JP2005518190A - 真核細胞中で組換えタンパク質を生産する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、真核細胞中でポリペプチドを生産する方法であって、（１）前記ポリペプチドの発現に適した条件及び設定温度下において、前記ポリペプチドを発現している細胞を微小担体上で培養する工程と、（２）前記設定温度以下の所定の温度まで培養物を冷却する工程と、（３）前記微小担体を沈降させる工程と、（４）培地の全部又は一部を採取する工程と、を備えた方法を提供する。

Description

発明の分野

本発明は、真核細胞を培養する方法、かかる細胞の大規模又は産業規模での培養において組換えタンパク質を生産する方法に関する。

発明の背景

微小担体培養は、細胞培養の分野において広く使用されている。微小担体培養では、固相微小担体の表面上に細胞を付着させて細胞を固定化するか、又はマクロ多孔性微小担体の内部構造の中に付着させて又は物理的に封入して細胞を固定化する。微小担体培養を用いるときには、培養物上清を採取しながら、細胞を有する担体を培養容器中に保持する方法が必要とされる。微小担体を利用するタイプの方法の１つに、培養上清を連続的に採取しながら、新しい培地を連続的に加える連続灌流法がある。このタイプの方法では、重力沈降機又は培養容器中の内部フィルターによって、微小担体を保持するのが通例である。微小担体を用いる別のタイプの方法として、培養上清の採取と新しい培地の添加を一定間隔でバッチ式に行う半連続法がある。このタイプの方法では、微小担体を保持させるには、培養容器の攪拌装置を停止させ、細胞を有する担体を容器の底に沈降させるのが最も容易である。細胞を含有する担体が沈降したときに、培養上清の一部を採取して、新しい培地と交換し、その後、攪拌機を再度始動させる。しかし、沈降させている間に攪拌を止めると、細胞は酸素又は栄養素が不足する危険に曝される。本発明は、容器の底に細胞を沈降させたときに、このような条件に対する細胞の耐性を向上させ、培養の総合的な性能に対して有利な効果を与える、改良法を提供する。

発明の概要

本発明は、細胞、特に所望のポリペプチドを産生する細胞を培養する改良法であって、担体の沈降と産物を含有する培養上清の採取とに先立って、冷却工程を行うことを特徴とする方法を提供する。

１つの側面において、本発明は、真核細胞中でポリペプチドを生産する方法であって、（１）前記ポリペプチドの発現に適した条件及び設定温度下において、前記ポリペプチドを発現している細胞を微小担体上で培養する工程と、（２）前記設定温度以下の所定の温度まで培養物を冷却する工程と、（３）前記微小担体を沈降させる工程と、（４）培地の全部又は一部を採取する工程と、を備えた方法を提供する。

幾つかの実施形態において、前記方法は、前記採取後に、培養容器に新しい培地を加える工程をさらに備える。
幾つかの実施形態において、前記方法は、前記採取した培地から前記ポリペプチドを回収する工程をさらに備える。

別の側面において、本発明は、真核細胞を培養する方法であって、（１）培養物の維持に適した条件及び設定温度下において、微小担体上で細胞を培養する工程と、（２）前記設定温度以下の所定の温度まで培養物を冷却する工程と、（３）前記微小担体を沈降させる工程と、（４）培地の全部又は一部を採取する工程と、を備えた方法を提供する。

幾つかの実施形態において、前記方法は、前記採取後に、培養容器に新しい培地を加える工程をさらに備える。
幾つかの実施形態において、前記方法は、大規模又は産業規模の方法である。

別の側面において、本発明は、微小担体培養中で増殖する真核細胞によって産生されるポリペプチドを採取する方法であって、（１）前記培養設定温度以下の所定の温度に培養物を冷却することと、次いで、（２）前記微小担体を沈降させることと、を備えた方法を提供する。

幾つかの実施形態では、前記担体を沈降させる前に、前記増殖温度から、培養設定温度より約５℃乃至３０℃低い温度、又は前記設定温度より約５℃乃至２０℃低い温度、又は前記設定温度より５℃乃至１５℃低い温度、又は前記培養設定温度より約５℃、１０℃、１５℃、若しくは２０℃低い温度まで、前記培養物を冷却する。

幾つかの実施形態では、前記担体を沈降させる前に、約１８℃乃至約３２℃の温度まで、約２０℃乃至約３０℃の温度まで、又は約２２℃乃至約２８℃の温度まで、又は約２４℃乃至約２８℃の温度まで、又は約２５℃乃至約２７℃の温度まで、前記培養物を冷却する。

幾つかの実施形態では、使用する細胞は昆虫細胞である。幾つかの実施形態では、使用する細胞は哺乳類細胞である。これらの実施形態のうち幾つかでは、前記使用する細胞はＢＨＫ細胞であり、別の実施形態では、前記細胞はＣＨＯ細胞であり、別の実施形態では、前記細胞はＨＥＫ細胞であり、別の実施形態では、前記細胞はＣＯＳ細胞であり、別の実施形態では、前記細胞はＨｅＬａ細胞である。好ましい細胞は、ＢＨＫ細胞とＣＨＯ細胞、とりわけＣＨＯ細胞である。

幾つかの実施形態では、前記微小担体は固相担体である。幾つかの実施形態では、前記微小担体はマクロ多孔性担体（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｃａｒｒｉｅｒ）であり、幾つかの実施形態では、前記微小担体は正の表面電荷を有するマクロ多孔性担体である。

幾つかの実施形態では、前記細胞は、所望のポリペプチド、好ましくは凝固因子、最も好ましくは、ヒト第ＶＩＩ因子又はヒト第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド（野生型第ＶＩＩ因子、Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、Ｓ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ； Ｓ５２Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｒ１５２Ｅ−第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｇｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するＦＶＩＩが含まれるが、これらに限定されない）を産生する。

幾つかの実施形態では、発現される前記タンパク質は、ヒト第ＶＩＩ因子である。別の実施形態では、発現される前記タンパク質は、野生型ＦＶＩＩと比較して実質的に同一の生物活性又は向上した生物活性を有する第ＶＩＩ因子である。別の実施形態では、発現される前記タンパク質は、野生型ＦＶＩＩに比べて、変化を受けた又は低下した生物活性を有する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである。別の実施形態では、発現される前記タンパク質は、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＩＩ、プロテインＣ、プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ）、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、成長ホルモン、インシュリン、インターロイキン、インターフェロン、若しくは抗体、又は前記タンパク質の断片である。

幾つかの実施形態では、前記培養された真核細胞は、インビトロ遺伝子組換えによって調製されたベクターを形質転換又はトランスフェクトされた組換え細胞である。幾つかの実施形態では、前記細胞は、内在性第ＶＩＩ因子の遺伝子を発現するヒト細胞である。
幾つかの実施形態では、前記所望のポリペプチドは、少なくとも約１５ｍｇ／リットル培養物のレベルで産生される。

