ES2503365T5 - Método para producir proteínas dependientes de vitamina K biológicamente activas por métodos recombinantes - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Metodo para producir protemas dependientes de vitamina K biologicamente activas por metodos recombinantes Fundamento de la invencion Campo de la invencion

Las realizaciones de la invencion se refieren generalmente a la produccion de protemas dependientes de vitamina K recombinantes, particularmente Factor IX, que son totalmente funcionales por co-expresion de una o mas protemas implicadas en el procesado de las protemas dependientes de vitamina K. Estas protemas de procesado incluyen, epoxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR) y Y-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGc). Adicionalmente, el propeptido de la protema dependiente de vitamina K puede modificarse para mejorar la y- carboxilacion.

Descripcion de la tecnica relacionada

Los trastornos de sangrado pueden resultar de una deficiencia en los niveles funcionales de una o mas de las protemas de la sangre, conocidas en conjunto como factores de coagulacion de la sangre, que se necesitan para la hemostasia normal, es decir, coagulacion de la sangre. La gravedad de un trastorno de sangrado dado es dependiente del nivel en sangre de factores de coagulacion funcionales. Los trastornos de sangrado suaves se observan generalmente cuando el nivel funcional de un factor de coagulacion dado alcanza aproximadamente el 5% de lo normal, aunque si el nivel funcional cae por debajo de 1%, es probable que ocurra sangrado grave con cualquier dano de la vasculatura.

La experiencia medica ha mostrado que la hemostasia esencialmente normal puede restaurarse temporalmente por infusion intravenosa de preparados biologicos que contienen uno o mas de los factores de coagulacion de la sangre. La denominada terapia de sustitucion, en donde un preparado biologico que contiene el factor de coagulacion de la sangre deficiente se infunde cuando se da el sangrado (bajo demanda) o para evitar el sangrado (profilacticamente), se ha mostrado que es efectivo en el manejo de pacientes con una amplia variedad de trastornos de sangrado. En general, para que la terapia de sustitucion sea efectiva, las infusiones intravenosas del factor de coagulacion ausente estan dirigidas a alcanzar niveles que esten bien por encima de 5% de lo normal durante un periodo de dos a tres dfas.

Historicamente, los pacientes que sufren de hemofilia, un trastorno del sangrado adquirido geneticamente que resulta de una deficiencia o bien del Factor VIII de coagulacion de la sangre (hemofilia A) o del Factor IX (hemofilia B), se trataban con exito mediante infusion periodica de toda la sangre o fracciones de plasma sangumeo de grados variables de pureza.

Mas recientemente, con el advenimiento de la biotecnologfa, los preparados biologicamente activos de factores de coagulacion de la sangre sinteticos (recombinante) se han convertido en disponibles comercialmente para el tratamiento de trastornos de coagulacion de la sangre. Las protemas de coagulacion de la sangre recombinantes estan esencialmente libres de riesgos de la contaminacion patogena humana que continua siendo una preocupacion que se asocia con preparados comerciales incluso de alta pureza que se derivan de la sangre humana.

El tratamiento adecuado de los trastornos de sangrado esta muy limitado a las regiones economicamente desarrolladas del mundo. En el caso de hemofilia se estima que mas del 75% de la poblacion mundial de pacientes recibe tratamiento inadecuado o, peor, ningun tratamiento, para su enfermedad. Para muchas regiones del mundo, el coste de preparados comerciales seguros y efectivos de factores de coagulacion es prohibitivo para el manejo rutinario de los trastornos de sangrado y, en algunos casos, solo el tratamiento de emergencia con productos donados esta disponible.

En regiones del mundo donde el tratamiento adecuado de trastornos de sangrado esta potencialmente disponible, el coste es muy alto y los pacientes son casi siempre dependientes de pagadores de tercera parte, por ejemplo, seguro de salud o programas subsidiarios del gobierno, para adquirir los productos comerciales necesarios. En promedio, el tratamiento de hemofilia en los Estados Unidos se estima que cuesta aproximadamente $50.000 por paciente por ano por el producto comercial necesario para cuidado rutinario, bajo demanda. Sin embargo, este coste podna ser mucho mayor en tanto que el Comite Consultivo Medico y Cientffico para la Fundacion Nacional de la Hemofilia ha recomendado que los pacientes debenan recibir tratamiento profilactico que, en el caso de un hemofflico adulto, podna llevar al coste anual muy por encima de $250.000 por ano. Dado que los lfmites de seguros de vida de aproximadamente $1 millon estan asociados generalmente con la mayona de poltticas en los Estados Unidos, los hemofflicos se reducen gravemente en terminos de la cantidad de producto comercial que pueden permitirse para el cuidado que, al menos, afecta a su calidad de vida durante la edad adulta y, a lo peor, eleva el riesgo de sangrado que amenaza la vida.

Durante los pasados 25 anos o asf, la biotecnologfa ha ofrecido la promesa de producir productos biofarmaceuticos a bajo coste. Desafortunadamente, esta promesa no se ha cumplido debido en mayor parte a la inherente complejidad de las moleculas biologicas que se dan de forma natural y una variedad de limitaciones asociadas con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

la smtesis de sus contrapartes de protema recombinante en celulas disenadas geneticamente. A pesar del tipo de celula, por ejemplo, animal, bacteria, levadura, insecto, planta, etc., que se elige para la smtesis, las protemas deben alcanzar ciertas propiedades estructurales mmimas para el uso terapeutico seguro y efectivo. En algunos casos, las protemas recombinantes deben simplemente doblarse correctamente despues de la smtesis para obtener la estructura tridimensional necesaria para la funcion apropiada. En otros casos, las protemas recombinantes deben sufrir modificacion post-traduccional, dirigida por enzima, extensiva, despues de que la protema del nucleo se ha sintetizado en la celula. Deficiencias en cualquiera de un numero de actividades enzimaticas intracelular pueden dar por resultado la formacion de un gran porcentaje de protema no funcional y limitar la utilidad de un sistema celular disenado geneticamente para la produccion economica de un producto biofarmaceutico previsto para uso comercial.

Varias de las protemas necesarias para la coagulacion normal de la sangre son muy complejas en termino de tener dominios estructurales multiples estando cada uno asociado con una propiedad funcional muy espedfica que es esencial para la efectividad total de la protema en el control de la hemostasia y/o prevencion de la trombosis. En particular, las denominadas protemas de coagulacion de la sangre “dependientes de vitamina K”, por ejemplo, Factores II, VII, IX, X, Protema C y Protema S, son protemas muy complejas y deben sufrir modificacion post- traduccional extensiva para la funcion normal. Alcanzar altos niveles de protemas dependientes de vitamina K funcionales por tecnologfa recombinante se ha limitado por la complejidad estructural de estas protemas y la incapacidad de crear sistemas celulares disenados geneticamente que vencen las deficiencias inherentes en las actividades enzimaticas necesarias para que ocurra la modificacion post-traduccional eficiente y completa.

