MX2007007356A - Reduccion del contenido de contaminantes proteinicos en composiciones que comprenden una proteina dependiente de la vitamina k de interes. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones de proteinas dependientes de la Vitamina K que tienen un contenido muy bajo, o insignificante, de contaminantes proteinicos. La presente invencion tambien se refiere a un metodo aplicable en la preparacion de estas composiciones de proteinas dependientes de la Vitamina K. Estos metodos se pueden utilizar ya sea solo o en combinacion secuencial con el proposito de reducir el contenido relativo de contaminantes proteinicos. La presente invencion es particularmente relevante en la preparacion de composiciones de factores de coagulacion seleccionados de los polipeptidos del Factor X (FX/Fxa), polipeptidos del Factor IX (FIX/FIXa), polipeptidos del Factor VII (FVII/FVIIa) y la Proteina C anticoagulante, en particular los polipeptidos del Factor VII.

Description

REDUCCIÓN DEL CONTENIDO DE CONTAMINANTES PROTEINICOS EN COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN UNA PROTEINA DEPENDIENTE D? LA VITAMINA K DE INTERÉS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones de proteínas dependientes de la Vitamina K que tienen un contenido muy bajo, o insignificante, de contaminantes proteínicos . La presente invención también se refiere a un método aplicable en la preparación de estas composiciones de proteínas dependientes de la Vitamina K. Estos métodos se pueden utilizar ya sea solos o en combinación secuencial con el propósito de reducir el contenido relativo de contaminantes proteínicos. La presente invención es particularmente relevante en la preparación de composiciones de factores de coagulación seleccionados de los polipéptidos del Factor X (FX/FXa) , polipéptidos del Factor IX (FIX/FIXa) , polipéptidos del Factor VII (FVII/FVIIa) y la Proteína C anticoagulante, en particular los polipéptidos del Factor VII.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En la producción de proteínas recombinantes a partir de cultivos de microorganismos o líneas de células, el paso de producción final es la recuperación y opcionalmente REF: 183072 la concentración del producto de interés. Los medios de cultivo en los cuales se han desarrollado las células y los cuales contienen proteínas secretadas y, en particular, lisados de células que contienen proteínas intracelulares de interés también contienen, a un grado mayor o menor, otras proteínas producidas por las células, además de otros contaminantes, tales como componentes de medios, ácidos nucleicos y similares. A fin de obtener un producto proteínico purificado, por lo tanto es necesario separar la proteína de interés de otras proteínas y polipéptidos y otras impurezas en el material crudo que contiene la proteína de interés. Frecuentemente es difícil retirar el contaminante proteínico que comprende dominios del mismo carácter que el polipéptido de interés. Las proteínas dependientes de la vitamina K se distinguen de otras proteínas al compartir una característica estructural común en su parte terminal amino de la molécula. La terminal N de estas proteínas, también referida como el dominio Gla, es rica en el aminoácido inusual ácido ?-carboxiglutámico el cual es sintetizado a partir de glutamato en una reacción dependiente de la vitamina K catalizada por la enzima ?-glutamilcarboxilasa. Debido a la presencia de aproximadamente 2 a 12 residuos de Gla, el dominio Gla está caracterizado por ser capaz de enlazar cationes divalentes tales como Ca27 Con el enlace de los iones metálicos, estas proteínas se someten a cambios conformacionales los cuales pueden medirse por medio de varias técnicas tal como el dicroísmo circular y la emisión de fluorescencia. El descubrimiento de cambios conformacionales inducidos por metales de proteínas que contienen Gla (Nelsestuen y colaboradores, J. Biol. Chem. 1976; 251, 6886-6893) junto con la identificación de anticuerpos policlonales específicos para la conformación (Furie y colaboradores, J. Biol. Chem. 1978; 253, 8980-8987) abrió la forma para la introducción de la cromatografía de inmunoafinidad específica para la conformación. Estos anticuerpos pudieron reconocer y unirse al dominio Gla en presencia de iones Ca2+ pero liberaron la proteína con la remoción de los iones Ca2+ utilizando un quelador tal como EDTA o citrato. En la década de 1980, la cromatografía de pseudoafinidad específica para la conformación se desarrolló haciendo uso de la propiedad única de las proteínas que contenían Gla para someterse a cambios inducidos por metales en la conformación. La cromatografía de pseudoafinidad difiere de la cromatografía de afinidad convencional debido a que no existe un ligando de afinidad inmovilizado que esté implicado y se realiza sobre una matriz cromatográfica convencional (Yan S. B., J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218). La proteína Gla puede ser absorbida en un material de intercambio aniónico al eliminar los iones metálicos divalentes. Subsecuentemente, la elución se realiza al agregar Ca2+ al amortiguador de elución. En 1986, Bj0rn y Thim reportaron la purificación del Factor VII recombinante en un material de intercambio aniónico tomando ventaja de la propiedad de enlaces de Ca2+ del dominio Gla del Factor VII (Bj0rn S. y Thim L., Research Dislosure, 1986, 26960-26962.). La absorción se logró en un amortiguador sin Ca2+ y la elución del Factor VII fue posible utilizando un amortiguador que contenía Ca2+ con una baja intensidad iónica y bajo condiciones suaves. Yan y colaboradores han utilizado el mismo principio para la purificación de la Proteína C humana recombinante (Yan S. B. y colaboradores, Bio/technology . 1990; 8, 655-661) . Mientras que la presencia del dominio Gla proporciona una ventaja para la separación de proteínas que contienen Gla de otras proteínas, los inventores de la presente invención observaron que propiedades similares y el comportamiento de las proteínas que contienen Gla hace difícil separarlas unas de las otras. Varios anticuerpos específicos conformacionales producidos contra unas proteínas Gla muestran reactividad cruzada con otras proteínas Gla (Furie B. y Furie B., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771; Church y colaboradorres, J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267) .

Brown y colaboradores (Brown y colaboradores, J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802.) han reportado anticuerpos monoclonales que son específicos para los residuos Gla. Estos anticuerpos podrían reconocer todas las proteínas Gla sometidas a prueba: Factor VII, Factor IX, Factor II, Proteína C, Proteína S, GAS-6, proteína Gla de matriz ósea, conantocina G. Las proteínas con un dominio GLA comprenden, pero no están limitadas a, las siguientes proteínas: GAS-6, Proteína S, Factor II (Protrombina) , trombina, Factor X/Xa, Factor IX/IXa, Proteína C, Factor VlI/VIIa, Proteína Z, proteína 1 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 2 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 3 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 4 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína Gla de Matriz y Osteocalcina. El documento US 5,633,350 describe un método para la separación de proteínas dependientes de la vitamina K a partir de proteínas complementarias no dependientes de la vitamina K. La necesidad de separar eficientemente una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, tal como un polipéptido que contiene el dominio Gla de interés, a partir de contaminantes proteínicos es un problema particularmente relevante cuando se trata de la purificación de estos polipéptidos producidos en cultivos celulares, debido a que la célula hospedante (la cual puede no ser una línea de células humana) puede producir cantidades significativas de contaminantes proteínicos que pueden causar reacciones inmunogénicas indeseables con el uso del polipéptido. De esta manera, un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos adecuados para la producción o aún la remoción del contenido de contaminantes proteínicos en composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés con un contenido muy bajo o aún insignificante de contaminantes proteínicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a varios métodos para reducir o aún eliminar el contenido de contaminante (s) proteínico (s) en composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés.

Proteínas dependientes de la vi tamina K de interés La presente invención se refiere en un amplio aspecto a la purificación de una proteína dependiente de la vitamina K de interés y a composiciones purificadas particulares que comprenden estas proteínas. El término "de interés" se aplica en este documento como un indicador a la especie particular (una proteína dependiente de la vitamina K) la cual es relevante para la obtención en la forma más pura, por ejemplo con el propósito de utilizar la proteína dependiente de la vitamina K en un contexto terapéutico. Los métodos descritos en este documento pueden ser aplicables en principio a la purificación de cualquier proteína dependiente de la vitamina K que comprenda, pero que no está limitada a, GAS-6, Proteína S, Factor II (Protrombina) , Trombina, Factor X/Xa, Factor IX/IXa, Proteína C, Factor VlI/VIIa, Proteína Z, proteína 1 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 2 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 3 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 4 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína Gla de Matriz y Osteocalcina) , en particular los factores de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionados de los polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada. En una modalidad particular, el método se utiliza para la purificación de proteínas dependientes de la vitamina K recombinantes de interés que son producidas bajo condiciones de cultivos de células, en particular cultivos de células no humanas.

En una modalidad particular, la proteína dependiente de la vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX, tal como FIX y FlXa. En otra modalidad particular, la proteína dependiente de la vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII, tal como el polipéptido relacionado con el Factor VII, o derivados del Factor VII o un conjugado del Factor VII, en particular un polipéptido del Factor VII humano, en particular el Factor VII humanó de tipo natural o el Factor Vlla humano de tipo natural. Como se utiliza en este documento, los términos "polipéptido del Factor VII" y "polipéptido FVII" significan cualquier proteína que comprenda la secuencia de aminoácidos 1-406 del Factor Vlla humano de tipo natural (es decir, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la patente norteamericana No. 4,784,950), variantes del mismo así como también polipéptidos relacionados con el Factor VII, derivados del Factor VII y conjugados del Factor VII. Esto incluye las variantes del Factor VII, polipéptidos relacionados con el Factor VII, derivados del Factor VII y conjugados del Factor VII que exhiben sustancialmente una actividad biológica igual o mejorada con relación al Factor Vlla humano de tipo natural. Los términos "Factor VII" o "FVII" se proponen para incluir los polipéptidos del Factor VII en su forma escindida (zimógeno), así como también aquellas que han sido procesadas proteolíticamente para producir sus formas bioactivas respectivas, las cuales pueden designarse como el Factor Vlla. Típicamente, el Factor VII es escindido entre los residuos 152 y 153 para producir el Factor Vlla. Estas variantes del Factor VII pueden exhibir diferentes propiedades con relación al Factor VII humano, inclusive estabilidad, enlaces de fosfolípidos, actividad específica alterada y similares. Como se utiliza en este documento, "Factor VII humano de tipo natural" es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la patente norteamericana No. 4,784,950. Como se utiliza en este documento, "polipéptidos relacionados con el Factor VII" incluye polipéptidos, inclusive variantes (o análogos), en los cuales la actividad biológica del Factor Vlla ha sido modificada sustancialmente, tal como reducida, con relación a la actividad del Factor Vlla de tipo natural. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el Factor VII o el Factor Vlla en el cual se han introducido alteraciones de secuencias de aminoácidos que modifican o alteran la bioactividad del polipéptido. El término "derivado del Factor VII" utilizado en este documento, se propone para designar un polipéptido del Factor VII que exhibe una actividad biológica sustancialmente igual o mejorada con relación al Factor VII de tipo natural, en el cual uno o más aminoácidos del péptido precursor han sido modificados genética y/o química y/o enzimáticamente, por ejemplo por medio de la alquilación, glicosilación, PEGilación, GlicoPEGilación, acilación, formación de éster o formación de amida o similares. Esto incluye pero no está limitado a Factor Vlla humano conjugado a PEG, Factor Vlla humano conjugado a cisteína-PEG y variantes de los mismos. Los ejemplos no limitantes de derivados del Factor VII incluyen derivados del Factor VII conjugados a GlicoPeg como se describe en el documento WO 03/31464 y las solicitudes de patente norteamericanas Nos. US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557 y US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); conjugados del Factor VII como se describe en el documento WO 01/04287, solicitud de patente norteamericana No. 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) y WO 02/02764, solicitud de patente norteamericana 20030211094 (University of Minnesota) . El término "actividad biológica mejorada" se refiere a los polipéptidos del Factor VII con i) una actividad proteolítica sustancialmente igual o incrementada en comparación con el Factor Vlla humano de tipo natural recombinante o ii) a los polipéptidos del Factor VII con una actividad de enlace de TF sustancialmente igual o incrementada en comparación con el Factor Vlla humano de tipo natural recombinante o iii) un polipéptidos del Factor VII con un período de vida promedio sustancialmente igual o incrementado en el plasma sanguíneo en comparación con el Factor Vlla humano de tipo natural recombinante. El término "Factor Vlla humano conjugado a PEG" significa el Factor Vlla humano, que tiene una molécula de PEG conjugada al polipéptido del Factor Vlla humano. Se debe entender que la molécula de PEG puede estar unida a cualquier parte del polipéptido del Factor Vlla que incluye cualquier residuo de aminoácido o porción de carbohidrato del polipéptido del Factor Vlla. El término "Factor Vlla humano conjugado a cisteína-PEG" significa el Factor Vlla que tiene una molécula de PEG conjugada a un grupo sulfhidrilo de una cisteína introducida en el Factor Vlla humano. Los ejemplos no limitantes de las variantes del Factor VII que tienen una actividad proteolítica sustancialmente igual o incrementada en comparación con el Factor Vlla humano de tipo natural recombinante incluyen S52A-Factor Vlla, S60A-Factor Vlla (Lino y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); variantes del Factor Vlla que exhiben estabilidad proteolítica incrementada como se describe en la patente norteamericana No. 5,580,560; el Factor Vlla que ha sido escindido proteolíticamente entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup y colaboradores, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995) ; formas oxidadas del Factor Vlla (Kornfelt y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); variantes del Factor VII como se describe en PCT/DK02/00189 (correspondiente al documento WO 02/077218) ; y variantes del Factor VII que exhiben estabilidad proteolítica incrementada como se describe en el documento WO 02/38162 (Scripps Research Institute) ; variantes del Factor VII que tienen un dominio Gla modificado y que exhiben un enlace de membrana mejorado como se describe en el documento WO 99/20767, patentes norteamericanas Nos. US 6017882 y US 6747003, solicitud de patente norteamericana No. 20030100506 (University of Minnesota) y el documento WO 00/66753, solicitudes de patente norteamericanas Nos. US 20010018414, US 2004220106 y US 200131005, patentes norteamericanas Nos. US 6762286 y US 6693075 (University of Minnesota) ; y variantes del Factor VII como se describe en el documento WO 01/58935, patente norteamericana No. US 6806063, solicitud de patente norteamericana No. 20030096338 (Maxygen ApS), el documento WO 03/93465 (Maxygen ApS) y el documento WO 04/029091 (Maxygen ApS) . Los ejemplos no limitantes de variantes del Factor VII que tienen actividad biológica incrementada en comparación con el Factor Vlla de tipo natural incluyen las variantes del Factor VII descritas en los documentos WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (correspondiente al documento WO 03/027147), solicitud de patente danesa No. PA 2002 01423 (correspondiente al documento WO 04/029090) , solicitud de patente danesa No. PA 2001 01627 (correspondiente al documento WO 03/027147); WO 02/38162 (Scripps Research Institute) ; y variantes del Factor VII con actividad mejorada como se describe en el documento JP 2001061479 (Chemo-Sero- Therapeutic Res Inst . ) . Los ejemplos de las variantes del Factor VII incluyen, sin limitación, P10Q-FVII, K32E-FVII, P10Q/K32E-FVII, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII y S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F37 Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F3 4Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; y FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 233Thr a 240Asn; FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys; y FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 153lle a 223Arg. De esta manera, las variantes de sustitución en un polipéptido del Factor VII incluyen, sin limitación, sustituciones en las posiciones PlO, K32, L305, M306, D309, L305, L305, F374, V158, M298, V158, E296, K337, M298, M298, S336, S314, K316, K316, F374, S52, S60, R152, S344, T106, K143, N145, V253, R290, A292, G291, R315, V317 y sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de T233 a N240 o de R304 a C329; o de 1153 a R223, o combinaciones de los mismos, en particular variantes tales como P10Q, K32E, L305V, M306D, D309S, L305I, L305T, F374P, V158T, M298Q, V158D, E296V, K337A, M298Q, M298K, S336G, S314E, K316H, K316Q, F374Y, S52A, S60A, R152E, S344A, T106N, K143N, N145T, V253N, R290N, A292T, G291N, R315N, V317T y sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de T233 a N240, o de R304 a C329, o de 1153 a R223, o combinaciones de los mismos. La expresión "polipéptidos" en conexión con los términos "polipéptidos del Factor X" y "polipéptidos del Factor IX" se propone que incluya cualquier proteína que comprenda la secuencia de aminoácidos del Factor X y el Factor IX humanos de tipo natural, respectivamente, así como también los "análogos", "variantes", "polipéptidos relacionados", "derivados" y " conjugados" respectivos de los mismos, donde las expresiones "variantes", "polipéptidos relacionados", "derivados" y "conjugados" se definen como el Factor VII, mutatis mutandis .