幾つかの実施形態において、本発明を実施する際に使用される前記細胞は、細胞接着によって固相担体の表面又はマクロ多孔性担体内部構造中に付着（ａｔｔａｃｈ）された付着依存性細胞である。別の実施形態では、本発明を実施する際に使用される前記細胞は、物理的封入によって、マクロ多孔性担体の内部構造中に捕捉された懸濁細胞である。

特に好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、ヒト第ＶＩＩ因子又はヒト第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドを発現するように改変され且つ血清及び他の動物由来の成分の不存在下で増殖に適するように改変されたＢＨＫ２１又はＣＨＯ細胞である。
ある一連の実施形態では、前記培地（ｍｅｄｉｕｍ）は、動物由来の成分を欠く培地である。別の実施形態では、前記培地は動物由来の成分を欠き、且つタンパク質を欠く（無タンパク質）。

別の実施形態では、前記細胞はＣＨＯ細胞であり、前記ポリペプチドはヒト第ＶＩＩ因子であり、前記担体はマクロ多孔性担体であり、前記培地は動物由来の成分を含まない無タンパク質培地であり、前記細胞はＣＨＯ細胞であり、前記培養温度設定値は約３６℃であり、担体の沈降前に前記培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）を冷却する温度は約２６℃である。

発明の詳細な説明

本発明は、微小担体を用いた真核細胞の培養法であって、特に、かかる細胞によって発現される大規模又は産業的な量の所望のポリペプチドを生産する方法を提供する。この培養法のタイプは、担体を沈降させた後に培養上清をバッチ式に採取する、微小担体式の方法である。

細胞を含有する担体を沈降させる前に冷却工程を設けることによって、培養の総合的な性能に対して好ましい効果を与えることが明らかとなった。
科学的な理論に拘泥することを望むものではないが、冷却工程によって、培養容器の底部に細胞が沈降したときに、細胞がその状況に耐える能力が増大するものと考えられる。これによって、培養の総合的な性能に有利な効果がもたらされる。５００Ｌの培養容器では約１時間に及ぶ沈降期間中には、酸素の調節を行うことはできず、溶存酸素の濃度は急速に減少する。

本明細書に記載されているタイプの微小担体法を用いるときには、担体を沈降させる前に、培養容器の温度調節ループを解除するのが慣例とされているが、培養容器を積極的に冷却することは行わない。温度制御ループを解除する唯一の目的は、細胞を培養容器の底に沈降させながら、細胞の局所的なオーバーヒートを防ぐことである。解除しても、実際には培養容器は冷却されず、通例、温度の減少は１℃に満たない。本発明の冷却工程を用いることによって（例えば、（例えば、２６℃に冷却するなど）培養時設定温度を１０℃下回る冷却）、細胞の酸素所要量（酸素消費によって測定）は約５０％減少することが明らかとなった。２０℃に冷却すると、細胞の酸素所要量は約７５％減少する。培養物は、培養時の設定温度以下の所定の温度まで冷却される（例えば、約５℃乃至３０℃の温度に、若しくは約５℃乃至２０℃の温度に、若しくは約５℃乃至１５℃の温度に、又は設定温度より約５℃、１０℃、１５℃、若しくは２０℃低い温度）。

本発明の冷却工程は、担体を沈降させる直前に行われる。本明細書で使用する「直前に（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｂｅｆｏｒｅ）」とは、培養容器の内容物を所定の温度まで冷却したらすぐに冷却を停止し、容器の攪拌を停止させて、細胞を有する担体を容器の底に沈降させることを意味する。

冷却工程の期間は、通例、培養容器のサイズ、低下させる所望の温度、用いる冷却方法に応じて、１０乃至２４０分（例えば、２０乃至１８０分、又は３０乃至１２０分など）を要するが、あらゆる期間の冷却工程が本発明に包含される。このように、冷却工程は、細胞を含有する微小担体を沈降させる約１０分乃至約２４０分前から開始するのが通常である。例えば、培養容器のジャケットに冷却水を供給することによって５００Ｌの培養容器の温度を３６℃から２６℃の培養温度に低下させるには、約３０分かかるのが通例であり、培養容器のジャケットに冷却水を供給することによって、５０００Ｌの培養容器の温度を３６℃の培養温度から３６℃から２６℃に低下させるのにも、同じく約３０分かかる。

冷却工程は、以下のように行うのが通例である。培養容器の温度制御ループを解除し、例えば、培養容器のジャケットに冷却水を与えるバルブを常に開放し続けて、培養容器を冷却する。温度を常にモニターし、培養容器の内容物が設定温度以下の所定の温度（例えば、培養時設定温度より１０℃低い温度）に達したら、冷却を停止する。その後、培養容器の攪拌機を停止させることによって、細胞を含有する担体を沈降させる。沈降した後に、培養上清又は培地の一部を採取し、培養容器に新鮮な培地を加えて、採取した培地と交換する。培養上清を採取し、新しい培地を加えたら、攪拌機を始動させ、温度制御ループを作動させて、再び温度を培養設定温度まで調節する。加えた新鮮な培地は、培養設定温度に近い温度まで（実際の設定値に応じて、約３０℃又はそれ以上まで）予め加温しておくのが通例である。

本発明を実施する際には、培養物を冷却するのに有効なあらゆる方法を用いることができる。例えば、所望の温度に達するまで、十分な期間、培養容器のジャケットに冷却水を供給することによって培養容器を冷却してもよいし、あるいは、培養容器に冷却コイルを取り付けた後、この冷却コイルを単独で用いるか、又は上記ジャケットの冷却と併用してもよい。

細胞培養の操作： 本発明の細胞培養は、攪拌された培養容器系の中で行われ、微小担体を用いるタイプの方法が用いられる。微小担体を用いる方法では、担体（マクロ多孔性担体）の内部構造中に細胞を移動させるか、担体の表面に細胞自体を付着させるか（固相担体）、またはこれらをともに行う。微小担体を用いた方法では、最初に、真核細胞、微小担体、及び培地を培養容器に供給する。培養容量が開始時の容器の最終運転容量に達していなければ、翌日、培地をさらに加えてもよい。続いて、最終的に培養を終結するまで、産物を含有する培養上清を定期的に採取し、新しい培地と交換する。産物を含有する上清を採取するときには、培養物の攪拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、かき混ぜ（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））を停止し、細胞含有担体を沈降させた後に、産物を含有する培地の一部を採取する。

増殖工程： 産物を含有する培養上清を下流工程のために定期的に採取する生産期に達する前に、当該細胞に適し得る任意のスキーム又はルーチンに従って細胞を増殖させる。本増殖期は、単一工程であってもよいし、複数工程の操作であってもよい。単一工程の増殖操作では、細胞を貯蔵庫から取り出し、生産を行う微小担体含有培養容器に直接播種する。多段階増殖操作では、細胞を貯蔵庫から取り出し、生産が行われる最終の微小担体含有培養容器に到達するまで、サイズが徐々に大きくなる多数の培養容器を通じて増殖させる。増殖段階の間、細胞は、増殖に最適な条件下で増殖させる。温度、ｐＨ、溶存酸素等の培養条件は、細胞ごとに最適値が明らかとなっており、当業者には自明であろう（例えば、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２^ｎｄ Ｅｄ．， Ｒｉｃｋｗｏｏｄ， Ｄ． ａｎｄ Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．， Ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）を参照）。

