KR20130128013A - 관심있는 비타민 ｋ-의존성 단백질을 포함한 조성물 중의 단백질 오염물질의 양의 감소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 오염물질의 매우 낮은, 또는 무시할만한 양을 가진 비타민 K-의존성 단백질 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 비타민 K-의존성 단백질 조성물의 제조에 사용가능한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 단독으로 또는 단백질 오염물질의 상대적 양을 감소시키는 목적과 순차적으로 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 특히 인자 X 폴리펩티드(FX/FXa), 인자 IX 폴리펩티드(FIX/FIXa), 인자 VII 폴리펩티드(FVII/FVIIa), 및 항응고 단백질 C, 특히 인자 VII 폴리펩티드 중에서 선택된 응고 인자의 조성물의 제조와 관련된다.

Description

관심있는 비타민 Ｋ-의존성 단백질을 포함한 조성물 중의 단백질 오염물질의 양의 감소{REDUCTION OF THE CONTENT OF PROTEIN CONTAMINANTS IN COMPOSITIONS COMPRISING A VITAMIN K-DEPENDENT PROTEIN OF INTEREST}
본 발명은 단백질 오염물질의 매우 낮은, 또는 무시할만한 양을 가진 비타민 K-의존성 단백질 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 비타민 K-의존성 단백질 조성물의 제조에 사용가능한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 단독으로 또는 단백질 오염물질의 상대적 양을 감소시키는 목적과 순차적으로 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 특히 인자 X 폴리펩티드(FX/FXa), 인자 IX 폴리펩티드(FIX/FIXa), 인자 VII 폴리펩티드(FVII/FVIIa), 및 항응고 단백질 C, 특히 인자 VII 폴리펩티드 중에서 선택된 응고 인자의 조성물의 제조와 관련된다.
미생물 또는 세포주의 배양으로부터 재조합 단백질의 생성시, 최종 생성 단계는 회수 및 선택적으로 관심있는 생성물의 농축이다. 세포가 성장한, 그리고 분비된 단백질 및, 특히 관심있는 세포내 단백질을 함유한 세포 용해물을 함유하는 배양 배지는 많게 또는 적게 다른 오염물질과 별개로 세포에 의하여 생성된 다른 단백질, 예를 들면 배지 성분, 핵산 등을 함유한다. 따라서, 정제된 단백질 생성물을 얻기 위하여, 관심있는 단백질을 함유한 천연물질에 있는 다른 단백질 및 폴리펩티드 및 다른 불순물로부터 관심있는 단백질을 분리하는 것이 필요하다.
관심있는 단백질과 같은 성질의 도메인을 포함한 단백질 오염물질을 제거하는 것은 종종 난해하다.
비타민 K-의존성 단백질은 분자의 아미노 말단 부분에 공통된 구조적 특징으로 공유함으로써 다른 단백질과 구별된다. Gla-도메인이라고도 불리는 이들 단백질의 N-말단은 효소 γ-글루타밀 카르복실라제에 의하여 촉매되는 비타민 K-의존성 반응에서 글루타메이트에서 합성된 특이한 아미노산 γ-카르복시 글루탐산에 풍부하다. 약 2 내지 12 Gla 잔기의 존재 때문에, Gla-도메인은 Ca2 +와 같은 2가 양이온과 결합할 수 있는 특징이 있다. 금속 이온의 결합 시, 이들 단백질은 원편광 이색성 및 형광 방출과 같은 몇몇 기술에 의하여 측정될 수 있는 입체형태적 변화를 거친다.
입체형태 특이적 폴리클로날 항체의 동정(Furie et al., J. Biol. Chem. 1978; 253, 8980- 8987)과 함께 Gla-함유 단백질의 금속 유도된 입체형태적 변화의 발견(Nelsestuen et. al., J. Biol. Chem. 1976; 251, 6886-6893)은 입체형태 특이적 면역친화도 크로마토그래피의 도입을 위한 방법의 문을 열었다. 이들 항체는 Ca2+의 존재 하에 Gla-도메인을 인식하고 결합할 수 있지만, EDTA 또는 시트레이트와 같은 Ca2 + 킬레이터를 사용하여 Ca2 +의 제거시에 단백질을 방출하였다.
1980년대에, 입체형태에 금속 유도된 변화를 거치기 위하여 Gla 함유 단백질의 유일한 특성을 이용하는 입체형태 특이적 유사친화도 크로마토그래피가 개발되었다. 유사친화도 크로마토그래피는 관련된 고정된 친화도 리간드가 없고 종래의 크로마토그래피 매트릭스에서 수행된다는 점에서 종래의 친화도 크로마토그래피와 다르다(Yan S. B., J. MoI. Recog. 1996; 9, 211-218). Gla 단백질은 2가 금속 이온을 제거함으로써 음이온 교환 물질에 흡수될 수 있다. 그 다음, 용리 완충액에 Ca2+을 첨가함으로써 용리를 수행한다.
1986년에, BjØrn 및 Thim은 인자 VII의 Gla-도메인의 Ca2 +-결합 특성을 이용하여 음이온 교환 물질에 재조합 인자 VII의 정제를 보고하였다(Bjorn S. and Thim L., Research Dislosure, 1986, 26960-26962.). 흡수는 완충액에서 이루어졌으며 인자 VII의 용리는 낮은 이온 세기 및 순한 조건 하에서 Ca2 + 함유 완충액을 사용하여 가능하였다.
Yan et al.은 재조합 사람 단백질 C의 정제에 동일한 원리를 사용하였다(Yan S. B. et al., Bio/technology. 1990; 8, 655-661).
Gla-도메인의 존재는 다른 단백질로부터 Gla 함유 단백질을 분리하기 위한 이점을 제공하지만, 본 발명의 발명자들은 Gla 함유 단백질의 유사한 특성 및 행동이 그것들을 서로서로 분리하기 어렵게 한다는 것을 발견하였다. 한 Gla 단백질에 대하여 발생된 몇몇 입체형태 특이적 항체는 다른 Gla 단백질과 교차 반응성을 나타낸다(Furie B. and Furie B., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771; Church et al., J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267.).
Brown et al. (Brown et al., J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802.)은 Gla 잔기에 특이적인 모노클로날 항체를 보고하였다. 이들 항체는 시험되는 모든 Gla 단백질, 즉 인자 VII, 인자 IX, 인자 II, 단백질 C, 단백질 S, GAS-6, 골기질 Gla 단백질, 코난토킨 G를 인식할 수 있다.
GLA-도메인을 포함한 단백질은, 한정하는 것은 아니지만, 다음 단백질을 포함한다: GAS-6, 단백질 S, 인자 II (프로트롬빈), 트롬빈, 인자 X/Xa, 인자 IX/IXa, 단백질 C, 인자 VII/VIIa, 단백질 Z, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 1, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 2, 막관통 감마 카르복시글루탐산 단백질 3, 감마 카르복시글루탐산 단백질 4, 기질 Gla 단백질, 및 오스테오클라신을 포함한다.
US 5,633,350은 비-비타민 K 의존성 동반 단백질로부터 비타민 K 의존성 단백질을 분리하기 위한 방법을 설명한다.
관심있는 비타민 K-의존성 단백질, 예를 들면 관심있는 Gla-도메인 함유 폴리펩티드를 단백질 오염물질로부터 효율적으로 분리하기 위한 필요성은 특히 세포 배양에서 생성된 이러한 폴리펩티드의 정제를 다룰 때 관련된 이슈인데, 이는 숙주세포(사람 세포주가 아닐 수 있다)가 폴리펩티드의 사용시 바람직하지 않은 면역성 반응을 야기할 수 있는 현저한 양의 단백질 오염물질을 생성할 수 있기 때문이다.
따라서, 본 발명의 목적은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물에서 단백질 오염물질의 양을 감소 또는 제거하기에 적합한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 매우 낮은 또는 무시할만한 양의 단백질 오염물질을 가진 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 단백질 오염물질(들)의 양을 감소하거나 제거하기 위한 다양한 방법에 관한 것이다.
관심있는 비타민 K-의존성 단백질
본 발명은 넓은 의미에서 관심있는 비타민 K-의존성 단백질의 정제 및 이러한 단백질을 포함한 특별히 정제된 조성물에 관한 것이다. 용어 "관심있는"는 예를 들면 치료 상황에서 비타민 K-의존성 단백질을 사용하려는 목적으로 가장 순수한 형태를 얻는 것과 관련된, 특정 종(비타민 K-의존성 단백질)을 지시하는 것으로 본원에 사용된다.
본원에 설명된 방법은 원칙적으로, 한정하는 것은 아니지만, GAS-6, 단백질 S, 인자 II(프로트롬빈), 트롬빈, 인자 X/Xa, 인자 IX/IXa, 단백질 C, 인자 VII/VIIa, 단백질 Z, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 1, 막관통-카르복시글루탐산 단백질 2, 막관통 감마 카르복시글루탐산 단백질 3, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 4, 기질 Gla 단백질, 및 오스테오클라신), 특히 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C에서 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자를 포함한 어떤 비타민 K-의존성 단백질의 정제에 사용될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 이 방법은 세포 배양 조건, 특히 비-사람 세포 배양에서 생성된 관심있는 재조합 비타민 K-의존성 단백질의 정제에 사용된다.
한 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드, 예를 들면 FIX 또는 FIXa이다.
다른 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드, 예를 들면 인자 VII-관련 폴리펩티드, 또는 인자 VII 유도체, 또는 인자 VII 콘쥬게이트, 특히 사람 인자 VII 폴리펩티드, 특히 사람 야생형 인자 VII 또는 야생형 사람 인자 VIIa이다.
본원에 사용된 용어 "인자 VII 폴리펩티드" 및 "FVII 폴리펩티드"는 사람 인자 VIIa (즉, U.S. Patent No. 4,784,950에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드)의 아미노산 서열 1-406을 포함한 어떤 단백질, 그것의 변이체 뿐만 아니라 인자 VII-관련 폴리펩티드, 인자 VII 유도체 및 인자 VII 콘쥬게이트를 포함한 어떤 단백질을 의미한다. 이것은 인자 VII 변이체, 인자 VII-관련 폴리펩티드, 인자 VII 유도체 및 야생형 사람 인자 VIIa에 비해서 실질적으로 동일한 또는 향상된 생물학적 활성을 나타내는 인자 VII 콘쥬게이트를 포함한다.
용어 "인자 VII" 또는 "FVII"는 그것들의 분열되지 않은 형태(자이모겐)의 인자 VII 폴리펩티드뿐만 아니라 인자 VIIa로 지정될 수 있는 그것들 각각의 생활성 형태를 생성하도록 단백질가수분해되어 가공된 것들을 포함하도록 의도된다. 전형적으로, 인자 VII는 잔기 152와 153에서 분열되어 인자 VIIa를 생성한다. 인자 VII의 이러한 변이체는 안정성, 인지질 결합, 변경된 특이적 활성 등을 포함한, 사람 인자 VII에 비해서 다른 특성을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "야생형 사람 인자 VIIa"는 U.S. Patent No. 4,784,950에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이다.
본원에 사용된 "인자 VII-관련 폴리펩티드"는 인자 VIIa 생물학적 활성이 야생형 인자 VIIa의 활성에 비해서 실질적으로 변형된, 예를 들면 감소된 변이체(또는 유사체)를 포함한 폴리펩티드를 포함한다. 이들 폴리펩티드는, 한정하는 것은 아니지만, 폴리펩티드의 생활성을 변형 또는 파괴하는 특정 아미노산 서열 변경이 도입된 인자 VII 또는 인자 VIIa를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "인자 VII 유도체"는 야생형 인자 VII에 비해서 실질적으로 동일한 또는 향상된 생물학적 활성을 나타내며, 모 펩티드의 하나 이상의 아미노산은 예를 들면 알킬화, 글리코실화, PEG화, 글리코PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의하여 유전학적 및/또는 화학적 및/또는 효소학적으로 변형된 인자 VII 폴리펩티드를 지시하도록 의도된다. 이것은, 한정하는 것은 아니지만, PEG화된 사람 인자 VIIa, 시스테인-PEG화된 사람 인자 VIIa 및 그것의 변이체를 포함한다. 인자 VII 유도체의 무한정 예는 WO 03/31464 및 US 특허출원 US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557, 및 US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.)에 개시된 글리코PEG화된 인자 VII 유도체; WO 01/04287, US 특허출원 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) 및 WO 02/02764, US 특허출원 20030211094 (University of Minnesota)에 개시된 인자 VII 콘쥬게이트를 포함한다.
용어 "향상된 생물학적 활성"이란 i) 재조합 야생형 사람 인자 VIIa에 비해서 실질적으로 동일한 또는 증가된 단백질가수분해 활성을 가진 인자 VII 폴리펩티드 또는 ii) 재조합 야생형 사람 인자 VIIa에 비해서 실질적으로 동일한 또는 증가된 TF 결합 활성을 가진 인자 VII 폴리펩티드 또는 iii) 재조합 야생형 사람 인자 VIIa에 비해서 혈장에서 실질적으로 동일한 또는 증가된 반감기를 가진 인자 VII 폴리펩티드를 말한다. 용어 "PEG화된 사람 인자 VIIa"는 사람 인자 VIIa 폴리펩티드에 콘쥬게이트된 PEG 분자를 가진 사람 인자 VIIa를 의미한다. PEG 분자는 인자 VIIa 폴리펩티드의 어떤 아미노산 잔기 또는 탄수화물 부분을 포함한 인자 VIIa 폴리펩티드의 어떤 부분에 부착될 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "시스테인-PEG화된 사람 인자 VIIa"는 사람 인자 VIIa에 도입된 시스테인의 술프히드릴기에 콘쥬게이트된 PEG 분자를 가진 인자 VIIa를 의미한다.