Composiciones Cuando se utiliza en este documento la expresión "composición" se propone para referirse a una composición líquida, tal como una composición líquida acuosa, es decir una composición que comprende menos de 5% de solventes no acuosos. El término "primera composición" se refiere a una composición que comprende una proteína dependiente de la vitamina K de interés antes de un tratamiento, tal como un paso de purificación, de acuerdo con la presente invención. El término se utiliza para distinguir la "primera composición" de "una segunda composición", la cual se refiere a la misma composición, pero después de este tratamiento, tal como un paso de purificación. La proteína dependiente de la vitamina K de interés es mucho más típicamente una proteína recombinante que es producida bajo condiciones de cultivos de células, es decir la proteína dependiente de la vitamina K de interés se obtiene ya sea directamente como un constituyente de un sobrenadante del cultivo de células o se obtiene a partir de un sobrenadante del cultivo de células después de uno o más pasos de proceso precedentes. En la práctica de la presente invención, las células son células eucarióticas, tal como una línea de células eucarióticas establecida que incluye, sin limitación, líneas de células CHO (por ejemplo, ATCC CCL 61) , COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), de hígado de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) y HEK293 (por ejemplo, ATCC CRL 1573; Graham y colaboradores, J. Gen . Virol . 36:59-72, 1977) . Una línea de células BHK preferida es la línea de células tk~tsl3 BHK (Waechter y Baserga, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 79: 1106-1110, 1982), posteriormente referidas como las células BHK 570. La línea de células BHK 570 está disponible en the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, bajo el acceso de ATCC número CRL 10314. Una línea de células tk'ts 13BHK también está disponible en ATCC bajo el número de acceso CRL 1632. Una línea de células CHO preferida es la línea de células CHO Kl disponible en ATCC bajo el número acceso CCI61. Otras líneas de células adecuadas incluyen, sin limitación, Rat Hep I (Hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1); células DUKX (línea de células CHO) (Urlaub y Chasin, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 77:4216-4220, 1980) (las células DUKX también son referidas como las células DXBll) y DG44 (línea de células CHO) ( Cell , 33: 405, 1983 y Soma tic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986). También son útiles las células 3T3, células Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras células. En algunas modalidades, las células pueden ser células mutantes o recombinantes, tal como, por ejemplo, las células que expresan un espectro cualitativa y cuantitativamente diferente de enzimas que catalizan la modificación posterior a la traducción de las proteínas (por ejemplo, enzimas de glicosilación tales como las glicosil transferasas y/o glicosidasas, o enzimas de procesamiento tales como propéptidos) que el tipo de células del cual se derivan. Las líneas de células de insectos adecuadas también incluyen, sin limitación, líneas de células Lepidoptera, tales como las células Spodoptera frugiperda o las células Trichoplusia ni (véase, por ejemplo, la patente norteamericana No. US 5,077,214). Típicamente, el contenido total de contaminantes proteínicos en la primera composición (tal como una composición no purificada) es al menos 200 ppm, tal como al menos 300 ppm, por ejemplo al menos 400 ppm o al menos 500 ppm. También típicamente, el contenido total de contaminantes de Proteína S en la primera composición (tal como una composición no purificada) es al menos 200 ppm, tal como al menos 300 ppm, por ejemplo al menos 400 ppm o al menos 500 ppm.

Contaminantes proteínicos típicos Cuando se utilizan en este documento los términos "contaminante proteínico" y "contaminantes proteínicos" y similares se proponen para referirse a constituyentes de proteínas o polipéptidos que constituyen impurezas con relación a la proteína dependiente de la vitamina K de interés. De esta manera, la proteína dependiente de la vitamina K de interés no será contada obviamente como un contaminante proteínico aunque las definiciones de la "proteína dependiente de la vitamina K" tal como y "contaminantes proteínicos", respectivamente, son solapadas parcialmente. En una modalidad, el contaminante proteínico es una proteína dependiente de la vitamina K (pero no la proteína dependiente de la vitamina K de interés) . Como las proteínas dependientes de la vitamina K son producidas típicamente en cultivos de células, un grupo particular de contaminantes proteínicos son las proteínas de células hospederas. Las "proteínas de células hospederas" son proteínas producidas por la célula hospedante que expresa la proteína dependiente de la vitamina K de interés y se consideran típicamente como impurezas. Las proteínas de células hospederas pueden ser proteínas humanas si se utiliza una línea de células humanas para la producción de proteínas dependientes de la vitamina K de interés o proteínas no humanas, si se utiliza una línea de células no humanas para la producción de la proteína de interés. De esta manera, en un aspecto de la invención, el contaminante proteínico es una proteína de célula hospedante, tal como una proteína dependiente de la vitamina K. Una clase particularmente relevante de proteínas de células hospederas son las proteínas que contienen el dominio Gla tales como GAS-6, Proteína S, Factor II (Protrombina), trombina, Factor X/Xa, Factor IX/IXa, Proteína C, Factor VII/Vlla, Proteína Z, proteína 1 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 2 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 3 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 4 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína Gla de Matriz y Osteocalcina . El número de residuos Gla en estas proteínas está en el rango de 2 a 12. Puesto que la síntesis de los residuos Gla requieren la vitamina K, las proteínas que contienen residuos Gla también son referidas como proteínas dependientes de la vitamina K. En el presente contexto, una proteína de célula hospedante particular de relevancia es la Proteína S. En una modalidad particular, la Proteína S es una Proteína S de hámster. De esta manera, los métodos y las composiciones definidos en este documento se enfocan particularmente a la reducción del contenido de la Proteína S.

Reducción del contenido de contaminantes proteínicos Un aspecto fundamental de la presente invención es el (los) método (s) capaz (capaces) de retirar un contaminante proteínico (en particular la Proteína S) de composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés (en particular un polipéptido del Factor VII) . De esta manera, la presente invención se refiere a un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes proteínicos en una composición que comprende una proteína dependiente de la vitamina K de interés, el método comprende al menos los pasos que consisten en (i) poner en contacto la composición con un material en fase sólida el cual es capaz de unir uno o más contaminantes proteínicos y/o la proteína dependiente de la vitamina K de interés y (ii) recolectar una composición resultante que comprende la proteína dependiente de la vitamina K de interés, por lo cual el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5. En las modalidades mucho más importantes, el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante (tal como una composición purificada) que comprende la proteína dependiente de la vitamina K de interés se hace descender a lo sumo 100 ppm. Como se mencionara anteriormente, la proteína dependiente de la vitamina K de interés es típicamente un factor de coagulación dependiente de la vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y la Proteína C activada. En una modalidad más particular, la proteína dependiente de la vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. En otra modalidad más particular, la proteína dependiente de la vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. En otra modalidad particular, la proteína dependiente de la vitamina K de interés es un polipéptido del Factor X. En una modalidad particular, la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son los polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S; y la proteína dependiente de la vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. En una modalidad, el contaminante proteínico es la proteína S de hámster. En otra modalidad, el contaminante proteínico es la proteína S y la proteína dependiente de la vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. En una modalidad, el contaminante proteínico es la proteína S de hámster. En una modalidad, la invención se refiere a métodos para la separación de una proteína dependiente de la vitamina K de interés que contiene 2-16 residuos de Gla de otros contaminantes proteínicos dependientes de la vitamina K que contienen de 2 a 16 residuos de Gla. En otra modalidad, la invención proporciona un método para la separación de proteínas con efecto anticoagulante tal como la proteína S y la proteína C de proteínas con efecto coagulante. En un aspecto, la proteína dependiente de la vitamina K de interés es un factor de coagulación y el contaminante proteínico con efecto anticoagulante es la Proteína S. En otra modalidad, la invención proporciona un método para la separación de contaminantes proteínicos no humanos de una proteína dependiente de la vitamina K humana. En un aspecto de la invención, los contaminantes proteínicos no humanos también son proteínas dependientes de la vitamina K. En todavía otro aspecto, los contaminantes proteínicos no humanos son proteínas de hámster. No obstante, el método de la invención hace posible producir un nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la vitamina K de interés la cual ha sido reducida por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000. En particular, el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante (tal como una composición purificada) , tal como un sobrenadante de cultivo de células tratado, es a lo sumo 100 ppm, tal como a lo sumo 90 ppm, o a lo sumo 80 ppm, o a lo sumo 70 ppm, o a lo sumo 60 ppm, o a lo sumo 50 ppm, o a lo sumo 40 ppm, o a lo sumo 30 ppm, o a lo sumo 20 ppm, o a lo sumo 10 ppm o a lo sumo 5 ppm; o el contenido total de contaminantes de Proteína S en la segunda composición resultante (tal como una composición purificada) , tal como un sobrenadante de cultivo de células tratado, es a lo sumo 100 ppm, tal como a lo sumo 90 ppm, o a lo sumo 80 ppm, o a lo sumo 70 ppm, o a lo sumo 60 ppm, o a lo sumo 50 ppm, o a lo sumo 40 ppm, o a lo sumo 30 ppm, o a lo sumo 20 ppm, o a lo sumo 10 ppm o a lo sumo 5 ppm o a lo sumo 1 ppm. Los sobrenadantes de cultivos de células típicos pueden tener una cantidad significativa de contaminantes proteínicos (en particular la Proteína S) , de esta manera, el contenido total de contaminantes proteínicos en el sobrenadante de cultivo de células (tal como un sobrenadante no purificado) es típicamente al menos 500 ppm, tal como al menos 750 ppm, o al menos 1000 ppm, o al menos 2000 ppm; o el contenido total de contaminantes de Proteína S en el sobrenadante de cultivo de células (tal como un sobrenadante no purificado) es al menos 500 ppm, tal como al menos 750 ppm, o al menos 1000 ppm, o al menos 2000 ppm. De esta manera, un aspecto de lo anterior se refiere a un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes de Proteína S en una composición que comprende un polipéptido del Factor VII, el método comprende al menos los pasos que consisten en (i) poner en contacto la composición con un material en fase sólida el cual es capaz de enlazar el (los) contaminante (s) de Proteína S y/o el polipéptido del Factor VII y (ii) recolectar una composición resultante que comprende el polipéptido del Factor VII, por lo cual el nivel de contaminante (s) de Proteína S expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII ha sido reducido por al menos un factor de 2, tal como al menos un factor de 5. Los materiales en fase sólida que son útiles en este documento son aquellos utilizados típicamente en métodos y procesos de captura cromatográfica y de afinidad y variantes particulares de los mismos, como será evidente. En una variante principal de lo anterior, el material en fase sólida enlaza una cantidad relativamente más alta del contaminante proteínico en comparación con la proteína dependiente de la vitamina K de interés. En un aspecto, la proteína dependiente de la vitamina K de interés no se enlaza a la fase sólida y fluye a través de la columna cromatográfica mientras que el contaminante proteínico se enlaza a la fase sólida, dando por resultado la separación de la proteína dependiente de la vitamina K de interés del contaminante proteínico. En particular, el material en fase sólida se enlaza específicamente a al menos uno de los contaminantes, por ejemplo por medio de una afinidad fuerte o por medio de un enlace covalente del (los) contaminante (s) , tal como por medio de la formación de enlaces de disulfuro a las porciones de tiol del(los) contaminante (s) . En una modalidad, el material en fase sólida es una resina de intercambio iónico, tal como una resina de intercambio aniónico. Las resinas de intercambio aniónico comúnmente utilizadas comprenden la resina Q, una amina cuaternaria y resina DEAE, DiEtilAminoEtano. Las resinas de intercambio aniónico son comercialmente disponibles, por ejemplo Mono Q (Amersham Biosciences) , Source 15Q o 30Q (Amersham Biosciences) , Poros 20HQ o 50HQ (Perseptive Biosystems), Toyopearl Q650S (Toso Haas) y otras. La elución de la resina de intercambio aniónico se puede realizar al incrementar la conductividad del amortiguador de elución tal como incrementando la concentración de las sales en el amortiguador de elución o al disminuir el pH del amortiguador de elución. En una modalidad particular de la invención, la elución se realiza al incrementar la concentración de CaCl2. En otra modalidad particular, la elución se realiza al incrementar la concentración de MgCl2. La elución se puede llevar a cabo gradualmente o al utilizar una elución de gradiente. La resina de intercambio que catiónico utilizada más ampliamente contiene un grupo carboximetilo (CM) o sulfopropilo (SP) . Los ejemplos de estos intercambiadores de cationes incluyen sin limitación Toyopearl CM-650 o Toyopearl SP-650 (Toso Haas), Source 15 S o 30 S, CM o SP Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) Obelix (Amersham Biosciences) . En otra modalidad, el material en fase sólida es una matriz sustituida con ligandos hidrófobos tales como los grupos etilo, butilo, fenilo o hexilo. Este tipo de cromatografía es referido como la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés) y toma ventaja de las propiedades hidrófobas de las proteínas. La adsorción es promovida por las interacciones hidrófobas entre regiones no polares sobre la proteína y ligandos hidrófobos inmovilizados sobre un soporte sólido. La adsorción se logra a concentraciones altas de sal en la fase móvil acuosa y la elución es facilitada al disminuir la concentración de sal. En una modalidad particular, el material es una matriz sustituida por un ligando de butilo o fenilo. En un aspecto adicional de la invención, el material en fase sólida lleva ligandos de afinidad. En una modalidad, el material en fase sólida está llevando anticuerpos monoclonales producidos contra al menos un (unos) contaminante (s) proteínico (s) , en particular contra la Proteína S. Esto se ilustra en la sección "Experimentales".

