ES2315022T3 - Metodo para la produccion de fvii. - Google Patents
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Abstract
Método para la producción de factor VII (FVII) que comprende: a) Cultivo de una línea celular de mamífero que comprende una secuencia de ADN que codifica endoproteasa Kex2 o una variante de endoproteasa KEX2, donde dicha variante es seleccionada del grupo que consiste en KEX2 1-613 y KEX2 1-674, y una secuencia de ADN que codifica FVII en un medio de cultivo adecuado, bajo condiciones donde dicha endoproteasa KEX2 o variante de endoproteasa KEX2 y dicho FVII son expresados; y b) Aislamiento de FVII del medio.
Description
Método para la producción de FVII.
La presente invención se refiere a un método
para la liberación de alta eficiencia de proteínas recombinantes en
células eucarióticas o más específicamente, para aumentar la
secreción de factor VII por coexpresión con endoproteasa Kex2 en
células cultivadas de origen mamífero.
Avances en el cultivo celular y tecnologías de
ADN recombinante han facilitado la expresión de una variedad de
proteínas de valor terapéutico u otro valor económico usando
células creadas genéticamente. La expresión de muchas proteínas
terapéuticas biológicamente activas, que son derivadas de fuentes
eucarióticas superiores, frecuentemente requiere modificaciones
específicas postraduccionales que no se originan de forma natural en
células eucarióticas o procarióticas inferiores, que por lo tanto
necesitan el uso de células derivadas de fuentes eucarióticas
superiores. Por ejemplo, la expresión de glicoproteínas en células
mamíferas tiene la ventaja de suministrar proteínas que contienen
glicosilación natural. Las glicoproteínas producidas a partir de
mamíferos contienen fracciones de carbohidrato de cadena externa
que son marcadamente diferentes de las fracciones de carbohidrato de
cadena externa presentes en glicoproteínas producidas a partir de
eucariotas inferiores. El uso de células mamíferas como huéspedes
para la producción de proteínas de mamífero segregadas tienen la
ventaja significante sobre la secreción de eucariotas inferiores de
que las células mamíferas tienen un sistema secretor que reconoce
fácilmente y procesa de forma adecuada proteínas dirigidas a la
secreción, que no es necesariamente verdadero para
eucariotas
inferiores.
inferiores.
La expresión eficaz de secuencias de
codificación en huéspedes eucarióticos pueden también requerir la
expresión de proteínas asociadas que son requeridas para el
tratamiento, estabilización o modificación de la proteína para
conseguir actividad biológica. La expresión óptima de proteínas
recombinantes biológicamente activas puede también ser dependiente
de la presencia de factores específicos de traducción y/o de
transcripción. Estas proteínas pueden estar presentes en células
huéspedes a niveles tan bajos que la expresión eficaz de proteínas
recombinantes está limitada. Ejemplos de proteínas que requieren
modificación específica postraduccional incluyen determinados
factores de coagulación, que requieren
gamma-carboxilación de residuos específicos de
ácido glutámico para la actividad biológica y pueden también
requerir la conversión de residuos específicos de ácido aspártico a
ácido beta-hidroxi aspártico para la actividad
biológica.
La coagulación sanguínea es un proceso que
consiste en una interacción compleja de varios componentes
sanguíneos, o factores, que finalmente dan lugar a un coágulo de
fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos que participan en
la denominada cascada de coagulación son proenzimas o zimógenos,
proteínas enzimáticamente inactivas que son convertidas en enzimas
proteolíticamente activas por la acción de un activador que en sí
mismo es un factor de coagulación activado. Los factores de
coagulación que han sufrido tal conversión y generalmente llamados
factores activos son designados añadiendo el sufijo "a"
minúscula (p. ej. factor VIIa).
El factor VII es una glicoproteína traza del
plasma que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El
zimógeno es catalíticamente inactivo (Williams et al., J.
Biol. Chem. 264, 1989, págs. 7536-7543; Rao et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, págs.
6687-6691). El Factor VII monocatenario puede ser
convertido en factor VIIa bicatenario por el Factor Xa, Factor
XIIa, Factor IXa o trombina in vitro. Se considera que el
Factor Xa es un activador fisiológico importante del Factor VII.
Como otras proteínas diferentes del plasma implicadas en la
hemostasis, el Factor VII depende de la vitamina K para la
expresión en una forma activa, la vitamina K siendo requerida para
la \gamma-carboxilación de residuos múltiples de
ácido glutámico reagrupados en el N-término de la
proteína. El dominio conteniendo ácido
\gamma-carboxiglutámico (Gla) es seguido de dos
dominios que son homólogos al precursor del factor de crecimiento
epidérmico (EGF) mientras que la parte de la serina proteasa ocupa
la mitad C-terminal de la
molécula.
molécula.