Problema a resolver

La primera protema de coagulacion de la sangre dependiente de vitamina K sintetica en llegar a estar disponible comercialmente fue el Factor IX que se fabrica aun hoy en dfa a partir de celulas de Ovario de Hamster Chino (CHO) disenadas geneticamente (BeneFix, Injerto Direccional del Factor IX de Coagulacion (Recombinante), Weyth Pharmaceuticals, Inc. Filadelfia, PA 19l0l CI 8020-3 W10483C007, Rev 10/05). Aunque el Factor IX recombinante puede producirse usando celulas CHO, no es optimo como un tratamiento para la Hemofilia B porque no se ha procesado de forma apropiada y por consiguiente su biodisponibilidad a los pacientes es variable. Mientras que niveles razonables de protema de Factor IX recombinante pueden expresarse mediante celulas CHO disenadas geneticamente, por ejemplo, hasta 188 mg/L, los niveles de Factor IX totalmente funcional que se producen estan en el orden de solo 0,5 mg/L debido a la capacidad limitada de las celulas CHO para gamma-carboxilar totalmente los primeros 12 residuos de acido glutamico en la region amino terminal de la protema denominada como el dominio gla. Ademas de esta deficiencia en la modificacion post-traduccional del Factor IX, el trabajo posterior demostro que el pro-Factor IX, una forma de Factor IX que contiene un dominio de propeptido que se necesita para la gamma- carboxilacion intracelular eficiente de la protema, no se procesa completamente antes de la secrecion desde la celula CHO. Como consecuencia, se encontro que muy por encima de la mitad del Factor IX secretado desde celulas CHO disenadas geneticamente aun contiene la region propeptido y no es funcional (Bond, M., Jankowski, M., Patel, H., Karnik, S., Strand, A., Xu, B., et al. [1998] Biochemical characterization of recombinant factor IX. Semin. Hematol, 35 [2 Supl. 2], 11-17).

La presente solicitud aborda una necesidad de un metodo para producir protemas dependientes de vitamina K tal como Factor IX que se hayan procesado apropiadamente de manera que sean activas y en rendimiento suficiente para la produccion comercial. Para aumentar la disponibilidad de protemas de coagulacion de la sangre dependientes de vitamina K para cumplir con la necesidad medica mundial para el tratamiento de trastornos de sangrado tales como hemofilia B, se necesitan mejoras en la produccion de protema totalmente funcional, Factor IX en este ejemplo, a partir de celulas disenadas geneticamente. De forma espedfica, se necesitan la identificacion y suplemento de deficiencias en las actividades enzimaticas necesarias para obtener modificacion post-traduccional esencialmente completa.

Compendio de la invencion

Segun la presente invencion se proporciona un metodo para producir producto de protema de Factor IX recombinante biologicamente activo como se presenta en la reivindicacion 1.

Las realizaciones de la invencion se dirigen a metodos para producir un producto de Factor IX recombinante biologicamente activo, que incluye transfectar una celula CHO con un gen que codifica la protema de Factor IX unido de forma operable a un promotor y al menos dos genes que codifican un(os) factor(es) de procesado unido(s) de forma operable a al menos un promotor, o bien de forma simultanea o secuencial, y cosechar el producto de protema de Factor IX. Preferiblemente, la celula produce producto de protema dependiente de vitamina K biologicamente activa en una cantidad de al menos aproximadamente 15 mg/L.

El factor de procesado es un acido nucleico seleccionado de, epoxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR) y Y-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC) unido de forma operable a uno o mas promotores. Preferiblemente, la una o mas protemas de factor de procesado se produce(n) en una cantidad suficiente para facilitar la produccion de al menos aproximadamente 15 mg/L del producto de protema dependiente de vitamina K recombinante biologicamente activo. Preferiblemente, al menos uno de los genes se sobre-expresa. Mas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

preferiblemente, el gen sobre-expresado se une de forma operable a un promotor del factor de alargamiento 1-a de hamster chino (CHEF1).

En realizaciones preferidas, al menos aproximadamente el 75% de los residuos de acido glutamico en el dominio gla del producto de protema de Factor IX biologicamente activo estan gamma-carboxilados.

En algunas realizaciones preferidas, el producto de protema de Factor IX tiene una supresion en un propeptido del producto de protema de Factor IX.

En algunas realizaciones preferidas, el producto de protema de Factor IX incluye una region de propeptido heterologa que es de una protema de Factor IX que es diferente del producto de protema de Factor IX.

Preferiblemente, al menos el 10% de la protema de Factor IX recombinante es biologicamente activa. Mas preferiblemente, al menos el 20% de la protema de Factor IX es biologicamente activa. Aun mas preferiblemente, al menos el 50% de la protema de Factor IX es biologicamente activa. Aun mas preferiblemente, al menos el 80% de la protema de Factor IX es biologicamente activa.

En realizaciones preferidas, la protema de Factor IX biologicamente activa se produce en una cantidad de al menos aproximadamente 20 mg/L. Mas preferiblemente, la protema de Factor IX biologicamente activa se produce en una cantidad de al menos aproximadamente 30 mg/L. Mas preferiblemente, la protema de Factor IX biologicamente activa se produce en una cantidad de al menos aproximadamente 50 mg/L.

En algunas realizaciones preferidas, la transfeccion es secuencial y transfectar la celula de mairnfero incluye ademas seleccionar las celulas que expresan altos niveles del producto de protema de Factor IX o el(los) factor(es) de procesado, clonar las celulas seleccionadas y amplificar las celulas clonadas. En algunas realizaciones preferidas, las etapas de transfeccion con el(los) gen(es) que codifica(n) el(los) factor(es) de procesado se realizan antes de las etapas de transfeccion con el gen que codifica la protema de Factor IX. En realizaciones preferidas alternativas, las etapas de transfeccion con el gen que codifica la protema de Factor IX se realizan antes de las etapas de transfeccion con el(los) gen(es) que codifica(n) el(los) factor(es) de procesado.

En realizaciones preferidas, la celula CHO se selecciona para la expresion de niveles endogenos de uno o mas factores de procesado antes de la transfeccion.

Las realizaciones de la invencion se dirigen a una celula CHO recombinante que incluye un gen para la protema de Factor IX unido de forma operable a un promotor y un gen para al menos un factor de procesado unido de forma operable a al menos un promotor. La expresion de la(s) protema(s) codificada(s) por el gen para al menos un(os) factor(es) de procesado en la celula facilita la produccion de protema de Factor IX biologicamente activo en una cantidad de preferiblemente al menos aproximadamente 15 mg/L.