En otro aspecto, el material en fase sólida está llevando ligandos de triazina inmovilizados, tal como un ligando de triazina descrito en el documento WO 97/10887 (tal como un ligando de triazina descrito en la página 5 línea 21 a la página 13 línea 6) o en el documento US 6,117,996 (tal como el párrafo 4-21) el contenido de los cuales es incorporado por este acto a manera de referencia en su totalidad. La Proteína S circula en el plasma ya sea libre o en un complejo con C4bp. La cadena B contiene el sitio de interacción para la Proteína S. De esta manera, es importante para la presente invención utilizar la especie C4bp que contiene la cadena B. En una modalidad de la invención, la molécula completa de C4bp se utiliza para la inmovilización a la matriz sólida. En otra modalidad, la cadena B o una secuencia de la cadena B la cual es capaz de enlazarse a la Proteína S se utiliza para la inmovilización a la matriz sólida. En otra variante, el material en fase sólida está llevando la Proteína C inmovilizada. En otra variante, el material en fase sólida está llevando un ligando de triazina inmovilizado. En otra variante, el material en fase sólida está llevando la proteína de enlace C4. La Proteína S se enlaza a la Proteína C y C4bp con mucho más afinidad que otras proteínas dependientes de la Vitamina K. Por lo tanto, es posible reducir el contenido de la Proteína S al enlazar la Proteína S a la Proteína C inmovilizada o C4bp. Alternativamente, las secuencias seleccionadas de la Proteína C y C4bp responsables de enlazarse a la Proteína S se pueden utilizar para la inmovilización a la fase sólida. La proteína de enlace C4b (C4bp) está implicada en la regulación del sistema complementario. Es una proteína multimérica que comprende 7 cadenas alfa idénticas y una cadena beta individual. Las cadenas alfa y beta tienen pesos moleculares de 70 kD y 45 kD, respectivamente. Ambas subunidades pertenecen a una superfamilia de proteínas compuestas predominantemente de repeticiones consensúales cortas (SCR, por sus siglas en inglés) ordenadas en tándem de aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, el material en fase sólida se enlaza a al menos uno de los contaminantes por medio de la captura covalente. La Proteína S tiene una porción de cisteína libre, mientras que el Factor VII no tiene ninguna. La porción de cisteína libre entonces puede unirse selectivamente a una sustancia tiolada activada o una matriz de intercambio de tiol-disulfuro, con la formación de un disulfuro mezclado. Por esto, debe ser posible reducir la Proteína S por ejemplo por medio de la cromatografía covalente, cromatografía de exclusión de tamaño o procesos de membrana. Se debe entender que una variante de esta modalidad es aquella donde no está implicado un material en fase sólida, es decir donde la formación de disulfuro (por ejemplo por medio de la formación de dímeros) hace posible separar el contaminante proteínico de la proteína dependiente de la Vitamina K de interés por otros medios, por ejemplo por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño o procesos de membrana. En una modalidad particular, la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un constituyente de un sobrenadante de cultivo de células, véase la sección "Experimentales". En otra modalidad del método definido aún más anteriormente, el material en fase sólida enlaza una cantidad relativamente más alta de la proteína dependiente de la Vitamina K de interés en comparación con el (los) contaminante (s) proteínico (s) . Más particularmente, el material en fase sólida se enlaza específicamente a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés. En una variante, el material en fase sólida está llevando anticuerpos monoclonales producidos contra la proteína dependiente de la Vitamina K de interés o un análogo de la misma. En otra variante, el material en fase sólida está llevando un inhibidor para la proteína dependiente de la Vitamina K de interés, por ejemplo un inhibidor tipo benzamidina o guanidina tales como aquellos que comprenden una configuración -C (=N-Z1-R1) -NH-Z2-R2, en donde Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -0-, -S-, -NRH- y un enlace individual, donde RH se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, arilo y arilmetilo y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de 2 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, o Z2 y R2 son como se definiera anteriormente y -C=N-Z1-R1 forma parte de un anillo heterocíclico, o Z1 y R1 son como se definiera anteriormente y -C-NH-Z2-R2 forma parte de un anillo heterocíclico, o -C (=N-Z1-R1) -NH-Z2-R2 forma un anillo heterocíclico en donde -Z1-R1-R2-Z2- es un bi-radical. En aún otras variantes, el material en fase sólida está llevando un metal en el cual tiene la capacidad de quelación con la proteína dependiente de la Vitamina K de interés (donde la elución subsecuente se puede realizar por medio del cambio de pH o con un amortiguador como imidazol), o está llevando el factor de tejido inmovilizado (tromboplastina) (en este ejemplo se descubre que los polipéptidos del Factor VII se enlazan al factor de tejido con una afinidad mucho más grande que los contaminantes proteínicos como la Proteína S, razón por la cual será posible reducir el contenido de, por ejemplo, la Proteína S por medio del enlace de, por ejemplo, un polipéptido del Factor VII al factor de tejido inmovilizado (véase también el documento US 6,573,056)) o está llevando heparina inmovilizada (véase la sección "Experimentales") o está llevando fosfatidilserina (la fosfatidilserina se enlaza al dominio Gla de las proteínas que comprenden el dominio Gla como las proteínas dependientes de la Vitamina K solo en ausencia de calcio; en presencia de calcio, la fosfatidilserina se enlaza al dominio EGF (el Factor VII tiene 2 bucles de EGF y la Proteína S tiene 4 bucles de EGF) , de esta manera, será posible separar el Factor VII y los contaminantes proteínicos como la Proteína S debido a la diferente afinidad por la fosfatidilserina, especialmente en presencia de calcio) . En otra modalidad, el material en fase sólida es hidroxiapatita . En otra modalidad del método definido aún más anteriormente, el material en fase sólida es un material cromatográfico. Los ejemplos de materiales en fase sólida adecuados son, por ejemplo, aquellos seleccionados de materiales de intercambio aniónico, materiales de intercambio catiónico, hidroxiapatita, materiales en fase sólida hidrófobos, etc., véase la sección de "Experimentales".

Varios aspectos particulares de la invención serán descritos en lo siguiente.

Inmunoafinidad utilizando un anticuerpo monoclonal para un contaminante proteínico De acuerdo con este aspecto de la presente invención, al menos uno de los contaminantes proteínicos es enlazado por un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales. De esta manera, la composición puede ponerse en contacto simplemente con el material en fase sólida y puede separarse subsecuentemente del material en fase sólida para obtener al menos una composición menos contaminada. El acoplamiento de anticuerpos monoclonales a un material en fase sólida se puede realizar por vía de grupos reactivos colocados sobre el material en fase sólida. Las matrices utilizadas mucho más típicas son soportes activados por bromuro de cianógeno (CNBr) o N-hidroxi-succinimida (NHS) (Wilchek M. y colaboradores, Reactive & Functional Polymers. 1999, 41,263-268). Respecto a los soportes activados por CNBr y NHS, el acoplamiento ocurre por vía de grupos amino primarios en el anticuerpo lo que conduce a un enlace de isourea con el grupo CNBr y un enlace de amida con el grupo NHS. La solución de anticuerpo se disuelve o se dialisa en un amortiguador de acoplamiento adecuado, por ejemplo NaHC03 0.2 M. NaCl 0.5 M pH 8.3, los amortiguadores con grupos amino primarios no pueden utilizarse. El pH de acoplamiento depende del anticuerpo y el soporte activado pero normalmente se puede utilizar pH 6-9. A fin de conservar la estabilidad del soporte activado antes de utilizarlo se lava con 10-15 volúmenes de medios de HCl 1 mM helado. Inmediatamente después, el soporte de lavado es transferido a la solución de anticuerpo y se mezcla suavemente y se ajusta al nivel de pH deseado. La mezcla de acoplamiento se deja con rotación suave ya sea algunas horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C. Después de que se completa el acoplamiento, cualquier grupo sin reaccionar sobre el soporte es bloqueado por medio del reposo por ejemplo en un amortiguador de Tris, etanolamina o glicina pH 8-9 durante algunas horas a temperatura ambiente. Después del bloqueo, el soporte es lavado utilizando un método que alterna un pH alto y un pH bajo con por ejemplo el amortiguador de bloqueo y un amortiguador de acetato pH 3-4. Una modalidad particular se refiere a un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes proteínicos en una primera composición (tal como un sobrenadante de cultivo de células) que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición (tal como una composición no purificada) con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra al menos uno de los contaminantes proteínicos y (ii) separar la segunda composición resultante de esta manera del material en fase sólida para obtener una composición en donde el niv l de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5. De esta manera, se descubre que es muy benéfico utilizar directamente un sobrenadante de cultivo de células, es decir sin ningún paso de purificación anterior. Esto puede ser debido al hecho que el (los) contaminante (s) proteínico (s) puede (n) ser escindido (s) al menos parcialmente por la proteína dependiente de la Vitamina K de interés si el sobrenadante de cultivo de células es procesado antes de la aplicación del presente método por medio del cual surge una mezcla más compleja de contaminantes proteínicos. De esta manera, puede ser aún más difícil reducir el contenido de contaminantes proteínicos cuando existe esta mezcla compleja. No obstante, se debe entender que la presente invención también proporciona un método alternativo en donde se aplican los mismos pasos, pero donde la composición líquida que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés no es necesariamente un constituyente de un sobrenadante de cultivo de células obtenido directamente de un cultivo de células . El (los) contaminante (s) proteínico (s) es (son) típicamente proteínas de células hospederas y, de esta manera, el anticuerpo monoclonal es producido típicamente contra un contaminante proteínico seleccionado de proteínas de células hospederas, tales como contaminantes proteínicos que contienen el dominio Gla, en particular un contaminante proteínico seleccionado de GAS-6, Proteína S, Factor II (Protrombina) , Factor X/Xa, Factor IX/IXa, Proteína C, Factor Vlla, Proteína Z, proteína 1 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 2 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 3 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 4 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína Gla de Matriz y Osteocalcina, más particularmente la Proteína S. Como se mencionara anteriormente, la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es típicamente un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada. En una modalidad más particular, la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. En otra modalidad más particular, la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. En una modalidad, una cantidad predominante de contaminantes proteínicos son los polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S y la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. No obstante, el método hace posible producir un nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés en la cual ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000. En particular, el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición (purificada) es a lo sumo 100 ppm, tal como a lo sumo 90 ppm, o a lo sumo 80 ppm, o a lo sumo 70 ppm, o a lo sumo 60 ppm, o a lo sumo 50 ppm, o a lo sumo 40 ppm, o a lo sumo 30 ppm, o a lo sumo 20 ppm, o a lo sumo 10 ppm o a lo sumo 5 ppm; o el contenido total de contaminantes de Proteína S en la segunda composición (purificada) es a lo sumo 100 ppm, tal como a lo sumo 90 ppm, o a lo sumo 80 ppm, o a lo sumo 70 ppm, o a lo sumo 60 ppm, o a lo sumo 50 ppm, o a lo sumo 40 ppm, o a lo sumo 30 ppm, o a lo sumo 20 ppm, o a lo sumo 10 ppm o a lo sumo 5 ppm. Los sobrenadantes de cultivo de células típicos pueden tener una cantidad significativa de contaminantes proteínicos (en particular la Proteína S) , de esta manera, el contenido total de contaminantes proteínicos en un sobrenadante de cultivo de células (tal como un sobrenadante de cultivo de células no purificado) es típicamente al menos 500 ppm, tal como al menos 750 ppm, o al menos 1000 ppm, o al menos 2000 ppm; o el contenido total de contaminantes de Proteína S en el sobrenadante de cultivo de células no purificado es al menos 500 ppm, tal como al menos 750 ppm, o al menos 1000 ppm, o al menos 2000 ppm. Una modalidad particular de este aspecto de la presente invención se refiere a un método para reducir el contenido de contaminantes de Proteína S en un sobrenadante de cultivo de células que comprende un polipéptido del Factor VII, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición, tal como un sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra el (los) contaminante (s) de la Proteína S y (ii) separar la segunda composición resultante de esta manera del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) de la Proteína S expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII de interés ha sido reducido por al menos un factor de 50.

