CN106967150A - 二价阳离子结合蛋白在阴离子交换树脂上的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在阴离子交换树脂材料上纯化高纯度的二价阳离子结合蛋白的方法、用所述方法得到的二价阳离子结合蛋白和包含实施所述方法所用工具的试剂盒。

Description

二价阳离子结合蛋白在阴离子交换树脂上的纯化方法
本申请是国际申请日为2011年4月29日、国家申请号为201180032360.4（国际申请号为PCT/EP2011/056832）、发明名称为“二价阳离子结合蛋白在阴离子交换树脂上的纯化方法”的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及在阴离子交换树脂材料上高纯度地纯化二价阳离子结合蛋白的方法、涉及可用所述方法得到的二价阳离子结合蛋白和涉及包含实施所述方法所用工具(means)的试剂盒。
发明背景
到目前为止，许多哺乳动物蛋白如下在宿主细胞中产生：例如，用编码所述蛋白的DNA转染细胞并使重组细胞在有利于所述蛋白表达的条件下生长。由细胞分泌到细胞培养基中或存在于细胞内的蛋白可使用色谱技术，例如离子交换色谱、亲和色谱等，与培养基和其它组分分离。为了进一步的药学应用，纯化尤为重要。然而，目的蛋白完全纯化后，必须保持蛋白的生物学活性。
通过二价阳离子从阴离子交换树脂洗脱钙结合蛋白的概念在大概三十年前被首次报道。尽管从牛血浆成功分离了牛因子VII，人因子VII的纯化仍是有问题的，即，产生的物质仅为部分纯的或得到的量少使得其被表征为无可检测蛋白情况下的活性。本领域工作者通过将蛋白吸附到二价阳离子(即柠檬酸钡)然后通过阴离子交换色谱分离蛋白的方法成功从人血浆中分离了足够量的人因子VII(得率约为30%)。此外，借助常规的离子交换树脂，例如阴离子交换树脂和使用包含二价阳离子，例如钙离子(Ca2+)、钡离子(Ba2+)和锶离子(Sr2+)的洗脱液从产生具有不同比活的维生素K依赖性蛋白的细胞培养物中回收和纯化维生素K依赖性蛋白的方法是可用的。
此外，用于在溶液中纯化因子IX (FIX)的方法是可用的，其包括以下步骤：将包含FIX的溶液加样到阴离子交换树脂，用电导率低于从树脂洗脱FIX所需电导率的溶液洗涤阴离子交换树脂，以及用包含二价阳离子的第一洗脱液从阴离子交换树脂洗脱FIX，以形成第一洗出液。然后将第一洗出液加样到肝素或肝素样树脂以形成第二洗出液，将第二洗出液加样到羟磷灰石以形成第三洗出液，在洗涤步骤中利用高电导率洗涤剂。
因子IX (FIX)为凝血系统的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，属于肽酶家族S1。FIX为无活性的，除非被因子XIa或因子VIIa激活。其激活需要钙、膜磷脂和因子VIII。FIX缺乏导致隐性遗传性出血病症血友病B，其可通过给予翻译后修饰的(即磷酸化和硫酸化的)FIX成功治疗。
此外，因子VII (FVII)为在凝血级联中发挥重要作用的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，其中其与组织因子(TF)一起启动凝血过程。当血管损伤时，TF暴露于血液和循环FVII中。一旦与TF结合，FVII被凝血酶、因子Xa、IXa、XIIa和FVIIa-TF复合物(其底物为FX和FIX)活化为FVIIa。此外，膜联蛋白V为膜联蛋白类细胞蛋白，具有以钙依赖的方式结合磷脂酰丝氨酸并形成膜结合二维晶格的能力。其可在凝血、凋亡、吞噬作用和质膜衍生微粒形成中发挥作用。
因此，本发明的根本问题为提供高纯度地纯化二价阳离子结合蛋白的改良方法。上述技术问题在权利要求书描述的实施方案中得到解决。
发明概述
本发明涉及纯化二价阳离子结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a) 将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换树脂材料，任选用不存在二价阳离子的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料；和