재조합 야생형 사람 인자 VIIa에 비해서 실질적으로 동일한 또는 증가된 단백질분해 활성을 가진 인자 VII 변이체의 무한정한 예는 S52A-인자 VIIa, S60A-인자 VIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); U.S. Patent No. 5,580,560에 개시된 증가된 단백질분해 안정성을 나타내는 인자 VIIa 변이체; 잔기 290과 291 또는 잔기 315과 316 사이에서 단백질가수분해에 의하여 분열된 인자 VIIa (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); 인자 VIIa의 산화된 형태 (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); PCT/DK02/00189 (WO 02/077218)에 개시된 인자 VII 변이체); 및 WO 02/38162 (스크립스 연구소)에 개시된 증가된 단백질가수분해 안정성을 나타내는 인자 VII 변이체; WO 99/20767, 미국특허 US 6017882 및 US 6747003, 미국특허출원 20030100506 (미네소타 대학교) 및 WO 00/66753, 미국특허출원 US 20010018414, US 2004220106, 및 US 200131005, 미국특허 US 6762286 및 US 6693075 (미네소타 대학교)에 개시된 바와 같이 변형된 Gla-도메인을 가지고 향상된 막 결합성을 나타내는 인자 VII 변이체; 및 WO 01/58935, 미국특허 US 6806063, 미국특허출원 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS) 및 WO 04/029091 (Maxygen ApS)에 개시된 인자 VII 변이체를 포함한다.
야생형 인자 VIIa에 비해서 증가된 생물학적 활성을 가진 인자 VII 변이체의 무한정 예는 WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (WO 03/027147), 덴마크 특허출원 PA 2002 01423 (WO 04/029090), 덴마크 특허출원 PA 2001 01627 (WO 03/027147); WO 02/38162 (스크립스 연구소)에 개시된 인자 VII 변이체; 및 JP 2001061479 (Chemo-Sero- Therapeutic Res Inst.)에 개시된 향상된 활성을 가진 인자 VIIa 변이체를 포함한다.
인자 VII의 변이체의 예는, 한정하는 것은 아니지만,
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
및 233Thr으로부터 240Asn까지의 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실을 가진 FVII; 304Arg으로부터 329Cys까지의 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실을 가진 FVII; 및 153Ile로부터 223Arg까지의 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실을 가진 FVII를 포함한다.
따라서, 인자 VII 폴리펩티드에서의 치환 변이체는, 한정하는 것은 아니지만, 위치 P1O, K32, L305, M306, D309, L305, L305, F374, V158, M298, V158, E296, K337, M298, M298, S336, S314, K316, K316, F374, S52, S60, R152, S344, T106, K143, N145, V253, R290, A292, G291, R315, V317에서의 치환, 및 T233으로부터 N240까지 또는 R304으로부터 C329까지, I153으로부터 R223까지, 또는 그것들의 조합에서의 아미노산 서열에서의 치환, 첨가 또는 결실, 특히 P1OQ, K32E, L305V, M306D, D309S, L305I, L305T, F374P, V158T, M298Q, V158D, E296V, K337A, M298Q, M298K, S336G, S314E, K316H, K316Q, F374Y, S52A, S60A, R152E, S344A, T106N, K143N, N145T, V253N, R290N, A292T, G291N, R315N, V317T와 같은 변이체; 및 T233으로부터 N240까지, 또는 R304로부터 C329까지, 또는 I153으로부터 R223까지, 또는 그것의 조합에서의 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다.
용어 "인자 X 폴리펩티드" 및 "인자 IX 폴리펩티드"와 관련된 "폴리펩티드"는 각각 야생형 사람 인자 X 및 인자 IX를 포함한 어떤 단백질, 뿐만 아니라 각각의 "유사체", "변이체", "관련된 폴리펩티드", "유도체" 및 그것의 "콘쥬게이트"를 포함하도록 의도되며, "변이체", "관련된 폴리펩티드", "유도체" 및 "콘쥬게이트"는 필요한 변경을 가한 인자 VII로 정의된다.
조성물
본원에 사용된 용어 "조성물"은 액체 조성물, 예를 들면 수성 액체 조성물, 즉 5% 미만의 비-수성 용매를 포함하는 조성물을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "첫 번째 조성물"은 본 발명에 따라서 정제 단계와 같은 처리 전에 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함하는 조성물을 말한다. 이 용어는 "첫 번째 조성물"과 정제 단계와 같은 처리 후에 동일한 조성물로 언급되는 "두 번째 조성물"과 구별하는 데 사용된다.
관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 가장 전형적으로 세포 배양 조건 하에서 생성되는 재조합 단백질인데, 즉, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 세포 배양 상청액의 성분으로 직접 얻어지거나 하나 이상의 선행하는 공정 단계 후 세포 배양 상청액에서 얻어진다. 본 발명을 실행할 때, 세포는, 한정하는 것은 아니지만, CHO (예를 들면, ATCC CCL 61), COS-1 (예를 들면, ATCC CRL 1650), 새끼 햄스터 신장 (BHK), 및 HEK293 (예를 들면, ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 세포주를 포함한 확립된 진핵 세포주와 같은 진핵세포이다. 바람직한 BHK 세포주는 tk- ts13 BHK 세포주 (Waechter and Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79: 1106-1110, 1982)이며, 이후에는 BHK 570 세포로 언급된다. BHK 570 세포주는 ATCC 승인번호 CRL 10314 하에 아메리카 타입 컬쳐 콜랙션(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852)에서 구입가능하다. tk- ts13 BHK 세포주는 또한 승인번호 CRL 1632로 ATCC에서 구입가능하다. 바람직한 CHO 세포주는 승인번호 CCI61 하에 ATCC에서 구입가능하다.
다른 적합한 세포주는, 한정하는 것은 아니지만, Rat Hep I (래트 간종양; ATCC CRL 1600), 래트 Hep II (래트 간종양; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 사람 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1); DUKX 세포 (CHO 세포주) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216-4220, 1980) (DUKX 세포는 또한 DXBI1 세포로 언급됨), 및 DG44 (CHO 세포주) (Cell, 33: 405, 1983, and Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986)를 포함한다. 3T3 세포, 나말와 세포, 골수종 및 골수종과 다른 세포의 융합이 또한 유용하다. 일부 구체예에서, 세포는 돌연변이 또는 재조합 세포, 예를 들면 그것들이 유래한 세포 유형보다는 단백질의 번역 후 변형을 촉매하는 효소(예를 들면, 글리코실 전이효소 및/또는 글리코시다제와 같은 글리코실화 효소, 또는 프로펩티드와 같은 가공 효소)의 정성적 또는 정량적으로 다른 스펙트럼을 발현하는 세포일 수 있다. 또한 적합한 곤충 세포주는, 한정하는 것은 아니지만, 레피도프테라 세포주, 예를 들면 스포도프테라 프루지페르다 세포 또는 트리코플루시아 니 세포(예를 들면, US 5,077,214 참조)를 포함한다.
전형적으로, 첫 번째(예를 들면 정제되지 않은) 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 적어도 200 ppm, 예를 들면 적어도 300 ppm, 예를 들면 적어도 400 ppm, 또는 적어도 500 ppm이다.
또한 전형적으로, 첫 번째(예를 들면 정제되지 않은) 조성물 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 적어도 200 ppm, 예를 들면 적어도 300 ppm, 예를 들면 적어도 400 ppm, 또는 적어도 500 ppm이다.
전형적인 단백질 오염물질
본원에 사용된 용어 "단백질 오염물질" 및 "단백질 오염물질들" 등은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질과 관련하여 불순물을 구성하는 단백질 또는 폴리펩티드 성분을 말하는 것으로 의도된다. 따라서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 그와 같은 "비타민 K-의존성 단백질"과 "단백질 오염물질"의 정의가 각각 부분적으로 겹치더라도 단백질 오염물질로 명백하게 계수되지 않을 것이다. 한 구체예에서, 단백질 오염물질은 비타민 K-의존성 단백질이다(그러나 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 아니다).
비타민 K-의존성 단백질은 전형적으로 세포 배양에서 생성되므로, 어떤 그룹의 단백질 오염물질은 숙주세포 단백질이다. "숙주세포 단백질"은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 발현하는 숙주세포에 의하여 생성된 단백질이며, 전형적으로 불순물로 간주된다. 숙주세포 단백질은 사람 세포주가 관심있는 비타민 K-의존성 단백질 또는 비-사람 단백질의 생산에 사용되는 경우, 또는 비-사람 세포주가 관심있는 단백질의 생산에 사용되는 경우, 사람 단백질일 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 단백질 오염물질은 숙주세포 단백질, 예를 들면 비타민 K-의존성 단백질이다.
숙주세포 단백질의 특별히 관련된 부류는 GAS-6, 단백질 S, 인자 II (프로트롬빈), 트롬빈, 인자 X/Xa, 인자 IX/IXa, 단백질 C, 인자 VII/VIIa, 단백질 Z, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 1, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 2, 막관통 감마 카르복시글루탐산 단백질 3, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 4, 기질 Gla 단백질, 및 오스테오클라신과 같은 단백질을 함유한 Gla-도메인이다. 이들 단백질에서 Gla 잔기의 수는 2-12의 범위이다. Gla 잔기의 합성이 비타민 K를 필요로 하기 때문에, Gla 잔기를 함유한 단백질은 또한 비타민 K-의존성 단백질로 언급된다.
본 문맥에서, 관련된 특정 숙주세포 단백질은 단백질 S이다. 특정 구체예에서, 단백질 S는 햄스터 단백질 S이다. 따라서, 본원에 정의된 방법 및 조성물은 특히 단백질 S의 양의 감소에 초점을 맞춘다.
단백질 오염물질의 양의 감소
본 발명의 중추적 양태는 관심있는 비타민 K-의존성 단백질(특히 인자 VII 폴리펩티드)을 포함한 조성물로부터 단백질 오염물질(특히 단백질 S)을 제거할 수 있는 방법이다.
따라서, 본 발명은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물에서 하나 이상의 단백질 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 적어도 (i) 조성물을 하나 이상의 단백질 오염물질 및/또는 관심있는 비타민 K-의존성 단백질과 결합할 수 있는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 비해서 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 5의 인자로 감소된, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 결과의 조성물을 수집하는 단계를 포함한다.
가장 중요한 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 결과의 두 번째(예를 들면 정제된) 조성물 중에 단백질 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm까지 떨어진다.
전술한 바와 같이, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 전형적으로 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C 중에서 선택된 비타민 K-의존성 단백질이다. 다른 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드이다. 또 다른 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드이다. 다른 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자는 인자 X 폴리펩티드이다.
특정 구체예에서, 주된 양의 단백질 오염물질은 Gla-도메인 함유 폴리펩티드, 특히 단백질 S이고; 및 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드이다. 한 구체예에서, 단백질 오염물질은 햄스터 단백질 S이다. 다른 구체예에서, 단백질 오염물질은 단백질 S이고 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드이다. 한 구체예에서, 단백질 오염물질은 햄스터 단백질 S이다.
한 구체예에서, 본 발명은 2-16 Gla-잔기를 함유한 다른 비타민 K-의존성 단백질 오염물질로부터 2-16 Gla-잔기를 함유한 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 응고 효과를 가진 단백질로부터 단백질 S 및 단백질 C와 같은 항-응고 효과를 가진 단백질을 분리하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 응고 인자이며 항-응고 효과를 가진 단백질 오염물질은 단백질 S이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 사람 비타민 K-의존성 단백질로부터 비-사람 단백질 오염물질을 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양태에서, 비-사람 단백질 오염물질은 또한 비타민 K-의존성 단백질이다. 또 다른 양태에서, 비-사람 단백질 오염물질은 햄스터 단백질이다.
본 발명의 방법은 예를 들면 10의 인자, 또는 적어도 25의 인자, 또는 적어도 50의 인자, 예를 들면 적어도 100의 인자, 또는 적어도 250의 인자, 또는 적어도 500의 인자, 또는 적어도 750의 인자, 또는 적어도 1000의 인자, 또는 적어도 2000의 인자로 감소된 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 대해서 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준을 생산할 수 있게 한다.
특히, 처리된 세포 배양 상청액과 같은 결과의 두 번째(예를 들면 정제된) 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm, 예를 들면 최대 90 ppm, 또는 최대 80 ppm, 또는 최대 70 ppm, 또는 최대 60 ppm, 또는 최대 50 ppm, 또는 최대 40 ppm, 또는 최대 30 ppm, 또는 최대 20 ppm, 또는 최대 10 ppm 또는 최대 5 ppm이고; 또는 처리된 세포 배양 상청액과 같은 결과의 두 번째(예를 들면 정제된) 조성물 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm, 예를 들면 최대 90 ppm, 또는 최대 80 ppm, 또는 최대 70 ppm, 또는 최대 60 ppm, 또는 최대 50 ppm, 또는 최대 40 ppm, 또는 최대 30 ppm, 또는 최대 20 ppm, 또는 최대 10 ppm 또는 최대 5 ppm 또는 최대 1 ppm이다.