本発明のある実施形態では、前記細胞培養工程は、１つの培養容器の中で実施される。すなわち、生産を行う微小担体含有培養容器中に、細胞を直接播種し、適切な細胞密度に達するまで細胞を増殖させ、生産期を開始させる。

本発明の別の実施形態では、前記細胞培養工程は、少なくとも２つの異なる培養容器（すなわち、１以上の種培養容器（第一の増殖段階）の後に、生産培養容器（最後の増殖段階であり、続いて、生産期に入る）の中で実施される。前記第一の増殖工程では、培地を含有している種培養容器の中に所望のポリペプチドを発現している細胞を播種し、細胞が最少の交雑接種密度（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｙ）に達するまで増殖させる。続いて、増殖した種培養を（ａ）培地と（ｂ）微小担体を含有する生産培養容器に移す。この培養容器中では、固相担体の表面又はマクロ多孔性担体の外部及び内部表面に細胞が移動する条件下で、細胞を培養し、マクロ多孔性担体の内部及び内部表面で細胞の増殖を継続し、細胞が担体に完全に移転するまで、この最後の増殖段階で細胞を増殖させ続ける。この最後の増殖段階中には、微小担体を培養容器の底に沈めて、培地の交換を行った後、所定の割合のタンク容量を除去し、相当する割合のタンク容量の新鮮な培地を容器に加える。次いで、微小担体を培地中に再懸濁させ、所定の間隔（例えば、２４時間ごと）で、この培地除去と交換工程を繰り返す。交換する培地の量は細胞密度に依存し、典型的には、タンク容量の１０−９５％、好ましくは、下表１に示されているように２５％乃至８０％である。

増殖期が複数工程の操作である場合には、最終培養容器に入れるのに十分な数の細胞が得られるまで、徐々にサイズが大きくなる培養容器の中で増殖が行われる場合があることが理解できるであろう。例えば、順次、５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、又は５００Ｌの種培養容器を１以上使用することがある。種培養容器は、通例、５Ｌ乃至１０００Ｌの容量を有する。典型的には、約０．２乃至０．４×１０^６細胞／ｍｌの開始密度で、細胞を種培養容器中に接種し、培養物が約１．０×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度に達するまで増殖させる。典型的には、最少交雑接種密度は、０．８乃至約１．５×１０^６細胞／ｍｌである。

所望のポリペプチド（例えば、第ＶＩＩ因子）の生産に適した設定値の中には、（種培養中又は微小担体上での）細胞の初期増殖には必ずしも適しないものがある。例えば、温度、ＤＯＴ、及び／又はｐＨは、２つの期で異なる場合がある。増殖中の培地交換は、細胞を生存増殖させ続けるために行われるのであって、下流工程用に培養上清を採取するために行われるのではない。

（微小担体を含有する）最終培養容器中で最後の増殖工程を行うために用いることができる培養条件は、下表１にまとめられている。

生産期： 生産期を開始する（すなわち、下流工程のために含産物培養上清を取得する）のに適した値に細胞密度が達したら、培養上清の６０−９５％、好ましくは８０％を２４時間ごとに採取する。この細胞密度の値は、典型的には、１−１２×１０^６細胞／ｍｌである。この時点で、設定条件を変えて、所望のポリペプチドの生産に適した値に設定してもよい。

培地の交換は、タンクの底に微小担体を沈めた後、選択した割合のタンク容量を除去し、対応するタンク容量の割合の新鮮な培地を容器に加える。タンク容量の２５乃至９０％を交換するのが通例であり、好ましくは、タンク容量の８０％を新鮮な培地と交換する。次いで、微小担体を培地中に再懸濁させ、１０−４８時間ごと（好ましくは、２４時間ごと）に、この培地除去交換工程を繰り返すのが通例である。

このプロセスの本側面の概要が表２に示されている。

必要に応じて、生産期に入る時点、及び生産期中に、培養の設定温度を低下させてもよい。
生産期に入るときには、温度、操作ｐＨ及び培地交換頻度を、生産に最適な値へ変化させるのが通例である。増殖期と生産期における温度範囲と値の例は、それぞれ、表１及び２を参照いただきたい。ＣＨＯ細胞株の場合、生産期中には約３６℃の温度が好ましい。

微小担体： 本明細書において使用する微小担体（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）とは、（剪断（ｓｈｅａｒ）による著しい損傷を細胞にもたらさない攪拌速度を用いて）懸濁培養中で使用できるほど小さい粒子をいう。微小担体は、固体、多孔性であるか、あるいは表面上に多孔性コーティングを有する固い殻（ｓｏｌｉｄ ｃｏｒｅ）を有する。微小担体は、例えば、セルロース又はデキストランをベースとするものであり得（これらに限定されない）、その表面（多孔性担体の場合には、外部及び内部表面）を正に帯電させ得る。

ある一連の実施形態では、前記微小担体は、総じて約１５０乃至３５０μｍの粒径を有しており、約０．８乃至２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。ある一連の実施形態では、前記微小担体は固相担体である。有用な固相微小担体には、Ｃｙｔｏｄｅｘ １^ＴＭ及びＣｙｔｏｄｅｘ ２^ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）が含まれるが、これらに限定されない。固相担体は、特に接着細胞（足場依存性細胞）に適している。

別の一連の実施形態では、前記微小担体は、マクロ多孔性担体（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｃａｒｒｉｅｒ）である。本明細書で使用するマクロ多孔性担体とは、以下の特性を有する（例えば、セルロースベースの）粒子である。（ａ）（剪断による著しい損傷を細胞にもたらさない攪拌速度を用いて）懸濁培養中で使用できるほど小さい粒子であり、且つ（ｂ）粒子の内部空間中に細胞が遊走できる十分なサイズの細孔（ｐｏｒｅ）と内部空間を有している。それらの表面（外部及び内部）は、ある実施形態では、正に帯電されていてもよい。ある一連の実施形態では、前記担体は、（ａ）総じて約１５０乃至３５０μｍの粒径を有し、（ｂ）約１５乃至４０μｍの平均細孔開口径を有する細孔を有し、（ｃ）約０．８乃至２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。幾つかの実施形態では、前記正電荷はＤＥＡＥ（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノエチル）基によって与えられる。有用なマクロ多孔性担体には、Ｃｙｔｏｄｅｘ １^ＴＭ及びＣｙｔｏｄｅｘ ２^ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましいのは、２３０μｍの平均粒径、３０μｍの平均孔サイズ、１．１ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有するＣｙｔｏｐｏｅｒ １^ＴＭ担体である。