Proteína C Inmovilizada De acuerdo con este aspecto de la presente invención, al menos uno de los contaminantes proteínicos es enlazado por un material en fase sólida que lleva la Proteína C inmovilizada. De esta manera, la composición puede ponerse en contacto simplemente con el material en fase sólida y puede separarse subsecuentemente del material en fase sólida para obtener al menos una composición menos contaminada. Más particularmente, la invención proporciona un método para reducir el contenido de contaminantes proteínicos en una composición que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida que lleva la Proteína C inmovilizada y (ii) separar la segunda composición resultante de esta manera del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5, tal como un método para reducir el contenido de Proteína S en una composición que comprende un polipéptido del Factor VII, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida que lleva la Proteína C inmovilizada y (ii) separar la segunda composición resultante de esta manera del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10. Se debe entender que los métodos anteriores para la reducción del contenido de contaminante (s) proteínico (s) se pueden utilizar solos o en combinación, tal como en combinación. Los pasos de cromatografía individuales se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado. En base a estudios preliminares, se cree que las siguientes combinaciones proporcionan una reducción total excelente del contenido de contaminante (s) proteínico (s) : • cromatografía de intercambio catiónico — > inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico — > cromatografía de intercambio aniónico • cromatografía de intercambio catiónico — > cromatografía de interacción hidrófoba —> cromatografía de intercambio aniónico • cromatografía de intercambio catiónico ? cromatografía de interacción hidrófoba — inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico —> cromatografía de intercambio aniónico • cromatografía de intercambio aniónico — > inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra una proteína de interés -> inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contaminantes —> cromatografía de intercambio aniónico —> cromatografía de interacción hidrófoba cromatografía de intercambio aniónico — > cromatografía de interacción hidrófoba - cromatografía de intercambio catiónico • cromatografía de intercambio aniónico — cromatografía de interacción hidrófoba —> inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra contaminantes proteínicos -» cromatografía de intercambio catiónico • cromatografía de intercambio aniónico —> inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra una proteína de interés — cromatografía de intercambio aniónico -» cromatografía de interacción hidrófoba • cromatografía de intercambio catiónico — hidroxiapatita — cromatografía de intercambio aniónico • cromatografía de intercambio catiónico —» hidroxiapatita -> inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico - cromatografía de intercambio aniónico • inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra una proteína de interés -» cromatografía de interacción hidrófoba ? cromatografía de intercambio aniónico -> inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico —> cromatografía de intercambio aniónico • inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclinales contra una proteína de interés —> cromatografía de intercambio aniónico —> cromatografía de interacción hidrófoba — > inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico -» cromatografía de intercambio aniónico • hidroxiapatita —» cromatografía de interacción hidrófoba - cromatografía de intercambio catiónico — cromatografía de intercambio aniónico • hidroxiapatita - inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico — > cromatografía de intercambio catiónico — > cromatografía de intercambio aniónico • inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico — cromatografía de interacción hidrófoba -» cromatografía de intercambio aniónico • inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico —> cromatografía de interacción hidrófoba -> filtración en gel -> cromatografía de intercambio aniónico • inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra un contaminante proteínico — > cromatografía de intercambio catiónico -> cromatografía de interacción hidrófoba - cromatografía de intercambio aniónico • inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra una proteína de interés — cromatografía de intercambio aniónico —> cromatografía de interacción hidrófoba -» cromatografía de intercambio catiónico En una modalidad particular, la inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales contra una proteína de interés se utiliza como el primer paso del proceso de purificación. De esta manera, se descubre que es muy benéfico utilizar directamente un sobrenadante de cultivo de células, es decir sin ningún paso de purificación anterior. Se debe entender que la reducción del (los) contaminante (s) proteínico (s) es típicamente por al menos un factor de 2, tal como por al menos un factor de 5, en cada uno de los pasos de los métodos de múltiples pasos descritos anteriormente.

Composiciones novedosas que comprenden una proteína dependiente de la Vi tamina K de interés Se cree que los métodos de la presente invención dan origen a composiciones de proteínas dependientes de la Vitamina K, en particular polipéptidos del Factor VII, los cuales son novedosos por sí mismos. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés producida bajo condiciones de cultivo de células, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos es a lo sumo 100 ppm en base al contenido de la proteína dependiente de la Vitamina K de interés. En la mayoría de modalidades de este documento, el contenido de los contaminantes proteínicos está en el rango de 0.01-100 ppm, tal como 0.01-50 ppm, por ejemplo 0.05-25 ppm, o 0.05-20 ppm, o 0.05-15 ppm, o 0.05-10 ppm, o 0.05-5 ppm. Un aspecto alternativo de la presente invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido del Factor VII obtenido a partir de un cultivo de células no humanas libre de suero, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S es a lo sumo 100 ppm en base al contenido del polipéptido del Factor VII. En la mayoría de modalidades de este documento, el contenido de los contaminantes proteínicos está en el rango de 0.01-100 ppm, tal como 0.01-50 ppm, por ejemplo 0.05-25 ppm, o 0.05-20 ppm, o 0.05-15 ppm, o 0.05-10 ppm, o 0.05-5 ppm. En los aspectos anteriores, la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es típicamente un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de los polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada. En una modalidad más particular, la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. En otra modalidad más particular, la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII . Una modalidad más particular de lo anterior se refiere a una composición que comprende un polipéptido del Factor VII producido bajo condiciones de cultivo de células, en donde el contenido total de contaminantes de la Pro teína S es a lo sumo 100 ppm en base al contenido del polipéptido del Factor VII .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención es ilustrada adicionalmente por las siguientes modalidades : 1 . Un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes proteínicos en una composición que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés , el método comprende al menos los pasos que consisten en ( i ) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida el cual tiene la capacidad de enlazar uno o más de estos contaminantes proteínicos y/o la proteína dependiente de la Vitamina K de interés y ( ii ) recolectar una segunda composición resultante que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés, por lo cual el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido de la primera composición a la segunda composición resultante por al menos un factor de 2, tal como al menos 5, tal como al menos 10, tal como al menos 20, tal como al menos 50, tal como al menos 100. 2. El método de acuerdo con la modalidad 1, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es a lo sumo 100 ppm. 3. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-2, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada. 4. El método de acuerdo con las modalidades 1-3, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. 5. El método de acuerdo con la modalidad 1-3, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII, tal como el Factor Vlla humano de tipo natural. 6. El método de acuerdo con la modalidad 5, en donde el polipéptido del Factor VII comprende una sustitución de aminoácido seleccionada de P10Q y K32E. 7. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-6, en donde la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son los polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S, y en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. 8. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-7, en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000, o al menos un factor de 5000. 9. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-8, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es a lo sumo 100 ppm, tal como a lo sumo 50 ppm, tal como a lo sumo 10 ppm, tal como a lo sumo 5 ppm, tal como a lo sumo 2 ppm, tal como a lo sumo 1 ppm.

. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-9, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en la primera composición es al menos 500 ppm. 11. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-10, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S en la primera composición es al menos 500 ppm. 12. Un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes de Proteína S en una composición que comprende un polipéptido del Factor VII, el método comprende al menos los pasos que consisten en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida el cual es capaz de enlazar el (los) contaminante (s) de Proteína S y/o del polipéptido del Factor VII y (ii) recolectar una segunda composición resultante que comprende el polipéptido del Factor VII, por lo cual el nivel de contaminante (s) de Proteína S expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII ha sido reducido por al menos un factor de 2, tal como 5. 13. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11 y 12, en donde el material en fase sólida enlaza una cantidad relativamente más alta del contaminante proteínico en comparación con la proteína dependiente de la Vitamina K de interés. 14. El método de acuerdo con la modalidad 13, en donde el material en fase sólida se enlaza específicamente a al menos uno de los contaminantes, por ejemplo por medio de una afinidad fuerte o por medio del enlace covalente del (los) contaminante (s) , tal como por medio de la formación de enlaces de disulfuro para las porciones de tiol del (los) contaminante (s) . 15. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13 y 14, en donde el material en fase sólida está llevando anticuerpos monoclonales producidos contra al menos uno de los contaminantes proteínicos. 16. El método de acuerdo con la modalidad 15, en donde la composición que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un constituyente de un sobrenadante de cultivo de células. 17. El método de acuerdo con la modalidad 14, en donde el material en fase sólida está llevando la Proteína C inmovilizada. 18. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11 y 12, en donde el material en fase sólida enlaza una cantidad relativamente más alta de la proteína dependiente de la Vitamina K de interés en comparación con el (los) contaminante (s) proteínico (s) . 19. El método de acuerdo con la modalidad 18, en donde el material en fase sólida enlaza específicamente la proteína dependiente de la Vitamina K de interés.

. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 18 y 19, en donde el material en fase sólida está llevando anticuerpos monoclonales producidos contra la proteína dependiente de la Vitamina K de interés o un análogo de la misma. 21. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 18 y 19, en donde el material en fase sólida es un ligando de triazina con afinidad por la proteína dependiente de la Vitamina K de interés o un análogo de la misma. 22. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 18 y 19, en donde el material en fase sólida está llevando un inhibidor para la proteína dependiente de la Vitamina K de interés, o está llevando un metal el cual tiene la capacidad de quelación con la proteína dependiente de la Vitamina K de interés, o está llevando un factor de tejido inmovilizado (tromboplastina) , o está llevando heparina inmovilizada . 23. El método de acuerdo con la modalidad 22, en donde el inhibidor para la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un inhibidor tipo benzamidina o guanidina tales como aquellos que comprenden una configuración -C (=N-Z1-R1) -NH-Z2-R2, en donde Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de -O-, -S-, -NRH- y un enlace individual, donde RH se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, arilo y arilmetilo y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, o Z2 y R2 son como se definiera anteriormente y -C=N-Z1-R1 forma parte de un anillo heterocíclico, o Z1 y R1 son como se definiera anteriormente y -C-NH-Z2-R2 forma parte de un anillo heterocíclico, o -C (=N-Z1-R1) -NH-Z2-R2 forma un anillo heterocíclico en donde -Z1-R1-R2-Z2- es un bi-radical. 24. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11 y 12, en donde el material en fase sólida es un material cromatográfico. 25. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11 y 12, en donde el material en fase sólida se enlaza a una membrana. 26. El método de acuerdo con la modalidad 22-23, en donde el material en fase sólida es un material de intercambio aniónico. 27. El método de acuerdo con la modalidad 26, en donde la elusión del intercambio aniónico se realiza al incrementar la concentración de una sal de calcio tal como CaCl2. 28. El método de acuerdo con la modalidad 26, en donde la elusión del intercambio aniónico se realiza al incrementar la concentración de una sal de magnesio tal como MgCl2. 29. El método de acuerdo con la modalidad 24, en donde el material en fase sólida es un material de intercambio catiónico. 30. El método de acuerdo con la modalidad 24, en donde el material en fase sólida es hidroxiapatita. 31. El método de acuerdo con la modalidad 24, en donde el material en fase sólida es un material en fase sólida hidrófobo. 32. Un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes proteínicos en una composición (en particular un sobrenadante de cultivo de células) que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra al menos uno de los contaminantes proteínicos y (ii) separar la segunda composición resultante del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5. 33. El método de acuerdo con la modalidad 32, en donde el anticuerpo monoclonal es producido contra un contaminante proteínico seleccionado de proteínas de células hospederas, tales como los contaminantes proteínicos que contienen el dominio Gla, en particular un contaminante proteínico seleccionado de GAS-6, Proteína S, Factor II (Protrombina) , trombina, Factor X/Xa, Factor IX/IXa, Proteína C, Factor VlI/VIIa, Proteína Z, proteína 1 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 2 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 3 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 4 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína Gla de Matriz y Osteocalcina, más particularmente Proteína S. 34. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 27-28, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada. 35. El método de acuerdo con la modalidad 29, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. 36. El método de acuerdo con la modalidad 29, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. 37. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 32-36, en donde la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son los polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S, y en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. 38. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 32-37, en donde la cantidad predominante de contaminantes proteínicos es la Proteína S de hámster. 39. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 32-38, en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000. 40. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 32-39, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante es a lo sumo 100 ppm. 41. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 32-40, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S en la segunda composición resultante es a lo sumo 100 ppm. 42. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 32-41, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en la primera composición es al menos 500 ppm. 43. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 32-42, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S en la primera composición es al menos 500 ppm. 44. Un método para reducir el contenido de contaminantes de Proteína S en una composición, tal como en un sobrenadante de cultivo de células, que comprende un polipéptido del Factor VII, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición, tal como un sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra el (los) contaminante (s) de Proteína S y (ii) separar una segunda composición resultante del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) de Proteína S expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII de interés ha sido reducido por al menos un factor de 50. 45. Un método para reducir el contenido de contaminantes proteínicos en una composición que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida que lleva la Proteína C inmovilizada y (ii) separar una segunda composición resultante del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5. 46. El método de acuerdo con la modalidad 45, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada. 47. El método de acuerdo con la modalidad 46, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. 48. El método de acuerdo con la modalidad 46, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. 49. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 45-48, en donde la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S y en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. 50. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 45-49, en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000. 51. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 45-50, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante es a lo sumo 100 ppm. 52. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 45-51, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S en la segunda composición resultante es a lo sumo 100 ppm. 53. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 45-52, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en la primera composición es al menos 500 ppm. 54. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 45-53, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S en la primera composición es al menos 500 ppm. 55. Un método para reducir el contenido de Proteína S en una composición que comprende un polipéptido del Factor VII, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida que lleva la Proteína C inmovilizada y (ii) separar la segunda composición resultante del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10. 56. Un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes proteínicos en un sobrenadante de cultivo de células que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto el sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra la proteína dependiente de la Vitamina K de interés o un análogo de la misma, (ii) lavar opcionalmente el material en fase sólida y (iii) eluir la proteína dependiente de la Vitamina K de interés del material en fase sólida para obtener una composición resultante en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5. 57. El método de acuerdo con la modalidad 56, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada. 58. El método de acuerdo con la modalidad 57, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. 59. El método de acuerdo con la modalidad 57, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. 60. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 56-59, en donde la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S, y en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. 61. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 56-60, en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000. 62. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 56-61, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en la composición resultante es a lo sumo 100 ppm. 63. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 56-62, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S en la composición resultante es a lo sumo 100 ppm. 64. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 56-63, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos en el sobrenadante de cultivo de células es al menos 500 ppm. 65. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 56-64, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S en el sobrenadante de cultivo de células es al menos 500 ppm. 66. Un método para reducir el contenido de contaminantes proteínicos en un sobrenadante de cultivo de células que comprende un polipéptido del Factor VII, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto de sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra el polipéptido del Factor VII o un análogo del mismo, (ii) lavar opcionalmente el material en fase sólida y (iii) eluir el polipéptido del Factor VII del material en fase sólida para obtener una composición resultante en donde el nivel de contaminantes proteínicos expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII ha sido reducido por al menos un factor de 100. 67. Un método para reducir el contenido de la Proteína S en un sobrenadante de cultivo de células que comprende un polipéptido del Factor VII, el método comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto el sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra el polipéptido del Factor VII o un análogo del mismo, (ii) lavar opcionalmente el material en fase sólida y (iii) eluir el polipéptido del Factor VII del material en fase sólida para obtener una composición resultante en donde el nivel de Proteína S expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII ha sido reducido por al menos un factor de 100. 68. Una composición que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés producida bajo condiciones de cultivo de células, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos es a lo sumo 100 ppm en base al contenido de la proteína dependiente de la Vitamina K de interés. 69. La composición de acuerdo con la modalidad 68, en donde el contenido de contaminantes proteínicos está en el rango de 0.01-100 ppm, tal como 0.01-50 ppm, por ejemplo 0.05-25 ppm, o 0.05-20 ppm, o 0.05-15 ppm, o 0.05-10 ppm, o 0.05-5 ppm. 70. Una composición que comprende un polipéptido del Factor VII obtenida a partir de un cultivo de células no humanas libre de suero, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S es a lo sumo 100 ppm en base al contenido del polipéptido del Factor VII. 71. Una composición que comprende un polipéptido del Factor IX, obtenida a partir de un cultivo de células no humanas libre de suero, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S es a lo sumo 100 ppm en base al contenido del polipéptido del Factor IX. 72. La composición de acuerdo con cualquiera de las modalidades 67-71, en donde el contenido de los contaminantes de Proteína S está en el rango de 0.01-100 ppm, tal como 0.01-50 ppm, por ejemplo 0.05-25 ppm, o 0.05-20 ppm, o 0.05-15 ppm, o 0.05-10 ppm, o 0.05-5 ppm. 73. La composición de acuerdo con cualquiera de las modalidades 67-72, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada. 74. La composición de acuerdo con la modalidad 73, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX. 75. La composición de acuerdo con la modalidad 73, en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII. 76. Una composición que comprende un polipéptido del Factor VII producido bajo condiciones de cultivo de células, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S es a lo sumo 100 ppm, tal como en el rango de 0.01-100 ppm, en base al contenido del polipéptido del Factor VII.