(b) 用包含至少一种二价阳离子的洗脱液洗脱二价阳离子结合蛋白，以形成包含二价阳离子结合蛋白的洗出液；
其中步骤(b)中的洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高，或在不实施洗涤步骤的情况下，比步骤(a)中加样缓冲液的pH高。
此外，本发明涉及可用上述方法得到的纯化的二价阳离子结合蛋白，和包含实施上述方法所用工具的试剂盒。
发明详述
在一方面，本发明涉及纯化二价阳离子结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a) 将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换树脂材料，任选用不存在二价阳离子的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料；和
(b) 用包含至少一种二价阳离子的洗脱液洗脱二价阳离子结合蛋白，以形成包含二价阳离子结合蛋白的洗出液；
其中步骤(b)中的洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高，或在不实施洗涤步骤的情况下，比步骤(a)中加样缓冲液的pH高。
本文使用的术语“不存在二价阳离子”是指缓冲液中不存在游离二价阳离子和任何蛋白结合的二价阳离子，其中可存在与螯合剂或通过螯合剂例如EDTA络合的二价阳离子。
将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换树脂材料可通过任何本领域已知的方法实施。特别地，适合将二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换树脂材料的条件是本领域技术人员所熟知的。加样缓冲液电导率的特定条件使得产物的结合依赖于蛋白质和使用的阴离子交换树脂材料的特定性质(例如配体密度和配体呈递等)。二价阳离子结合到通常高度酸性区域的(即带负电的)蛋白。二价阳离子结合时负电荷被掩盖。然而，通过将不存在二价阳离子的二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换材料，例如，通过螯合剂(例如EDTA)脱去结合的二价阳离子，蛋白表面携带高度负电荷的块(patches)，使其与阴离子交换配体强结合。将蛋白加样到阴离子交换树脂材料的条件常常进一步需要pH和反荷离子(例如Cl-)浓度的平衡。反荷离子的化学还影响洗脱行为，例如Cl-携带一个负电荷，中性pH时磷酸盐携带两个负电荷。与Cl-相比后者可具有更高的洗脱能力，即使当导电率较低时也如此。
本发明使用的溶液和缓冲液的盐浓度通常在20-200 mM，优选100-150 mM范围内。
此外，用于本发明方法步骤(a)中将二价阳离子结合蛋白加样到阴离子交换材料，提供二价阳离子结合蛋白与阴离子交换材料结合的条件的合适的加样缓冲液是本领域所熟知的。例如，加样缓冲液可具有< pH 7.4，优选< pH 7.0，更优选< pH 6.5，最优选< pH6.0的pH。其可包含适合二价阳离子结合蛋白与阴离子交换树脂材料结合的任何盐浓度，可由本领域技术人员容易地确定。在一个优选的实施方案中，加样缓冲液可包含螯合剂，例如EDTA，优选2 mM EDTA。本发明方法中可加样到阴离子交换树脂材料的包含二价阳离子结合蛋白的加样缓冲液可包含例如20 mM Tris、150 mM NaCl和2 mM EDTA。