El factor de procesado es un gen que produce un producto genico de procesado seleccionado de VKOR y VKGC, unido de forma operable a uno o mas promotores para la expresion en dicha celula. Preferiblemente, el al menos un producto genico de procesado se expresa a un mayor nivel que el observado en las celulas normales no transfectadas de la misma lmea. Mas preferiblemente, el producto genico sobre-expresado esta unido de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hamster chino (CHEF1).

En realizaciones preferidas, el gen que codifica la protema de Factor IX se modifica para aumentar el porcentaje de residuos de acido glutamico que se carboxilan cuando se compara al porcentaje de residuos de acido glutamico carboxilado presentes en la protema de Factor IX producida a partir de celulas que expresan una protema de Factor IX codificada por un gen que codifica la protema de Factor IX no modificada.

En algunas realizaciones preferidas, la modificacion incluye una supresion en la region propeptido del gen que codifica la protema de Factor IX.

En algunas realizaciones preferidas, la modificacion incluye sustitucion de una region propeptido de la protema de Factor IX con una region propeptido heterologa procedente de una protema de Factor IX heterologa.

En algunas realizaciones preferidas, la celula usada para la transfeccion de un gen para una protema de Factor IX se preselecciona seleccionando variantes de una lmea celular de cultivo tisular espedfica que contienen enzimas de modificacion que se dan de forma natural capaces de producir una protema de Factor IX compuesta de aminoacidos que se modifican post-traduccionalmente para contener al menos 25% de la sulfatacion y al menos 25% de los niveles de fosforilacion presentes en la protema de Factor IX derivada de plasma correspondiente.

En realizaciones preferidas, una protema de Factor IX recombinante se produce mediante una o mas de las etapas del metodo descrito en esta memoria. La protema de Factor IX recombinante producida por los metodos descritos pueden incluirse en una composicion farmaceutica, o un estuche. La protema de Factor IX recombinante puede usarse en un metodo para tratar hemofilia administrando una cantidad efectiva de la protema de Factor IX recombinante a un paciente que lo necesita.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Las realizaciones preferidas se dirigen a metodos para producir productos de protema de Factor IX recombinante biologicamente activos, mediante un procedimiento que implica una o mas de las siguientes etapas:

(a) transfectar una celula de mairnfero con un gen que codifica la protema de Factor IX unida de forma operable a un promotor;

(b) seleccionar celulas que expresan altos niveles del producto de protema de Factor IX;

(c) transfectar las celulas seleccionadas con uno o mas factores de procesado unidos de forma operable a un promotor;

(d) repetir la etapa (b);

(e) opcionalmente, repetir las etapas (a) y/o (c) seguido de (b);

(f) clonar las celulas seleccionadas; y

(g) amplificar las celulas clonadas; y

(h) cosechar el producto de las celulas clonadas en una cantidad de al menos 15 mg/L de protema de Factor IX recombinante biologicamente activa.

Aspectos, caractensticas y ventajas adicionales de esta invencion seran evidentes a partir de la descripcion detallada de las realizaciones preferidas que siguen.

Breve descripcion de los dibujos

Estas y otras caractensticas de esta invencion se describiran ahora con referencia a los dibujos de realizaciones preferidas que se pretende que ilustren y no que limiten la invencion.

La Figura muestra la cantidad total de Factor IX producido por clon despues de la transfeccion de un gen de Factor IX tipo salvaje en celulas CHO. El gen del Factor IX estaba bajo el control del promotor CHEF-1. Las celulas se dejaron crecer en suero al 5% durante 14 dfas. El medio de cultivo celular se cosecho y la cantidad total de antfgeno de Factor IX en |jg por mL se cuantifico por un metodo ELISA de Factor IX.

Descripcion detallada

Las realizaciones preferidas de la invencion se dirigen a metodos para crear una celula disenada geneticamente que produzca un alto porcentaje de protema de Factor IX biologicamente activa en cantidades adecuadas para la comercializacion mundial. Las realizaciones de la invencion se describen con respecto a la produccion de Factor IX. Sin embargo, los metodos descritos son aplicables a todas las protemas dependientes de vitamina K.

Para producir compuestos bioterapeuticos de protema dependiente de vitamina K de bajo coste para uso comercial en una base mundial, una celula disenada geneticamente debe crearse para la produccion que (1) produce grandes cantidades de la cadena polipeptfdica que tiene la estructura primaria deseada y (2) es capaz de realizar de forma eficiente todas las modificaciones post-traduccionales esenciales que se necesitan para producir un producto biofarmaceutico sintetico totalmente funcional.

Como se usa en esta memoria, el termino “uso comercial” significa un Factor IX u otra protema dependiente de vitamina K que, cuando se produce a partir de celulas de cultivo tisular, es al menos activo biologicamente al 10% y es capaz de produccion a un nivel de al menos aproximadamente 30 mg/L.

Como se usa en esta memoria “actividad biologica” se determina con referencia a un patron de Factor IX derivado del plasma humano, tal como MONONINE® (ZLB Behring). La actividad biologica del patron de Factor IX se toma como que es 100%. Preferiblemente, el Factor IX segun las realizaciones de la invencion tiene al menos 20% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 25% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 30% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 35% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 40% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 45% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 50% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 55% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 60% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 65% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 70% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 75% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 80% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 85% de la actividad del patron de Factor IX, mas preferiblemente al menos 90% de la actividad del patron de Factor IX.

La Factor IX segun la invencion es capaz de la produccion a un nivel de al menos aproximadamente 20 mg/L, preferiblemente al menos aproximadamente 30 mg/L, mas preferiblemente al menos aproximadamente 40 mg/L, mas preferiblemente al menos aproximadamente 50 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 60

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 70 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 80 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 90 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 100 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 110 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 120 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 130 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 140 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 150 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 160 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 170 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 180 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 190 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 200 mg/L, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 210 mg/L de protema dependiente de vitamina K biologicamente activa.

El termino “factor de procesado” es un termino amplio que incluye cualquier protema, peptido, cofactor no peptidico, sustrato o acido nucleico que promueva la formacion de una protema dependiente de vitamina K funcional. Ejemplos de dichos factores de procesado incluyen, aunque no estan limitados a PACE, VKOR y VKGC.

“Clonacion de dilucion lfmite” tiene su significado normal y habitual y se refiere a un procedimiento para obtener una poblacion de celula monoclonal partiendo de una masa de celulas policlonales. El cultivo de partida (policlonal) se diluye en serie hasta que se obtiene un cultivo monoclonal.

El Instituto de Genetica ha mostrado que la produccion de grandes cantidades de protemas dependientes de vitamina K es posible en celulas CHO disenadas geneticamente (Patente de EE.UU. num. 4.770.999), aunque el porcentaje de protema totalmente funcional es muy bajo. Un objeto de la presente invencion es una celula CHO disenada geneticamente que produce grandes cantidades de protemas dependientes de vitamina K por la que el porcentaje de protema totalmente funcional es adecuada para producir un producto biofarmaceutico de bajo coste para uso comercial en una base mundial.