전형적인 세포 배양 상청액은 상당한 양의 단백질 오염물질(특히 단백질 S)을 가질 수 있으므로, (예를 들면 정제되지 않은) 세포 배양 상청액 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 전형적으로 적어도 500 ppm, 예를 들면 적어도 750 ppm, 또는 적어도 1000 ppm, 또는 적어도 2000 ppm; 또는 (예를 들면 정제되지 않은) 세포 배양 상청액 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 적어도 500 ppm, 예를 들면 적어도 750 ppm, 또는 적어도 1000 ppm, 또는 적어도 2000 ppm이다.
따라서, 상기의 한 양태는 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물에서 하나 이상의 단백질 S 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 적어도 (i) 조성물을 단백질 S 오염물질(들) 및/또는 인자 VII 폴리펩티드와 결합할 수 있는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 인자 VII 폴리펩티드에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 S 오염물질(들)의 수준이 적어도 2의 인자, 예를 들면 적어도 5의 인자로 감소된, 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 결과의 조성물을 수집하는 단계를 포함한다.
본원에 유용한 고체상 물질은 전형적으로 크로마토그래피 및 친화도 포획 방법과 과정 및 그것의 특정 변이체에 사용되는 것들이다.
상기의 한 주된 변이체에서, 고체상 물질은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 비해서 단백질 오염물질의 상대적으로 더 높은 양에 결합한다. 한 양태에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 고체상에 결합하지 않고 단백질 오염물질이 고체상에 결합하는 동안 크로마토그래피 칼럼을 통하여 흘러나와 단백질 오염물질로부터 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 분리한다. 특히, 고체상 물질은 예를 들면 상기 오염물질(들)의 강한 치환도 또는 공유결합에 의하여, 예를 들면 상기 오염물질(들)의 티올 부분에 이황화 결합의 형성에 의하여 특이적으로 오염물질 중 적어도 하나에 결합한다.
한 구체예에서, 고체상 물질은 이온 교환 수지, 예를 들면 음이온 교환 수지이다. 보통 사용되는 음이온 교환 수지는 Q-수지, 4차 아민, 및 DEAE 수지, 디에틸아미노에탄을 포함한다. 음이온 교환 수지, 예를 들면 Mono Q (Amersham Biosciences), Source 15Q 또는 3OQ (Amersham Biosciences), Poros 20HQ 또는 50HQ (Perseptive Biosystems), Toyopearl Q650S (Toso Haas) 등은 상업적으로 구입가능하다.
음이온 교환 수지로부터의 용리는 용리 완충액의 전도도를 증가시킴으로써, 예를 들면 용리 완충액 중의 염의 농도를 증가시킴으로써, 또는 용리 완충액의 pH를 감소시킴으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 한 특정 구체예에서, 용리는 CaCl2의 농도를 증가시킴으로써 수행된다. 다른 특정 구체예에서, 용리는 MgCl2의 농도를 증가시킴으로써 수행된다. 용리는 단계적으로 또는 구배 용리를 사용함으로써 수행될 수 있다.
가장 널리 사용되는 양이온 교환 수지는 카르복시메틸(CM) 또는 술포프로필(SP)기를 함유한다. 이러한 양이온 교환기의 예는, 한정하는 것은 아니지만, Toyopearl CM-650 또는 Toyopearl SP-650 (Toso Haas), Source 15 S 또는 30 S, CM 또는 SP Sepharos 고속 유속 (Amersham Biosciences) Obelix (Amersham Biosciences)를 포함한다.
다른 구체예에서, 고체상 물질은 에틸-, 부틸-, 페닐 또는 헥실- 기와 같은 소수성 리간드로 치환된 기질이다. 이 유형의 크로마토그래피는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)라고 언급되며 단백질의 소수성 특성을 이용한다. 흡수는 단백질 상의 비극성 영역과 고체상의 고정된 소수성 리간드 간의 소수성 상호작용에 의하여 촉진된다. 흡수는 수성 이동상 중의 높은 염 농도에서 이루어지고, 용리는 염 농도를 감소시킴으로써 촉진된다. 한 특정 구체예에서, 물질은 부틸 또는 페닐 리간드로 치환된 기질이다.
본 발명의 다른 양태에서, 고체상 물질은 친화도 리간드를 운반한다. 한 구체예에서, 고체상 물질은 단백질 오염물질(들) 중 적어도 하나, 특히 단백질 S에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반한다. 이것은 "실험"편에서 설명된다. 다른 양태에서, 고체상 물질은 고정된 트리아진 리간드, 예를 들면 그 내용이 본원에 전부 참고문헌으로 포함되는 WO 97/10887 (예를 들면 5 페이지 21번째 줄부터 13 페이지 6번째 줄까지에 설명된 트리아잔 리간드) 또는 US 6,117,996 (예를 들면 문단 4-21)에 설명된 트리아잔 리간드를 운반한다.
단백질 S는 C4bp가 없거나 C4bP와 복합체를 이루는 혈장에서 순환한다. B 사슬은 단백질 S의 상호작용 부위를 함유한다. 따라서, 본 발명은 B 사슬을 함유한 C4bp 종을 사용하는 것이 중요하다. 본 발명의 한 구체예에서, 전체 C4bp 분자는 고체 기질에 고정하기 위하여 사용된다. 다른 구체예에서, B-사슬 또는 단백질 S와 결합할 수 있는 B 사슬의 서열은 고체 기질에 고정하기 위하여 사용된다.
다른 변이체에서, 고체상 물질은 고정된 단백질 C을 운반한다. 다른 변이체에서, 고체상 물질은 고정된 트리아진 리간드를 운반한다. 다른 변이체에서, 고체상 물질은 C4 결합 단백질을 운반한다. 단백질 S는 다른 비타민 K-의존성 단백질보다 큰 친화도를 가진 단백질 C 및 C4bp와 결합한다. 따라서, 단백질 S를 고정된 단백질 C 또는 C4bp에 결합시킴으로써 단백질 S의 양을 감소시키는 것이 가능하다. 대안적으로, 단백질 S에 대한 결합에 관여하는 단백질 C 및 C4bp의 선택된 서열은 고체상에 고정하기 위하여 사용될 수 있다.
C4b-결합 단백질(C4bp)은 보체계의 조절에 관여한다. 그것은 7개의 동일한 알파 사슬 및 단일 베타 사슬을 포함한 멀티머 단백질이다. 알파와 베타 사슬은 각각 분자량 70 kD와 45 kD을 가진다. 두 하위단위체는 주로 길이가 연쇄적으로 배열된 짧은 일치 반복(SCR) 60 아미노산 잔기로 구성된 단백질의 상과에 속한다.
다른 구체예에서, 고체상 물질은 공유 포획에 의하여 오염물질 중 적어도 하나에 결합한다. 단백질 S는 하나의 자유 시스테인 부분을 가지지만, 인자 VII는 아무 것도 가지지 않는다. 그 다음 자유 시스테인 부분은 혼합된 이황화물의 형성으로 이황화티올 교환에 의하여 활성화된 티올화된 물질 또는 기질에 선택적으로 부착될 수 있다. 이 결과 예를 들면 공유 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 또는 맴브레인 과정에 의하여 단백질 S를 감소시키는 것이 가능해야 한다. 이 구체예의 변이체는 고체상 물질이 관여하지 않는, 즉 이황화 형성(예를 들면, 다이머의 형성)이 다른 수단, 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피 또는 맴브레인 과정에 의하여 관심있는 비타민 K-의존성 단백질로부터 단백질 오염물질을 분리할 수 있게 하는 것으로 이해되어야 한다.
한 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 세포 배양 상청액의 성분이다. "실험"편 참조.
상기에 더 설명한 방법의 다른 구체예에서, 고체상 물질은 단백질 오염물질(들)에 비해서 상대적으로 더 높은 양의 관심있는 비타민 K-의존성 단백질과 결합한다. 더 구체적으로, 고체상 물질은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질과 특이적으로 결합한다.
한 변이체에서, 고체상 물질은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질 또는 그것의 유도체에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반한다.
다른 변이체에서, 고체상 물질은 상기 관심있는 비타민 K-의존성 단백질의 억제제, 예를 들면 벤즈아미딘- 또는 구아니딘-형 억제제, 예를 들면 -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프를 포함한 것들을 운반하며, 여기서
Z1과 Z2는 각각 -O-, -S-, -NRH- 및 단일 결합으로 구성된 군 중에서 선택되고, RH는 수소, C1 -4-알킬, 아릴 및 아릴메틸로 구성된 군 중에서 선택되며, R1과 R2는 각각 수소, 선택적으로 치환된 C1 -6-알킬, 선택적으로 치환된 C2 -6-알케닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴로 구성된 군 중에서 선택되고, 또는
Z2와 R2는 상기에서 정의한 바와 같고 -C=N-Z1-R1는 헤테로사이클릭 환의 부분을 형성하고, 또는
Z1과 R1는 상기에 정의된 바와 같고 -C-NH-Z2-R2는 헤테로사이클릭 환의 부분을 형성하고, 또는
-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2는 -Z1R1R2Z2-가 이가라디칼인 헤테로사이클릭 환을 형성한다.
또 다른 변이체에서, 고체상 물질은 상기 관심있는 비타민 K-의존성 단백질과 킬레이트결합할 수 있는 금속(그 다음 용리는 pH 변화 또는 완충액 유사 이미다졸로 수행될 수 있다)을 운반하거나, 고정된 조직 인자(트로보플라스틴) (이 경우에, 인자 VII 폴리펩티드는 단백질 오염물질 유사 단백질 S 보다 더 큰 친화도로 조직 인자에 결합하며, 이러한 이유로 예를 들면 인자 VII 폴리펩티드를 고정된 조직 인자에 결합시킴으로써 예를 들면 단백질 S의 양을 감소시키는 것이 가능할 것이다(또한 US 6,573,056 참조)), 고정된 헤파린을 운반하거나("실험"편 참조), 포스파티딜세린을 운반한다(포스파티딜세린은 칼슘의 부재시에만 단백질 유사 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 Gla-도메인의 Gla-도메인에 결합하고, 칼슘의 존재시에 포스파티딜세린은 EGF-도메인에 결합한다(인자 VII는 2 EGF-루프를 가지고, 단백질 S는 4 EGF-루프를 가진다), 따라서, 특히 칼슘의 존재시에 포스파티딜세린의 상이한 치환도 때문에 인자 VII와 단백질 오염물질 유사 단백질 S를 분리하는 것이 가능할 것이다).
다른 구체예에서, 고체상 물질은 수산화인회석이다.
상기에 더 설명된 방법의 다른 구체예에서, 고체상 물질은 크로마토그래피 물질이다. 적합한 고체상 물질의 예는 예를 들면 음이온 교환 물질, 양이온 교환 물질, 수산화인회석, 소수성 고체상 물질 등에서 선택된 것들이다. "실험"편 참조.
본 발명의 다양한 특정 양태는 하기에 설명될 것이다.
단백질 오염물질의 모노클로날 항체를 사용하는 면역친화도
본 발명의 이 양태에 따라서, 단백질 오염물질(들) 중 적어도 하나는 모노클로날 항체를 운반하는 고체상에 의하여 결합된다. 따라서, 조성물은 상기 고체상 물질과 단순하게 접촉될 수 있으며, 이어서 적어도 덜 오염된 조성물을 얻기 위하여 고체상으로부터 분리될 수 있다.
모노클로날 항체를 고체상 물질에 결합시키는 것은 고체상 물질에 있는 반응기를 통하여 수행될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 기질은 브롬화시아노겐(CnBr) 또는 N-히드록시-숙신이미드(NHS) 활성화된 지지체이다(Wilchek M. et al., Reactive & Functional Polymers. 1999, 41,263-268). CNBr- 및 NHS 활성화된 지지체에 관해서는, 결합은 CNBr-기와의 이소우리아-결합 및 NHS-기와의 아미드-결합을 유도하는 항체 중의 1차 아미노기를 통하여 발생한다.
항체 용액을 적합한 결합 완충액, 예를 들면 0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl pH 8.3에 용해하거나 투석하며, 1차 아미노기를 가진 완충액은 사용될 수 없다. 결합 pH는 항체 및 활성화된 지지체에 의존하며 보통 pH 6-9가 사용될 수 있다. 활성화된 지지체의 안정성을 보존하기 위하여 사용 전에 얼음 냉각된 1 mM HCl의 10-15 배지 부피로 세척된다. 세척된 지지체를 항체 용액에 옮긴 후 즉시, 부드럽게 혼합하고 원하는 pH 수준으로 조절한다. 결합 혼합물을 실온에서 몇 시간 또는 4℃에서 밤새 부드럽게 회전시키면서 놔둔다. 결합이 완료된 후, 지지체에 있는 어떤 반응하지 않은 그룹을 실온에서 몇 시간 동안 예를 들면 트리스, 에탄올 아민 또는 글리신 완충액 pH 8-9에 정치시킴으로써 차단한다. 차단 후, 지지체를 예를 들면 차단 완충액 및 아세테이트 완충액 pH 3-4로 높은 pH와 낮은 pH를 변화시키는 방법을 사용하여 세척한다.