本发明方法任选包括用不存在二价阳离子的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料的步骤。该洗涤步骤可通过任何本领域已知的方法实施。用于从阴离子交换材料洗去杂质而基本上不洗脱二价阳离子结合蛋白的合适的洗涤缓冲液是本领域所熟知的。例如，洗涤缓冲液可具有< pH 7.4，优选< pH 7.0，更优选< pH 6.5，最优选< pH 6.0的pH。其可包含适合洗涤阴离子交换树脂材料而不洗脱显著量的二价阳离子结合蛋白的任何盐浓度，可由本领域技术人员容易地确定。例如，洗涤缓冲液可包含合适的缓冲剂，例如Tris或MES，优选20 mM Tris或20 mM MES。此外，其可包含螯合剂，例如EDTA，优选2 mM EDTA。此外，其可包含用于调节洗涤缓冲液电导率的合适的盐，例如NaCl，其可以如下浓度存在：<200 mM，优选100 mM - 200 mM，更优选150 mM - 200 mM，更优选170 mM - 190 mM，最优选175 mM - 185 mM。在本申请的另一个优选的实施方案中，洗涤缓冲液包含100 - 200 mMNaCl。盐浓度的绝对值取决于待纯化的二价阳离子结合蛋白，其中确定何种二价阳离子结合蛋白需要较低或较高的盐浓度以得到最佳纯度在本领域技术人员的知识范畴内。
此外，本发明方法在步骤(a)之后和步骤(b)之前可进一步包括至少一个额外的洗涤步骤，其中额外的洗涤缓冲液的电导率等于或小于洗脱液的电导率。该额外的洗涤步骤在不存在二价阳离子的情况下实施。在一个实施方案中，额外的洗涤缓冲液具有7.4的pH。额外的洗涤缓冲液可包含任何本领域技术人员已知的合适的盐浓度。此外，额外的洗涤缓冲液可包含缓冲剂，例如Tris (优选20 mM Tris)、HEPES、Tris/醋酸盐、组氨酸、Gly-Gly、MOPS或曲辛(Tricine) (通常浓度为5-50 mM)，以及可包含反荷离子，例如Cl-，其浓度提供比洗脱缓冲液低的电导率。在本发明一个优选的实施方案中，额外的洗涤缓冲液具有比洗脱液低的盐浓度。在另一个优选的实施方案中，额外的洗涤缓冲液包含螯合剂，例如EDTA，优选2 mM EDTA。
用包含至少一种二价阳离子的洗脱液洗脱二价阳离子结合蛋白以形成包含二价阳离子结合蛋白的洗出液可通过任何本领域已知的方法实施。然而，依照本发明，步骤(b)中的洗脱液具有比步骤(a)中的洗涤缓冲液高的pH，或在不实施洗涤步骤的情况下，比步骤(a)中的加样缓冲液高的pH。洗脱液优选具有≥ 7.4，更优选≥ 8.0的pH，步骤(a)中的洗涤缓冲液，或在不实施洗涤步骤的情况下，步骤(a)中的加样缓冲液具有≤ 7.4，更优选≤7.0，更优选≤ 6.5，最优选≤ 6.0的pH，只要步骤(b)中洗脱液的pH比步骤(a)中的洗涤缓冲液的pH高，或在不实施洗涤步骤的情况下，比步骤(a)中的加样缓冲液的pH高。在优选的实施方案中，步骤(b)中洗脱液的pH比步骤(a)中的洗涤缓冲液的pH(或在不实施洗涤步骤的情况下，比步骤(a)中的加样缓冲液的pH)高至少0.5个pH单位，优选1.0个pH单位，更优选至少1.5个pH单位，最优选至少2.0个pH单位。
如本文所使用的，洗脱液可包含适合从阴离子交换树脂材料洗脱二价阳离子结合蛋白而不洗脱显著量杂质的任何盐浓度，可由本领域技术人员容易地确定。例如，其可包含合适的缓冲剂，例如Tris (优选20 mM Tris)、HEPES、Tris/醋酸盐、组氨酸、Gly-Gly、MOPS或曲辛(浓度通常为5-50 mM范围)。其可还包含用于调节洗涤缓冲液的电导率的合适盐，例如NaCl，其可以> 150 mM，更优选> 180 mM，最优选> 195 mM的浓度存在。在本发明一个优选的实施方案中，本发明方法使用的所有缓冲液的电导率大致相同。在另一个优选的实施方案中，步骤(a)中的洗涤缓冲液，或在不实施洗涤步骤的情况下，步骤(a)中的加样缓冲液的电导率等于或小于步骤(b)中洗脱液的电导率。