Las proteínas implicadas en la cascada de
coagulación son también frecuentemente procesadas hasta proteínas
maduras por seccionamiento en los residuos de aminoácidos
dibásicos. Así, el factor VII es sintetizado con un propéptido de
38 aminoácidos N-terminal, que es seccionado
C-terminalmente por dos pares de argininas
(R-R-R-R). Hay
varias enzimas candidatas que pueden intervenir en este tratamiento
in vivo, algunas de las cuales operan preferentemente en el
retículo endoplásmico (ER) y algunas en el aparato de Golgi en una
forma ligada a la membrana.
Otra modificación importante postraduccional del
factor VII es la gamma-carboxilación de 10 residuos
de ácido glutámico localizados cerca del punto de seccionamiento
del propéptido. La secuencia de eventos está indicada por el hecho
de que la presencia del propéptido y su secuencia correcta parece
importante para el proceso de gamma-carboxilación
(Busby et al., Curr. Adv. in Vit. K. Res.
173-181 (1987) y Ul-rich et
al., J. Biol. Chem. 263 (20) 9697-9702 (1988),
que ocurre en el ER catalizado por una carboxilasa ligada a la
membrana.
La endoproteasa Kex2 de levadura de
Saccharomyces es una proteasa que procesa específicamente el
precursor del \alpha-factor de tipo acoplamiento y
un factor asesino. Las propiedades de la endoproteasa Kex2 son
indicadas como las siguientes: (1) Kex2 secciona en el
c-terminal de la secuencia Lys-Arg
para la escisión del \alpha-factor de tipo
acoplamiento de su precursor, y en el C-terminal de
la secuencia Lys-Arg y la secuencia
Pro-Arg para liberar el factor asesino maduro; (2)
se intentó una purificación de la misma, y se descubrió que la
enzima está presente en una fracción de la membrana y que requiere
iones de calcio para la activación de la misma; (3) Kex2 es una
glicoproteína que tiene un peso molecular de 100 a 120 K Dalton;
(4) Kex2 secciona específicamente en el C-terminal
de las secuencias Arg-Arg, Lys-Arg,
y Pro-Arg (BBRC, 144, 807-814,
1987).
En WO 90/01550 los plásmidos se describen como
portadores de unidades de expresión policistrónica que incluyen una
guía intercistrónica. En US 5460950 (Barr et al.) las
células huéspedes se describen expresantes de PACE, una
endoproteasa humana, capaz de seccionar polipéptidos precursores
donde la secuencia codificante de PACE y la secuencia codificante
del polipéptido precursor está operativamente enlazada a una
secuencia de control de la expresión que permite la coexpresión de
las dos secuencias. Se dan ejemplos de coexpresssion de PACE y vWF
y de coexpresión de PACE y factor de coagulación IX.
EP 319944 (Mulvihill et al.) expone un
método para la coexpresión de una proteína de interés y una segunda
proteína que procesa la proteína de interés de alguna manera. Se dan
ejemplos de coexpresión de la proteína C y KEX2, coexpresión del
factor VII y factor IX, y coexpresión de trombina y KEX2.
La presente invención se refiere a un método
para la producción de factor VII que comprende
- a)
- cultivar una línea celular mamífera que comprende una secuencia de ADN codificante de la endoproteasa KEX2 o una variante de la endoproteasa KEX2, donde dicha variante es seleccionada del grupo que consiste en KEX2 1-613 y KEX2 1-674, y una secuencia de ADN codificante de FVII en un medio de cultivo adecuado, bajo condiciones donde dicha endoproteasa KEX2 o variante de endoproteasa KEX2 y dicho FVII son expresados; y
- b)
- aislar el Factor VII del medio.
La endoproteasa KEX2 puede ser truncada en su
extremo C-terminal de ese modo puede ser privada de
su región transmembrana. Además una señal de retención en ER puede
ser añadida al extremo C-terminal de la
endoproteasa truncada.
El medio de cultivo es preferiblemente un medio
sin suero y la línea celular mamífera es preferiblemente una línea
celular CHO o una línea celular BHK.
Como se utiliza en este caso el término
"KEX2" significa el gen de la endoproteasa de levadura de
S. cerevisiae.
Como se utiliza en este caso el término "Kex2
de longitud total" significa la secuencia completa de Kex2 del
aminoácido 1 a 814.