大規模培養条件：本明細書で使用する、大規模培養容器は、少なくとも約１００Ｌ、好ましくは少なくとも約５００Ｌ、より好ましくは少なくとも約１０００Ｌ、最も好ましくは少なくとも約５０００Ｌの容量を有する。細胞培養プロセスが少なくとも２つの異なる培養容器中（１以上の種培養容器の後に（最初の増殖工程）、生産培養容器（最後の増殖工程、続いて生産期に入る））で実施される場合には、前記プロセスでは、約５０Ｌの増殖された種培養（約１．０×１０^６細胞／ｍＬを有する）を、１５０Ｌの培地を含有する５００Ｌ培養容器に移すのが通例である。大規模培養は、（例えば、温度、ｐＨ、溶存酸素圧（ＤＯＴ）、及び攪拌速度の）適切な条件に保ち、培養容器に培地を加えることによって容量を次第に増加させる。微小担体プロセスの場合には、前記培養容器は、１乃至１０ｇ／Ｌの最終微小担体濃度範囲に対応する量の微小担体も含む。容器に移すと、その後、細胞は、最初の２４時間以内に、担体の表面上に遊走するか、又は担体の内部に遊走するのが通例である。「大規模プロセス」という用語は、「産業規模（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ−ｓｃａｌｅ）プロセス」という用語と互換的に使用されることがある。さらに、「培養容器」という用語は、「タンク」、「リアクター」、「発酵槽」、「バイオリアクター」という用語と互換的に使用されることがある。

細胞： 本発明を実施する場合、培養される細胞は、好ましくは真核細胞、より好ましくは確立された真核細胞株（ＣＨＯ（例えば、 ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＨＥＫ２９３ （例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３； Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６： ５９−７２，） １９７７）細胞株が含まれるが、これらに限定されない）である。好ましいＢＨＫ細胞株は、ｔｋ⁻ ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞株であり（Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０，１９８２）、以下、ＢＨＫ５７０細胞と称する。ＢＨＫ５７０細胞株は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １０３１４で、米国菌培養収集所、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＭＤ ２０８５２から入手できる。ｔｋ⁻ ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞株は、受託番号ＣＲＬ １６３２でＡＴＣＣから入手することもできる。

好ましいＣＨＯ細胞株は、受託番号ＣＣｌ６１でＡＴＣＣから入手できるＣＨＯ Ｋ１細胞株である。
他の適切な細胞株には、ラットＨｅｐ Ｉ（ラット肝細胞腫； ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、ラットＨｅｐ ＩＩ（ラット肝細胞腫； ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）；ＤＵＫＸ細胞（ＣＨＯ細胞株） （Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４２１６−４２２０，１９８０）（ＤＵＫＸ細胞は、ＤＸＢ１１細胞とも称される、ＤＧ４４ （ＣＨＯ細胞株） （Ｃｅｌｌ， ３３： ４０５，１９８３、及びＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２： ５５５，１９８６）が含まれるが、これらに限定されない。３Ｔ３細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、骨髄腫、及び骨髄腫と他の細胞との融合物も有用である。幾つかの実施形態では、前記細胞は、例えば、元の細胞種とは、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ及び／又はグリコシダーゼなどのグリコシル化酵素又はプロペプチドなどのプロセッシング酵素）を定性的又は定量的に異なって発現する細胞などの、変異又は組換え細胞であり得る。適切な昆虫細胞株には、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞、又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞など）も含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、米国特許第５、０７７、２１４号参照）。

幾つかの実施形態では、本発明を実施する際に用いられる細胞は、懸濁培養中で増殖することができる。本明細書で使用する、懸濁可能細胞（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）とは、巨大で堅固な凝集体を作らずに懸濁物中で増殖できる細胞、すなわち、単分散である細胞又は凝集物当たり僅か数個の細胞を有する緩やかな凝集体を成して増殖する細胞である。懸濁可能細胞には、順応（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）又は操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）がなくても懸濁物中で増殖する細胞（例えば、造血細胞又はリンパ球など）、及び付着依存性細胞（例えば、上皮細胞又は繊維芽細胞など）を徐々に懸濁培養に順応させて懸濁可能とした細胞が含まれるが、これらに限定されない。

本発明を実施する際に用いられる細胞は、接着細胞であり得る（足場依存性細胞又は付着依存性細胞としても知られる）。本明細書で使用する、接着細胞とは、繁殖及び増殖のために適切な表面に自身を接着又は固着（ａｎｃｈｏｒ）する必要がある細胞である。本発明のある実施形態では、使用する細胞は接着細胞であり、これらの実施形態では、増殖期と生産期の両方で、微小担体を使用する。用いる接着細胞は、増殖期の間に、担体上に（マクロ多孔性担体を用いるのであれば、さらに、担体の内部構造中に）遊走可能であり、且つ生産バイオリアクターに移されているときには、新しい担体に遊走可能とすべきである。接着細胞が、独力で新しい担体に遊走する能力が十分でなければ、タンパク分解酵素又はＥＤＴＡを有する細胞含有微小担体を接触させることによって、担体から遊離させてもよい。用いる培地（特に、動物由来の成分が存在しないときには）は、接着細胞を支持するのに適した成分をさらに含有すべきである。接着細胞の培養に適した培地は、例えば、Ｓｉｇｍａなどの市販の製造業者から購入できる。

前記細胞は、懸濁順応細胞又は懸濁可能細胞であり得る。このような細胞を使用するのであれば、細胞の増殖を懸濁物中で行い得るので、最終増殖期の生産培養容器自体の中と生産期だけに、微小担体を使用する。懸濁順応細胞の場合には、用いる微小担体は、担体の内部構造中に物理的な封入によって細胞が付着されたマクロ多孔性担体であるのが通例である。

培地： 「細胞培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」及び「培地」という用語は、真核細胞を増殖させるために用いられる栄養溶液であって、通例、以下のカテゴリーのうち１以上から得られる少なくとも１つの成分を与える溶液を指す。（１）培地の浸透圧に寄与するナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカルシウムの塩、（２）通常グルコースなどの炭水化物の形態であるエネルギー源、（３）全ての必須アミノ酸（一般には、基本的な２０アミノ酸群）、（４）低濃度で必要とされるビタミン類及び他の有機化合物、（５）微量元素（微量元素とは、通例極めて低い濃度（通常、μＭの範囲）で必要とされる無機物質として定義される）。栄養溶液には、必要に応じて、（ａ）動物血清、（ｂ）ホルモン及び他の増殖因子（例えば、インシュリン、トランスフェリン、上皮細胞増殖因子など）、（ｃ）タンパク質や組織の加水分解物というカテゴリーの何れかから得られる成分を１以上補充することができる。