本发明的洗脱液进一步包含至少一种二价阳离子。在一个优选的实施方案中，洗脱液包含选自Ca2+、Be2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Sr2+、Zn2+、Co2+、Ni2+和Cu2+或其组合的二价阳离子。洗脱液中存在的阳离子浓度优选为1-20 mM，更优选2 mM。阳离子以与阴离子形成的合适的盐的形式存在于洗脱液中。本领域技术人员已知合适的阴离子，包括例如基于硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐和硼酸盐的阴离子，或其组合。洗脱液中存在的包含二价阳离子的盐浓度可为1mM – 20 mM，优选2 mM。在一个优选的实施方案中，所述盐为CaCl2。在一个特别优选的实施方案中，洗脱液包含2 mM CaCl2。在进一步优选的实施方案中，洗脱液包含2 mM Ca2+，并且其pH比步骤(a)中的洗涤缓冲液的pH (或在不实施洗涤步骤的情况下，比步骤(a)中的加样缓冲液的pH)高至少0.5个pH单位，优选至少1.0个pH单位，更优选1.5个pH单位，最优选至少2.0个pH单位。
如本文所使用的，术语“阴离子交换树脂材料”无特定的限制。依照本发明，所述树脂包括任何本领域已知的适合阴离子交换色谱的材料，例如基于琼脂糖的色谱材料(例如琼脂糖凝胶，如Fast Flow或Capto)、聚合的合成材料(例如聚甲基丙烯酸酯，如Toyopearls)、聚苯乙烯/二乙烯基苯(例如Poros、Source)或纤维素(例如Cellufine)。在本发明一个具体的实施例中，阴离子交换树脂材料为琼脂糖凝胶，其基于改性的琼脂糖，其多糖链交联形成三维网络。在一个优选的实施方案中，阴离子交换树脂材料包括，但不限于，携带伯胺作为配体的树脂，例如氨基己基琼脂糖凝胶、苄脒琼脂糖凝胶、赖氨酸琼脂糖凝胶或精氨酸琼脂糖凝胶。在另一个优选的实施方案中，阴离子交换树脂材料包括，但不限于具有在中性pH时带正电部分的树脂，例如烷基氨基乙烷，如二乙基氨基乙烷(DEAE)、二甲基氨基乙烷(DMAE)或三甲基氨基乙基(TMAE)、聚乙烯亚胺(PEI)、季氨基烷基、季氨基乙烷(QAE)、季铵(Q)等。在一个特别优选的实施方案中，阴离子交换树脂材料为Q-SepharoseFast Flow (Q-Sepharose FF)。
本发明的二价阳离子结合蛋白可为任何二价阳离子结合蛋白，例如钙结合蛋白和/或维生素K依赖性蛋白。在一个优选的实施方案中，二价阳离子结合蛋白选自因子IX(FIX)、因子VII (FVII)和膜联蛋白V。
二价阳离子结合蛋白可使用本领域技术人员已知的方法获得，例如血浆衍生蛋白、转基因生产蛋白或重组生产蛋白，例如使用CHO细胞。用于从细胞培养物提取蛋白的分泌和非分泌方法是本领域技术人员所熟知的。其可包括任何本领域已知的用于以下的方法(i) 通过基因工程，例如通过RNA反转录和/或DNA扩增产生重组DNA，(ii) 通过转染，例如通过电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞，(iii) 例如以连续或分批方式培养所述转化细胞，(iv) 二价阳离子结合蛋白例如组成型或在诱导时的表达，和 (v) 例如从培养基或通过收获转化细胞分离蛋白以获得粗制的二价阳离子结合蛋白。此外，编码二价阳离子结合蛋白的重组DNA，例如质粒，可还包含编码用于选择已成功转染重组DNA的细胞的选择性标记的DNA序列。
可预纯化蛋白以减少杂质，例如通过凝胶电泳、色谱、凝胶过滤、离心、过滤、沉淀、结晶和任何其它本领域已知的方法。本文使用的术语“杂质”包括源自于二价阳离子结合蛋白的生产的任何杂质，可包括例如，宿主细胞蛋白杂质、核酸杂质、多肽杂质、缓冲液和盐杂质、源自细胞培养基的杂质、产物相关杂质例如二聚体或片段及其组合。
在一个优选的实施方案中，依照本发明方法纯化的二价阳离子结合蛋白具有相对于宿主细胞蛋白杂质而言至少95% w/w，更优选至少98% w/w，更优选至少99% w/w，最优选至少99.5% w/w二价阳离子结合蛋白/总蛋白的纯度。因此，在一个优选的实施方案中，纯化的二价阳离子结合蛋白中的杂质含量为少于5% w/w，更优选少于2% w/w，更优选少于1% w/w，最优选少于0.5% w/w。杂质的百分比值指产物，即纯化的二价阳离子结合蛋白的w/w，并且可例如通过HPLC或ELISA测量。