한 특정 구체예는 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 첫 번째 조성물(예를 들면 세포 배양 상청액)에 하나 이상의 단백질 오염물질의 양을 감소시키는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 (i) 첫 번째(예를 들면 정제되지 않은) 조성물을 단백질 오염물질(들)의 적어도 하나에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 고체상 물질과 접촉하는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 5의 인자로 감소된 조성물을 얻기 위하여 결과의 두 번째 조성물을 상기 고체상 물질로부터 분리하는 단계를 포함한다.
따라서, 즉, 어떤 선행하는 정제 단계 없이 직접 세포 배양 상청액을 사용하는 것이 매우 바람직한 것으로 확인되었다. 이것은 더 복잡한 단백질 오염물질의 혼합물이 발생하는 본 발명의 사용 전에 세포 배양 상청액이 가공되면 단백질 오염물질(들)이 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 의하여 적어도 부분적으로 분열될 수 있다는 사실에 기인할 수 있다. 따라서, 이러한 복잡한 혼합물이 존재할 때 단백질 오염물질의 양을 감소시키는 것이 보다 더 어려울 수 있다.
본 발명은 또한 동일한 단계가 적용되지만, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 액체 조성물이 세포 배양물에서 직접 얻은 세포 배양 상청액의 성분일 필요는 없는 대안적 방법을 제공하는 것으로 이해되어야 한다.
단백질 오염물질(들)은 전형적으로 숙주 세포 단백질이고, 따라서 모노클로날 항체는 전형적으로 숙주세포 단백질, 예를 들면 Gla-도메인-함유 단백질 오염물질 중에서 선택된 단백질 오염물질, 특히 GAS-6, 단백질 S, 인자 II (프로트롬빈), 인자 X/Xa, 인자 IX/IXa, 단백질 C, 인자 VIIa, 단백질 Z, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 1, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 2, 막관통 감마 카르복시글루탐산 단백질 3, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 4, 기질 Gla 단백질, 및 오스테오클라신, 더 특히 단백질 S 중에서 선택된 단백질 오염물질에 대하여 유도된다.
상기에 언급한 바와 같이, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 전형적으로 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C 중에서 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자이다. 한 다른 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드. 또 다른 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드이다.
한 구체예에서, 단백질 오염물질의 주된 양은 Gla-도메인 함유 폴리펩티드, 특히 단백질 S이고, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드이다.
상기 방법은 적어도 10의 인자, 또는 적어도 25의 인자, 또는 적어도 50의 인자, 예를 들면 적어도 100의 인자, 또는 적어도 250의 인자, 또는 적어도 500의 인자, 또는 적어도 750의 인자, 또는 적어도 1000의 인자, 또는 적어도 2000의 인자로 감소된 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준을 생성하는 것이 가능할 수 있도록 한다.
특히, 두 번째(정제된) 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm, 예를 들면 최대 90 ppm, or 최대 80 ppm, 또는 최대 70 ppm, 또는 최대 60 ppm, 또는 최대 50 ppm, 또는 최대 40 ppm, 또는 최대 30 ppm, 또는 최대 20 ppm, 또는 최대 10 ppm 또는 최대 5 ppm이거나; 두 번째(정제된) 조성물 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm, 예를 들면 최대 90 ppm, 또는 최대 80 ppm, 또는 최대 70 ppm, 또는 최대 60 ppm, 또는 최대 50 ppm, 또는 최대 40 ppm, 또는 최대 30 ppm, 또는 최대 20 ppm, 또는 최대 10 ppm 또는 최대 5 ppm이다.
전형적인 세포 배양 상청액은 상당한 양의 단백질 오염물질 (특히 단백질 S)을 가질 수 있으므로, 세포 배양 상청액 (예를 들면 정제되지 않은 세포 배양 상청액) 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 전형적으로 적어도 500 ppm, 예를 들면 적어도 750 ppm, 또는 적어도 1000 ppm, 또는 적어도 2000 ppm이거나; 또는 정제되지 않은 세포 배양 상청액 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 적어도 500 ppm, 예를 들면 적어도 750 ppm, 또는 적어도 1000 ppm, 또는 적어도 2000 ppm이다.
본 발명의 이 양태의 특정 구체예는 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 세포 배양 상청액에서 단백질 S 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) 첫 번째 조성물, 예를 들면 세포 배양 상청액을 단백질 S 오염물질(들)에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 인자 VII 폴리펩티드에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 S 오염물질(들)의 수준이 적어도 50의 인자로 감소된 조성물을 얻기 위하여 결과의 두 번째 조성물을 상기 고체상 물질로부터 분리하는 단계를 포함한다.
고정된 단백질 C
본 발명의 양태에 따라서, 단백질 오염물질(들)의 적어도 하나는 고정된 단백질 C를 운반하는 고체상 물질에 의하여 결합된다. 따라서, 조성물은 상기 고체상 물질과 간단히 접촉될 수 있고 이어서 적어도 덜 오염된 조성물을 얻기 위하여 고체상 물질로부터 분리될 수 있다.
더 구체적으로, 본 발명은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물에 단백질 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 (i) 첫 번째 조성물을 고정된 단백질 C를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 5의 인자로 감소된 조성물을 얻기 위하여 결과의 두 번째 조성물을 상기 고체상 물질로부터 분리하는 단계를 포함하고, 예를 들면 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물에 단백질 S의 양을 감소시키기 위한 방법은 (i) 첫 번째 조성물을 고정된 단백질 C를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 10의 인자로 감소된 조성물을 얻기 위하여 결과의 두 번째 조성물을 상기 고체상 물질로부터 분리하는 단계를 포함한다.
단백질 오염물질(들)의 양을 감소시키기 위한 상기 방법은 단독으로 또는 조합하여, 예를 들면 조합하여 사용될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 각각의 크로마토그래피 단계는 어떤 적합한 순서로 수행될 수 있다. 예비적 연구에 기초하여, 다음 조합은 단백질 오염물질(들)의 탁월한 전체적 감소를 제공한다고 생각된다:
Figure pat00004
양이온 교환 크로마토그래피 → 단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 -> 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00005
양이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00006
양이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00007
음이온 교환 크로마토그래피 → 관심있는 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 오염물질 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 음이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피
Figure pat00008
음이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 양이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00009
음이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 양이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00010
음이온 교환 크로마토그래피 → 관심있는 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 음이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피
Figure pat00011
양이온 교환 크로마토그래피 → 수산화인회석 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00012
양이온 교환 크로마토그래피 → 수산화인회석 → 단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00013
관심있는 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 음이온 교환 크로마토그래피 → 단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00014
관심있는 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 음이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00015
수산화인회석 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 양이온 교환 크로마토그래피 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00016
수산화인회석 → 단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 양이온 교환 크로마토그래피 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00017
단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00018
단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 겔여과 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00019
단백질 오염물질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 양이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 음이온 교환 크로마토그래피
Figure pat00020
관심있는 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도 → 음이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 양이온 교환 크로마토그래피
특정 구체예에서, 관심있는 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도는 정제 과정의 첫 번째 단계로 사용된다. 따라서, 즉 어떤 선행하는 정제 단계없이 세포 배양 상청액을 사용하는 것이 매우 이로운 것으로 확인된다. 단백질 오염물질(들)의 감소는 전형적으로 전술한 다단계 방법의 각각의 단계에서 적어도 2의 인자, 예를 들면 적어도 5의 인자인 것으로 이해해야 한다.
관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 신규 조성물
본 발명의 방법은 비타민 K-의존성 단백질의 조성물, 특히 그 자체가 신규한 인자 VII 폴리펩티드를 발생시키는 것으로 생각된다.
그러므로, 본 발명의 다른 양태는 단백질 오염물질의 전체 양이 관심있는 비타민 K-의존성 단백질의 양에 기초하여 최대 100 ppm인, 세포 배양 조건 하에서 생성된 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물에 관한 것이다. 그것의 대부분의 구체예에서, 단백질 오염물질의 양은 0.01-100 ppm, 예를 들면 0.01-50 ppm, 예를 들면 0.05-25 ppm, 또는 0.05-20 ppm, 또는 0.05-15 ppm, 또는 0.05-10 ppm, 또는 0.05-5 ppm의 범위이다.
본 발명의 대안적 양태는 단백질 S 오염물질의 전체 양이 인자 VII 폴리펩티드의 양에 기초하여 최대 100 ppm인, 무-혈청, 비-사람 세포 배양에서 얻은 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물에 관한 것이다. 그것의 대부분의 구체예에서, 단백질 오염물질의 양은 0.01-100 ppm, 예를 들면 0.01-50 ppm, 예를 들면 0.05-25 ppm, 또는 0.05-20 ppm, 또는 0.05-15 ppm, 또는 0.05-10 ppm, 또는 0.05-5 ppm의 범위이다.
상기의 양태에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 전형적으로 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C 중에서 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자이다. 한 다른 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드이다. 또 다른 특정 구체예에서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드이다.
상기의 다른 특정 구체예는 단백질 S 오염물질의 전체 양이 인자 VII 폴리펩티드의 양에 기초하여 최대 100 ppm인, 세포 배양 조건 하에서 생성된 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 하기 구체예에 의하여 더 설명된다:
1. 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물에 하나 이상의 단백질 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 (i) 첫 번째 조성물을 하나 이상의 단백질 오염물질 및/또는 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 결합할 수 있는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함하는 결과의 두 번째 조성물을 수집하는 단계를 포함하고, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준은 상기 첫 번째 조성물로부터 상기 결과의 두 번째 조성물까지 적어도 2, 예를 들면 적어도 5, 예를 들면 적어도 10, 예를 들면 적어도 20, 예를 들면 적어도 50, 예를 들면 적어도 100의 인자로 감소된 방법.
2. 구체예에 1에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 결과의 두 번째 조성물에 단백질 오염물질의 전체 양이 최대 100 ppm인 방법.
3. 구체예 1 내지 2 중 어느 하나에 따르는 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C 중에서 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자인 방법.
4. 구체예 1 내지 3에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드인 방법.
5. 구체예 1 내지 3에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드, 예를 들면 야생형 사람 인자 VIIa인 방법.
6. 구체예 5에 따른 방법으로서, 인자 VII 폴리펩티드는 P1OQ와 K32E 중에서 선택된 아미노산 치환을 포함하는 방법.
7. 구체예 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 단백질 오염물질의 주된 양은 Gla-도메인 함유 폴리펩티드, 특히 단백질 S이고, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 방법.
8. 구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 10의 인자, 또는 적어도 25의 인자, 또는 적어도 50의 인자, 예를 들면 적어도 100의 인자, 또는 적어도 250의 인자, 또는 적어도 500의 인자, 또는 적어도 750의 인자, 또는 적어도 1000의 인자, 또는 적어도 2000의 인자, 또는 적어도 5000의 인자로 감소된 방법.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 결과의 두 번째 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm, 예를 들면 최대 50 ppm, 예를 들면 최대 10 ppm, 예를 들면 최대 5 ppm, 예를 들면 최대 2 ppm, 예를 들면 최대 1 ppm인 방법.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 첫 번째 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 적어도 500 ppm인 방법.
11. 구체예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 첫 번째 조성물 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 적어도 500 ppm인 방법.
12. 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물 중에 하나 이상의 단백질 S 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 적어도 (i) 첫 번째 조성물을 단백질 S 오염물질(들) 및/또는 인자 VII 폴리펩티드와 결합할 수 있는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 결과의 두 번째 조성물을 수집하는 단계를 포함하고, 인자 VII 폴리펩티드에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 S 오염물질(들)의 수준은 적어도 2, 예를 들면 5의 인자로 감소된 방법.
13. 구체예 1 내지 11 및 12 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 비해서 상대적으로 더 높은 양의 단백질 오염물질과 결합하는 방법.
14. 구체예 13에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 예를 들면 강한 친화도에 의하여 또는 상기 오염물질(들)의 공유결합에 의하여, 예를 들면 상기 오염물질(들)의 티올 부분에 이황화 결합의 형성에 의하여 오염물질의 적어도 하나와 특이적으로 결합하는 방법.
15. 구체예 13과 14 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 단백질 오염물질(들) 중 적어도 하나에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 방법.
16. 구체예 15에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물은 세포 배양 상청액의 성분인 방법.
17. 구체예 14에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 고정된 단백질 C를 운반하는 방법.
18. 구체예 1 내지 11 및 12 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 단백질 오염물질(들)에 비해서 상대적으로 더 높은 양의 관심있는 비타민 K-의존성 단백질과 결합하는 방법.
19. 구체예 18에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질과 특이적으로 결합하는 방법.
20. 구체예 18과 19 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질 또는 그것의 유도체에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 방법.
21. 구체예 18과 19 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질 또는 그것의 유도체에 대한 친화도를 가진 트리아진 리간드인 방법.
22. 구체예 18과 19 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 상기 관심있는 비타민 K-의존성 단백질의 억제제를 운반하거나, 상기 관심있는 비타민 K-의존성 단백질과 킬레이트결합할 수 있는 금속을 운반하거나, 고정된 조직 인자(트롬보플라스틴)을 운반하거나, 고정된 헤파린을 운반하는 방법.