本発明には、動物由来の成分（例えば、血清又は血清成分）を有する培地及び動物由来の成分を欠く培地中で真核細胞を培養することが包含される。動物由来の成分（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））を有する細胞培地は、５％を超える血清、又は０−５％の血清（例えば、０−１％の血清又は０−０．１％の血清など）を有することができる。動物由来の成分を欠く培地が好ましい。本明細書で使用する、「動物由来の」成分とは、手を加えていない動物中で産生される任意の成分（例えば、血清から単離精製されるタンパク質など）、又は手を加えていない動物中で産生される成分を用いることによって産生される任意の成分（例えば、動物から単離精製された酵素を用いて、植物由来の物質を加水分解することによって作製されるアミノ酸など）をいう。これに対して、動物タンパク質の配列を有する（すなわち、動物中のゲノムに由来する）が、手を加えていない動物（ｉｎｔａｃｔ ａｎｉｍａｌ）から産生、単離精製される成分を欠く培地中において、インビトロでの細胞培養（例えば、組換え酵母若しくは細菌細胞、又は確立された連続継代真核細胞株中、組換えられていると否とを問わない）で産生されるタンパク質は、「動物由来の」成分ではない（例えば、酵母若しくは細菌細胞中で産生されたインシュリン、又は確立された哺乳類細胞株（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、又はＨＥＫ細胞）中で産生されたインシュリン、又はＮａｍａｌｗａ細胞中で産生されたインターフェロンなど）。

例えば、動物タンパク質の配列を有する（すなわち、動物中のゲノムに由来する）が、動物由来の成分を欠く培地中において、組換え細胞中で産生されるタンパク質（例えば、酵母又は細菌細胞中で産生されたインシュリンなど）は、「動物由来の成分」ではない。従って、動物由来の成分を欠く細胞培地とは、組換えによって作製された動物タンパク質を含有してもよい細胞培地である。しかし、このような培地には、例えば、動物の血清又はタンパク質又は動物の血清から精製される他の産物が含有されていない。このような培地は、例えば、植物に由来する１以上の成分を含有してもよい。本発明の条件下で細胞の増殖と維持を補助する任意の細胞培地（特に、動物由来の成分を欠く細胞培地）を用いることができる。典型的には、前記培地は、水、浸透圧調整剤、緩衝液、エネルギー源、アミノ酸、無機又は組換え鉄供給源、１以上の合成又は組換え増殖因子、ビタミン類、及び補因子を含有する。ある実施形態では、前記培地は動物由来の成分を欠き、且つタンパク質を欠く（無タンパク質）。動物由来の成分及び／又はタンパク質を欠く培地は、例えば、Ｓｉｇｍａ、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｉｂｃｏ、及びＧｅｍｉｎｉなどの業者から入手することができる。

慣用成分に加えて、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの生産に適した培地は、約０．１−５０ｍｇ／リットル、好ましくは約０．５−２５ｍｇ／リットル、より好ましくは約１−１０ｍｇ／リットル、最も好ましくは約５ｍｇ／リットルの濃度で、ビタミンＫ（第ＶＩＩ因子中のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化に必要とされる）を含有する。

本発明で使用するのに適した培地は、Ｇｉｂｃｏ、及びＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなどの業者から入手できる。
ある実施形態では、前記培地は、表３に示されている成分からなり、必要に応じて、表４に示されている成分が１以上補充される。下表（表３）は、本発明で使用するのに適した培地の組成である。必要に応じて、表４に列記されている成文を培地に１以上添加する。好ましい範囲は、表４に列記されている。ある実施形態では、使用される培地は、Ｍｅｄｉｕｍ ３１８−Ｘである。別の実施形態では、培地ＣＨＯ−Ｋである。

別の実施形態では、使用する培地は、以下の組成を有する（３１８−Ｕ）。

前記培地は、動物由来の成文を欠く培地であるか、又は動物由来の成分を欠き且つタンパク質を欠く培地である（「無タンパク質」）ことが好ましい。
ある実施形態において、前記培地は、動物由来の成分を欠く市販の無タンパク質ＣＨＯ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であり、前記細胞株はＣＨＯ細胞である。ある実施形態では、前記培地は３１８−Ｘ培地であり、前記細胞株はＢＨＫ細胞株であり、別の実施形態では、前記培地は３１８−Ｕ培地であり、前記細胞株はＢＨＫ細胞である。別の実施形態では、前記培地はＣＨＯ−Ｋ培地であり、前記細胞株はＣＨＯ細胞株である。

幾つかの実施形態では、本発明を実施する際に用いる細胞は、例えば、血清を欠く培地などの動物由来の成分を欠く培地中での懸濁増殖に適するように改変される。このような改変操作は、例えば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１^ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ， Ｅ．Ｃ． Ｂｅｕｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ｐｐ．６１９−６２３， １９９５ （ＢＨＫ及びＣＨＯ細胞）； Ｃｒｕｚ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｔｅｃｈ． １１：１１７−１２０， １９９７ （昆虫細胞）；Ｋｅｅｎ， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２０３−２１１，１９９５（骨髄腫細胞）；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｎｉｑｕｅｓ １４：９７２−９７８，１９９３（ヒト腎臓２９３細胞）に記載されている。特に好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、ヒト第ＶＩＩ因子を発現するように改作され且つ血清又は他の動物由来の成分の不存在下における増殖に適するように改変されたＢＨＫ２１又はＣＨＯ細胞である。

培養容器： 前記培養容器は、例えば、従来型の羽根によって攪拌を行う従来型攪拌タンクリアクター（ＣＳＴＲ、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ ｒｅａｃｔｏｒｓ）又は容器の底から空気を導入する手段によって攪拌を行うエアリフトリアクターであり得る。パラメータの中で、規定の制限内で調節されるのは、ｐＨ、溶存酸素圧（ＤＯＴ）、及び温度である。ｐＨは、例えば、上部空間のガス中の二酸化炭素（ＣＯ_２）濃度を変化させ、必要であれば、培養液に塩基を加えることによって調節することができる。溶存酸素圧は、例えば、空気若しくは純粋酸素又はそれらの混合物を散布することによって維持することができる。温度調節媒体は、必要に応じて加熱し又は冷却した水である。水は、容器周囲のジャケット中を通過させるか、培地中に浸漬させた配管コイル中を通過させることができる。

プロセッシング工程： 培養容器から培地を除去したら、所望のタンパク質を得るために１以上のプロセッシング工程（担体中に固定化されなかった細胞を除去するための遠心又は濾過、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動操作（例えば、調製用等電点（Ｉｅｆ）、溶解度分画（例えば、硫安分画）、又は抽出などが含まれるが、これらに限定されない）を行ってもよい。概略は、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２； 及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ．−Ｃ． Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， ｅｄｉｔｏｒｓ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照。

第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ関連因子ポリペプチドの精製には、例えば、抗第ＶＩＩ因子抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１： １１０９７，１９８６ ； 及び、Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７： ７７８５，１９８８）、並びに、例えば、第ＸＩＩａ因子又は第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子、及びトロンビンなどのトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼを用いたタンパク質分解によって活性化することが含まれ得る。例えば、Ｏｓｔｅｒｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１： ２８５３ （１９７２）； Ｔｈｏｍａｓ，米国特許第４，４５６，５９１号； 及び、Ｈｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６ （１９８３）を参照。あるいは、Ｍｏｎｏ Ｑ（Ｒ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などのイオン交換クロマトグラフィーカラムを通過させることによって、第ＶＩＩ因子を活性化させてもよい。