此外，在本发明的另一个方面，提供可通过本发明方法获得的纯化的二价阳离子结合蛋白，和包含实施本发明方法所用工具的试剂盒。特别地，本发明涉及包含包含至少一种二价阳离子的洗脱液的试剂盒，所述洗脱液适合从缓冲液中的阴离子交换树脂材料上洗脱二价阳离子结合蛋白，其中洗脱液的pH比缓冲液的pH高。例如，试剂盒可包含适合用本发明阴离子交换树脂材料纯化二价阳离子结合蛋白的加样缓冲液和/或洗脱液和/或洗涤缓冲液和/或额外的洗涤缓冲液。在一个优选的实施方案中，加样缓冲液、洗涤缓冲液和/或洗脱液如上所定义。此外，本发明试剂盒可包含合适的阴离子交换树脂材料。
本发明进一步涉及上文定义的本发明方法和/或上文定义的本发明试剂盒用于纯化二价阳离子结合蛋白的用途。
本发明提供使用阴离子交换树脂材料纯化二价阳离子结合蛋白的有效方法，使得过程相关的蛋白杂质高度减少并伴随高产物得率。
特别地，本发明方法基于下述原理。一般地，蛋白与阴离子交换树脂材料的结合在较低电导率和较高pH值时增加。反之亦然，蛋白与阴离子交换树脂材料的结合在较高电导率和较低pH值时降低。在本发明方法中，二价阳离子结合蛋白优选在低pH时加样和洗涤，其仍允许二价阳离子结合蛋白与阴离子交换材料的结合，并且不损害二价阳离子结合蛋白的结构完整性或活性。在这种条件下，许多蛋白杂质，特别是等电点(PI)比二价阳离子结合蛋白高的杂质，不与阴离子交换树脂材料结合，因此杂质与阴离子交换树脂材料的结合大大减少。在这些条件下不与阴离子交换树脂材料结合的蛋白杂质，即具有低PI的蛋白杂质，将不与二价阳离子结合蛋白一起洗脱，这是由于洗脱缓冲液pH的增加导致所有蛋白，包括二价阳离子结合蛋白与阴离子交换树脂材料的结合甚至更强。依照本发明方法，在这种洗脱条件下，由于洗脱缓冲液中存在二价阳离子，只有二价阳离子结合蛋白被特异性洗脱。在本文中，应指出的是，在增加的pH值下从阴离子交换树脂材料洗脱是很非典型的，这是因为，如前文所说明的，蛋白通常在较高的pH值下与阴离子交换树脂材料结合的更强。通过在上述条件下用包含至少一种二价阳离子的洗脱液特异性洗脱二价阳离子结合蛋白，本发明方法通过使用阴离子交换色谱的单一纯化步骤出人意料和有利地取得优良纯度的二价阳离子结合蛋白产物。
特别地，本发明通过增加本发明方法步骤(a)的加样步骤和/或洗涤步骤与洗脱二价阳离子结合蛋白步骤之间的pH有利地修饰了待纯化蛋白的表面电荷。当在高pH用二价阳离子实施待纯化蛋白的特异性洗脱时，洗脱步骤中增加的pH迫使杂质保持吸附在阴离子交换树脂材料上。特别地，对于驱使从阴离子交换树脂材料上洗脱，高pH通常为不利条件，这是因为在较高的pH值下蛋白与阴离子交换树脂材料更强地结合。然而，依照本发明，上述条件导致高纯度和高得率的二价阳离子结合蛋白。本发明方法可提供过程相关多肽杂质的显著减少，例如通过将中性pH的蛋白溶液加样到阴离子交换树脂材料，在降低的pH下施用洗涤步骤和在增加的pH和二价阳离子存在的情况下洗脱产物。代替低pH洗涤，样品可已经在低pH加样，随后在增加的pH和二价阳离子存在的情况下洗脱。
本发明所述方法和产物的各种修饰和变更在不脱离本发明范围和精神的情况下对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已关于具体的优选实施方案描述了本发明，但不应过度受限于这些实施方案。
附图简述
图1：膜联蛋白V在Q-Sepharose Fast Flow上纯化后得到的级分的SDS-PAGE。SDS-PAGE分析于还原条件下在12%的凝胶上实施。通过凝胶电泳方法分析加样、柱、穿流(flowthrough)、洗涤和洗脱级分A2-A8，分离的多肽通过银染(总蛋白染色)或使用抗膜联蛋白特异性抗体的蛋白质印迹显现。膜联蛋白V为约36 kDa的单链多肽，可在三个不同类型的结合位点结合多达10个二价阳离子分子。膜联蛋白V带的位置用箭头指出。
实施例
提供下列实施例作为本领域技术人员的指导。实施例不应被解释为限制本发明，实施例仅提供可用于理解和实施本发明实施方案的具体方法。
实施例1：rFIX在Q-Sepharose FF上的纯化