EXPERIMENTALES Anticuerpos monoclonales anti Proteína S de hámster Estos anticuerpos han sido desarrollados utilizando ratones RBF inmunizados con una acumulación de Proteína S de hámster aislada de la producción de SF-Factor Vlla y al utilizar una técnica de fusión que involucra mielomas FoxNy como compañero de fusión para los esplenocitos de RBF. Los anticuerpos monoclonales reconocen cualquier epítopo fuera del sitio de escisión de trombina así como también fuera del área de enlace de C4BP. Además, los anticuerpos monoclonales pueden ser independientes de Ca2+ así como también dependientes de Ca2+. El anticuerpo monoclonal puede ser de cualquier clase de Ig. Los anticuerpos monoclonales anti Proteína S de hámster independientes de Ca2+ están propuestos para utilizarse para la detección de la contaminación de Proteína S de hámster en cualquier fármaco producido a partir de células de CHO. Además, la intención es utilizar los anticuerpos monoclonales anti Proteína S de hámster dependientes de Ca2+ para el aislamiento y la purificación de la Proteína S de hámster de la producción de fármacos generados por medio de células de CHO y en particular para reducir (tal como eliminar) el contenido de Proteína S en composiciones de proteína dependiente de la Vitamina K. Los ratones RBF se inmunizaron con Proteína S de hámster aislada de la producción de SF-Factor Vlla (acumulación del lote HW3-029, contiene <1% del Factor Vlla) . Después de 6 semanas, se realizaron dos fusiones utilizando los mielomas FoxNy. Se aislaron varios hibridomas y se sometieron a prueba por su capacidad de enlace a la Proteína S bajo concentraciones variantes de Ca2+ que variaban de la ausencia de Ca2+ a una concentración de Ca2+ de Ca2+ 35 mM. Cuatro anticuerpos monoclonales (ProS-1 F18, ProS-1 F22, ProS-2 F32 y ProS-2 F46) se seleccionaron por su independencia a Ca y se trataron para ser del isotipo ya sea IgGl o IgG2a. Un ensayo ELISA de emparedado se desarrolló utilizando dos (ProS-1 F18 y ProS-2 F32) de los cuatro anticuerpos independientes a Ca2+ para la determinación de la contaminación de Proteína S de hámster en la dependencia a Ca2+ ya que estos dos anticuerpos mostraron buena cooperación. La afinidad relativa de los cuatro anticuerpos monoclonales independientes a Ca2+ fue muy baja. Además, se ha mostrado que no existe una reactividad cruzada hacia el Factor Vlla. Un anticuerpo monoclonal, ProS-1 F22, se utilizó en un ensayo ELISA para la detección de la Proteína S humana. F22 no reconoció del todo la Proteína S humana. Más probablemente este también es el caso para los anticuerpos monoclonales. Además se han desarrollado tres anticuerpos dependientes a Ca2+, ProS-2 F15, ProS-2 F35 y ProS-2 F44, ninguno de los cuales se enlaza a ninguna Proteína S en presencia de Citrato 20 mM, es decir cuando no está presente Ca2+. La capacidad de enlace de los tres anticuerpos a la Proteína S varía con la concentración de Ca2+ (variando de Ca2+ 2.5 mM a 35 mM) , pero todos son significativamente diferentes de cuando no está presente Ca2+. Los tres anticuerpos han sido congelados hasta nuevo aviso.

Determinación del contenido de Proteína S de hámster, ELISA utilizando anticuerpos monoclonales El contenido relativo de Proteína S de hámster se determina con un ensayo ELISA de emparedado utilizando dos diferentes anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se desarrollaron en ratones utilizando Proteína S purificada de células de CHO. Una placa de microtítulo Nunc maxisorbMR de 96 pocilios se reviste con el anticuerpo ProS-2-F32, la función del anticuerpo es capturar el antígeno. El procedimiento de revestimiento es como sigue: 100 µl de una solución que contiene aproximadamente 5 µg/ml de ProS-2-F32 (una solución madre con 1.93 mg/ml se diluye 1:386 en Na2HC03 0.1 M pH 9.8) se aplica a cada pocilio en la placa de microtítulo Nunc de 96 pocilios, se agrega un sellador de placa en la parte superior de la placa y la placa se incuba durante toda la noche entre 1 y 9°C. Día 2, después de la incubación primaria, la solución se desecha y cada uno de los pocilios se bloquea como sigue: Agregar 350 µl de amortiguador de bloqueo (Amortiguador de fosfato con solución salina (PBS) , fosfato 0.010 M y NaCl 0.15 M, Tween 20 al 0.1%, pH 7.2) a cada pocilio y un sellador de placa a la placa y se incuba la misma durante 1 hora a temperatura ambiente, donde la temperatura ambiente se define que está entre 18 y 25°C. Después de que se completa el tiempo de incubación de bloqueo, se desecha la solución y se lava cada pocilio tres veces independientes utilizando 350 µl de un amortiguador de lavado (fosfato 0.010 M y NaCl 0.15 M, Tween 20 al 0.05%, pH 7.2) . Los calibradores y las muestras se diluyen apropiadamente en un amortiguador de Tris que contenía citrato (Tris 0.010 M; NaCl 0.15 M, citrato 0.050 M, Tween 20 al 0.1% v/v, pH 8.6), los controles se diluyen en el amortiguador de Tris con una proteína portadora (Tris 0.010 M, NaCl 0.15 M, Tween 20 al 0.1% v/v, BSA al 1%, pH 8.0). 100 µl de cada uno de los calibradores, controles y muestras se aplican a la placa NuncMR, se agrega un sellador de placa y la placa se incuba durante toda la noche entre 1 y 9°C. Día 3. Los pocilios se vacían y la placa se lava 3 veces, como antes utilizando el amortiguador de lavado de PBS y el anticuerpo etiquetado con biotina ProS-l-F18 se agrega para la detección del complejo de antígeno-anticuerpo. La solución de anticuerpo ProS-l-F18 etiquetada con biotina se diluye 1:1000 en TBS, (Tris 0.010 M; NaCl 0.15 M, Tween 20 al 0.1%, pH 8.6) y se agregan 100 µl a cada pocilio, se aplica el sellador de placa y la placa se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución se desecha y se lava la placa 3 veces, como antes utilizando 350 µl del amortiguador de lavado de PBS. Aplicar 100 µl de una solución de Peroxidasa de Rábano Picante-avidina D, diluida 1:10000 en TBS (Tris 0.010 M; NaCl 0.15 M, Tween 20 al 0.1%, pH 8.6), aplicar el sellador de placas e incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar la placa 3 veces con PBS, amortiguador de lavado y finalmente agregar 100 µl de substrato de TMB. Incubar la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, agregar 100 µl de ácido fosfórico 2 M para detener la reacción y medir la absorbancia a 450 nm utilizando 620 nm como referencia.

Determinación del contenido de Proteína S de hámster, ELISA utilizando anticuerpos policlonales: El contenido de Proteína S de hámster se determinó en un ensayo ELISA de emparedado basado en anticuerpos policlonales . Revestimiento con anticuerpos primarios: Una microplaca Nunc maxisorb1® de 96 pocilios se revistió con el anticuerpo policlonal Rb-a-Hu Proteína S (código de DakoCytomation número A0384). La solución de anticuerpo, la cual tenía una concentración de proteína de 4.1 mg/ml, se diluyó en amortiguador de revestimiento (Amortiguador de bicarbonato, pH 9.6; 3.03 g de Na2C03; 5.98 g de NaHC03; Agua para 1 1) a 5.0 µg/ml (que correspondía a una dilución 1:820). Se agregaron 100 µl a cada pocilio, excepto los pocilios Al y A2, los cuales se utilizaron como modelos. La placa se incubó durante toda la noche a 4°C. A la mañana siguiente, la solución se desechó y la placa se lavó 3 veces (350 µl) con amortiguador de lavado (Tween/PBS) . La placa (excepto los pocilios Al y A2) se bloqueó subsecuentemente utilizando el amortiguador de dilución (BSA/Tween/PBS) . La placa se dejó bloquear a temperatura ambiente durante 1 hora con un sellador de placa, antes de que se lavara 3 veces (350 µl) con amortiguador de lavado (T^mortiguador de lavado (PBSyTween , pH 7. 4) ; 16.0 g de NaCl; 0.40 g de KH2P04; 2.30 g de Na2HP04; 0.40 g de KCl; 1 ml de tween 20; Agua para 2 1) . Muestras, Controles y estándares: Un estándar de proteína S con una concentración de 1120 µg/ml se diluyó en amortiguador de dilución (Amortiguador de dilución (BSA/Tween/PBS) : 0.5 g de albúmina de suero bovino (Sigma, A- 7030) ; Amortiguador de lavado para 100 ml) a una concentración de 25 ng/ml (1: 44800). Este estándar se diluyó adicionalmente en amortiguador de dilución por pasos de 2 veces al estándar más bajo de 0.78 ng/ml. El control positivo consiste de Proteína S humana (American Diagnostica, código 443) la cual se diluyó en amortiguador de dilución a una concentración de 2.5 ng/ml. Un control de conjugado se agregó al adicionar solo amortiguador de dilución a un par de pocilios. Las muestras se diluyeron en amortiguador de dilución, teniendo como objetivo una concentración entre 1 y 10 ng/ml, lo cual corresponde a la sección lineal de la curva estándar. Todos los estándares, controles y muestras se colocaron sobre la placa como duplicados y se incubaron durante toda la noche con un sellador de placa a 4°C. Incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP: Los pocilios se vaciaron y la placa se lavó 3 veces, como antes utilizando el amortiguador de lavado de Tween/PBS. La Rb-a-Proteína S humana, HRP (código de DakoCytomation número P0419) se diluyó 1000 veces en amortiguador de dilución y se agregaron 100 µl a cada pocilio excepto A1+A2. La placa se dejó incubar sobre un agitador durante una hora a temperatura ambiente antes de que se lavara 3 veces (350 µl) con amortiguador de lavado. Detección: 100 µl de solución de substrato se agregaron a todos los pocilios. La solución de substrato consistía de 4 tabletas de OPD, 2 mg cada una, (código de DakoCytomation S2045) en 12 ml de agua extremadamente pura y 5 µl de H202 al 30% inmediatamente antes del uso. La reacción se dejó proseguir durante 25 minutos antes de que se detuviera al agregar 50 µl de H2S04 2.5 M por pocilio. La placa se leyó en un lector de microplacas a 492 nm.