大規模生産用ポリペプチド：幾つかの実施形態では、本発明を実施する際に用いる前記細胞は、内在性第ＶＩＩ因子の遺伝子を発現するヒト細胞である。これらの細胞では、前記内在性遺伝子は未修飾のままとするか、若しくはインシチュで修飾を施してもよく、あるいは、内在性第ＶＩＩ遺伝子の発現を変化させるために、第ＶＩＩ遺伝子の外側の配列をインシチュで修飾してもよい。

別の実施形態では、任意の真核細胞源から得た細胞を操作して、組換え遺伝子からヒト第ＶＩＩ因子を発現させる。本明細書で使用する、「第ＶＩＩ因子」又は「第ＶＩＩポリペプチド」には、野生型第ＶＩＩ因子（すなわち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド）、野生型第ＶＩＩ因子と同じ又は向上した生物活性を実質的に示す第ＶＩＩ因子のバリアントが包含される。「第ＶＩＩ因子」という用語には、切断されていない（チモーゲン）型の第ＶＩＩ因子ポリペプチドに加え、生物活性を有する型を与えるためにタンパク質分解によってプロセッシングされた第ＶＩＩ因子ポリペプチド（第ＶＩＩａ因子と称されることがある）が包含される。典型的には、第ＶＩＩ因子は、残基１５２と１５３の間で切断されて第ＶＩＩａ因子を与える。

本明細書で使用する「第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド」には、野生型第ＶＩＩａ因子の活性に比べて、第ＶＩＩａの生物活性が実質的に修飾され又は低下したポリペプチド（バリアントを含む）が包含される。これらのポリペプチドには、前記ポリペプチドの生物活性を修飾又は崩壊させる特異的なアミノ酸配列の変化が導入された第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子が含まれるが、これらに限定されない。

第ＶＩＩａ因子の血液凝集という生物活性は、（１）組織因子（ＴＦ）に結合する能力、及び（２）第ＩＸ因子又は第Ｘ因子のタンパク分解を触媒して、活性化された第ＩＸ因子又は第Ｘ因子（それぞれ、第ＩＸａ因子又はＸａ因子）を生成する能力に由来する。本発明において、第ＶＩＩａ因子の生物活性は、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号に記載されているように、第ＶＩＩ因子欠損血漿及びトロンボプラスチンを用いて調製物が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量することができる。このアッセイでは、生物活性は、対照サンプルに比した凝固時間の減少として表され、１ユニット／ｍＬの第ＶＩＩ因子活性を含有するプールしたヒト血清標準と比べることによって、「第ＶＩＩ因子ユニット」に変換される。あるいは、（１）第ＶＩＩａ因子の生物活性は脂質膜中に包埋されたＴＦと第Ｘ因子を備えたシステムにおいて、、第ＶＩＩａ因子が第Ｘａ因子を産生する能力を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １９９１９−１９９２４，１９９７）、（２）水性系中での第Ｘ因子の加水分解を測定すること、（３）表面プラズモン共鳴に基づく装置を用いて、ＴＦへの物理的結合を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ４１３：３５９−３６３、１９９７）、（４）合成基質の加水分解を測定すること、によって定量することができる。

野生型第ＶＩＩａ因子に比べて実質的に同一又は向上した生物活性を有する第ＶＩＩ因子バリアントには、上述した凝固アッセイ、タンパク分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイのうち１以上でテストしたときに、同じ細胞種の中で生じる第ＶＩＩａ因子の比活性が、少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％であるバリアントが包含される。野生型第ＶＩＩａ因子に比べて実質的に減少した生物活性を有する第ＶＩＩ因子バリアントには、上述した凝固アッセイ、タンパク分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイのうち１以上でテストしたときに、同じ細胞種の中で生じる野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％、好ましくは約１０％、より好ましくは約５％、最も好ましくは約１％未満の比活性を示すバリアントが包含される。野生型第ＶＩＩ因子に比べて実質的に変化した生物活性を有する第ＶＩＩ因子バリアントには、ＴＦ非依存性第Ｘ因子のタンパク分解活性を示す第ＶＩＩ因子バリアント、及びＴＦを結合するが第Ｘ因子を切断しない第ＶＩＩ因子バリアントが含まれるが、これらに限定されない。

野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じ又は増大した生物活性を示すか、あるいは、野生型ＶＩＩ因子に比べて実質的に変化又は減少した生物活性を示すかを問わず、第ＶＩＩ因子のバリアントには、１以上のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって、野生型第ＶＩＩ因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

第ＶＩＩ因子バリアントの非限定的な例には、Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３５２：１８２−１９２，１９９８）；米国特許第５，５８０，５６０号に開示されているような、タンパク分解に対する安定性が増加したＦＶＩＩａバリアント；残基２９０と２９１の間又は残基３１５と３１６の間でタンパク分解によって切断された第ＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４８： ５０１−５０５，１９９５）；酸化型の第ＶＩＩａ（Ｋｏｒｎｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３６３： ４３−５４，１９９９）；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９号に開示されているＦＶＩＩバリアント；ＷＯ０２／３８１６２号に開示されているようなタンパク分解に対する安定性が増大したＦＶＩＩバリアント（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＷＯ９９／２０７６７号に開示されているような、修飾されたＧｌａドメインを有し且つ膜結合が増大したＦＶＩＩバリアント（ミネソタ大学）；並びにＷＯ０１／５８９３５号に開示されているようなＦＶＩＩバリアント（Ｍａｘｙｇｅｎ ＡｐＳ）が含まれる。

野生型ＦＶＩＩａに比べて増加した生物活性を有するＦＶＩＩバリアントの非限定的な例には、ＷＯ０１／８３７２５号、ＷＯ ０２／２２７７６号、ＷＯ０２／３８１６２号に開示されているＦＶＩＩバリアント（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＮＮ ａｎｓφｇｎｉｎｇｅｒ；及びＪＰ２００１０６１４７９号に開示されている活性が増大したＦＶＩＩａバリアント（Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｒｏ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓ Ｉｎｓｔ．）が含まれる。

野生型第ＶＩＩ因子に比べて実質的に低下又は変化した生物活性を有する第ＶＩＩ因子バリアントの非限定的な例には、Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ ２９： ３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｋａｚａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０： ６６−７２， １９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｅｎｄｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １５： ５１５−５２０，１９９８）、Ｇｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子（Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ３１７： ２４５−２４９，１９９３）が含まれる。

第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの例には、野生型第ＶＩＩ因子、Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、Ｓ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ；Ｓ５２Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｒ１５２Ｅ−第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｇｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するＦＶＩＩが含まれる。