用2个柱体积(CV)的2 M NaCl活化Q-Sepharose Fast Flow树脂并用4 CV平衡缓冲液(20 mM Tris，2 mM EDTA，pH 7.4，电导率约2 mS/cm)平衡。其后，包含FIX的过滤的细胞培养物上清液(其由经基因工程改造的CHO细胞系得到，并添加3 mM EDTA)以约150 cm/h的线性流速加样到柱(电导率约13-15 mS/cm)。然后用2 CV平衡缓冲液洗涤柱子，接着用5 CV洗涤缓冲液(20 mM MES，2 mM EDTA，175 mM NaCl，pH 6.0)第二次洗涤，以除去在pH 6.0时不与阴离子交换树脂材料结合的大部分蛋白杂质。洗脱前，通过用平衡缓冲液施用2 CV洗涤再次降低柱中的电导率。结合的FIX用5 CV洗脱液(20 mM Tris，2 mM CaCl2，180 mM NaCl，pH 8.0)洗脱。表1的结果显示通过应用该程序，使用阴离子交换色谱的单一纯化步骤可从细胞培养物上清液基质中得到纯度为98%的二价阳离子结合蛋白产物。
表1：rFIX在Q-Sepharose FF上的纯化
实施例2：FVII在Q-Sepharose FF上的纯化
用2 CV 2 M NaCl活化Q-Sepharose Fast Flow树脂，并用5 CV平衡缓冲液(20 mMTris，2 mM EDTA，pH 7.5，电导率约2 mS/cm)平衡。其后，包含FVII的过滤的细胞培养物上清液(由经基因工程改造的CHO细胞系得到，并添加9 mM EDTA)以约46 cm/h的线性流速加样到柱(电导率约16 mS/cm)。然后用4 CV平衡缓冲液洗涤柱子，接着用5 CV洗涤缓冲液(20mM MES，2 mM EDTA，170 mM NaCl，pH 6.0)第二次洗涤，以除去在pH 6.0时不与阴离子交换树脂材料结合的大部分蛋白杂质。洗脱前，通过用平衡缓冲液施用2 CV洗涤再次降低柱中的电导率。结合的FIX用5个柱体积的洗脱液(20 mM Tris，2 mM CaCl2，180 mM NaCl，pH8.0)洗脱。表2的结果显示通过应用该程序，使用阴离子交换色谱的单一纯化步骤可从细胞培养物上清液基质中得到纯度为97%的二价阳离子结合产物。
表2：rFVII在Q-Sepharose FF上的纯化
实施例3：人膜联蛋白V在Q-Sepharose FF上的纯化
用4 CV 2 M NaCl活化Q-Sepharose Fast Flow树脂并用15 CV平衡缓冲液(20 mMTris，2 mM EDTA，pH 7.5，电导率约2 mS/cm)平衡。其后，向从人胎盘纯化的膜联蛋白V蛋白制备物中掺入获自CHO细胞系的蛋白原液以产生膜联蛋白纯度低于20%的蛋白加样液。向包含膜联蛋白的蛋白混合物添加1 mM EDTA，以约23 cm/h的线性流速加样到柱(电导率约4mS/cm)。然后用10 CV平衡缓冲液洗涤柱子，接着用10 CV洗涤缓冲液(20 mM MES，2 mMEDTA，155 mM NaCl，pH 6.0)第二次洗涤，以除去在pH 6.0时不与阴离子交换树脂材料结合的大部分蛋白杂质。洗脱前，通过用平衡缓冲液施用10 CV洗涤再次降低柱中的电导率。结合的膜联蛋白用30 CV洗脱液(20 mM Tris，2 mM CaCl2，150 mM NaCl，pH 8.0)洗脱。洗脱缓冲液与洗涤缓冲液具有相同的电导率。得到的级分通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳于还原条件下在12%的凝胶上分析。图1描绘了含有分离多肽的凝胶的总蛋白染色(银染)和膜联蛋白V染色(抗膜联蛋白蛋白质印迹)。结果显示与加样到柱上的蛋白混合物(加样级分)相比，洗脱级分A2-A4中包含高纯度的膜联蛋白V。该数据表明，通过阴离子交换色谱的单一纯化步骤后，洗脱级分中可得到高纯度的二价阳离子结合蛋白。
实施例4：
测试了用于使用Q-Sepharose Fast Flow从宿主细胞蛋白(HCP)中纯化FIX的不同条件。具体地，该程序包括以下条件：
运行1：中性pH加样，低pH 6.5洗涤，高pH 7.9洗脱，洗涤和洗脱缓冲液的电导率相等。