23. 구체예 22에 따른 방법으로서, 상기 관심있는 비타민 K-의존성 단백질의 억제제는 벤즈아미딘- 또는 구아니딘-형 억제제, 예를 들면 -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프를 포함한 것들이며, 여기서
Z1 및 Z2은 각각 -O-, -S-, -NRH- 및 단일결합으로 구성된 군 중에서 선택되고, RH는 수소, C1 -4-알킬, 아릴 및 아릴메틸로 구성된 군 중에서 선택되며, R1 및 R2는 각각 수소, 선택적으로 치환된 C1 -6-알킬, 선택적으로 치환된 C2 -6-알케닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴로 구성된 군 중에서 선택되거나,
Z2 및 R2는 상기에 정의된 바와 같고 -C=N-Z1-R1는 헤테로사이클릭 환의 부분을 형성하거나,
Z1 및 R1은 상기에 정의된 바와 같고, -C-NH-Z2-R2는 헤테로사이클릭 환의 부분을 형성하거나,
-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2는 -Z1-R1-R2-Z2-이 이가라디칼인 헤테로사이클릭 환을 형성하는 방법.
24. 구체예 1 내지 11 및 12 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 구체예 1 내지 11 및 12 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 멤브레인에 결합하는 방법.
26. 구체예 22 내지 23에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 음이온 교환 물질인 방법.
27. 구체예 26에 따른 방법으로서, 음이온 교환으로부터의 용리는 CaCl2와 같은 칼슘염의 농도를 증가시킴으로써 수행되는 방법.
28. 구체예 26에 따른 방법으로서, 음이온 교환으로부터의 용리는 MgCl2와 같은 마그네슘염의 농도를 증가시킴으로써 수행되는 방법.
29. 구체예 24에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 양이온 교환 물질인 방법.
30. 구체예 24에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 수산화인회석인 방법.
31. 구체예 24에 따른 방법으로서, 고체상 물질은 소수성 고체상 물질인 방법.
32. 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물(특히 세포 배양 상청액) 중의 하나 이상의 단백질 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, (i) 첫 번째 조성물을 단백질 오염물질(들) 중 적어도 하나에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 5의 인자로 감소된, 조성물을 얻기 위하여 상기 고체상 물질로부터 결과의 두 번째 조성물을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
33. 구체예 32에 따른 방법으로서, 모노클로날 항체는 숙주세포 단백질, 예를 들면 Gla-도메인-함유 단백질 오염물질 중에서 선택된 단백질 오염물질, 특히 GAS-6, 단백질 S, 인자 II (프로트롬빈), 트롬빈, 인자 X/Xa, 인자 IX/IXa, 단백질 C, 인자 VII/VIIa, 단백질 Z, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 1, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 2, 막관통 감마 카르복시글루탐산 단백질 3, 막관통 감마-카르복시글루탐산 단백질 4, 기질 Gla 단백질, 및 오스테오클라신 중에서 선택된 단백질 오염물질, 더 특히 단백질 S에 대하여 유도된 방법.
34. 구체예 27과 28 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C 중에서 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자인 방법.
35. 구체예 29에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드인 방법.
36. 구체예 29에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 방법.
37. 구체예 32 내지 36 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 주된 양의 단백질 오염물질은 Gla-도메인 함유 폴리펩티드, 특히 단백질 S이고, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 방법.
38. 구체예 32 내지 37 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 주된 양의 단백질 오염물질은 햄스터 단백질 S인 방법.
39. 구체예 32 내지 38 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준은 적어도 10의 인자, 또는 적어도 25의 인자, 또는 적어도 50의 인자, 예를 들면 적어도 100의 인자, 또는 적어도 250의 인자, 또는 적어도 500의 인자, 또는 적어도 750의 인자, 또는 적어도 1000의 인자, 또는 적어도 2000의 인자로 감소된 방법.
40. 구체예 32 내지 39 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 결과의 두 번째 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm인 방법.
41. 구체예 32 내지 40 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 결과의 두 번째 조성물 중 단백질 S 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm인 방법.
42. 구체예 32 내지 41 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 첫 번째 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 적어도 500 ppm인 방법.
43. 구체예 32 내지 42 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 첫 번째 조성물 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 적어도 500 ppm인 방법.
44. 조성물, 예를 들면 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 세포 배양 상청액 중의 단백질 S 오염물질을 감소시키기 위한 방법으로서, (i) 첫 번째 조성물, 예를 들면 세포 배양 상청액을 단백질 S 오염물질(들)에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 인자 VII 폴리펩티드에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 S 오염물질(들)의 수준이 적어도 50의 인자로 감소된, 조성물을 얻기 위하여 상기 고체상 물질로부터 결과의 두 번째 조성물을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
45. 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물 중의 단백질 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, (i) 첫 번째 조성물을 고정된 단백질 C를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 5의 인자로 감소된, 조성물을 얻기 위하여 상기 고체상 물질로부터 결과의 두 번째 조성물을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
46. 구체예 45에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C 중에서 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자인 방법.
47. 구체예 46에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드인 방법.
48. 구체예 46에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 방법.
49. 구체예 45 내지 48 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 주된 양의 단백질 오염물질은 Gla-도메인 함유 폴리펩티드, 특히 단백질 S이고, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 방법.
50. 구체예 45 내지 49 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준은 적어도 10의 인자, 또는 적어도 25의 인자, 또는 적어도 50의 인자, 예를 들면 적어도 100의 인자, 또는 적어도 250의 인자, 또는 적어도 500의 인자, 또는 적어도 750의 인자, 또는 적어도 1000의 인자, 또는 적어도 2000의 인자로 감소된 방법.
51. 구체예 45 내지 50 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 결과의 두 번째 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm인 방법.
52. 구체예 45 내지 51 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 결과의 두 번째 조성물 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm인 방법.
53. 구체예 45 내지 52 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 결과의 두 번째 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 최대 500 ppm인 방법.
54. 구체예 45 내지 53 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 결과의 두 번째 조성물 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 최대 500 ppm인 방법.
55. 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물 중의 단백질 S의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, (i) 첫 번째 조성물을 고정된 단백질 C를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 10의 인자로 감소된, 조성물을 얻기 위하여 상기 고체상 물질로부터 결과의 두 번째 조성물을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
56. 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 세포 배양 상청액 중의 하나 이상의 단백질 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, (i) 세포 배양 상청액을 관심있는 비타민 K-의존성 단백질 또는 그것의 유사체에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준이 적어도 5의 인자로 감소된, 조성물을 얻기 위하여 상기 고체상 물질로부터 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 용리하는 단계를 포함하는 방법.
57. 구체예 56에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C 중에서 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자인 방법.
58. 구체예 57에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드인 방법.
59. 구체예 57에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 방법.
60. 구체예 56 내지 59 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 주된 양의 단백질 오염물질은 Gla-도메인 함유 폴리펩티드, 특히 단백질 S이고, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 방법.
61. 구체예 56 내지 60 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질(들)의 수준은 적어도 10의 인자, 또는 적어도 25의 인자, 또는 적어도 50의 인자, 예를 들면 적어도 100의 인자, 또는 적어도 250의 인자, 또는 적어도 500의 인자, 또는 적어도 750의 인자, 또는 적어도 1000의 인자, 또는 적어도 2000의 인자로 감소된 방법.
62. 구체예 56 내지 61 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 결과의 조성물 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm인 방법.
63. 구체예 56 내지 62 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 결과의 조성물 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 최대 100 ppm인 방법.
64. 구체예 56 내지 63 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 세포 배양 상청액 중의 단백질 오염물질의 전체 양은 적어도 500 ppm인 방법.
65. 구체예 56 내지 64 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 세포 배양 상청액 중의 단백질 S 오염물질의 전체 양은 적어도 500 ppm인 방법.
66. 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 세포 배양 상청액 중의 단백질 오염물질의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, (i) 세포 배양 상청액을 인자 VII 폴리펩티드 또는 그것의 유사체에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, (ii) 선택적으로 상기 고체상 물질을 세척하는 단계, 및 (iii) 인자 VII 폴리펩티드에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 오염물질의 수준이 적어도 100의 인자로 감소된 결과의 조성물을 얻기 위하여 상기 고체상 물질로부터 인자 VII 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법.
67. 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 세포 배양 상청액 중의 단백질 S의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, (i) 세포 배양 상청액을 인자 VII 폴리펩티드 또는 그것의 유사체에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 운반하는 고체상 물질과 접촉시키는 단계, (ii) 선택적으로 상기 고체상 물질을 세척하는 단계, 및 (iii) 인자 VII 폴리펩티드에 관하여 ppm으로 나타낸 단백질 S의 수준이 적어도 100의 인자로 감소된 결과의 조성물을 얻기 위하여 상기 고체상 물질로부터 인자 VII 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법.
68. 세포 배양 조건 하에서 생성된 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물로서, 단백질 오염물질의 전체 양은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질의 양에 기초하여 최대 100 ppm인 조성물.
69. 구체예 68에 따른 조성물로서, 단백질 오염물질의 조성물은 0.01-100 ppm, 예를 들면 0.01-50 ppm, 적어도 0.05-25 ppm, 또는 0.05-20 ppm, 또는 0.05-15 ppm, 또는 0.05-10 ppm, 또는 0.05-5 ppm의 범위인 조성물.
70. 무-혈청, 비-사람 세포 배양에서 얻은 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물로서, 단백질 S 오염물질의 전체 양은 인자 VII 폴리펩티드의 양에 기초하여 최대 100 ppm인 조성물.
71. 무-혈청, 비-사람 세포 배양에서 얻은, 인자 IX 폴리펩티드를 포함한 조성물로서, 단백질 S 오염물질의 최대 양은 인자 IX 폴리펩티드의 양에 기초하여 최대 100 ppm인 조성물.
72. 구체예 67 내지 71 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 단백질 S 오염물질은 0.01-100 ppm, 예를 들면 0.01-50 ppm, 적어도 0.05-25 ppm, 또는 0.05-20 ppm, 또는 0.05-15 ppm, 또는 0.05-10 ppm, 또는 0.05-5 ppm의 범위인 조성물.
73. 구체예 67 내지 72 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드, 인자 IX 폴리펩티드, 인자 X 폴리펩티드 및 활성화된 단백질 C 중에서 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자인 조성물.
74. 구체예 73에 따른 조성물로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드인 조성물.
75. 구체예 73에 따른 조성물로서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 조성물.
76. 세포 배양 조건 하에서 생성된 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물로서, 단백질 S 오염물질의 전체 양은 인자 VII 폴리펩티드의 양에 기초하여 최대 100 ppm, 예를 들면 0.01-100 ppm의 범위인 조성물.
실험
모노클로날 항 햄스터 단백질 S 항체
SF-인자 VIIa 제품으로부터 분리된 햄스터 단백질 S 풀로 면역화된 RBF 마우스를 사용하고, RBF 비장세포에 대한 융합 파트너로서 FoxNy 골수종 세포를 포함하는 융합 기술을 이용하여 이들 항체를 발생시켰다. 상기 모노클로날 항체는 트롬빈 절단 부위 밖에 있는 것뿐만 아니라 C4BP 결합 영역 밖에 있는 어떤 에피토프를 인식한다.
Ca2+ 독립적 모노클로날 항 햄스터 단백질 S 항체는 CHO 세포로부터 생산된 어떤 약물에서 햄스터 단백질 S 오염을 검출하는데 사용된다. 더욱이, CHO 세포에 의해 생산된 약물 제품으로부터 햄스터 단백질 S를 분리하고 정제하는데는 Ca2+ 의존성 모노클로날 항 햄스터 단백질 S 항체가 사용되며, 특히 비타민 K-의존성 단백질 조성물에서 단백질 S의 함량을 줄이는데(예를 들어 제거하는데) 사용된다.
RBF 마우스를 SF-인자 VIIa 제품(뱃치 HW3-029 풀, 인자 VIIa <1% 함유)으로부터 분리된 햄스터 단백질 S로 면역화했다. 6주 후에 FoxNy 골수종 세포를 이용하여 2개의 융합을 수행했다. 몇 개의 하이브리도마를 분리하여 Ca2+의 농도를 0mM Ca2+ 농도에서부터 35mM Ca2+ 농도까지 변화시키면서 단백질 S에 대한 결합 능력에 대해 시험했다. Ca2+ 독립성에 대해 4개의 모노클로날 항체(ProS-1 F18, ProS-1 F22, ProS-2 F32 및 ProS-2 F46)을 선택했고, IgG1 또는 IgG2a 이소타입 중 어느 하나로 이소타입화했다. Ca2+ 의존 상태에서 햄스터 단백질 S 오염을 측정하기 위해 4개의 Ca2+ 독립적 항체 중 2개(ProS-1 F18 및 ProS F32)를 이용하여 샌드위치 ELISA 분석을 전개시킨 바, 이들 두 항체는 우수한 협동작용을 나타냈다. 4개의 Ca2+ 독립적 모노클로날 항체의 상대적 친화도는 아주 낮았다. 더욱이, 인자 VIIa와의 교차-반응성은 없는 것으로 밝혀졌다. 모노클로날 항체 ProS-1 F22를 사람 단백질 S 검출용 ELISA에서 사용했다. F22는 사람 단백질 S를 전혀 인식하지 못했다. 이것은 다른 모노클로날 항체들의 경우에도 역시 유사할 것이다. 더욱이, 본 출원인은 3개의 Ca2+ 의존성 항체, ProS-2 F15, ProS-2 F35 및 ProS-2 F44도 발생시켰는데, 이들 중 어느 것도 20mM 시트레이트의 존재하에, 즉 Ca2+가 존재하지 않을 때 어떤 단백질 S와도 결합하지 않았다. 이 3개 항체와 단백질 S의 결합 능력은 Ca2+의 농도(2.5mM에서 35mM Ca2+의 범위)에 따라 변했으며, 모두 Ca2+가 존재하지 않을 때와 상당한 차이가 있었다. 추후 통지가 있을 때까지 3개의 항체를 냉동시켰다.