１以上の目的のタンパク質を内在遺伝子から発現するか、あるいは前記タンパク質をコードする組換え遺伝子を細胞中に導入した後に１以上の目的のタンパク質を発現するかを問わず、目的のタンパク質を発現する真核細胞の培養、好ましくは大規模培養も、本発明に包含される。このようなタンパク質には、第ＶＩＩＩ因子；第ＩＸ因子；第Ｘ因子；プロテインＣ；組織因子；レンニン；ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インシュリンＡ−鎖；インシュリンＢ−鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；心房性ナトリウム利尿ペプチド；肺表面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿若しくは組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などの、プラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性増殖因子；腫瘍壊死因子α及びβ；エンケファリナーゼ；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物のタンパク質；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）などの神経栄養性因子；ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、又はＮＧＦ−βなどの神経増殖因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；α−ＦＧＦ及びβ−ＦＧＦなどの繊維芽細胞増殖因子；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子；インシュリン様増殖因子−Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導性因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、及び−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦＳ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン類（ＩＬＳ）、例えば、ＩＬ−１乃至ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊加速因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；接着分子（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）；調節タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；抗体；上記した全てのポリペプチドの断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。

以下の実施例は、本発明を非限定的に説明することを意図したものである。

実施例１：ＣＨＯ細胞の調製
ヒトＦＶＩＩを発現させるためのプラスミドベクターｐＬＮ１７４が報告されている（Ｐｅｒｓｓｏｎ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ． １９９６．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８５：２４１−２４３）。要約すれば、該プラスミドベクターは、挿入されたｃＤＮＡを転写するためのマウスメタロチオネインプロモーターの調節下にあるプロペプチドを含むヒトＦＶＩＩをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列と、選択可能なマーカーとして使用するためのＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスジヒドロ葉酸リダクターゼｃＤＮＡとを担持している。

γ−カルボキシル化認識配列をコードしているプラスミドベクターを構築するためには、そのプロペプチドを含むＦＶＩＩをコードするｃＤＮＡを含有するクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｋ５＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた（ｐＬＮ１７１）（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９７． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９９１９−１９９２４）。このクローニングベクター上へのインバースＰＣＲによる変異導入によって、ＦＶＩＩのプロペプチドの後ろにＦＶＩＩをコードしているｃＤＮＡ中に、停止コドンをコードするヌクレオチド配列を挿入した。ＮａＯＨによる処理の後、以下のプライマー：
５’−ＡＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ−３’
５’−ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＣＣ−３’
と、Ｐｗｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ポリメラーゼを用いたＰＣＲによって、テンプレートプラスミドを変性させた。

得られた混合物をＤｐｎＩで消化して、残ったテンプレートＤＮＡを消化し、ＰＣＲ産物により大腸菌を形質転換した。配列決定による変異の存在に関して、クローンをスクリーニングした。正しいクローンから得たｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。得られたプラスミドは、ｐＬＮ３２９と名付けた。Ｆｕｇｅｎｅ６法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により、等量のｐＬＮ１７４とｐＬＮ３２９を、ＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣｌ６１）にトランスフェクトした。トランスフェクタントは、１μＭになるようにメトトレキサートを加え、０．４５ｍｇ／ｍｌになるようにＧ４１８を加えて選択した。限界希釈によってトランスフェクタントのプールをクローニングし、クローンからのＦＶＩＩの発現を測定した。

高産生クローンをさらにサブクローニングし、１０％のウシ胎児血清を加えたダルベッコの改変イーグル培地中で、２．４ｐｇ／細胞／日の特異的なＦＶＩＩ発現を示すクローンＥ１１を選択した。動物由来の成分を含まない市販のＣＨＯ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中での無血清懸濁培養にクローンが適するようにした。

実施例２：第ＶＩＩ因子の産生
実験条件の概要
動物由来の成分を含まない市販のＣＨＯ細胞用無タンパク質培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、本実施例における３つの培養物全てに、インシュリン（５ｍｇ／Ｌ）とビタミンＫ１（５ｍｇ／Ｌ）を補充した。
培養容器のサイズは５００Ｌであった。このプロセスのタイプは、担体を沈降させた後に、８０％の培地（４００Ｌ）をバッチ式に毎日交換する標準的なＣｙｔｏｐｏｒｅ １微小担体培養であった。

培養物ＦＦＦ１２３９とＦＦＦ１２４２では、培地交換時に担体を沈降させる直前に、冷却工程を毎日行った（ＦＦＦ１２３９では２６℃に冷却し、ＦＦＦ１２４２では１９日目まで２６℃に冷却、その後５３日目まで２０℃に冷却した）。
３つの培養物全てを通じて、培養パラメータ（温度、ｐＨ、溶存酸素）は、標準値を用いた。温度の設定値は３６．０℃であった。下方修正の場合（ＣＯ_２ガスを上部空間に加える）ｐＨの設定値は７．１０とし、上方修正の場合（培養液に炭酸ナトリウム溶液を加える）ｐＨの設定値は６．８０とした。溶存酸素の設定値は、空気と５０％飽和であった。

結果と結論の概要
３つの培養物のうち最初のもの（ＦＦＦ１２３５）では、高産生ＣＨＯクローン（実施例１に記載）を標準的な微小担体プロセスで培養し、冷却工程を行わなかった。図１から分かるように、ＦＶＩＩの力価を時間に対してプロットしたグラフは「ベルの形状」である。すなわち、１８−２０日以降から、この培養物には、ＦＶＩＩの力価の減少が見られた。この減少が、培養容器中の全細胞密度の減少によって、すなわち、培養容器から細胞が失われることによって引き起こされたことは明らかであった。

ＦＦＦ１２３９とＦＦＦ１２４２中で担体を沈降させる前に行った冷却工程中に、ジャケットへの冷却水用のバルブを常に開いた状態に保った。冷却水の温度（冷却工程の継続時間を決定する唯一のパラメータである）は、１０−１５℃であった。３６．０℃からそれぞれ２６．０℃及び２０．０℃に冷却するには、それぞれ、約３０分及び５５分を要した。古い培地を採取した後に、培養容器に加える新しい培地は、予め３０℃に加温しておいた。新しい培地を加えた後に、３６．０℃の設定値にして培養容器の温度調節ループを始動させたが、担体を沈降させる前の標的温度にかかわらず（２６．０℃又は２０．０℃）、その後元の温度に加温するのに約１２０分を要した。

冷却工程を毎日行った２つの培養物（ＦＦＦ１２３９とＦＦＦ１２４２）の全体的なプロフィールは、培養物ＦＦ１２３５と同様であった。ＦＦＦ１２３９とＦＦＦ１２４２で担体を沈降させる直前に行った毎日の冷却工程は、細胞密度とＦＶＩＩ力価に有利な効果を与えなかった。グラフはなお「ベル状形態」であったが、冷却工程によって、細胞密度とＦＶＩＩ力価のピーク値が増加するとともに（ＦＦＦ１２３５では、ピークのＦＶＩＩ力価は２２ｍｇ／Ｌであったのに対して、ＦＦＦ１２３９では３６ｍｇ／Ｌであった）、高い細胞密度と高いＦＶＩＩ力価の時間が延びた（ＦＶＩＩ力価が約１５ｍｇ／Ｌ以上の期間がＦＦＦ１２３５では８−９日であったのが、ＦＦＦ１２３９では１３−１４日に延びた）。２６℃への冷却によって、細胞密度とＦＶＩＩ力価が最大となったことが分かる。