Como se utiliza en este caso el término "Kex2
truncada" significa una enzima Kex2 donde el extremo
C-terminal ha sido eliminado, en particular del
aminoácido 814 al aminoácido 614 o 675, respectivamente.
Como se utiliza en este caso el término
"ER" significa: retículo endoplasmático.
Como se utiliza en este caso el término "señal
de retención en ER" significa KDEL en el
C-terminal.
Como se utiliza en este caso el término "una
endoproteasa de tipo Kex2" significa una endoproteasa de
levadura con una secuencia de aminoácidos que tiene cierta
homología a la secuencia de aminoácidos de Kex2 de longitud total
de al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente al menos
aproximadamente el 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente
el 90%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el
95%. Las secuencias de aminoácidos de la Kex2 como la endoproteasa
de levadura como puede diferir de la secuencia de aminoácidos de
Kex2 de longitud total por inserción o deleción de uno o más
residuos aminoácidos y/o sustitución de uno o más residuos
aminoácidos en la secuencia natural por residuos aminoácidos
diferentes. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una
naturaleza inferior, es decir las sustituciones de aminoácidos
conservadoras no afectan significativamente al doblamiento y/o la
actividad de la endoproteasa. Ejemplos de sustituciones
conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (tales
como arginina, lisina e histidina), aminoácidos acidicos (tales
como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales
como glutamina y asparragina), aminoácidos hidrofóbicos (tales como
leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (tales como
fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (tales
como glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las
sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la
actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas,
p. ej., por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, En, The Proteins,
Academic Press, Nueva York. Los cambios que ocurren más
frecuentemente son: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly,
Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg,
Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly al igual que las mismas
a la inversa.
Con el término "un derivado de una
endoproteasa de levadura" se entiende una secuencia
C-terminalmente truncada que puede contener una
señal de retención en ER fijada al extremo
C-terminal.
El método según la presente invención
generalmente comprende:
- (a)
- introducir en la línea celular mamífera un(os) sistema(s) de vector comprendiendo ADN que codifica la endoproteasa KEX2 o una variante de endoproteasa KEX2, donde dicha variante es seleccionada del grupo que consiste en KEX2 1-613 y KEX2 1-674, y el factor VII de codificación de ADN; y
- (b)
- hacer crecer las células mamíferas transfectadas en un medio apropiado bajo condiciones donde dicha endoproteasa KEX2 o variante de endoproteasa KEX2 y FVII son expresados; y
- (c)
- aislamiento del factor VII.
El sistema de vectores preferiblemente
comprenderá dos vectores separados que son capaces de expresar FVII
y la endoproteasa, respectivamente. En esta forma de realización de
la presente invención, las células mamíferas son cotransfectadas
con los dos vectores y luego son cultivadas en un medio de cultivo
adecuado. De forma alternativa un clon de expresión del factor VII
ya establecido puede ser transfectado con un vector capaz de
expresar la endoproteasa. El sistema de vectores puede también
comprender un único vector comprendiendo el cassette de expresión de
FVII y el cassette de expresión de la endoproteasa.
Las células mamíferas usadas como células
huéspedes en el método de la presente invención incluyen células de
ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de
cría de hámster (BHK), células COS, células HEK 293 o cualquier
número de otras líneas celulares disponibles inmortalizadas, p.
ej., de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC).
Ejemplos de líneas celulares de mamífero
adecuadas son las líneas celulares COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC
CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39), HEK 293 (ATCC CRL 1573) o
CHO (ATCC CCL 61). Métodos para transfectar células mamíferas y
secuencias de ADN de expresión introducidas en las células están
descritas en p. ej. Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601
- 621; Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341;
Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 -
426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro y Pearson,
Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham y van der Eb, Virology
52 (1973), 456; y Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841 –
845.
El vector puede ser cualquier vector que puede
ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante,
y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula
huésped en la que deba ser introducido. Así, el vector puede ser un
vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como
una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de
la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma
alternativa, el vector puede ser tal que, al introducirse en una
célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se
replique con el(los) cromosoma(s) en el(los)
que haya sido integrado. El vector es preferiblemente un vector de
expresión donde la secuencia de ADN codificante está operativamente
enlazada a segmentos adicionales requeridos para la transcripción
del ADN. En general, el vector de expresión es derivado del ADN
plásmido o vírico, o puede contener elementos de ambos. El término,
"operativamente enlazado" indica que los segmentos están
dispuestos de modo que funcionen en concierto para los objetivos
destinados, p. ej. la transcripción se inicia en un promotor y
procede a través de la secuencia de ADN que codifica para el
polipéptido.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN
que muestre actividad transcripcional en la célula huésped y puede
ser derivado de genes que codifican proteínas bien homólogas o
heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados
para dirigir la transcripción del ADN codificante en células
mamíferas son el promotor SV40 (Subramani et al., Mol. Cell
Biol. 1 (1981), 854 -864), el promotor MT-1 (gen de
metalotioneina) (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809 -
814) o el promotor tardío más importante del adenovirus 2.