햄스터 단백질 S의 함량 측정, 모노클로날 항체를 사용한 ELISA
2개의 상이한 모노클로날 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA를 이용하여 햄스터 단백질 S의 상대적 함량을 측정한다. 항체는 CHO 세포로부터의 정제된 단백질 S를 사용하여 마우스에서 발생시켰다.
96-웰 Nunc 맥시소브 마이크로타이터 플레이트를 항체 ProS-2-F32로 코팅하는데, 이 항체의 기능은 항원을 잡는 것이다.
코팅 과정은 다음과 같다: 약 5㎍/mL ProS-2-F32(1.93mg/mL의 원액을 0.1M Na2HCO3, pH 9.8로 1:386으로 희석한다)를 함유하는 용액 100㎕를 96-웰 Nunc 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 도포하고, 플레이트 실러를 플레이트 위에 가한 다음, 1 내지 9℃에서 플레이트를 하룻밤 인큐베이션한다.
2일째, 1차 인큐베이션 후에 용액을 버리고 각 웰을 다음과 같이 차단한다: 각 웰에 차단 완충액(식염수 포스페이트 완충액(PBS), 0.010M 포스페이트와 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.2)을 350㎕씩 가하고, 플레이트에 플레이트 실러를 가하고, 실온에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션하는데, 이때 실온은 18 내지 25℃로 정의한다. 차단-인큐베이션 시간이 완료된 후 용액을 버리고, 매번 350㎕의 세척 완충액(0.010M 포스페이트와 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.2)으로 각 웰을 3번 세척한다.
캘리브레이터 및 샘플은 시트레이트를 함유한 트리스 완충액(0.010M 트리스; 0.15M NaCl, 0.050M 시트레이트, 0.1% v/v Tween 20, pH 8.6) 중에 적당히 희석하고, 대조군은 캐리어 단백질을 함유한 트리스 완충액(0.010M 트리스, 0.15M NaCl, 0.1% v/v Tween 20, 1% BSA, pH 8.0) 중에 희석한다. 캘리브레이터, 대조군 및 샘플을 각각 100㎕씩 Nunc 플레이트에 도포하고, 플레이트 실러를 가한 다음, 1 내지 9℃에서 플레이트를 하룻밤 인큐베이션한다.
3일째, 웰을 비우고, 플레이트를 PBS 세척 완충액을 사용하여 상기와 같이 3번 세척한 다음, 비오틴 표지된 항체 ProS-1-F18을 가하여 항원-항체 복합체를 검출한다. 비오틴 표지된 ProS-1-F18 항체 용액을 TBS(0.010M 트리스; 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20, pH 8.6)로 1:1000으로 희석하고, 각 웰에 100㎕씩 가하고, 플레이트 실러를 도포한 다음, 실온에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션한다. 용액을 버리고, PBS 세척 완충액을 350㎕씩 사용하여 상기와 같이 플레이트를 3번 세척한다.
TBS(0.010M 트리스; 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20, pH 8.6) 중에 1:10000으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제 아비딘 D 용액을 100㎕씩 도포하고, 플레이트 실러를 도포한 다음, 실온에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션한다. PBS 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 3번 세척하고, 마지막으로 TMB 기질을 100㎕씩 가한다. 실온의 암실에서 플레이트를 10분간 인큐베이션하고, 2M 인산 100㎕를 가하여 반응을 중단시킨 다음, 기준으로서 620nm를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한다.
햄스터 단백질 S의 함량 측정, 폴리클로날 항체를 사용한 ELISA
폴리클로날 항체에 기초한 샌드위치 ELISA로 햄스터 단백질 S의 함량을 측정했다.
1차 항체를 사용한 코팅: 96-웰 Nunc 맥시소브 마이크로플레이트를 폴리클로날 항체 Rb-α-Hu 단백질 S(Dakocytomation code nr. A0384)로 코팅했다. 단백질 농도가 4.1mg/mL인 항체 용액을 5.0㎍/mL로 코팅 완충액(중탄산염 완충액, pH 9.6; 3.03g Na2CO3; 5.98g NaHCO3; 물 1L까지)으로 희석했다(1:820 희석에 해당함). 블랭크로서 사용할 A1 및 A2 웰을 제외한 각 웰에 100㎕씩 가했다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션했다.
다음날 아침 용액을 버리고 플레이트를 세척 완충액(Tween/PBS)으로 3번(350㎕) 세척했다. 이어서 플레이트(A1 및 A2 웰 제외)를 희석 완충액(BSA/Tween/PBS)을 사용하여 차단했다. 플레이트 실러를 가하고 플레이트를 실온에 1시간 동안 방치하여 차단시킨 다음, 플레이트를 세척 완충액(세척 완충액(PBS/Tween, pH 7.4); 16.0g NaCl; 0.40g KH2PO4; 2.30g Na2HPO4; 0.40g KCl; 1mL Tween 20; 물 2L까지)으로 3번(350㎕) 세척했다.
샘플, 대조군 및 표준물질: 1120㎍/mL 농도의 단백질 S 표준물질을 희석 완충액(희석 완충액(BSA/Tween/PBS): 0.5g 소 혈청 알부민(Sigma, A-7030); 세척 완충액 100mL까지)으로 25ng/mL 농도(1:44800)로 희석했다. 이 표준물질을 희석 완충액으로 2배씩 희석시켜 0.78ng/mL의 최저 표준물질까지 희석했다. 양성 대조군은 사람 단백질 S(American Diagnostica, code 443)로 구성되며, 이것을 희석 완충액으로 2.5ng/mL 농도로 희석했다. 한 쌍의 웰에는 희석 완충액만을 가하여 콘쥬게이트 대조군을 추가했다. 샘플은 희석 완충액으로 1 내지 10ng/mL의 농도가 되도록 희석했으며, 이것은 표준 곡선의 선형 부분에 해당한다. 모든 표준물질, 대조군 및 샘플은 2개씩 플레이트에 배치하고, 플레이트 실러를 가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이션했다.
HRP 콘쥬게이트 2차 항체와의 인큐베이션: 웰을 비우고, 플레이트를 Tween/ PBS 세척 완충액을 사용하여 상기와 같이 3번 세척했다. 희석 완충액으로 Rb-α-사람 단백질 S, HRP(Dakocytomation code nr. P0419)를 1000배 희석했고, A1+A2 웰을 제외한 각 웰에 100㎕씩 가했다. 플레이트를 진동기에 넣고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 세척 완충액으로 3번(350㎕) 세척했다.
검출: 기질 용액 100㎕를 모든 웰에 가했다. 기질 용액은 사용 직전에 초순수 12mL와 5㎕ 30% H2O2 중에 각각 2mg씩의 OPD 타블렛(Dakocytomation code S2045)을 4개 넣어 구성했다. 15분간 반응하도록 둔 다음, 웰 마다 2.5M H2SO4을 50㎕씩 가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트를 마이크로플레이트 리더에서 492nm에서 판독했다.
A. 항-단백질 S 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도
실시예 1
마우스에서 햄스터 단백질 S에 대하여 발생한 모노클로날 항체(MAb)(충진 칼럼 mL 당 0.4mg MAb)가 결합된 Amersham HiTrap NHS 활성화 칼럼(1mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 단백질 S의 감소를 수행한다. 칼럼을 10 CV의 10mM Na2HPO4, 150mM NaCl, pH 7.5로 평형화하고, 1.49mg/mL 인자 VIIa와 300ppm 이상의 단백질 S 함량을 함유하고 전도도가 14mS/cm인 용액을 100 CV를 로딩한 다음(칼슘은 시트레이트와 킬레이트를 만든다), 10 CV의 10mM Na2HPO4, 150mM NaCl, pH 7.5로 세척한다. 전체 단계는 60 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 작업한다. 20mM Na2HPO4, 2M NaCl, pH 7.2를 사용하여 소량의 단백질 S 및 인자 VIIa를 용출시키고(SDS-PAGE/은 염색으로 확인), 이어서 50mM 시트레이트 pH 3.0을 사용하여 결합된 단백질 S를 용리시키고, 인자 VIIa의 작은 분획(로딩 양의 <1%)은 50mM 글리신 pH 2.0을 사용하여 분리시킨다. 칼럼을 10 CV의 Na2HPO4, 150mM NaCl, pH 7.5를 사용하여 재평형화한다. 전체적으로 30ppm 이하의 단백질 S 수준, 즉 10배 이상의 감소가 ELISA에 의해 측정된다.
실시예 2
마우스에서 햄스터 단백질 S에 대하여 발생한 모노클로날 항체(MAb)(충진 칼럼 mL 당 0.4mg MAb)가 결합된 Amersham HiTrap NHS 활성화 칼럼(1mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 단백질 S의 감소를 수행한다. 칼럼을 10 CV의 15mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.5로 평형화하고, 150ppm 이상의 단백질 S 함량을 함유하고 전도도가 12mS/cm인 용액을 108 CV를 로딩한 다음(10mM 칼슘 존재), 10 CV의 15mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.5로 세척한다. 로딩 및 세척은 24 CV/h의 유속으로, 나머지 과정은 60 CV/h 유속으로, 그리고 온도는 5℃에서 수행한다. 칼럼을 15 CV의 50mM 시트레이트 pH 3.0으로 청소한 다음, 10 CV의 15mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.5로 재평형화하고, 마지막으로 12 CV의 15mM 글리신 pH 2.0으로 청소하고, 10 CV의 15mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.5로 재평형화한다. 전체적으로 15ppm 이하의 단백질 S 수준, 즉 10배 이상의 감소가 ELISA에 의해 측정된다.
실시예 3
마우스에서 햄스터 단백질 S에 대해 발생한 모노클로날 항체(MAb)(매질 mL 당 0.8mg 단백질 S MAb)가 고정된 GE Healthcar CNBr-활성화 Sepharose 4 FF 매질 상에서 단백질 S의 감소를 수행했다. 칼럼(1mL)을 10 CV의 75mM 트리스, 30mM 트리-Na-시트레이트, pH 7.5로 평형화하고, 665ng/mL의 단백질 S 함량
Figure pat00021
485ng/mg rFVIIa를 가진 용액을 32 CV를 로딩한 다음, 20 CV의 75mM 트리스, 30mM 트리-Na-시트레이트, pH 7.5로 세척했다. 칼럼을 10 CV의 50mM 글리신 pH 2.0으로 재생시키고, 8 CV의 75mM 트리스, 30mM 트리-Na-시트레이트, pH 7.5로 재평형화했다. 전체 분획에서 2.6ng/mL의 단백질 S 수준
Figure pat00022
3ng/mg rFVIIa, 즉 160배 이상의 감소가 ELISA에 의해 측정되었다. 로딩 및 세척은 7.2 CV/h의 유속으로, 나머지 과정은 40 CV/h의 유속으로 수행했다. 온도는 5℃였다.
실시예 4
충진층 칼럼의 대안으로서, 단백질 S의 감소를 마우스에서 햄스터 단백질 S에 대하여 발생한 모노클로날 항체(MAb)(멤브레인 유닛 당 1mg 단백질 S MAb)가 고정된 Sartorius 에폭시-활성화 멤브레인 유닛(멤브레인 부피 = 2.1mL) 상에서 수행했다. 멤브레인을 10 MV(멤브레인 부피)dml 75mM 트리스, 30mM 트리-Na-시트레이트, pH 7.5로 평형화하고, 683ng/mL의 단백질 S 함량
Figure pat00023
502ng/mg rFVIIa를 가진 용액을 14 MV를 로딩한 다음, 8 MV의 75mM 트리스, 30mM 트리-Na-시트레이트, pH 7.5로 세척했다. 멤브레인을 10 MV의 50mM 글리신 pH 2.0으로 재생시키고, 8 MV의 75mM 트리스, 30mM 트리-Na-시트레이트, pH 7.5로 재평형화했다. 전체 분획에서 9.1ng/mL의 단백질 S 수준
Figure pat00024
8ng/mg rFVIIa, 즉 62배 이상의 감소가 ELISA에 의해 측정되었다. 멤브레인 과정은 유속 143 MV/h로 온도 5℃에서 수행했다.