A. Inmunoafinidad utilizando Anticuerpos Monoclonales anti-Proteína S Ejemplo 1 La reducción de la Proteína S se realiza en una columna activada con NHS HiTrapMR de Amersham (volumen de columna de 1 ml (CV, por sus siglas en inglés) ) acoplada con anticuerpos monoclonales (MAb) producidos en ratones contra la Proteína S de hámster (0.4 mg de MAb por ml de columna empacada) . La columna se equilibra con 10 CV de Na2HP0 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5 y la carga es 100 CV de una solución con una conductividad de 14 mS/cm que contenía 1.49 mg/ml del Factor Vlla y un contenido de Proteína S mayor que 300 ppm (el calcio es quelado con citrato) seguido por un lavado de 10 CV de Na2HP04 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5. El paso completo es operado a una velocidad de flujo de 60 CV/hora y una temperatura de 5°C. Las trazas pequeñas de la proteína S y el Factor Vlla son eluídas con Na2HP04 20 mM, NaCl 2 M pH 7.2 (confirmado por medio de SDS-PAGE/tinción de plata) , subsecuentemente la Proteína S enlazada es eluida con citrato 50 mM pH 3.0 y una pequeña fracción del Factor Vlla (<1% de la cantidad de la carga) es desorbida con glicina 50 mM pH 2.0. La columna es re-equilibrada con 10 CV de Na2HP0 , NaCl 150 mM pH 7.5. Un nivel de Proteína S inferior a 30 ppm, es decir una reducción por un factor de al menos 10, se mide por medio de un ensayo ELISA en el funcionamiento directo.

Ejemplo 2 La reducción de la Proteína S se realiza en una columna activada con NHS HiTrapMR de Amersham (volumen de columna de 1 ml (CV) ) acoplada con anticuerpos monoclonales (MAb) producidos en ratones contra la Proteína S de hámster (0.4 mg de MAb por ml de columna empacada). La columna se equilibra con 10 CV de Tris 15 mM, NaCl 150 mM pH 7.5 y la carga es 108 CV de una solución con una conductividad de 12 mS/cm que tenía un contenido de Proteína S mayor que 150 ppm (calcio 10 mM presente) seguido por un lavado de 10 CV de Tris 15 mM, NaCl 150 mM pH 7.5. La carga y el lavado se conducen a una velocidad de flujo de 24 CV/hora, el resto del programa a 60 CV/hora y una temperatura de 5°C. La columna se limpia con 15 CV de citrato 50 mM pH 3.0 luego se re-equilibra con 10 CV de Tris 15 mM, NaCl 150 mM pH 7.5 y finalmente se limpia con 12 CV de glicina 50 mM pH 2.0 y se re-equilibra con 10 CV de Tris 15 mM, NaCl 150 mM pH 7.5. Un nivel de Proteína S inferior a 15 ppm, es decir una reducción por un factor de al menos 10, se mide por medio de un ensayo ELISA en el funcionamiento directo.

Ejemplo 3 La reducción de la Proteína S se realizó en medios Sepharose 4 FF"R activados con CNBr de GE Healthcare inmovilizados con un anticuerpo monoclonal (MAb) producido en ratones contra la Proteína S de hámster (0.8 mg de MAb de Proteína S por ml de medios) . La columna (1 ml) se equilibró con 10 CV de Tris 75 mM, tri-Na-citrato 30 mM pH 7.5 y la carga fue 32 CV de una solución con un contenido de Proteína S de 665 ng/ml « 485 ng/mg de rFVIIa seguido por un lavado con 20 CV de Tris 75 mM, tri-Na-citrato 30 mM pH 7.5. La columna se regeneró con 10 CV de glicina 50 mM pH 2.0 y se re-equilibró con 8 CV de Tris 75 mM, tri-Na-citrato 30 mM pH 7.5. Un nivel de Proteína S de 2.6 ng/ml « 3 ng/mg de rFVIIa, es decir una reducción por un factor de al menos 160, se midió por medio de un ensayo ELISA en la fracción de funcionamiento directo. La carga y el lavado se realizaron a una velocidad de flujo de 7.2 CV/hora, el resto del programa a 40 CV/hora. La temperatura fue 5°C.

Ejemplo 4 Como una alternativa para una columna de lecho empacado, la reducción de la Proteína S se realizó en una unidad de membrana activada con epoxi SartoriusMR (volumen de membrana = 2.1 ml) inmovilizada con un anticuerpo monoclonal (MAb) producido en ratones contra la Proteína S de hámster (1 mg de MAb de Proteína S por unidad de membrana) . La membrana se equilibró con 10 MV (volumen de membrana) de Tris 75 mM, tri-Na-citrato 30 mM pH 7.5 y la carga fue 14 MV de una solución con un contenido de Proteína S de 683 ng/ml « 502 ng/mg de rFVIIa seguido por un lavado con 8 MV de Tris 75 mM, tri-Na-citrato 30 mM pH 7.5. La membrana se regeneró con 10 MV de glicina 50 mM pH 2.0 y se re-equilibró con 8 MV de Tris 75 mM, tri-Na-citrato 30 mM pH 7.5. Un nivel de Proteína S de 9.1 ng/ml « 8 ng/mg de rFVIIa, es decir una reducción por un factor de al menos 62, se midió por medio de un ensayo ELISA en la fracción de funcionamiento directo. El proceso de la membrana se realizó a una velocidad de flujo de 143 MV/hora y a una temperatura de 5°C.

Ejemplo 5: Purificación de una solución de FIX La reducción de la Proteína S se realiza en una columna de Sepharose FFMR activada con NHS de Amersham (volumen de columna de 0.9 ml (CV) ) acoplada con anticuerpos monoclonales (MAb) producidos en ratones contra la Proteína S de hámster (0.8 mg de MAb por ml de columna empacada). La columna se equilibra con 10 CV de Tris 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5. BeneFIX (1000 IE; Lote no. LE 07D002AF) se suspendió en 10 mL de agua como se describe por el folleto del empaque. 5 mL de esta solución que contenía aproximadamente 2 mg de FIX se cargaron en la columna. El contenido de proteína S se midió por medio de un ensayo ELISA monoclonal a 230 ng/mL, aproximadamente 1150 ng de Proteína S en total. La columna se lavó con 10 CV de amortiguador de equilibrio y se eluyó con Tris 15 mM, NaCl 2 M, pH 7.5. Se encontró FIX en las fracciones de lavado y elución. El contenido de proteína S se midió por medio de un ensayo ELISA monoclonal a 26 y 52 ng en las fracciones de lavado y elución, respectivamente.

B. Croma tografía de Intercambio Tin ion ico Ejemplo 6 - Realización de una cromatografía de intercambio aniónico a pH 8.6 La cromatografía de intercambio aniónico se realizó en una columna (1 cm de diámetro interior x 1.3 cm de longitud = volumen de columna de 1.0 ml (CV) ) empacada con Q-Sepharose FF11 de Amersham, equilibrada con 5 CV de glicilglicina 10 mM, NaCl 175 mM, 8.6. La carga fue 35 ml de una solución que tenía un contenido de Proteína S mayor que 300 ppm. La columna se lavó con 7 CV de glicilglicina 10 mM, NaCl 175 mM y 4 CV de glicilglicina 10 mM, NaCl 50 mM. La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de 20 CV de CaCl2 0 mM a CaCl2 15 mM, amortiguado con glicilglicina que contenía NaCl 50 mM. La purificación se realizó a una velocidad de flujo de 40 CV/hora y a una temperatura de 5°C. La acumulación contenía un nivel de Proteína S inferior a 30 ppm, es decir una reducción por un factor de al menos 10.

Ejemplo 7 - Realización de una cromatografía de intercambio aniónico a pH 8.6 para la purificación de una solución de FIX utilizando la elución de NaCl La cromatografía de intercambio aniónico se realizó en una columna (0.5 cm de diámetro interno x 5 cm de longitud = volumen de columna de 1.0 ml (CV) ) empacada con Q-Sepharose FF"11 de Amersham, equilibrada con 10 CV de Tris 10 mM, NaCl 175 mM, 8.6. BeneFIX (1000 IE; Lote no. LE 07D051AD) se suspendió en 10 mL de agua como se describe por el folleto del empaque. 3 mL de esta solución que contenía aproximadamente 1.2 mg de FIX se cargaron en la columna. El contenido de Proteína S se midió por medio de un ensayo ELISA policlonal a 280 ng/mL, un total de 840 ng en la solución de carga. La columna se lavó con 7 CV de amortiguador de equilibrio seguido por el lavado con 3 CV de Tris 15 mM, NaCl 50 mM, pH 8.6. La columna se lavó subsecuentemente con este amortiguador de lavado mientras que se incrementaba la cantidad de CaCl2 (3-5-7-9 mM) en pasos isocráticos de 5 CV seguido por 10 CV de Tris 15 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 15 mM. La elución de FIX se realizó por medio de Tris 10 mM, NaCl 1 M. La SDS-PAGE mostró una banda débil en la última fracción de lavado con el amortiguador que contenía CaCl2 15 mM. La cantidad de Proteína S en la fracción de elución se midió por medio de un ensayo ELISA policlonal siendo menor que 1.5 ng/mL o menor que 7.5 ng.

Ejemplo 8 - Realización de una cromatografía de intercambio aniónico a pH 8.0 para la purificación de un polipéptido de FVII que comprende las sustituciones de aminoácidos P10Q y K32E La cromatografía de intercambio aniónico se realizó en una columna (1 cm de diámetro interno x 3.2 cm de longitud = volumen de columna de 2.5 ml (CV) ) empacada con Q-Sepharose FF*11* de Amersham, equilibrada con 10 CV de Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8. A 150 mL de sobrenadante de cultivo que contenía la variante de FVII con las mutaciones P10Q, K32E se agregaron 2.2 mL de una solución de EDTA 0.5 M. La conductividad se ajustó por la adición de 260 mL de agua para inyección (WFI, por sus siglas en inglés) . El contenido de Proteína S se midió por medio de un ensayo ELISA a 284 ng/mL o 97 microgramos en total. La columna se lavó con 10 CV de Tris 10 mM, NaCl 175 mM, pH 8 seguido por el lavado con amortiguador de equilibrio. La elución se realizó por medio de Tris 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 35 mM, pH 8. El contenido de Proteína S se midió por medio de un ensayo ELISA policlonal a 18 µg en la acumulación de la elución. La purificación se realizó a una velocidad de flujo de 24 CV/hora y a temperatura ambiente.

Ejemplo 9 - Realización de una cromatografía de intercambio aniónico a pH 6.0 utilizando una elución de gradiente de MgCl2 La cromatografía de intercambio aniónico se realizó en una columna (1 cm de diámetro interno x 3.2 cm de longitud = volumen de columna de 2.5 ml (CV) ) empacada con Q-Sepharose FFMR de Amersham, equilibrada con 10 CV de histidina 10 mM, NaCl 175 mM, pH 6.8 mL de una solución que contenía 1.6 mg/mL de polipéptido de FVII se cargaron en la columna. El contenido de Proteína S se midió por medio de un ensayo ELISA a 360 ng/mL o 2900 ng en total. La columna se lavó con 10 CV de amortiguador de equilibrio seguido por el lavado con 5 CV del amortiguador de lavado de histidina 10 mM, NaCl 50 mM, pH 6. La elución se realizó por medio de un gradiente del amortiguador de lavado a histidina 10 mM, MgCl2 50 mM, pH 6. El contenido de Proteína S se midió por medio de un ensayo ELISA policlonal a 790 ng en la acumulación de la elución. La purificación se realizó a una velocidad de flujo de 24 CV/hora y a 5°C.

Ejemplo 10 -Realización de una cromatografía de intercambio aniónico a pH 9.0 La cromatografía de intercambio aniónico se realizó a pH 9.0 en una columna (0.5 cm de diámetro interno x 5.5 cm de longitud = volumen de columna de 1.0 ml (CV) ) empacada con Source 30QMR de Amersham, equilibrada con 10 CV de Tris 10 mM, CaCl2 2 mM. La carga fue 8 ml de una solución que contenía 1 mg/ml de FVII y un contenido de Proteína S mayor que 10 ppm. La columna se lavó con 5 CV de Tris 10 mM, CaCl2 2 mM. La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de 50 CV de NaCl 0 mM a NaCl 600 mM, amortiguado con Tris que contenía CaCl2 2 mM. El nivel de Proteína S en las fracciones recolectadas se evaluó utilizando un ensayo ELISA de Proteína S. La Proteína S se eluyó en el borde delantero del pico principal que contenía > 99% de FVII. La purificación se realizó a una velocidad de flujo de 60 CV/hora y a una temperatura de 5CC.

C. Cromatografía de Interacción Hidrófoba Ejemplo 11 - Realización de la cromatografía de interacción hidrófoba La cromatografía de interacción hidrófoba se realizó a pH 6.0 en una columna (2.6 cm de diámetro interno x 8.5 cm de longitud = volumen de columna de 45.1 ml (CV) ) empacada con Toso Haas TSK-Gel phenyl 5 PW, equilibrada con 10 CV de citrato 10 mM, NH4-acetato 1.7 M. La carga fue 215 ml de una solución que contenía aproximadamente 700 µg/ml de FVII y un contenido de Proteína S mayor que 200 ppm. A la solución de carga se agregó NH4-acetato 1.7 M. La columna se lavó con 5 CV de citrato 10 mM, NH4-acetato 1.7 M. La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de 20 CV de NH4-acetato 1.7 M a NH4-acetato 0 M, amortiguado con citrato. La acumulación contenía un nivel de Proteína S inferior a 100 ppm, es decir una reducción por un factor de al menos 2. La purificación se realizó a una velocidad de flujo de 20 CV/hora y a una temperatura de 5°C.