Stafford (Patente de EE.UU. num. 5.268.275) ha mostrado que la produccion de un alto porcentaje de protemas dependientes de vitamina K gamma-carboxiladas es posible en celulas HEK 293 disenadas geneticamente que se crean para co-expresar enzimas que mejoran la carboxilacion de protema dependientes de vitamina K, aunque la cantidad total de protema gamma-carboxilada que se produce es muy baja. Como se describe en esta memoria es una celula HEK 293, CHO u otra, disenada geneticamente, que produce grandes cantidades de protemas dependientes de vitamina K por las que el porcentaje de protema totalmente funcional es adecuado para producir un producto biofarmaceutico de bajo coste para uso comercial en una base mundial.

Muchos metodos de transfeccion para crear celulas disenadas geneticamente que expresan grandes cantidades de protemas recombinantes se conocen bien. Los anticuerpos monoclonales, por ejemplo, se fabrican de forma rutinaria a partir de celulas disenadas geneticamente que expresan niveles de protema en exceso de 1000 mg/L. La presente invencion no es dependiente de ningun metodo de transfeccion espedfico que pudiera usarse para crear una celula disenada geneticamente.

Muchos vectores de expresion pueden usarse para crear celulas disenadas geneticamente. Algunos vectores de expresion se disenan para expresar grandes cantidades de protemas recombinantes despues de la amplificacion de celulas transfectadas bajo una variedad de condiciones que favorecen las celulas seleccionadas, de alta expresion. Algunos vectores de expresion se disenan para expresar grandes cantidades de protemas recombinantes sin la necesidad de amplificacion bajo presion de seleccion. La presente invencion no es dependiente del uso de ningun vector de expresion espedfico.

Para crear una celula disenada geneticamente para producir grandes cantidades de una protema dependiente de vitamina K dada, las celulas se transfectan con un vector de expresion que contiene el ADNc que codifica la protema. La presente invencion necesita que se cree una celula transfectada que sea capaz, bajo condiciones de crecimiento optimizadas, de producir un mmimo de 20 mg/L de la protema dependiente de vitamina K diana. Pueden alcanzarse mayores niveles de produccion de la protema dependiente de vitamina K diana y podnan ser utiles en la presente invencion. Sin embargo, el nivel optimo de produccion de la protema dependiente de vitamina K diana es un nivel a o por encima de 20 mg/L que puede obtenerse en una forma funcional significativamente mejorada cuando la protema diana se expresa con enzimas co-transfectadas seleccionadas que provocan la apropiada modificacion post-traduccional de la protema diana para dar un sistema celular dado.

Para crear una celula disenada geneticamente que sea capaz de realizar eficientemente todas las modificaciones post-traduccionales esenciales que se necesitan para producir un producto biofarmaceutico sintetico totalmente funcional, las enzimas seleccionadas se co-transfectan junto con la protema dependiente de vitamina K. El Instituto de Genetica ha mostrado que las celulas CHO disenadas geneticamente que producen grandes cantidades de protema dependiente de vitamina K (Factor IX) no se han procesado apropiadamente para eliminar la region propeptido antes de la secrecion. En este caso, el Instituto de Genetica ha encontrado que la co-expresion de una enzima (PACE), conocida por eliminar la region de propeptido de las protemas dependientes de vitamina K, elimina esencialmente la deficiencia en los niveles celulares intrmsecos de la enzima. Sin embargo, el Instituto de Genetica ha mostrado tambien que las deficiencias en los niveles intrmsecos de otras enzimas dan por resultado que la mayona de la protema dependiente de vitamina K producida por celulas CHO disenadas geneticamente no sean

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

funcionales debido al bajo porcentaje de gamma-carboxilacion post-traduccional del dominio gla (Bond, M., Jankowski, M., Patel, H., Karnik, S., Strand, A., Xu, B., et al. [1998] Biochemical characterization of recombinant factor IX. Semin. Hematol. 35 [2 Supl. 2], 11-17).

El metodo de la presente invencion implica la primera seleccion de una celula que puede disenarse geneticamente para producir grandes cantidades de una protema dependiente de vitamina K tal como Factor IX.

La celula puede seleccionarse de una variedad de fuentes, aunque es por otro lado una celula que puede transfectarse con un vector de expresion que contiene un acido nucleico, preferiblemente un ADNc de una protema dependiente de vitamina K.

A partir de un estanque de celulas transfectadas, se seleccionan clones que producen cantidades de la protema de Factor IX sobre un intervalo (Intervalo Diana) que se extiende desde el mayor nivel al menor nivel que es mmimamente aceptable para la produccion de un producto comercial. Los clones celulares que producen cantidades de protema de Factor IX en el Intervalo Diana pueden combinarse para obtener un unico estanque o multiples sub- estanques que dividen los clones en poblaciones de clones que producen niveles alto, medio o bajo de la protema dependiente de vitamina K en el Intervalo Diana.

Se considera que esta dentro del alcance de la presente invencion el que las celulas transfectadas que producen una protema de Factor IX en el Intervalo Diana pueden analizarse para determinar la extension a la que se produce la protema totalmente funcional. Dicho analisis proporcionara conocimiento en las deficiencias espedficas de enzima que limitan la produccion de protema totalmente funcional. Ademas, se anticipa que el analisis de sub-estanques que consisten en clones celulares que producen niveles alto, medio o bajo de la protema dependiente de vitamina K en el Intervalo Diana proporcionaran conocimiento en las deficiencias de enzima espedficas que limitan la produccion de protema totalmente funcional a niveles variables de produccion de la protema dependiente de vitamina K. Dicho analisis, si se hace en un unico estanque de clones celulares o en sub-estanques, revelanan las deficiencias enzimaticas espedficas que deben eliminarse para producir protema totalmente funcional.

Para eliminar las deficiencias enzimaticas en un estanque de clones transfectados que limita la produccion de protema dependiente de vitamina K totalmente funcional en el Intervalo Diana, las realizaciones de la presente invencion proporcionan la transfeccion del estanque de celulas con un vector de expresion que contiene un acido nucleico, preferiblemente un ADNc para una protema que, cuando se expresa por un clon celular, mitigara la deficiencia enzimatica en total o en parte. En realizaciones preferidas, se contempla ademas que mas de una deficiencia enzimatica puede mitigarse o esa mitigacion de una deficiencia en modificacion post-traduccional de la protema dependiente de vitamina K necesita la presencia de las actividades de mas de una enzima o protema u otro factor de procesado que puede proporcionarse en el metodo de la presente invencion mediante la transfeccion simultanea o posterior (secuencial) de los clones celulares con vectores de expresion adicionales que contienen ADNc para protemas dadas.