运行2：中性pH加样，低pH 6.0洗涤，高pH 8.0洗脱，洗涤缓冲液的电导率比洗脱缓冲液低。
运行2.1：与运行2相同，洗涤的盐浓度增加。
在所有实验中，恰在用低电导率的缓冲液洗脱前实施第二次洗涤。在所有实验中，洗脱缓冲液的电导率比加样缓冲液的电导率高。结果在表3中示出。
表3
实施例5：rFIX在Q-Sepharose FF上的比较纯化
为了证实本发明方法的有益效果，实施两个比较色谱运行。特别地，在Q-Sepharose FF上纯化来自澄清的CHO细胞培养物上清液的rFIX，其中运行1依照本发明方法实施，即步骤(b)中洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高，运行2以同样的方式实施，但步骤(a)中加样/洗涤与步骤(b)中洗脱之间无任何pH差异。各自的缓冲液条件在表4中简要给出。
表4：两个色谱rFIX纯化运行的缓冲液条件
分析所获得级分的rFIX活性得率、rFIX抗原得率、CHO宿主细胞蛋白(CHO HCP)减缩因数和rFIX比活。CHO HCP减缩因数计算为加样的总CHO HCO与洗出液中存在的CHO HCP的比率。各数据在表5中简要给出。
表5：两个色谱rFIX纯化运行的结果
这些结果说明本发明方法(特别是加样/洗涤和洗脱之间的pH改变)可显著改进污染宿主细胞蛋白的减少和纯化蛋白的比活。

Claims (8)

1.用于纯化二价阳离子结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a) 将不存在二价阳离子的加样缓冲液中的维生素K依赖性蛋白加样到阴离子交换树脂材料，并用不存在二价阳离子并且具有20-200 mM盐浓度的洗涤缓冲液洗涤已加样的阴离子交换树脂材料，所述不存在二价阳离子是指缓冲液中不存在游离二价阳离子和任何蛋白结合的二价阳离子；和
(b) 用包含至少一种二价阳离子的洗脱液洗脱维生素K依赖性蛋白，以形成包含维生素K依赖性蛋白的洗出液；
其中步骤(b)中洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高至少1.5个pH单位，和
其中维生素K依赖性蛋白是因子IX。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中洗涤缓冲液的电导率等于或小于步骤(b)中洗脱液的电导率。
3.权利要求1的方法，其中洗涤缓冲液具有100-150 mM盐浓度，或步骤(b)中洗脱液的pH比步骤(a)中洗涤缓冲液的pH高至少2.0个pH单位。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(b)中至少一种二价阳离子选自：Ca2+、Be2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Sr2+、Zn2+、Co2+、Ni2+和Cu2+或其组合。
5.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述阴离子交换树脂材料具有带正电的基团，其选自二乙基氨基乙烷(DEAE)、二甲基氨基乙烷(DMAE)、三甲基氨基乙基(TMAE)、聚乙烯亚胺(PEI)、季氨基烷基、季氨基乙烷(QAE)和季铵(Q)。
6.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述阴离子交换树脂材料携带伯胺作为配体，其选自氨基己基、苄脒、赖氨酸和精氨酸。
7.包含实施权利要求1-6中任一项的方法所用工具的试剂盒，其包含洗脱液，所述洗脱液包含至少一种二价阳离子，适合从缓冲液中的阴离子交换树脂材料洗脱因子IX，其中洗脱液的pH比所述洗涤缓冲液的pH高至少1.5个单位，洗涤缓冲液具有20-200 mM盐浓度。
8.权利要求7的试剂盒，其中洗脱液的pH比洗涤缓冲液的pH高至少2.0个pH单位。
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