Ejemplo 12 - Realización de la HIC en presencia de Ca2"1" La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) se realiza en una columna (1 cm de diámetro interno x 7 cm de longitud = 5.5 ml) empacada con resina Toyopearl MD-G ButylMR. La columna se equilibra con 10 CV de CaCl2 35 mM, NaCl 1.5 M, histidina 10 mM, pH 6.0. Después del equilibrio, 42 ml de una solución que contenía 0.1 mg/ml de FVIIa se cargan en la columna. Después de la carga, la columna se lava con 10 CV del amortiguador de equilibrio. El FVII(a) enlazado se eluye utilizando EDTA 20 mM, histidina 50 mM, pH 6.0. Una acumulación que contenía FVII(a) se recolecta con un contenido reducido de Proteína S.

D-l . Inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales anti-FVIIa dependientes de Ca2+ Ejemplo 13 - Realización de la captura por inmunoafinidad a pH 6 Una porción de 1500 ml de sobrenadante de cultivo de CHO Kl se estabilizó por medio de la adición de calcio a una concentración de Ca2+ 10 mM y por medio de la adición de amortiguador de histidina a una concentración de 10 mM, se ajustó con HCl a pH 6.0 y se filtró a través de un filtro sin salida de 0.45 micrómetros. El sobrenadante de cultivo estabilizado se cargó en una columna (1.6 cm de diámetro interno x 10 cm de longitud = CV de 20 ml) empacada con un anticuerpo monoclonal anti-FVIIa dependiente de Ca2+, se inmovilizó en Sepharose AB1^ de Pharmacia. Antes de la carga, la columna se equilibró con 5 CV de CaCl2 10 mM, histidina 10 mM, pH 6.0. Después de la carga, la columna se lavó con NaCl 2 M, CaCl2 10 M, histidina 10 mM, pH 6.0 para 10 CV. El FVII(a) enlazado se eluyó con 10 CV de EDTA 30 mM, histidina 50 mM, pH 6.0. Una acumulación que contenía FVII(a) se recolectó de aproximadamente 0.1 AU (280 nm) en el borde delantero del pico principal a aproximadamente 0.1 AU (280 nm) en el borde posterior. Se utilizó una velocidad de flujo de 12 CV/hora y una temperatura de 5°C por toda la purificación. Los niveles de Proteína S se determinaron por medio de un ensayo ELISA de Proteína S, basado en anti-huPS policlonal.

D-2. Purificación por afinidad utilizando ligandos inmovilizados Ejemplo 14 - Purificación por afinidad de un análogo de FVII utilizando análogos de benzamidina inmovilizados Una columna HiTrapMR (GE Healthcare) activada con NHS con un volumen de columna de 1 ml (CV) se acopló con el análogo de benzamidina (Fórmula 1 o Fórmula 2) . La columna se equilibró con 5 CV de HEPES 50 M, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, Tween 80 al 0.01%, pH 7.5. La columna se cargó con 0.5 CV de una solución que contenía un análogo de FVII y 200 mg/L de Proteína S, a pH 7.5. Después de la carga, la columna se lavó con 6 CV de amortiguador de equilibrio. La elución se realizó con 5 CV de HAc 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, Tween 80 al 0.01%, pH 4.4 y 4 CV de Gly-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, Tween 80 al 0.01%, pH 3.0. El eluato se ajustó a pH 6, poco después de la elución. La velocidad de flujo fue 30 CV por hora y la conducción se realizó a temperatura ambiente. La mayor parte de la Proteína S no se enlazó a la resina y se observó en el flujo directo y el lavado. Se observó lo opuesto para FVII donde la mayor parte se enlazó a la resina y se eluyó con la disminución en el pH. El contenido de Proteína S en las fracciones de elución se midió por medio de un ensayo ELISA monoclonal siendo de aproximadamente 150 ng y 180 ng utilizando columnas inmovilizadas con un compuesto de la fórmula 1 o la fórmula 2, respectivamente. Fórmula 1 : Fórmula 2 Ejemplo 15. Purificación por afinidad de la proteína S utilizando ligandos de triazina inmovilizados (modo de flujo directo) La purificación se realizó en una columna (1 cm de diámetro interior x 6.2 cm de longitud = volumen de columna de 5 mL (CV) ) empacada con ACL 5/5MR (ProMetic), equilibrada con 10 CV de Tris 20 M, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, pH 8.5. La carga fue 43 mL de una solución que contenía más de 40000 ppm de Proteína S. La columna se lavó con 2 CV de Tris 20 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, pH 8.5. La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de 40 CV de Tris 20 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, pH 8.5 a Tris 20 mM, NaCl 1 M, CaCl25 mM, pH 8.5. Una acumulación que contenía el FVII se recolectó proporcionando un eluato que contenía un nivel de Proteína S inferior a 7000 ppm de proteína S.

E. Cromatografía de Intercambio Catiónico Ejemplo 16 - Intercambiador de cationes Obelix CIÉ de Amersham número de catálogo 11-0010 Los medios de cultivo se cargaron en la resina de intercambio catiónico. La columna se equilibró con NaAc 30 mM pH 7.0. La velocidad de flujo fue 48 CV/H a temperatura ambiente. Después de la carga, la resina se lavó con amortiguador de equilibrio seguido por el lavado con NaAc 1M pH 7 para 5-10 volúmenes de columna. El amortiguador de equilibrio se aplicó nuevamente para 10 volúmenes de columna. El producto se eluyó con NaAc 30 mM, NaCl 2 M, pH 6.3 o amortiguador de Tris a pH más alto y NaCl. La acumulación se recolectó en una base de UV y se enfrió inmediatamente. La proteína S se eluyó en los pasos de lavado. La columna se limpia con NaOH 1 M después del uso. Alternativamente, se agregó NaAc a la aplicación a 1M a pH 7 y se lavó con el mismo amortiguador. El amortiguador de equilibrio fue NaAc 1M pH 7.0. Después de la aplicación, el material no enlazado se deslavó con amortiguador de equilibrio. Un lavado con NaAc 30 mM pH 6.3 se condujo para 10 cv y el producto se eluyó por medio de NaAc 30 mM, NaCl 2M pH 6.3 o amortiguador de Tris a pH más alto y NaCl. La acumulación se recolectó en una base de UV. 8 La proteína S se eluye en los pasos de lavado. La resina también se utilizó de la siguiente manera: Se equilibró con NaAc 30 mM pH 6.0 y se aplicó el producto (conductividad inferior a 10 mS/cm) . Los materiales no enlazados se deslavaron con amortiguador de equilibrio y la elución se realizó al incrementar el gradiente de NaCl. La velocidad de flujo fue 30 cv/hora a temperatura ambiente. La acumulación se recolectó en una base de UV. La Proteína S se eluyó en el frente del producto.

Ejemplo 17 - SP-Sepharose HPMR, Amersham número de catálogo 17-1087 La columna se equilibró con Mes 50 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 2.5 mM, pH 5.75. La aplicación se ajustó a una conductividad menor que 10 mS/cm. El material no enlazado se deslavó con amortiguador de equilibrio y luego el producto se eluyó al incrementar la concentración de NaCl. La velocidad de flujo fue 48 volúmenes de columna por hora y la purificación se realizó en una habitación fría. La proteína S se eluye en las fracciones de funcionamiento directo. La columna se limpió con NaOH 1M después del uso.

Ejemplo 18 - Toyopearl SP 650 M La reducción de la Proteína S de una mezcla que comprendía aproximadamente 25 mg/l de FVII y 25 mg/l de Proteína S se realizó en una columna Toyopearl SP 650 MMR (Tosoh Bioscience) de 1 ml (0.5 cm de diámetro interno x 5 cm de altura del lecho) . La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna (CV) de solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6 y 0.5 ml de la mezcla que comprendía FVII y Proteína S se cargaron en la columna. La columna se lavó/eluyó con 1 CV de solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6 seguido por un lavado/elución de gradiente de NaCl 0-1 M en solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6. El paso de purificación completo se operó a una velocidad de flujo de 48 CV/hora a temperatura ambiente. La proteína S se eluyó en el flujo directo y FVII durante la elución de gradiente. La separación de la proteína S y FVII se identificó y se confirmó por medio del análisis de SDS-PAGE nativo, estándar con tinción de plata y por medio de una conducción de purificación paralela que cargaba un estándar de FVII. La columna se equilibró con 3 CV de NaOH 0.1 M, seguido por 10 CV de amortiguador de NaCl 1.5 M + histidina 25 mM, pH 6.

Ejemplo 19 - CM Sepharose FFEM La reducción de la Proteína S de una mezcla que comprendía aproximadamente 25 mg/l de FVII y 25 mg/l de Proteína S se realizó en una columna CM Sepharose FF"1* (GE Health Care) de 1 ml (0.5 cm de diámetro interno x 5 cm de altura del lecho) . La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna (CV) de solución amortiguadora de histidina 40 mM, pH 6, y 0.5 ml de la mezcla que comprendía FVII y Proteína S se cargaron en la columna. La columna se lavó/eluyó con 1 CV de solución amortiguadora de histidina 40 mM, pH 6 seguido por un lavado/elución de gradiente de NaCl 0-0.35 en solución amortiguadora de histidina 40 mM, pH 6. El paso de purificación completo se operó a una velocidad de flujo de 48 CV/hora a temperatura ambiente. La Proteína S se eluyó en el flujo directo y el FVII durante la elución de gradiente. La separación de la Proteína S y FVII se identificó y se confirmó por medio del análisis de SDS-PAGE nativo, estándar con tinción de plata. La columna se equilibró con 3 CV de NaOH 0.1 M, seguido por 10 CV de amortiguador de NaCl 1.5 M + histidina 25 mM, pH 6.

Ejemplo 20 - CM Sepharose FE1" La reducción de la Proteína S de una mezcla que comprendía aproximadamente 25 mg/l de FVII y 25 mg/l de Proteína S se realizó en una columna CM Sepharose FF"8 (GE Health Care) de 1 ml (0.5 cm de diámetro interno x 5 cm de altura del lecho) . La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna (CV) de solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6 y 0.5 ml de la mezcla que comprendía FVII y Proteína S se cargaron en la columna. La columna se lavó/eluyó con 1 CV de solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6 seguido por un lavado/elución de gradiente de NaCl 0-0.35 en solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6. El paso de purificación completo se operó a una velocidad de flujo de 48 CV/hora a temperatura ambiente. La Proteína S se eluyó en el flujo directo y FVII durante la elución de gradiente. La separación de la Proteína S y FVII se identificó y se confirmó por medio del análisis de SDS-PAGE nativo, estándar con tinción de plata. La columna se equilibró con 3 CV de NaOH 0.1 M, seguido por 10 CV de amortiguador de NaCl 1.5 M + histidina 25 mM, pH 6.

Ejemplo 21 - Toyopearl SP 650 MMR La reducción de la Proteína S de una mezcla que comprendía aproximadamente 25 mg/l de FVII y 25 mg/l de Proteína S se realizó en una columna Toyopearl SP 650 MMR (Tosoh Bioscience) de 1 ml (0.5 cm de diámetro interno x 5 cm de altura del lecho) . La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna (CV) de solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6 y 0.5 ml de la mezcla que comprendía FVII y Proteína S se cargaron en la columna. La columna se lavó/eluyó con 1 CV de solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6 seguido por un lavado/elución de gradiente de NaCl 0-0.35 M en solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6.

El paso de purificación completo se operó a una velocidad de flujo de 48 CV/hora a temperatura ambiente. La Proteína S se eluyó en el flujo directo y FVII durante la elución de gradiente. La separación de la Proteína S y FVII se identificó y se confirmó por medio del análisis de SDS-PAGE nativo, estándar con tinción de plata. La columna se equilibró con 3 CV de NaOH 0.1 M, seguido por 10 CV de amortiguador de NaCl 1.5 M + histidina 25 mM, pH 6.

Ejemplo 22 - Capto MMCMR Los medios cromatográficos se empacaron en una columna de 1.6 cm de diámetro a una altura del lecho de 10 cm. La purificación se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 20 volúmenes de columna por hora, a aproximadamente 5°C. La columna se equilibró en NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM e histidina 20 mM, pH 6.0. Al sobrenadante de cultivo que comprendía FVII se agregó CaCl2 e histidina a concentraciones de 5 y 10 mM respectivamente, se ajustó a pH 6.0 y se cargó en la columna. La carga de columna específica fue aproximadamente 1.3 mg de FVII por mL de lecho empacado. Después de la carga, la columna se lavó con amortiguador de equilibrio, seguido por NaCl 0.8 M, CaCl2 10 mM, histidina 20 mM, pH 6.6, seguido por amortiguador de equilibrio, seguido por NaCl 0.5 M, histidina 25 mM, pH 5.8. El FVII se eluyó de la columna con NaCl 0.5 M, histidina 25 mM, pH 6.8. La Proteína S se encontró enriquecida en el flujo directo durante la carga y en la fracción de lavado con NaCl 0.8 M, CaCl2 10 mM, histidina 20 mM, pH 6.6.