La celula huesped puede transfectarse primero con gen(es) que codifica(n) uno o mas factores de procesado y posteriormente transfectarse con un gen que codifica una protema de Factor IX. En algunas realizaciones, la celula huesped se transfecta primero con un gen que codifica una protema de Factor IX y posteriormente se transfecta con uno o mas factores de procesado. Opcionalmente, la celula huesped puede transfectarse con el(los) gen(es) para el(los) factor(es) de procesado o con el gen para la protema de Factor IX que es igual o esencialmente igual que un transgen temprano. Despues de cada ronda de transfeccion, se seleccionan clones que expresan niveles optimos del transgen.

Una protema tal tendna la actividad enzimatica de epoxido reductasa de vitamina K (VKOR). Otra de tal enzima tendna la actividad enzimatica de gamma-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC).

Se describe en esta memoria un metodo para identificar las necesidades de transfeccion de protema mmimas para obtener un alto porcentaje de protema de Factor IX totalmente funcional a partir de un clon celular que produce la protema de Factor IX en una cantidad en el Intervalo Diana.

En realizaciones preferidas de la presente invencion, estanques de clones celulares que producen una protema de Factor IX en el Intervalo Diana se transfectan posteriormente para proporcionar una protema espedfica o protemas multiples en varias combinaciones. Los estanques transfectados de clones celulares se analizan entonces para determinar los porcentajes relativos de protema de Factor IX totalmente funcional que se producen actualmente por estanques transfectantes que co-expresan las protemas varias. El estanque transfectante que produce el mayor porcentaje de protema de Factor IX totalmente funcional con el numero mmimo de protemas co-expresadas, se selecciona para clonaje posterior.

En realizaciones preferidas de la presente invencion, el estanque transfectante seleccionado se clona para determinar el nivel optimo de produccion de protema de Factor IX totalmente funcional que se alcanza por co- expresion de protema(s) adicional(es). Se contempla que porcentajes superiores de protema de Factor IX totalmente funcional se producira por clones celulares que producen cantidades totales menores de la protema de Factor IX en el Intervalo Diana. En algunas realizaciones, algunos clones celulares pueden ser superproductores de protema de Factor IX sin mejoras significativas en el procesado post-traduccional. Sin embargo, dichas lmeas superproductoras

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

producen cantidades usables de protema funcional cuando el nivel de produccion total es alto. En realizaciones preferidas, el nivel optimo de produccion sera el nivel mayor de protema de Factor IX funcional.

La practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiolog^a, ADN recombinante e inmunolog^a, que estan dentro de las habilidades de la tecnica. Dichas tecnicas se explican totalmente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al., “Molecular Cloning; A Laboratory Manual”, 2a ed (1989); “DNA Cloning”, Vols. I y II (D. N Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); “Transcription and Translation” (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney ed. 1986); “Immobilized Cells and Enzymes” (IRL Press, 1986); B. Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984); la serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), particularmente los Vols. 154 y 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds., respectivamente); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J. H. Miller y M. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); “Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology”, Mayer y Walker, eds. (Academic Press, Londres, 1987); Scopes, “Protein Purification: Principles and Practice”, 2a ed. 1987 (Springer-Verlag, N.Y.); y “Handbook of Experimental Immunology” Vols I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell eds. 1986).

Modificacion del propeptido

En algunas realizaciones, la Y-carboxilacion se aumenta sustituyendo la secuencia de propeptido nativo con una secuencia de propeptido que tiene una menor afinidad por la gamma-carboxilasa como se trata en la Solicitud de EE.UU. num. 2003/0220247. Las secuencias de propeptido util incluyen formas alteradas de secuencias tipo salvaje o secuencias de propeptido, o combinaciones de los mismos, para protemas dependientes de vitamina K heterologas. La secuencia de propeptido en protemas dependientes de vitamina K es el elemento de reconocimiento para la enzima que dirige la gamma-carboxilacion de la protema. Las protemas dependientes de vitamina K no son totalmente funcionales a menos que comprendan un alto porcentaje de restos gamma-carboxilados. Asf, es importante cuando se generan versiones recombinantes de estas protemas que los mecanismos se ponen en el sitio para asegurar gamma-carboxilacion total de los mismos.

El alineamiento secuencial de varias secuencias de propeptido se muestra en la FIG. 3 del documento US 2003/0220247. Asf, los propeptidos que son utiles en la presente invencion son aquellos que tienen las secuencias mostradas en la FIG. 3 en donde una secuencia de 18 aminoacidos de varios propeptidos utiles se muestra junto con las afinidades relativas de estos propeptidos para gamma carboxilasa. Un propeptido de baja afinidad puede generarse modificando cualquiera de aminoacidos -9 o -13 en o bien protrombina o protema C. Las modificaciones preferidas incluyen la sustitucion de un residuo de Arg o His en la posicion -9 y la sustitucion de un residuo Pro o Ser en la posicion -13. Otras protemas quimericas preferidas incluyen un propeptido seleccionado del grupo que consiste en Factor IX alterado, o un propeptido inalterado en combinacion con la protema de Factor IX maduro que no es nativo a la secuencia de propeptido elegido.

El termino “protema totalmente gamma-carboxilada” se usa en esta memoria para referirse a una protema en donde al menos aproximadamente 80% de los aminoacidos que debenan gamma-carboxilarse estan carboxilados. Preferiblemente, al menos aproximadamente 85%, mas preferiblemente, al menos aproximadamente 90%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 95% e incluso mas preferiblemente, al menos aproximadamente 99% de los aminoacidos que se gamma-carboxilanan estan gamma-carboxilados.

Enzima que convierte aminoacidos basicos pareados (PACE)

Como se usa en esta memoria, el termino “PACE” es un acronimo para enzima que convierte (o escinde) aminoacidos basicos pareados. PACE, originalmente aislado de una lmea celular de hugado humano, es una endopeptidasa tipo subtilisina, es decir, una enzima que escinde propeptido que muestra especificidad para la escision en residuos basicos de un polipeptido, por ejemplo, -Lys-Arg-, -Arg-Arg, o -Lys-Lys-. PACE se estimula por iones de calcio; y se inhibe por fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Una secuencia de ADN que codifica PACE (o furina) aparece en la FIG. 1 [SEQ ID NO:1] de la Patente de EE.UU. num. 5.460.950, que se incorpora en esta memoria por referencia.

La co-expresion de PACE y una proprotema que necesita el procesado para la produccion de la protema madura da por resultado expresion de alto nivel de la protema madura. Adicionalmente, la co-expresion de PACE con protemas que necesitan Y-carboxilacion para actividad biologica permite la expresion de rendimientos aumentados de protemas maduras funcionales, biologicamente activas, en celulas eucariotas, preferiblemente de mairnfero.