La secuencia de ADN codificante puede también,
ser operativamente conectada a un terminador adecuado, tal como el
terminador de la hormona de crecimiento humana (Palmiter et
al., op. cit.) o el terminador ADH3 (McKnight
et al., op. cit.).
El vector puede además comprender elementos
tales como señales de poliadenilación (p. ej. de SV40 o la región
Elb del adenovirus 5), secuencias potenciadoras transcripcionales
(p. ej. el potenciador SV40) y secuencias potenciadoras
traduccionales (p. ej. aquellas que codifican los ARNs del
adenovirus VA).
El vector también puede contener preferiblemente
una región codificante del péptido señal, que codifica para una
secuencia de aminoácidos enlazada al terminal amino del polipéptido
FVII que puede dirigir el polipéptido FVII expresado en la vía
secretora de la célula huésped. El péptido señal puede ser homólogo
o heterólogo a la línea celular huésped mamífera y puede ser el
péptido señal natural.
Finalmente, el vector puede comprender una
secuencia de ADN que le permita replicarse en la célula huésped en
cuestión. Un ejemplo de tal secuencia en una célula mamífera es el
origen de replicación SV40. Las células mamíferas transfectadas son
cultivadas en un medio nutritivo adecuado bajo condiciones que
permiten la coexpresión de FVII y la endoproteasa a partir de lo
cual FVII es recuperado del medio de cultivo. El medio cultivo usado
para las células mamíferas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para hacer crecer células mamíferas, tales como medios
mínimos o complejos que contienen suplementos apropiados. Los
medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o
pueden ser preparados según recetas publicadas (p. ej. en catálogos
de la Colección Americana de Cultivos Tipo). El FVII producido por
las células puede luego ser recuperado del medio de cultivo por
procedimientos convencionales incluyendo la separación de las
células huéspedes del medio por centrifugado o filtración,
precipitación de los componentes proteínicos del sobrenadante o
filtración mediante una sal, p. ej. sulfato amónico, purificación
por una variedad de procedimientos cromatográficos, p. ej.
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en
gel, cromatografía de afinidad, o similar, dependiendo del tipo de
polipéptido en
cuestión.
cuestión.
Los ejemplos siguientes son ofrecidos sólo como
ilustración, no como limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Fig.1 destaca la construcción del plásmido de
expresión Kex2 usando pcDNA3 de Invitrogen como cassette de
expresión. A partir de un clon genómico de KEX2 en el plásmido
pME568, el N-terminal de 800 bp de la región
codificante fue subclonado en pUC19 Acc651-Xba1
después de la introducción de un sitio Acc651 de 15 bp hacia arriba
del ATG inicial por PCR del N-terminal de 375 bp
usando los cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este fragmento Acc651-Hind3 de
375 bp's fue ligado al fragmento contiguo a
Hind3-Xba1 de 420 bp's y clonado en pUC19. A partir
del plásmido resultante, pHW1252, el fragmento
Acc651-Xba de 1800 bp fue cortado e insertado con
el fragmento Xba1-SnaB1 C-terminal
de 1750 bp de pME568 en pcDNA3 Acc651-EcoRV de 5.4
kb para producir el plásmido de expresión pHW1253. La secuencia de
KEX2 en pHW1253 es esencialmente como se describe en Philippsen, P.
et al. Nature 387 (suppl.), 93-98 (1997) en
The Yeast Genome Directory.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Células de riñón de cría de hámster (BHK) que
expresan FVII (Berkner et al., Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol. 51, 531-541 (1986)) fueron
transfectadas con 2 \mug de plásmido pH1253 como se describe en el
ejemplo 1, usando el método de amina LipoFect como se describe por
el proveedor (Gibco, Life Technologies, Roskilde, Denmark). Clones
estables fueron seleccionados en un medio (medio Eagle modificado
Du Ibecco, 10% de suero fetal de ternera, 100 Ul de Penicilina, 100
Ul de Estreptomicina, 1 mmol/l de Napirovato y 5 mg/l de vitamina
K1) conteniendo 1 mg/l de Geneticina G418 (Gibco). Después de la
selección, los clones estables fueron seleccionados usando
cilindros de clonación y mantenidos a 37°C en una atmósfera
conteniendo el 5% de CO_{2}.