실시예 5
FIX 용액의 정제
마우스에서 햄스터 단백질 S에 대하여 발생한 모노클로날 항체(MAb)(충진 칼럼 mL 당 0.8mg MAb)가 결합된 Amersham NHS 활성화 Sepharose FF 칼럼(0.9mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 단백질 S의 감소를 수행한다. 칼럼을 10 CV의 15mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.5로 평형화한다. BeneFIX(1000 IE; 뱃치 no. LE 07D002AF)를 패키지 설명서에 설명된 대로 물 10mL에 현탁시켰다. 약 2mg의 FIX를 함유하는 이 용액 5mL를 칼럼 위로 로딩했다. 단백질 S의 함량은 모노클로날 ELISA에 의해 230ng/mL까지 측정되었고, 총 단백질 S는 약 1150ng였다. 칼럼을 10 CV의 평형화 완충액으로 세척하고, 15mM 트리스, 2M NaCl, pH 7.5로 용리시켰다. FIX는 세척 및 용리 분획에서 발견되었다. 단백질 S의 함량은 모노클로날 ELISA에 의해 세척 및 용리 분획에서 각각 26ng 및 52ng까지 측정되었다.
B. 음이온 교환 크로마토그래피
실시예 6
pH 8.6에서 음이온 교환 크로마토그래피의 수행
Amersham Q-Sepharose FF로 충진하고 5 CV의 10mM 글리실글리신, 175mM NaCl, pH 8.6으로 평형화한 칼럼(내경 1cm x 길이 1.3cm = 1.0mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피를 수행했다. 300ppm 이상의 단백질 S 함량을 함유하는 용액을 35mL를 로딩했다. 칼럼을 7 CV의 10mM 글리실글리신, 175mM NaCl 및 4 CV의 10mM 글리실글리신, 50mM NaCl로 세척했다. 50mM NaCl을 함유하는 글리실글리신으로 완충하여, 0mM CaCl2에서부터 15mM CaCl2까지 선형 구배로 20 CV를 사용하여 용리를 수행했다. 정제는 온도 5℃에서 유속 40 CV/h로 수행했다. 풀은 30ppm 이하의 단백질 S 수준을 함유했으며, 이것은 10배 이상의 감소이다.
실시예 7
NaCl 용리를 이용한 FIX-용액의 정제를 위한 pH 8.6에서 음이온 교환 크로마 토그래피의 수행
Amersham Q-Sepharose FF로 충진하고 10 CV의 10mM 트리스, 175mM NaCl, pH 8.6으로 평형화한 칼럼(내경 0.5cm x 길이 5cm = 1.0mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피를 수행했다. BeneFIX(1000 IE; 뱃치 no. LE 07D051AD)를 패키지 설명서에 설명된 대로 물 10mL에 현탁시켰다. 약 1.2mg의 FIX를 함유하는 이 용액 3mL를 칼럼 위로 로딩했다. 단백질 S의 함량은 폴리클로날 ELISA에 의해 280ng /mL까지 측정되었고, 로딩 용액 중에 총 840ng였다. 칼럼을 7 CV의 평형화 완충액으로 세척한 다음, 3 CV의 15mM 트리스, 50mM NaCl, pH 8.6으로 세척했다. 이어서 칼럼을 15mM 트리스, 50mM NaCl, 15mM CaCl2를 5 CV 적용한 후 10 CV 적용하는 등용매 단계에 걸쳐 CaCl2의 양(3-5-7-9mM)을 증가시키면서 세척 완충액으로 세척했다. 10mM 트리스, 1M NaCl를 사용하여 FIX의 용리를 수행했다. SDS-PAGE는 15mM CaCl2를 함유하는 완충액을 사용한 마지막 세척 분획에서 약한 밴드를 나타냈다.
용리 분획에서 단백질 S의 양은 폴리클로날 ELISA에 의해 1.5ng/mL 이하 또는 7.5ng 이하인 것으로 측정되었다.
실시예 8
아미노산 치환 P10Q 및 K32E를 포함하는 FVII-폴리펩티드의 정제를 위한 pH 8.0에서 음이온 교환 크로마토그래피의 수행
Amersham Q-Sepharose FF로 충진하고 10 CV의 10mM 트리스, 50mM NaCl, pH 8로 평형화한 칼럼(내경 1cm x 길이 3.2cm = 2.5mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피를 수행했다. P10Q, K32E 돌연변이를 가진 FVII 변이체를 함유하는 배양 상청액 150mL에 0.5M EDTA 용액을 2.2mL를 가했다. 260mL WFI(주사수)를 가하여 전도도를 조정했다. 단백질 S의 함량은 ELISA에 의해 284ng/mL까지 또는 총 97 마이크로그램이 측정되었다. 칼럼을 10 CV의 10mM 트리스, 175mM NaCl, pH 8로 세척한 다음 평형화 완충액으로 세척했다. 10mM 트리스, 50mM NaCl, 35mM CaCl2, pH 8을 사용하여 용리를 수행했다. 단백질 S의 함량은 폴리클로날 ELISA에 의해 용리 풀에서 18㎍까지 측정되었다. 정제는 실온에서 유속 24 CV/h로 수행했다.
실시예 9
MgCl 2 구배 용리를 이용한 pH 6.0에서 음이온 교환 크로마토그래피의 수행
Amersham Q-Sepharose FF로 충진하고 10 CV의 10mM 히스티딘, 175mM NaCl, pH 6으로 평형화한 칼럼(내경 1cm x 길이 3.2cm = 2.5mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피를 수행했다. 1.6mg/mL의 FVII 폴리펩티드를 함유하는 용액을 8mL를 칼럼 위로 로딩했다. 단백질 S의 함량은 ELISA에 의해 360ng/mL까지 또는 총 2900ng이 측정되었다. 칼럼을 10 CV의 평형화 완충액으로 세척한 다음, 5 CV의 세척 완충액, 10mM 히스티딘, 50mM NaCl, pH 6으로 세척했다. 세척 완충액에서부터 10mM 히스티딘, 50mM MgCl2, pH 6까지의 구배로 용리를 수행했다. 단백질 S의 함량은 폴리클로날 ELISA에 의해 용리 풀에서 790ng까지 측정되었다. 정제는 온도 5℃에서 유속 24 CV/h로 수행했다.
실시예 10
pH 9.0에서 음이온 교환 크로마토그래피의 수행
Amersham Source 30Q로 충진하고 10 CV의 10mM 트리스, 2mM CaCl2로 평형화한 칼럼(내경 0.5cm x 길이 5.5cm = 1.0mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 pH 9.0에서 음이온 교환 크로마토그래피를 수행했다. 1mg/mL의 FVII와 10ppm 이상의 단백질 S 함량을 함유하는 용액을 8mL를 로딩했다. 칼럼을 5 CV의 10mM 트리스, 2mM CaCl2로 세척했다. 2mM CaCl2를 함유하는 트리스로 완충하여, 0mM NaCl에서부터 600mM NaCl까지 선형 구배로 50 CV를 사용하여 용리를 수행했다. 수집된 분획들에서 단백질 S 수준을 단백질 S ELISA를 이용하여 평가했다. 주 피크의 앞 부분에서 용리된 단백질 S는 FVII를 >99% 함유했다. 정제는 온도 5℃에서 유속 60 CV/h로 수행했다.
C. 소수성 상호작용 크로마토그래피
실시예 11
소수성 상호작용 크로마토그래피의 수행
Toso Haas TSK-Gel 페닐 5 PW로 충진하고 10 CV의 10mM 시트레이트, 1.7M NH4-아세테이트로 평형화한 칼럼(내경 2.6cm x 길이 8.5cm = 45.1mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 pH 6.0에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행했다. 약 700㎍/mL FVII와 200ppm 이상의 단백질 S 함량을 함유하는 용액을 215mL를 로딩했다. 로딩 용액에 1.7M NH4-아세테이트를 첨가했다. 칼럼을 5 CV의 10mM 시트레이트, 1.7M NH4-아세테이트로 세척했다. 시트레이트로 완충하여, 1.7M NH4-아세테이트에서부터 0M NH4-아세테이트까지 선형 구배로 20 CV를 사용하여 용리를 수행했다. 풀은 100ppm 이하의 단백질 S 수준을 함유했으며, 이것은 2배 이상의 감소이다. 정제는 온도 5℃에서 유속 20 CV/h로 수행했다.
실시예 12
Ca 2+ 의 존재하에 HIC의 수행
Toyopearl MD-G 부틸 수지로 충진한 칼럼(내경 1cm x 길이 7cm = 5.5mL) 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 수행한다. 칼럼을 10 CV의 35mM CaCl2, 1.5M NaCl, 10mM 히스티딘, pH 6.0으로 평형화한다. 평형화 후, 0.1mg/mL FVIIa를 함유하는 용액을 42mL를 칼럼 위로 로딩한다. 로딩 후, 칼럼을 10 CV의 평형화 완충액으로 세척한다. 결합된 FVII(a)를 20mM EDTA, 50mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 용리시켰다. FVII(a)를 함유하는 풀을 수집했더니 단백질 S의 함량이 감소한 것으로 나타났다.
D-1. Ca 2+ -의존성 항-FVIIa 모노클로날 항체를 사용한 면역친화도
실시예 13
pH 6에서 면역친화도 포착의 수행
CHO K1 배양 상청액 1500mL를 10mM Ca2+ 농도의 칼슘과 10mM 농도의 히스티틴 완충액을 첨가하여 안정화한 다음, HCl로 pH 6.0으로 조정하고, 0.45 마이크론 데드-엔드 필터를 통해 여과했다. Pharmacia Sepharose 4B 위에 고정한 Ca2+-의존성 항-FVIIa 모노클로날 항체로 충진한 칼럼(내경 1.6cm x 길이 10cm = 20mL CV) 위로 안정화된 배양 상청액을 로딩했다. 로딩 전, 칼럼을 5 CV의 10mM CaCl2, 10mM 히스티딘, pH 6.0으로 평형화했다. 로딩 후, 칼럼을 10 CV의 2M NaCl, 10mM CaCl2, 10mM 히스티딘, pH 6.0으로 세척했다. 결합된 FVII(a)를 10 CV의 30mM EDTA, 50mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 용리시켰다. 주 피크 앞 부분의 약 0.1 AU(280 nm)에서부터 꼬리 부분의 약 0.1 AU(280nm)까지 FVII(a) 함유 풀을 수집했다. 정제 과정 전체에서 유속 12 CV/h와 온도 5℃를 사용했다. 단백질 S의 수준을 폴리클로날 항 huPS에 기초한 단백질 S ELISA에 의해 측정했다.
D-2. 고정된 리간드를 사용한 친화도 정제
실시예 14
고정된 벤자미딘 유사체를 사용한 FVII 유사체의 친화도 정제
1mL 칼럼 부피(CV)의 NHS 활성화 HiTrap(GE Healthcare)에 벤자미딘 유사체(구조식 1 또는 구조식 2)를 결합시켰다. 칼럼을 5 CV의 50mM HEPES, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% Tween 80, pH 7.5로 평형화했다. pH 7.5에서 칼럼에 FVII 유사체와 20mg/L의 단백질 S를 함유하는 용액을 5 CV를 로딩했다. 로딩 후, 칼럼을 6 CV의 평형화 완충액으로 세척했다. 5 CV의 50mM HAc, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% Tween 80, pH 4.4 및 4 CV의 50mM Gly-HCl, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% Tween 80, pH 3.0을 사용하여 용리를 수행했다. 용리 직후 용리액의 pH를 6으로 조정했다. 유속은 시간당 30 CV였고, 작업은 실온에서 수행했다. 대부분의 단백질 S는 수지에 결합하지 않았으며, 흐름 통과 및 세척 시에 관찰되었다. 반대로, FVII는 대부분 수지에 결합한 것이 관찰되었고, pH가 감소함에 따라 용리되었다. 용리 분획들에서 단백질 S의 함량은 모노클로날 ELISA에 의해 구조식 1 또는 구조식 2의 화합물을 고정시킨 칼럼을 사용했을 때 각각 약 150ng 및 180ng인 것으로 측정되었다.
구조식 1:
Figure pat00025
구조식 2:
Figure pat00026
실시예 15
고정된 트리아진 리간드를 사용한 단백질 S의 친화도 정제(흐름 통과 방식)
ACL 5/5(ProMetic)로 충진하고 10 CV의 20mM 트리스, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, pH 8.5로 평형화한 칼럼(내경 1cm x 길이 6.2cm = 5mL 칼럼 부피(CV)) 상에서 정제를 수행했다. 40000ppm 이상의 단백질 S를 함유하는 용액을 43mL를 로딩했다. 칼럼을 2 CV의 20mM 트리스, 100mM NaCl, 5mM CaCl2 pH 8.5로 세척했다. 20mM 트리스, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, pH 8.5에서부터 20mM 트리스, 1M NaCl, 5mM CaCl2, pH 8.5까지의 선형 구배로 40 CV를 사용하여 용리를 수행했다. 7000ppm 이하의 단백질 S 수준을 함유하는 용리액을 제공하는 FVII 함유 풀을 수집했다.
E. 양이온 교환 크로마토그래피
실시예 16
Amersham cat no 11-0010 Obelix CIE 양이온 교환제
배양 배지를 양이온 교환 수지에 로딩했다. 칼럼을 30mM NaAc pH 7.0으로 평형화했다. 유속은 실온에서 48 CV/h였다. 로딩 후, 수지를 평형화 완충액으로 세척하고, 이어서 5-10 칼럼 부피의 1M NaAc pH 7로 세척했다. 평형화 완충액을 10 칼럼 부피를 다시 적용했다. 30mM NaAc, 2M NaCl, pH 6.3 또는 더 높은 pH 및 NaCl의 트리스 완충액으로 프로덕트를 용리시켰다. UV에 기초 풀을 수집하고 즉시 냉각시켰다. 단백질 S는 세척 단계에서 용리되었다. 사용 후 칼럼을 1M NaOH로 청소한다.
