCR-중재된 돌연변이에 의한 프로펩티드 후 FVII을 암호화하는 cDNA 로 삽입되었다. 템플레이트 플라스미드를 NaOH로 처리하고 Pwo (Boehringer Mannheim) 와 Taq (Perkin-Elmer) 중합효소와 함께 다음 프라이머로 PCR 하여 변성시킨다:
5'-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3'
5'-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3'
형성된 혼합물을 Dpnl로 분해하여 잔여 템플레이트 DNA를 분해하고 Escherichia coli 는 PCR 산물로 형질전환되었다. 클론을 시퀀싱하여 변이가 존재하는지에 대해 스크린하였다. 정확한 클론으로부터 cDNA는 BamHI-Ecorl 단편으로서 발현 플라스미드 pcDNA3 (Invitrogen)으로 전달되었다. 형성된 플라스미드는 pLN329라 불린다. CHO K1세포 (ATCC CC161)는 Fugene 6 방법으로 pLN174 와 pLN329의 동등한 양으로 전달감염되었다(Boehriner-Mannheim). 메토트렉사트를 1㎛까지 첨가하고, G-418를 0.45 mg/ml까지 첨가하여 전달감염체를 선택한다. 전달감염체의 혼주는 제한 희석으로 클론되었고 클론으로부터 FVII발현이 측정되었다.
생산량이 많은 클론은 더 서브클론되고 Dulbecco-변경된 이글스 배지에서 10 % 소태아혈청으로 2.4 pg/세포/day의 특이적 FVII발현이 선택되었다. 클론은 동물유도된 성분이 없는 상업적으로 구입가능한 CHO 배지 (JRH Bioscience)에서 혈청이 없는 진탕 배양물로 변경되었다.
실시예 2: 인자 VII의 생산
실험적 조건의 요약
상업적으로 구입가능한 동물-유도된 성분 (JRH Biosciences)이 없는 CHO세포에 대한 단백질이 없는 배지는 실시예에서 모두 세가지의 배양동안에 인슐린 (5 mg/L)과 비타민 K1 (5 mg/L)로 보충하였다.
배양 용기의 크기는 500 l이다. 공정유형은 담체의 침강 후에 배지(400 L)의 80%를 매일 배치식 교환하여 표준 Cytopore 1 미세담체 배양이다.
FFF 1239 와 FFF 1242를 배양할 때 배지 교환에서 담체를 침강하기 즉시 전에 매일 냉각 단계를 적용하였다(FFF 1239에서 26 ℃로 냉각; 19일까지 26 ℃로 냉각한 후 FFF 1242에서 53일까지 20 ℃로 냉각이 후속한다).
모두 세 개를 배양하는 동안, 온도, pH, 용해된 산소와 같은 배양 변수에 대해 표준 설정이 사용되었다. 온도 설정은 36.0 ℃였다. pH 설정은 하류 조절에 대해 7.10이고(CO2가스를 상부공간에 첨가하여) 상부 조절에 대해 6.80 이다(탄산 나트륨 용액을 배양액에 첨가하여). 용해된 산소의 설정은 공기로 50% 포화되었다.
결과와 결론의 요약
세 개의 배양물의 첫번째에서, 생산량이 많은 CHO 클론, FFF 1235,(실시예 1에 기술된 바와 같이)이 표준 미세담체 공정에서 배양되었고 냉각 단계는 적용되지 않았다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 시간 대 FVII 역가에 대한 그래프는 "종-모양", 즉, 18-20 일부터 배양에서 FVII 역가에서 감소가 관찰되었다. 감소는 배양 용기에서 전체 세포 밀도의 감소 즉, 배양 용기로부터 세포의 손실에 의해 야기된다는 것이 명백하다.
FFF 1239 와 FFF 1242에서 담체의 침강전에 수행된 냉각 단계동안에, 자켓에 대한 냉각수의 밸브는 항상 열려있다. 냉각 단계가 지속되는 동안 결정적인 유일한 변수인 냉각수의 온도는 10-15 ℃였다. 36.0 ℃ 에서 각각 26. 0 ℃ 와 20. 0 ℃으로의 냉각은 각각 30 분과 55 분이 걸렸다. 오래된 배지를 수거한 후 배양 용기에 첨가된 새로운 배지는 30℃로 이전에 가열되었다. 새로운 배지를 첨가한 후, 배양 용기의 온도 조절 루프는 설정 36.0 ℃으로 활성화되고 설정까지 후속 가열은 담체의 침강전에 표적 온도(26.0 ℃ 또는 20.0 ℃)와 관계없이 약 120 분 걸렸다.
매일 냉각 단계가 적용되는 두가지 배양물, FFF 1239 와 FFF 1242의 전체 프로필은 배양물 FFF 1235과 유사하였다. FFF 1239 와 FFF 1242에서 담체의 침강 직전에 적용된 매일 냉각 단계는 세포 밀도와 FVII 역가에 긍정적인 영향을 미쳤다. 그래프는 여전이 "벨-형태"이어도, 냉각 단계는 세포 밀도와 FVII 역가의 정점 값을 증가시켰고(FFF 1239 36 mg/L 에서 피크 FVII 역가 대 FFF 1235에서 22 mg/L) 세포 밀도가 높고 FVII 역가가 높은 기간을 연장시켰다(FFF 1235에서 8-9일부터 FFF 1239에서 13-14 일까지 확장된 15 mg/L 이상의 FVII 역가를 가진 기간). 26 ℃까지 냉각으로 가장 높은 세포 밀도와 FVII 역가를 얻었음을 볼 수 있다.