Epoxido reductasa dependiente de vitamina K

La epoxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR) es importante para las protemas dependientes de vitamina K porque la vitamina K se convierte a epoxido de vitamina K durante las reacciones en que es un cofactor. La cantidad de vitamina K en la dieta humana esta limitada. Por lo tanto, el epoxido de vitamina K debe convertirse de nuevo a vitamina K por VKOR para evitar la disminucion. Consecuentemente, la co-transfeccion con VKOR proporciona suficiente vitamina K para el apropiado funcionamiento de las enzimas dependientes de vitamina K tal como la Y-glutamil-carboxilasa dependiente de vitamina K (VKCG). El apropiado funcionamiento de VKCG

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

dependiente de vitamina K es esencial para la apropiada Y-carboxilacion del dominio gla de los factores de coagulacion dependientes de vitamina K.

Gamma carboxilasa dependiente de vitamina K

La Y-glutamil-carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC) es una enzima ER implicada en la modificacion de post-traduccion de protemas dependientes de vitamina K. La VKGC incorpora CO2 en el acido glutamico para modificar multiples residuos en la protema dependiente de vitamina K en aproximadamente 40 residuos del propeptido. La perdida de tres carboxilaciones disminuye marcadamente la actividad de protemas dependientes de vitamina K tal como los factores de coagulacion dependientes de vitamina K. La secuencia de ADNc para la y- glutamil-carboxilasa dependiente de vitamina K humana se describe por la Patente de EE.UU. num. 5.268.275. La secuencia se proporciona en SEQ ID NO: 15 de la Patente de EE.UU. num. 5.268.275.

Tecnicas de ingeniena genetica

La produccion de genes clonados, ADN recombinante, vectores, celula huesped transformadas, protemas y fragmentos de protema por ingeniena genetica se conoce bien. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. num. 4.761.371 de Bell et al. en Col. 6 lmea 3 a Col. 9 lmea 65; Patente de EE.Uu. num. 4.877.729 de Clark et al. en Col. 4 lmea 38 a Col. 7 lmea 6; Patente de EE.UU. num. 4.912.038 de Schilling en Col. 3 lmea 26 a col. 14 lmea 12; y la Patente de EE.UU. num. 4.879.224 de Wallner en Col. 6 lmea 8 a Col. 8 lmea 59.

Un vector es una construccion de ADN replicable. Los vectores se usan en esta memoria para amplificar el ADN que codifica el Factor IX y/o para expresar el ADN que codifica el Factor IX. Un vector de expresion es una construccion de ADN replicable en que una secuencia de ADN que codifica el Factor IX esta unida de forma operable a secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la expresion de la protema de Factor IX en un huesped adecuado. La necesidad de dichas secuencias de control variara dependiendo del huesped seleccionado y el metodo de transformacion elegido. Generalmente, las secuencias de control incluyen un promotor transcripcional, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripcion, una secuencia que codifica los sitios de union ribosomica de ARNm adecuados, y secuencias que controlan la terminacion de transcripcion y traduccion.

Los vectores de amplificacion no necesitan dominios de control de expresion. Todo lo que se necesita es la capacidad de replicar en un huesped, normalmente otorgada por un origen de replicacion, y un gen de seleccion para facilitar el reconocimiento de los transformantes.

Los vectores comprenden plasmidos, virus (por ejemplo, adenovirus, citomegalovirus), fagos y fragmentos de ADN integrables (es decir, fragmentos integrables en el genoma del huesped por recombinacion). El vector replica y funciona independientemente del genoma huesped, o puede, en algunos ejemplos, integrarse en el genoma en sf mismo. Los vectores de expresion contendnan un promotor y sitios de union al ARN que se unen de forma operable al gen a expresar y son operables en el organismo huesped.

Las regiones de ADN se unen de forma operable o se asocian de forma operable cuando se relacionan de forma funcional las unas a las otras. Por ejemplo, un promotor se une de forma operable a una secuencia de codificacion si controla la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union a ribosoma se une de forma operable a una secuencia de codificacion si se coloca de manera que permita la traduccion.

Las celulas huesped transformadas son celulas que se han transformado o transfectado con uno o mas vectores de protema dependiente de vitamina K construidos usando tecnicas de ADN recombinante.

Expresion de protemas multiples

Las realizaciones de la invencion estan dirigidas a proveer a la celula con las enzimas y cofactores necesarios para procesar protemas de Factor IX de manera que se alcancen mayores rendimientos de protemas biologicamente activas. Cuando se producen niveles adecuados de protemas totalmente funcionales por una celula recombinante, las largas etapas de purificacion disenadas para eliminar la protema inutil, parcialmente modificada, o no modificada, del producto deseado se evitan. Esto disminuye el coste de produccion y elimina el material inactivo que puede tener efectos secundarios indeseados para el paciente.

En realizaciones preferidas, los metodos para producir protemas de Factor IX por co-expresion con VKGC y VKOR pueden incluir las siguientes tecnicas. Primero, un unico vector que contiene secuencias de codificacion para mas de una protema y una protema de Factor IX pueden insertarse en una celula huesped seleccionada. PACE y una protema de Factor IX puede insertarse en una celula huesped seleccionada. De forma alternativa, dos o mas vectores separados que codifican una protema de Factor IX mas una o mas protemas distintas, pueden insertarse en un huesped. En el cultivo bajo condiciones adecuadas para la celula huesped seleccionada, los dos o mas polipeptidos se producen e interactuan para proporcionar la escision y modificacion de la pro-protema en la protema madura.

Otra alternativa es el uso de dos celulas huesped transformadas en donde una celula huesped expresa la protema de Factor IX y la otra celula huesped expresa uno o mas de VKGC y VKOR que se secretaran en el medio. Estas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

celulas huesped pueden co-cultivarse en condiciones que permiten la expresion y secrecion o liberacion de la protema de Factor IX recombinante y los polipeptidos recombinantes co-expresados, la gamma-carboxilacion de glutamatos N-terminales.

En algunos ejemplos, puede ser deseable tener una pluralidad de copias, dos o mas, del gen que expresa la protema de Factor IX en relacion a los demas genes, o viceversa. Esto puede conseguirse en una variedad de formas. Por ejemplo, una puede usar vectores o plasmidos separados, donde el vector que contiene la protema de Factor IX que codifica el polinucleotido tiene un mayor numero de copias que el vector que contiene las demas secuencias de polinucleotido, o viceversa. En esta situacion, sena deseable tener diferentes marcadores seleccionables en los dos plasmidos, para asf asegurar el mantenimiento continuado de los plasmidos en el huesped. De forma alternativa, uno o ambos genes podnan integrarse en el genoma huesped, y uno de los genes podna asociarse con un gen de amplificacion (por ejemplo, dhfr o uno de los genes de metalotioneina).