대안으로서, pH 7에서 1M까지 NaAc를 첨가하고 동일한 완충액으로 세척했다. 평형화 완충액은 1M NaAc pH 7.0이었다. 적용 후, 미결합 물질을 평형화 완충액으로 씻어냈다. 10 CV의 30mM NaAc pH 6.3을 사용하여 세척했고, 30mM NaAc, 2M NaCl, pH 6.3 또는 더 높은 pH 및 NaCl의 트리스 완충액을 사용하여 프로덕트를 용리시켰다. UV에 기초 풀을 수집했다. 단백질 S는 세척 단계에서 용리된다.
수지는 또한 다음의 방식으로도 사용되었다: 30mM NaAc pH 6.0으로 평형화하고, 프로덕트(전도도 10mS/cm 이하)를 적용했다. 미결합 물질을 평형화 완충액으로 씻어내고, NaCl 구배를 증가시켜 용리를 수행했다. 유속은 실온에서 30 CV/h였다. UV에 기초 풀을 수집했다. 단백질 S는 프로덕트의 앞쪽에서 용리되었다.
실시예 17
SP-Sepharose HP, Amersham cat no 17-1087
칼럼을 50mM Mes, 50mM NaCl, 2.5mM CaCl2, pH 5.75로 평형화했다. 전도도를 10mS/cm 이하로 조정했다. 미결합 물질을 평형화 완충액으로 씻어낸 다음, NaCl 농도를 증가시켜 프로덕트를 용리시켰다. 유속은 시간 당 48 칼럼 부피였고, 정제는 냉소에서 행했다.
단백질 S는 전체 분획에서 용리된다. 사용 후 칼럼을 1M NaOH로 청소했다.
실시예 18
Toyopearl SP 650 M
1mL(내경 0.5cm x 층 높이 5cm) Toyopearl SP 650 M(Tosoh Bioscience) 칼럼 상에서 약 25mg/L FVII와 25mg/L 단백질 S를 포함하는 혼합물로부터 단백질 S의 감소를 수행했다. 칼럼을 10 칼럼 부피(CV)의 10mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 평형화하고, FVII와 단백질 S를 포함하는 혼합물을 0.5mL를 칼럼 위로 로딩했다. 칼럼을 1 CV의 10mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 세척/용리시키고, 이어서 10mM 히스티딘 완충액 pH 6 중의 0-1M NaCl로 구배 세척/용리시켰다. 전체 정제 단계는 실온에서 유속 48 CV/h로 작업했다. 단백질 S는 흐름-통과 동안 용리되었고, FVII는 구배 용리 동안 용리되었다. 단백질 S와 FVII의 분리를 확인했고, 은 염색을 사용하는 표준 네이티브 SDS-PAGE 분석에 의해, 그리고 FVII 표준물질을 로딩한 병행 정제 과정에 의해 다시 한번 확인했다. 칼럼을 3 CV의 0.1M NaOH로 평형화한 다음, 10 CV의 1.5M NaCl + 25mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 평형화했다.
실시예 19
CM Sepharose FF
1mL(내경 0.5cm x 층 높이 5cm) CM Sepharose FF(GE HealthCare) 칼럼 상에서 약 25mg/L FVII와 25mg/L 단백질 S를 포함하는 혼합물로부터 단백질 S의 감소를 수행했다. 칼럼을 10 칼럼 부피(CV)의 40mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 평형화하고, FVII와 단백질 S를 포함하는 혼합물을 0.5mL를 칼럼 위로 로딩했다. 칼럼을 1 CV의 40mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 세척/용리시키고, 이어서 40mM 히스티딘 완충액 pH 6 중의 0-0.35M NaCl로 구배 세척/용리시켰다. 전체 정제 단계는 실온에서 유속 48 CV/h로 작업했다. 단백질 S는 흐름-통과 동안 용리되었고, FVII는 구배 용리 동안 용리되었다. 단백질 S와 FVII의 분리를 확인했고, 은 염색을 사용하는 표준 네이티브 SDS-PAGE 분석에 의해 다시 한번 확인했다. 칼럼을 3 CV의 0.1M NaOH로 평형화한 다음, 10 CV의 1.5M NaCl + 25mM 히스티딘 완충액, pH 6으로 평형화했다.
실시예 20
CM Sepharose FF
1mL(내경 0.5cm x 층 높이 5cm) CM Sepharose FF(GE HealthCare) 칼럼 상에서 약 25mg/L FVII와 25mg/L 단백질 S를 포함하는 혼합물로부터 단백질 S의 감소를 수행했다. 칼럼을 10 칼럼 부피(CV)의 10mM 히스티딘 완충액, pH 6으로 평형화하고, FVII와 단백질 S를 포함하는 혼합물을 0.5mL를 칼럼 위로 로딩했다. 칼럼을 1 CV의 10mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 세척/용리시키고, 이어서 10mM 히스티딘 완충액, pH 6 중의 0-0.35M NaCl로 구배 세척/용리시켰다. 전체 정제 단계는 실온에서 유속 48 CV/h로 작업했다. 단백질 S는 흐름-통과 동안 용리되었고, FVII는 구배 용리 동안 용리되었다. 단백질 S와 FVII의 분리를 확인했고, 은 염색을 사용하는 표준 네이티브 SDS-PAGE 분석에 의해 다시 한번 확인했다. 칼럼을 3 CV의 0.1M NaOH로 평형화한 다음, 10 CV의 1.5M NaCl + 25mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 평형화했다.
실시예 21
Toyopearl SP 650 M
1mL(내경 0.5cm x 층 높이 5cm) Toyopearl SP 650 M(Tosoh Bioscience) 칼럼 상에서 약 25mg/L FVII와 25mg/L 단백질 S를 포함하는 혼합물로부터 단백질 S의 감소를 수행했다. 칼럼을 10 칼럼 부피(CV)의 10mM 히스티딘 완충액, pH 6으로 평형화하고, FVII와 단백질 S를 포함하는 혼합물을 0.5mL를 칼럼 위로 로딩했다. 칼럼을 1 CV의 10mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 세척/용리시키고, 이어서 10mM 히스티딘 완충액 pH 6 중의 0-0.35M NaCl로 구배 세척/용리시켰다. 전체 정제 단계는 실온에서 유속 48 CV/h로 작업했다. 단백질 S는 흐름-통과 동안 용리되었고, FVII는 구배 용리 동안 용리되었다. 단백질 S와 FVII의 분리를 확인했고, 은 염색을 사용하는 표준 네이티브 SDS-PAGE 분석에 의해 다시 한번 확인했다. 칼럼을 3 CV의 0.1M NaOH로 평형화한 다음, 10 CV의 1.5M NaCl + 25mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 평형화했다.
실시예 22
Capto MMC
10cm의 층 높이에 직경이 1.6cm인 칼럼을 크로마토그래피 매질로 충진했다. 약 5℃에서 시간 당 20 칼럼 부피의 유속으로 정제를 수행했다. 150mM NaCl, 5mM CaCl2 및 20mM 히스티딘, pH 6.0으로 칼럼을 평형화했다. FVII를 포함하는 배양 상청액에 CaCl2과 히스티딘을 각각 5mM 및 10mM의 농도로 가하고, pH 6.0으로 조정하고, 칼럼 위로 로딩했다. 구체적인 칼럼 로딩 양은 충진층 mL 당 약 1.3mg FVII였다. 로딩 후, 칼럼을 평형화 완충액; 0.8M NaCl, 10mM CaCl2, 20mM 히스티딘, pH 6.6; 평형화 완충액; 0.5M NaCl, 25mM 히스티딘 pH 5.8로 차례로 세척했다. 0.5M NaCl, 25mM 히스티딘, pH 6.8을 사용하여 칼럼으로부터 FVII를 용리시켰다. 로딩 동안의 흐름 통과와 0.8M NaCl, 10mM CaCl2, 20mM 히스티딘, pH 6.6을 사용한 세척 분획에서 단백질 S가 풍부하게 발견되었다.
F. 히드록시아파타이트 물질을 사용한 크로마토그래피
실시예 23
히드록시아파타이트 칼럼, BioRad cat no 157-0085 Type I 80um
pH를 조정한 다음, 미리 평형화한 수지에 직접 적용했다. 유속은 4-20℃에서 시간 당 42 칼럼 부피이다. 베이스라인까지 평형화 완충액(물)으로 세척한 다음, pH 6.2에서 K2HPO4/KH2PO4 완충액의 구배를 400mM까지 증가시켜 프로덕트를 용리시킨다. UV에 기초 풀을 수집하고 바로 냉각시킨다.
단백질 S는 프로덕트 뒤쪽에서 용리된다. 사용 후 칼럼을 1M NaOH로 청소한다.
G. 헤파린 친화도 크로마토그래피
실시예 24
Toyopearl Heparin 650 M
1mL(내경 0.5cm x 층 높이 5cm) Toyopearl Heparin 650 M(Tosoh Bioscience) 칼럼 상에서 약 25mg/L FVII와 25mg/L 단백질 S를 포함하는 혼합물로부터 단백질 S의 감소를 수행했다. 칼럼을 10 칼럼 부피(CV)의 10mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 평형화하고, FVII와 단백질 S를 포함하는 혼합물을 0.5mL를 칼럼 위로 로딩했다. 칼럼을 1 CV의 10mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 세척/용리시키고, 이어서 10mM 히스티딘 완충액 pH 6 중의 0-0.35M NaCl로 구배 세척/용리시켰다. 전체 정제 단계는 실온에서 유속 48 CV/h로 작업했다. 단백질 S는 구배 용리 동안 FVII에 앞서 용리하였다. 단백질 S와 FVII의 분리를 확인했고, 은 염색을 사용하는 표준 네이티브 SDS-PAGE 분석에 의해 다시 한번 확인했다. 칼럼을 3 CV의 0.1M NaOH로 평형화한 다음, 10 CV의 1.5M NaCl + 25mM 히스티딘 완충액 pH 6으로 평형화했다.

Claims (15)

  1. 세포 배양 조건에서 생성된 관심있는 재조합 비타민 K-의존성 단백질을 포함하는 조성물에 단백질 S의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 조성물을 하기 (A) 단계 및 (B) 단계의 조합으로 처리하는 단계를 포함하고:
    (A) 세포 배양 조건에서 생성된 관심있는 재조합 비타민 K-의존성 단백질을 포함하는 상기 조성물을 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 대한 모노클로날 항체를 보유하는 고체상 물질에 접촉하는 단계로서, 상기 고체상 물질은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 결합할 수 있는 것인 단계; 및 이에 따라 얻어지는 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함하는 결과적인 조성물을 수집하는 단계; 및
    (B) 상기 (A) 단계로 처리된 조성물을 단백질 S에 대한 모노클로날 항체를 보유하는 고체상 물질에 접촉하는 단계로서, 상기 고체상 물질은 단백질 S에는 결합할 수 있지만 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 상기 고체상에 결합하지 않고 크로마토그래피 컬럼을 통과해 흐르는 것인 단계; 및 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함하는 결과적인 조성물을 수집하는 단계,
    여기서, 세포 배양 조건에서 생성된 관심있는 재조합 비타민 K-의존성 단백질을 포함하는 조성물은 세포 배양 상청액이며, 상기 세포 배양 상청액은 어떠한 선행하는 정제 단계 없이 상기 (A) 단계의 고체상 물질에 적용되고,
    이로써 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 대하여 ppm으로 나타낸 단백질 S의 수준은 상기 세포 배양 상청액으로부터 상기 (B) 단계에서 얻어지는 결과적인 조성물까지 적어도 2의 인자로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 대한 ppm으로 나타낸 단백질 S의 수준은 상기 세포 배양 상청액으로부터 상기 (B) 단계에서 얻어지는 결과적인 조성물까지 적어도 5의 인자로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 IX 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 X 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 인자 VII 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질은 야생형 사람 인자 VIIa인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 인자 VII 폴리펩티드는 P1OQ와 K32E 중에서 선택된 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단백질 S는 햄스터 단백질 S인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질에 대하여 ppm으로 나타낸 단백질 S의 수준은 적어도 10의 인자로 감소된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서서, 비정제된 세포 배양 상청액 중의 단백질 S 오염물질의 양은 적어도 500 ppm인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 결과적인 정제된 조성물 중의 단백질 S의 전체 양은 최대 100 ppm인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 세포 배양 조건 하에서 생성된 관심있는 비타민 K-의존성 단백질을 포함한 조성물로서, 단백질 S의 전체 양은 관심있는 비타민 K-의존성 단백질의 양에 기초하여 최대 100 ppm인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 무-혈청, 비-사람 세포 배양에서 얻은 인자 VII 폴리펩티드를 포함한 조성물로서, 단백질 S 오염물질의 전체 양은 인자 VII 폴리펩티드의 양에 기초하여 최대 100 ppm인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서, 무-혈청, 비-사람 세포 배양에서 얻은 인자 IX 폴리펩티드를 포함한 조성물로서, 단백질 S 오염물질의 최대 양은 인자 IX 폴리펩티드의 양에 기초하여 최대 100 ppm인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 S의 양은 0.01-100 ppm의 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
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