결과
그래프적 표현
FFF 1235, FFF 1239, FFF 1242에서 FVII 역가는 도 1에 그래프적으로 제시되어 있다.
배양물 FFF 1235, FFF 1239, 와 FFF 1242에 대한 세포 수와 FVII 역가는 도 2 내지 도 4에 제시되어 있다.
배양물 FFF 1239 와 FFF 1242로부터 유도된 전체 결론은 매일 담체의 침강 전에 냉각 단계는 배양의 전체 성능에 긍정적인 효과를 미치고 26 ℃가 20 ℃보다 바람직하다는 것이다.
여기서 인용된 모든 특허 , 특허 출원, 참고 문헌은 전체가 여기에 참고문헌으로 통합되어 있다.
본 발명의 많은 변형이 상기 상세 기술문의 관점에서 능숙한 사람들에게 알려져 있다. 그러한 명백한 변형은 첨부된 청구항의 의도된 영역 내이다.
Claims (41)
- 진핵 세포에서 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법으로, (ⅰ) 상기 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건과 설정 온도에서 미세담체에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 배양물을 상기 설정 이하로 정해진 온도로 냉각하는 단계;(ⅲ) 미세담체를 침강시키는 단계; (ⅳ) 배지의 모두 또는 일부를 수거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 수거 후에 신선한 배지를 배양 용기에 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 수거된 배양 배지로부터 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,정해진 온도는 설정 이하의 약 5 ℃ 내지 30℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서,정해진 온도는 설정 이하의 약 5 ℃ 내지 20℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서,정해진 온도는 설정 이하의 약 5 ℃ 내지 15 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서,정해진 온도는 설정 이하의 약 10 ℃ 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물은 침강 전에 약 18 ℃ 내지 약 32 ℃의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 배양물은 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 배양물은 약 22 ℃ 내지 약 28 ℃의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 배양물은 약 24 ℃ 내지 약 28 ℃의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11항에 있어서, 배양물은 약 25 ℃ 내지 약 27 ℃의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 곤충세포인 것을특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 포유동물세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 포유동물세포는 HEK, BHK, CHO세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 포유동물 세포는 CHO세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 인자 VII 또는 인자 Vll-관련된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17항에 있어서, 폴리펩티드는 야생형 인간 인자 Vll인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17항에 있어서, 폴리펩티드는 L305V-FVII, L305V/M306D/D309S- FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII,K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V1 58D/E296V-FVII, V1 58D/M298K-FVII, S336G-FVII ; S52A-인자 Vll, S60A-인자 Vll ; R152E-인자 Vll, S344A-인자 Vll, Gla 도메인이 없는 인자 Vlla; P11Q/K33EFVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ; 233Thr부터 240Asn까지 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 삭제된 FVII, 304Arg 부터 329Cys까지 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 삭제된 FVII로 구성된 군에서 선택되는, 인자 VII-관련 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 배양물의 적어도 약 15 mg/l 수준에서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 인간인자 VII, 세포는 CHO세포, 담체는 대공성 담체, 배양 설정은 36 ℃, 담체가 침강하기 전에 배양물은 약 26 ℃로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (ⅰ) 배양물을 유지하기에 적절한 조건과 설정 온도에서 미세담체에서 세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 배양물을 상기 설정 이하로정해진 온도로 냉각하는 단계;(ⅲ) 미세담체를 침강시키는 단계; (ⅳ) 배지의 모두 또는 일부를 수거하는 단계를 포함하는 진핵 세포를 배양하기 위한 방법.
- 제 22항에 있어서, 상기 수거 후에 신선한 배지를 배양 용기에 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항 또는 제 23항에 있어서,정해진 온도는 설정 이하로 약 5 ℃ 와 30℃ 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 24항에 있어서,정해진 온도는 설정 이하로 약 5 ℃ 와 20℃ 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항에 있어서,정해진 온도는 설정 이하로 약 5 ℃ 와 15℃ 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26항에 있어서,정해진 온도는 설정 이하로 약 10 ℃ 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항 또는 제 23항에 있어서, 배양물은 약 18 ℃ 내지 약 32 ℃의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 배양물은 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 배양물은 약 22℃ 내지 약 28℃ 의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30항에 있어서, 배양물은 약 24℃ 내지 약 28℃ 의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항에 있어서, 배양물은 약 25℃ 내지 약 27℃ 의 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 곤충세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 포유동물세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항에 있어서, 포유동물세포는 HEK, BHK, CHO세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35항에 있어서, 포유동물세포는 CHO세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 원하는 인자 VII 또는 인자 VII-관련된 폴리펩티드를 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 야생형인간인자 VII인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 38항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305l-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII ; S52A-인자 VII, S60A-인자 VII ; R152E-인자 VII, S344A-인자 VII, Gla 도메인이 없는 인자 Vlla; P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/Nl45T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; 233 Thr 부터 240Asn까지 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 삭제된 FVII, 304 Arg부터 329Cys까지 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 삭제된 FVII로 구성된 군에서 선택되는, 인자 VII-관련 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 배양물의 적어도 약 15 mg/l 수준에서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 미세담체 배양물에서 자라는 진핵 세포에 의해 생산되는 폴리펩티드를 수거하는 방법으로, 상기 방법은 (i) 배양의 설정 이하의 미리결정된 온도로 배양물을 냉각시키는 단계, 후속하여 (ii) 미세담체를 침강시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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