結果
グラフ表示
ＦＦＦ１２３５、ＦＦＦ１２３９、ＦＦＦ１２４２のＦＶＩＩ力価が、図１にグラフで示されている。
培養物ＦＦＦ１２３５、ＦＦＦ１２３９、ＦＦＦ１２４２の細胞数とＦＶＩＩ力価が図２乃至図４に示されている。

培養物ＦＦＦ１２３９とＦＦＦ１２４２から導かれる結論をまとめると、毎日担体を沈降させる前に冷却工程を置くことで、培養の全体的な成果に好ましい効果がもたらされこと、及び２０℃より２６℃が好ましいことである。

本明細書に引用されている全ての特許、特許出願、文献は、その全体が参考文献として援用される。
当業者であれば、上記の記述に照らして、本発明に数多くの改変を行うことができるであろう。このような自明な改変も、添付した特許請求の範囲の範囲に属する。

図１には、培養物ＦＦＦ１２３５、ＦＦＦ１２３９、及びＦＦＦ１２４２中のＦＶＩＩ力価がグラフで示されている（５００μＬの培養容器中において、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ担体上のＣＨＯ細胞を用いて行った培養の概観）。 図２-図４には、培養物ＦＦＦ１２３５、ＦＦＦ１２３９、及びＦＦＦ１２４２の細胞数とＦＶＩＩの力価が示されている。ＦＦＦ１２３５、細胞数とＦＶＩＩ力価（図２）。 ＦＦＦ１２３９、細胞数とＦＶＩＩ力価（図３）。 ＦＦＦ１２４２、細胞数とＦＶＩＩ力価（図４）。

Claims (41)

1. 真核細胞中でポリペプチドを生産する方法であって、
   （１）前記ポリペプチドの発現に適した条件及び設定温度下において、前記ポリペプチドを発現している細胞を微小担体上で培養する工程と、
   （２）前記設定温度以下の所定の温度まで培養物を冷却する工程と、
   （３）前記微小担体を沈降させる工程と、
   （４）培地の全部又は一部を採取する工程と、を備えた方法。
2. 前記採取後に、培養容器に新しい培地を加える工程をさらに備えた、請求項１に記載の方法。
3. 前記採取した培地から前記ポリペプチドを回収する工程をさらに備えた、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記所定の温度が前記設定温度の約５℃乃至３０℃低い、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記所定の温度が前記設定温度の約５℃乃至２０℃低い、請求項４に記載の方法。
6. 前記所定の温度が前記設定温度の約５℃乃至１５℃低い、請求項５に記載の方法。
7. 前記所定の温度が前記設定温度の約１０℃低い、請求項６に記載の方法。
8. 前記沈降前に、前記培養物が約１８℃乃至約３２℃の温度に冷却される、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
9. 前記培養物が約２０℃乃至約３０℃の温度に冷却される、請求項７に記載の方法。
10. 前記培養物が約２２℃乃至約２８℃の温度に冷却される、請求項９に記載の方法。
11. 前記培養物が約２４℃乃至約２８℃の温度に冷却される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記培養物が約２５℃乃至約２７℃の温度に冷却される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法。
14. 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法。
15. 前記哺乳類細胞がＨＥＫ、ＢＨＫ、及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ポリペプチドが第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである、請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法。
18. 前記ポリペプチドが野生型ヒト第ＶＩＩ因子である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ポリペプチドが、
    Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、Ｓ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ；Ｓ５２Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｒ１５２Ｅ−第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｇｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するＦＶＩＩ
    からなる群から選択される第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
20. 前記ポリペプチドが少なくとも約１５ｍｇ／リットル培養物のレベルで生産される、請求項１乃至１９の何れか１項に記載の方法。
21. 請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法であって、前記ポリペプチドがヒト第ＶＩＩ因子であり、前記細胞がＣＨＯ細胞であり、前記担体がマクロ多孔性担体であり、前記培養設定温度が３６℃であり、前記担体を沈降させる前に前記培養物が約２６℃まで冷却される、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
22. 真核細胞の培養を行う方法であって、
    （１）培養物を維持するのに適した条件及び設定温度下において、微小担体上で細胞を培養する工程と、
    （２）前記設定温度以下の所定の温度まで培養物を冷却する工程と、
    （３）前記微小担体を沈降させる工程と、
    （４）培地の全部又は一部を採取する工程と、
    を備えた方法。
23. 前記採取後に、培養容器に新しい培地を加える工程をさらに備えた、請求項２２に記載の方法。
24. 前記所定の温度が前記設定温度の約５℃乃至３０℃低い、請求項２２乃至２３の何れか１項に記載の方法。
25. 前記所定の温度が前記設定温度の約５℃乃至２０℃低い、請求項２４に記載の方法。
26. 前記所定の温度が前記設定温度の約５℃乃至１５℃低い、請求項２５に記載の方法。
27. 前記所定の温度が前記設定温度の約１０℃低い、請求項２６に記載の方法。
28. 前記培養物が約１８℃乃至約３２℃の温度に冷却される、請求項２２乃至２３の何れかに記載の方法。
29. 前記培養物が約２０℃乃至約３０℃の温度に冷却される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記培養物が約２２℃乃至約２８℃の温度に冷却される、請求項２９に記載の方法。
31. 前記培養物が約２４℃乃至約２８℃の温度に冷却される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記培養物が約２５℃乃至約２７℃の温度に冷却される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項２２乃至３２の何れか１項に記載の方法。
34. 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項２２乃至３２の何れか１項に記載の方法。
35. 前記哺乳類細胞がＨＥＫ、ＢＨＫ、及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記細胞が所望の第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドを生産する、請求項２２乃至３６の何れか１項に記載の方法。
38. 前記所望のポリペプチドが野生型ヒト第ＶＩＩ因子である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記所望のポリペプチドが、
    Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、Ｓ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ；Ｓ５２Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｒ１５２Ｅ−第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｇｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するＦＶＩＩ
    からなる群から選択される第ＶＩＩ因子関連ペプチドである、請求項３８に記載の方法。
40. 前記所望のポリペプチドが少なくとも約１５ｍｇ／リットル培養物のレベルで生産される、請求項２２乃至３９の何れか１項に記載の方法。
41. 微小担体培養中で増殖する真核細胞によって産生されたポリペプチドを採取する方法であって、（１）所定の培養設定温度以下に培養物を冷却する工程と、次いで、（２）前記微小担体を沈降させる工程と、を備えた方法。

Images