Los clones estables fueron seleccionados en un
FVII-ELISA (Novo Nordisk) para la producción de
FVII. La actividad enzimática de Kex2 de 1 millón de células de los
clones anteriores fue determinada esencialmente como se describe
por N. C. Rockwell, G. T. Wang, G. A. Kraft, y R. S. Fuller.,
Biochemistry 36 (7): 1912 - 1917, 1997. La línea celular original
productora de FVII fue cultivada en paralelo y usada como
referencia.
\newpage
Estamos viendo una correlación positiva entre la
expresión de Kex 2 y la secreción de FVII en esta línea celular
BHK, con 2-3 veces más FVII producido en los clones
que coexpresan Kex2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Un ADNc de FVII con regiones delecionadas no
traducidas fue preparado por PCR con Taq polimerasa usando los
cebadores siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y el ADNc de FVII humano como molde
(Hagen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, págs.
2412-2416). El fragmento de PCR fue clonado en el
vector PBluescript II KS+ (Stratagene) y la secuencia fue
verificada. El ADNc fue transferido como un fragmento de
BamHI-SpeI al vector Zem219b de expresión celular
de mamífero (Busby et al. J. Biol. Chem. 266, 1991, págs.
15286-15292), que lleva un
metal-lothionin de ratón en el promotor para
conducir el ADNc insertado y el ADNc de
dihidrofolato-reductasa conducido por un promotor
SV40 para el uso como un marcador seleccionable. El plásmido
resultante fue designado
pLN174.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las células CHO-K1 (ATCC CCL 61)
adaptadas para el crecimiento en suspensión fueron transfectadas
con:
- a.
- el plásmido de expresión pLN174 de FVII (ejemplo a) y el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen) sin ADNc insertado.
- b.
- el plásmido de expresión pLN174 de FVII (ejemplo a) y el vector de expresión pcDNA3/KEX2
usando el reactivo de transfección
Qiafect. Se seleccionaron transfectantes dobles usando 1 \muM de
metotrexato y 700 \mug/ml de Geneticina (Gibco). Cuando los
clones fueron visibles por el ojo desnudo los cultivos fueron
transferidos a matraces en T para un cultivo
adicional.
Las agrupaciones de transfectantes (a y b como
se ha descrito anteriormente) fueron sembrados en matraces T25
(0,25 x 10^{6} células por matraz) para la medición de producción
de FVII. Cuando las células se adherieron al sustrato, se añadió un
medio fresco conteniendo 5 \mug/ml de vitamina K1. El medio de
cultivo fue cosechado después de 2 días adicionales y evaluado para
actividad de FVII con un kit ELISA (DAKO). Como se puede observar a
partir de la tabla abajo la cotransfección de pcDNA3/KEX2 y FVII da
un nivel de expresión 5 veces mayor de inmunorreactividad de FVII en
comparación con FVII cuando es cotransfectado con el vector pcDNA3
sólo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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[0035]
<110> Novo Nordisk A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para obtener FVII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5565sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 5565
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1998-11-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia
artificial:cebador 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (4)
1. Método para la producción de factor VII
(FVII) que comprende:
a) Cultivo de una línea celular de mamífero que
comprende una secuencia de ADN que codifica endoproteasa Kex2 o una
variante de endoproteasa KEX2, donde dicha variante es seleccionada
del grupo que consiste en KEX2 1-613 y KEX2
1-674, y una secuencia de ADN que codifica FVII en
un medio de cultivo adecuado, bajo condiciones donde dicha
endoproteasa KEX2 o variante de endoproteasa KEX2 y dicho FVII son
expresados; y
b) Aislamiento de FVII del medio.
2. Método según la reivindicación 1, donde dicha
endoproteasa KEX2 o variante de endoproteasa KEX2 tiene una señal
de retención en ER en forma de aminoácidos KDEL añadidos al extremo
C-terminal.
3. Método según la reivindicación 1, donde el
medio de cultivo es un medio sin suero.
4. Método según la reivindicación 1, donde la
línea celular de mamífero es seleccionada del grupo que consiste en
líneas celulares CHO, BHK y HEK 293.
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