F. Cromatografía utilizando un material de Hidroxiapatita Ejemplo 23 - Columna de hidroxiapatita, BioRad número de catálogo 157-0085 Tipo I 80 um La aplicación se ajusta respecto al pH y luego se aplica directamente sobre la resina la cual es equilibrada anteriormente. La velocidad de flujo es 42 volúmenes de columna por hora a 4-20 °C. Deslavar con amortiguador de equilibrio (agua) hasta la línea de referencia y luego eluir el producto con un gradiente creciente de amortiguador de K2HP04/KH2P04 a 400 mM a pH 6.2. La acumulación se recolecta en una base de UV y se enfría inmediatamente. La Proteína S se eluye en la parte posterior del producto. La columna se limpia con NaOH 1M después del uso.

G. Cromatografía de Afinidad de Heparina Ejemplo 24 - Heparina Toyopearl 650 MMR del sobrenadante de La reducción de la Proteína S de una mezcla que comprendía aproximadamente 25 mg/l de FVII y 25 mg/l de Proteína S se realizó en una columna Heparina Toyopearl 650 MMR (Tosoh Bioscience) de 1 ml (0.5 cm de diámetro interno x 5 cm de altura del lecho) . La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna (CV) de solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6 y, 0.5 ml de la mezcla que comprendía FVII y Proteína S se cargaron en la columna. La columna se lavó/eluyó con 1 CV de solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6 seguido por un lavado/elusión de gradiente de NaCl 0-0.35 en solución amortiguadora de histidina 10 mM, pH 6. El paso de purificación completo se operó a una velocidad de flujo de 48 CV/hora a temperatura ambiente. La Proteína S se eluyó antes del FVII durante la elución de gradiente. La separación de la Proteína S y FVII se identificó y se confirmó por medio del análisis de SDS-PAGE nativo, estándar con tinción de plata. La columna se equilibró con 3 CV de NaOH 0.1 M, seguido por 10 CV de amortiguador de NaCl 1.5 M + histidina 25 mM, pH 6.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (76)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes proteínicos en una composición que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, caracterizado porque comprende al menos los pasos que consisten en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida el cual tiene la capacidad de enlazar uno o más de estos contaminantes proteínicos y/o la proteína dependiente de la Vitamina K de interés y (ii) recolectar una segunda composición resultante que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés, por lo cual el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido de la primera composición a la segunda composición resultante por al menos un factor de 2, tal como al menos 5, tal como al menos 10, tal como al menos 20, tal como al menos 50, tal como al menos 100.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es a lo sumo 100 ppm.
3. 3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada.
4. 4. El método de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX.
5. 5. El método de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII, tal como el Factor Vlla humano de tipo natural.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII comprende una sustitución de aminoácido seleccionada de P10Q y K32E.
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son los polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S, y en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII.
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000, o al menos un factor de 5000.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es a lo sumo 100 ppm, tal como a lo sumo 50 ppm, tal como a lo sumo 10 ppm, tal como a lo sumo 5 ppm, tal como a lo sumo 2 ppm, tal como a lo sumo 1 ppm.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en la primera composición es al menos 500 ppm.
11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el contenido total de contaminantes de Proteína S en la primera composición es al menos 500 ppm.
12. 12. Un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes de Proteína S en una composición que comprende un polipéptido del Factor VII, caracterizado porque comprende al menos los pasos que consisten en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida el cual es capaz de enlazar el (los) contaminante (s) de Proteína S y/o del polipéptido del Factor VII y (ii) recolectar una segunda composición resultante que comprende el polipéptido del Factor VII, por lo cual el nivel de contaminante (s) de Proteína S expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII ha sido reducido por al menos un factor de 2, tal como 5.
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y 12, caracterizado porque el material en fase sólida enlaza una cantidad relativamente más alta del contaminante proteínico en comparación con la proteína dependiente de la Vitamina K de interés.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el material en fase sólida se enlaza específicamente a al menos uno de los contaminantes, por ejemplo por medio de una afinidad fuerte o por medio del enlace covalente del (los) contaminante (s) , tal como por medio de la formación de enlaces de disulfuro para las porciones de tiol del (los) contaminante (s) .
15. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque el material en fase sólida está llevando anticuerpos monoclonales producidos contra al menos uno de los contaminantes proteínicos.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la composición que comprende la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un constituyente de un sobrenadante de cultivo de células.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el material en fase sólida está llevando la Proteína C inmovilizada.
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y 12, caracterizado porque el material en fase sólida enlaza una cantidad relativamente más alta de la proteína dependiente de la Vitamina K de interés en comparación con el (los) contaminante (s) proteínico (s) .
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el material en fase sólida enlaza específicamente la proteína dependiente de la Vitamina K de interés .
20. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizado porque el material en fase sólida está llevando anticuerpos monoclonales producidos contra la proteína dependiente de la Vitamina K de interés o un análogo de la misma.
21. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizado porque el material en fase sólida es un ligando de triazina con afinidad por la proteína dependiente de la Vitamina K de interés o un análogo de la misma.
22. 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizado porque el material en fase sólida está llevando un inhibidor para la proteína dependiente de la Vitamina K de interés, o está llevando un metal el cual tiene la capacidad de quelación con la proteína dependiente de la Vitamina K de interés, o está llevando un factor de tejido inmovilizado (tromboplastina) , o está llevando heparina inmovilizada.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el inhibidor para la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un inhibidor tipo benzamidina o guanidina tales como aquellos que comprenden una configuración -C (=N-Z1-R1) -NH-Z2-R2, en donde Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de -O-, -S-, -NRH- y un enlace individual, donde RH se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, arilo y arilmetilo y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, o Z2 y R2 son como se definiera anteriormente y -C=N-Z1-R1 forma parte de un anillo heterocíclico, o Z1 y R1 son como se definiera anteriormente y -C-NH-Z2-R2 forma parte de un anillo heterocíclico, o -C (=N-Z1-R1) -NH-Z2-R2 forma un anillo heterocíclico en donde -Z1-R1-R2-Z2- es un bi-radical.
24. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y 12, caracterizado porque el material en fase sólida es un material cromatográfico.
25. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y 12, caracterizado porque el material en fase sólida se enlaza a una membrana.
26. 26. El método de conformidad con las reivindicaciones 22-23, caracterizado porque el material en fase sólida es un material de intercambio aniónico.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la elusión del intercambio aniónico se realiza al incrementar la concentración de una sal de calcio tal como CaCl2.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la elusión del intercambio aniónico se realiza al incrementar la concentración de una sal de magnesio tal como MgCl2.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el material en fase sólida es un material de intercambio catiónico.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el material en fase sólida es hidroxiapatita.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el material en fase sólida es un material en fase sólida hidrófobo.
32. 32. Un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes proteínicos en una composición (en particular un sobrenadante de cultivo de células) que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, el método está caracterizado porque comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra al menos uno de los contaminantes proteínicos y (ii) separar la segunda composición resultante del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es producido contra un contaminante proteínico seleccionado de proteínas de células hospederas, tales como los contaminantes proteínicos que contienen el dominio Gla, en particular un contaminante proteínico seleccionado de GAS-6, Proteína S, Factor II (Protrombina) , trombina, Factor X/Xa, Factor IX/IXa, Proteína C, Factor VII/Vlla, Proteína Z, proteína 1 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 2 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 3 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 4 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína Gla de Matriz y Osteocalcina, más particularmente Proteína S.
34. 34. El método de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 27-28, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII.
37. 37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-36, caracterizado porque la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son los polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S, y en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII.
38. 38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-37, caracterizado porque la cantidad predominante de contaminantes proteínicos es la Proteína S de hámster .
39. 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-38, caracterizado porque el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000.
40. 40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-39, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante es a lo sumo 100 ppm.
41. 41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-40, caracterizado porque el contenido total de contaminantes de Proteína S en la segunda composición resultante es a lo sumo 100 ppm.
42. 42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-41, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en la primera composición es al menos 500 ppm.
43. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-42, caracterizado porque el contenido total de contaminantes de Proteína S en la primera composición es al menos 500 ppm.
44. 44. Un método para reducir el contenido de contaminantes de Proteína S en una composición, tal como en un sobrenadante de cultivo de células, que comprende a polipéptido del Factor VII, caracterizado porque comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición, tal como un sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra el (los) contaminante (s) de Proteína S y (ii) separar una segunda composición resultante del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) de Proteína S expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII de interés ha sido reducido por al menos un factor de 50.
45. 45. Un método para reducir el contenido de contaminantes proteínicos en una composición que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, caracterizado porque comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida que lleva la Proteína C inmovilizada y (ii) separar una segunda composición resultante del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX.
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII.
49. 49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-48, caracterizado porque la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S y en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII.
50. 50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-49, caracterizado porque el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000.
51. 51. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-50, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en la segunda composición resultante es a lo sumo 100 ppm.
52. 52. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-51, caracterizado porque el contenido total de contaminantes de Proteína S en la segunda composición resultante es a lo sumo 100 ppm.
53. 53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-52, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en la primera composición es al menos 500 ppm.
54. 54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-53, caracterizado porque el contenido total de contaminantes de Proteína S en la primera composición es al menos 500 ppm.
55. 55. Un método para reducir el contenido de Proteína S en una composición que comprende un polipéptido del Factor VII, caracterizado porque comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto una primera composición con un material en fase sólida que lleva la Proteína C inmovilizada y (ii) separar la segunda composición resultante del material en fase sólida para obtener una composición en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10.
56. 56. Un método para reducir el contenido de uno o más contaminantes proteínicos en un sobrenadante de cultivo de células que comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, caracterizado porque comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto el sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra la proteína dependiente de la Vitamina K de interés o un análogo de la misma, (ii) lavar opcionalmente el material en fase sólida y (iii) eluir la proteína dependiente de la Vitamina K de interés del material en fase sólida para obtener una composición resultante en donde el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 5.
57. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada.
58. 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX.
59. 59. El método conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII.
60. 60. El método conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-59, caracterizado porque la cantidad predominante de contaminantes proteínicos son polipéptidos que contienen el dominio Gla, en particular la Proteína S, y en donde la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII.
61. 61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-60, caracterizado porque el nivel de contaminante (s) proteínico (s) expresado como partes por millón con relación a la proteína dependiente de la Vitamina K de interés ha sido reducido por al menos un factor de 10, o al menos un factor de 25, o al menos un factor de 50, tal como por al menos un factor de 100, o al menos un factor de 250, o al menos un factor de- 500, o al menos un factor de 750, o al menos un factor de 1000, o al menos un factor de 2000.
62. 62. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-61, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en la composición resultante es a lo sumo 100 ppm.
63. 63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-62, caracterizado porque el contenido total de contaminantes de Proteína S en la composición resultante es a lo sumo 100 ppm.
64. 64. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-63, caracterizado porque el contenido total de contaminantes proteínicos en el sobrenadante de cultivo de células es al menos 500 ppm.
65. 65. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-64, caracterizado porque el contenido total de contaminantes de Proteína S en el sobrenadante de cultivo de células es al menos 500 ppm.
66. 66. Un método para reducir el contenido de contaminantes proteínicos en un sobrenadante de cultivo de células que comprende un polipéptido del Factor VII, caracterizado porque comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto de sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra el polipéptido del Factor VII o un análogo del mismo, (ii) lavar opcionalmente el material en fase sólida y (iii) eluir el polipéptido del Factor VII del material en fase sólida para obtener una composición resultante en donde el nivel de contaminantes proteínicos expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII ha sido reducido por al menos un factor de 100.
67. 67. Un método para reducir el contenido de la Proteína S en un sobrenadante de cultivo de células que comprende un polipéptido del Factor VII, caracterizado porque comprende el paso que consiste en (i) poner en contacto el sobrenadante de cultivo de células con un material en fase sólida que lleva anticuerpos monoclonales producidos contra el polipéptido del Factor VII o un análogo del mismo, (ii) lavar opcionalmente el material en fase sólida y (iii) eluir el polipéptido del Factor VII del material en fase sólida para obtener una composición resultante en donde el nivel de Proteína S expresado como partes por millón con relación al polipéptido del Factor VII ha sido reducido por al menos un factor de 100.
68. 68. Una composición, caracterizada porque comprende una proteína dependiente de la Vitamina K de interés producida bajo condiciones de cultivo de células, en donde el contenido total de contaminantes proteínicos es a lo sumo 100 ppm en base al contenido de la proteína dependiente de la Vitamina K de interés.
69. 69. La composición de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque el contenido de contaminantes proteínicos está en el rango de 0.01-100 ppm, tal como 0.01-50 ppm, por ejemplo 0.05-25 ppm, o 0.05-20 ppm, o 0.05-15 ppm, o 0.05-10 ppm, o 0.05-5 ppm.
70. 70. Una composición, caracterizada porque comprende un polipéptido del Factor VII obtenida a partir de un cultivo de células no humanas libre de suero, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S es a lo sumo 100 ppm en base al contenido del polipéptido del Factor VII.
71. 71. Una composición, caracterizada porque comprende un polipéptido del Factor IX, obtenida a partir de un cultivo de células no humanas libre de suero, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S es a lo sumo 100 ppm en base al contenido del polipéptido del Factor IX.
72. 72. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-71, caracterizada porque el contenido de los contaminantes de Proteína S está en el rango de 0.01-100 ppm, tal como 0.01-50 ppm, por ejemplo 0.05-25 ppm, o 0.05-20 ppm, o 0.05-15 ppm, o 0.05-10 ppm, o 0.05-5 ppm.
73. 73. La composición de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 67-72, caracterizada porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un factor de coagulación dependiente de la Vitamina K seleccionado de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor X y Proteína C activada.
74. 74. La composición de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor IX.
75. 75. La composición de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la proteína dependiente de la Vitamina K de interés es un polipéptido del Factor VII.
76. 76. Una composición, caracterizada porque comprende un polipéptido del Factor VII producido bajo condiciones de cultivo de células, en donde el contenido total de contaminantes de Proteína S es a lo sumo 100 ppm, tal como en el rango de 0.01-100 ppm, en base al contenido del polipéptido del Factor VII.