De forma alternativa, uno podna emplear dos regiones reguladoras transcripcionales que tienen diferentes velocidades de iniciacion transcripcional, proporcionando la expresion mejorada de la protema de Factor IX o la expresion de cualquiera de los demas polipeptidos del factor de procesado, respecto a la protema de Factor IX. Como otra alternativa, uno puede usar diferentes promotores, donde un promotor proporciona un bajo nivel de expresion constitutiva de la protema de Factor IX, mientras el segundo promotor proporciona un alto nivel de expresion inducida de los demas productos. Una amplia variedad de promotores se conocen para las celulas huesped seleccionadas, y pueden seleccionarse facilmente y emplearse en la invencion por un experto en la tecnica tal como promotores CMV, MMTV, SV 40 o SRa que son promotores de mairnferos bien conocidos.

En una realizacion preferida, se usa un promotor para el factor de alargamiento - 1a de hamster chino (CHEF1) para proporcionar alto nivel de expresion de un factor de coagulacion de Factor IX y/o factor(es) de procesado. El vector CHEF1 se usa como se describe en Deer, et al. (2004) “High-level expression of proteins in mammalian cells using transcription regulatory sequences from the Chinese Hamster EF-1a gene” Biotechnol. Prog. 20:880-889 y en la Patente de EE.UU. num. 5.888.809. El vector CHEF1 utiliza las secuencias de flanqueo 5' y 3' del EF-1a de hamster chino. La secuencia promotora CHEF1 incluye aproximadamente 3,7 kb de ADN que se extiende desde un sitio de restriccion Spel al codon de metionina de inicio (ATG) de la protema EF-1a. La secuencia de ADN se presenta en SEQ ID NO: 1 de la Patente de EE.UU. num. 5.888.809.

La produccion de Factor IX biologicamente activo, se maximiza mediante sobreexpresion de uno o mas de VKOR y VKGC y/o por modificacion de la region gla para maximizar la Y-carboxilacion. Esto es, los componentes que limitan la velocidad se expresan en cantidad suficiente para que el sistema entero opere para producir una cantidad viable comercialmente de protema de Factor IX.

Celulas huesped

Celulas huesped adecuadas incluyen celulas procariotas, levadura o eucariotas superiores tales como celulas de marnffero y celulas de insecto. Las celulas derivadas de organismos multicelulares son un huesped particularmente adecuado para la smtesis de protema dependiente de vitamina K recombinante, y se prefieren particularmente las celulas de mamffero. La propagacion de dichas celulas en cultivo celular se ha vuelto un procedimiento rutinario (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)). Ejemplos de lmeas celulares huesped utiles son celulas VERO y HeLa, lmeas celulares de ovario de hamster chino (CHO), y lmeas celulares WI138, HEK 293, BHK, COS-7, CV y MDCK. Los vectores de expresion para dichas celulas incluyen normalmente (si fuera necesario) un origen de replicacion, un promotor situado corriente arriba del ADN que codifica la(s) protema(s) dependiente(s) de vitamina K para expresarse y asociado de forma operativa con eso, junto con un sitio de union de ribosoma, un sitio de empalme de ARN (si se usa ADN genomico que contiene un intron), un sitio de poliadenilacion, y una secuencia de terminacion transcripcional. En una realizacion preferida, la expresion se lleva a cabo en celulas de ovario de hamster chino (CHO) usando el sistema de expresion de la Patente de EE.UU. num. 5.888.809.

Las secuencias de control transcripcional y traduccional en vectores de expresion a usar en la transformacion de celulas de vertebrados se proporcionan habitualmente por fuentes virales. Por ejemplo, promotores usados normalmente se derivan de polioma, Adenovirus 2 y Virus de simio 40 (SV40). Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. num. 4.599.308.

Un origen de replicacion puede proporcionarse mediante la construccion del vector para incluir un origen exogeno, tal como puede derivarse de SV 40 u otra fuente viral (por ejemplo, Polioma, Adenovirus, VSV o BPV), o puede proporcionarse mediante el mecanismo de replicacion cromosomica de la celula huesped. Si el vector se integra en el cromosoma de celula huesped, lo ultimo es a menudo suficiente.

Mas que usar vectores que contienen ongenes virales de replicacion, se puede transformar celulas de mamnfero mediante el metodo de cotransformacion con un marcador seleccionable y el ADN para la(s) protema(s) dependiente(s) de vitamina K. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados son dihidrofolato reductasa (DHFR) o timidina quinasa. Este metodo se describe adicionalmente en la Patente de EE.UU. num. 4.399.216.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Otros metodos adecuados para la adaptacion a la smtesis de protema(s) dependiente(s) de vitamina K en cultivo de celulas de vertebrados recombinante incluyen los descritos en M-J. Gething et al., Nature 293, 620 (1981); N. Mantei et al., Nature 281,40; A. Levinson et al., Solicitudes EPO nums. 117.060A y 117.058A.

Las celulas huesped tales como celulas de insecto (por ejemplo, celulas cultivadas de Spodoptera frugiperda) y los vectores de expresion tales como el vector de expresion de baculovirus (por ejemplo, vectores derivados de Autographa californica MNPV, Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV o Galleria ou MNPV) pueden emplearse en la realizacion de la presente invencion, como se describe en las Patentes de EE.UU. nums. 4.745.051 y 4.879.236 de Smith et al. En general, un vector de expresion de baculovirus comprende un genoma de baculovirus que contiene el gen a expresar insertado en el gen de polihedrina en una posicion que oscila de la senal de partida transcripcional de polihedrina al sitio de partida ATG y bajo el control transcripcional de un promotor de polihedrina de baculovirus.

Las celulas huesped procariotas incluyen organismos gram negativo o gram positivo, por ejemplo Escherichia coli (E. coli) o Bacilos. Celulas eucariotas superiores incluyen lmeas celulares establecidas de origen mairnfero como se describe a continuacion. Celulas huesped ejemplares son E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli 294 (ATCC 31.446). Una amplia variedad de vectores procariotas y microbianos adecuados estan disponibles. La E. coli se transforma tfpicamente usando pBR322. Los promotores mas normalmente usados en vectores de expresion microbiana recombinantes incluyen los sistemas promotores betalactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); y Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), un sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) y Solicitud de publicacion EPO num. 36.776) y el promotor tac (H. De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 (1983)). El promotor y la secuencia Shine- Dalgarno (para la expresion de huesped procariota) se unen de forma operable al ADN que codifica la(s) protema(s) dependiente(s) de vitamina K, es decir, se colocan de manera que promueven la transcripcion del ARN mensajero de protema(s) dependiente(s) de vitamina K a partir del ADN.

Los microbios eucariotas tales como cultivos de levadura pueden transformarse tambien con vectores que codifican protema dependiente de vitamina K, vease por ejemplo, la Patente de EE.UU. num. 4.745.057. El Saccharomyces cerevisiae es el usado mas normalmente entre los microorganismos huesped eucariotas inferiores, aunque un numero de otras cepas estan normalmente disponibles. Los vectores de levadura pueden contener un origen de replicacion a partir del plasmido de levadura de 2 micras o una secuencia de replicado de forma autonoma (ARS), un promotor, ADN que codifica una o mas protemas dependientes de vitamina K, secuencias de poliadenilacion y terminacion de transcripcion, y un gen de seleccion. Un plasmido ejemplar es YRp7, (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Secuencias de promocion adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980) u otras enzimas glucolfticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); y Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)). Vectores y promotores adecuados para usar en la expresion de levadura se describen adicionalmente en R Hitzeman et al., Publicacion EPO num. 73.657.

Los genes clonados empleados en la presente invencion pueden codificar cualquier especie de origen, que incluye raton, rata, conejo, gato, porcina y humana, aunque preferiblemente codifican protemas de Factor IX de origen humano. El ADN que codifica las protemas de Factor iX que es hibridable con ADN que codifica protemas descritas en esta memoria se abarca tambien. La hibridacion de dichas secuencias puede llevarse a cabo en condiciones de severidad reducida o incluso condiciones severas (por ejemplo, condiciones representadas por una severidad de lavado de NaCl 0,3M, citrato sodico 0,03M, SDS al 0,1% a 60°C o incluso 70°C a ADN que codifica la protema dependiente de vitamina K descrita en esta memoria en un ensayo de hibridacion in situ estandar. Vease J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)).

Como se anota anteriormente, realizaciones preferidas de la presente invencion proporcionan metodos para proporcionar protemas dependientes de vitamina K funcionales por metodos que incluye carboxilacion de los residuos glu N terminales. La estrategia puede incluir co-expresar protema dependiente de vitamina K junto con VKOR y VKGC en una unica celula huesped. En general, el metodo comprende cultivar una celula huesped que expresa una protema dependiente de vitamina K y protemas de soporte; y despues cosechar las protemas del cultivo. Mientras algunas celulas huesped pueden proporcionar alguna protema dependiente de vitamina K, VKOR y VKGC a niveles basales, en realizaciones preferidas, el vector de ADN que codifica VKGC y VKOR se incluye para mejorar la carboxilacion. El cultivo puede llevarse a cabo en un recipiente de fermentacion adecuado, con un medio de crecimiento y bajo condiciones apropiadas para la expresion de la(s) protema(s) dependiente(s) de vitamina K por la celula huesped particular elegida. La protema dependiente de vitamina K cosechada del cultivo se encuentra que se carboxila debido a la expresion de las protemas de soporte en la celulas huesped. En realizaciones preferidas, la protema dependiente de vitamina K puede recogerse directamente del medio de cultivo, o las celulas huesped se lisan y la protema dependiente de vitamina K se recoge de las mismas. En realizaciones preferidas, la protema dependiente de vitamina K puede entonces purificarse adicionalmente de acuerdo con tecnicas conocidas.

Como una proposicion general, la pureza de la protema recombinante producida segun la presente invencion sera preferiblemente una pureza apropiada conocida por el trabajador experto en la tecnica para llevar a la actividad y estabilidad optima de la protema. Por ejemplo, cuando la protema recombinante es Factor IX, el Factor IX es preferiblemente de pureza ultra-alta. Preferiblemente, la protema recombinante se ha sometido a multiples etapas de

5

10

15

20

25

30

35

40

purificacion cromatografica, tales como cromatograffa de afinidad, cromatograffa de intercambio ionico y preferiblemente cromatograffa de inmunoafinidad para eliminar sustancias que provocan fragmentacion, activacion y/o degradacion de la protema recombinante durante la fabricacion, almacenaje y/o uso. Ejemplos ilustrativos de dichas sustancias que se eliminan preferiblemente por purificacion incluyen trombina y Factor IXa; otros contaminantes de protema, tales como enzimas de modificacion tipo PACE/furina, VKOR y vKgC; protemas, tales como protemas de hamster, que se liberan en el medio de cultivo tisular a partir de las celulas de produccion durante la produccion de protema recombinante, contaminantes que no son protema, tales como ffpidos; y mezclas de contaminantes de protema y que no son protema, tales como lipoprotemas. Los procedimientos de purificacion para las protemas dependientes de vitamina K se conocen en la tecnica. Por ejemplo, vease la Patente de EE.UU. num. 5.714.583.

Las secuencias de codificacion de ADN de Factor IX, junto con vectores y celulas huesped para la expresion de las mismas, se describen en la Solicitud de Patente Europea 373012, Solicitud de Patente Europea 251874, Solicitud de Patente PCT 8505376, Solicitud de Patente PCT 8505125, Solicitud de Patente Europea 162782 y Solicitud de Patente PCT 8400560. Los genes para otros factores de coagulacion se conocen tambien y estan disponibles, por ejemplo, Factor II (Num. de Acceso NM_000506), Factor VII (Num. de Acceso NM_019616) y Factor X (Num. de Acceso NM_000504).

Ejemplos

Ejemplo 1. Transfeccion primaria de celulas CHO con gen de Factor IX

Un gen de Factor IX tipo salvaje se transfecto en celulas CHO por dilucion ffmite en platos de 96 pocillos. El gen de Factor IX estaba bajo el control del promotor CHEF-1. Las celulas se dejaron crecer en suero al 5% durante 14 dfas. El medio de cultivo celular se cosecho y la cantidad total de anffgeno de Factor IX en |jg por mL se cuantifico por un metodo ELISA de Factor IX. Mas de 150 clones se evaluaron y la cantidad total de Factor IX producido por clon se presenta en la Figura 1.

Las celulas CHO transfectadas con el gen de Factor IX produjeron anffgeno de Factor IX que se detecto por ELISA de Factor IX. La cantidad vario significativamente entre clones. El intervalo de la produccion total de protema despues de 14 dfas en cultivo fue entre 0 y mayor que 1,6 jg/mL de medio de cultivo. Aunque no determinado en este experimento, el Factor IX producido en transfectantes primarios fue aproximadamente biologicamente activo al 20% (no se muestran datos) como se determina en un ensayo de coagulacion APTT usando plasma deficiente en Factor IX. El anffgeno de Factor IX puede producirse por lo tanto en celulas CHO despues de la transfeccion de las celulas con Factor IX de tipo salvaje.

Ejemplo 2. Supertransfeccion de celulas CHO que producen Factor IX con genes VKGC y VKOR

Para aumentar el porcentaje de Factor IX activo producido en celulas CHO transfectadas con Factor IX, los transfectantes primarios se acumularon, se expandieron en cultivo tisular, y se supertransfectaron con vectores que contienen ADNc por enzimas ensenadas generalmente por ser importantes para la gamma-carboxilacion dependiente de vitamina K eficiente del Factor IX. Los clones que producen Factor IX se acumularon en un matraz de agitacion y se supertransfectaron con ADNc por gamma-carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC) y epoxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR). Las celulas supertransfectadas individualmente se hicieron crecer por dilucion ffmite en platos de 96 pocillos en suero al 5% durante 14 dfas. La cantidad total de anffgeno de Factor IX producido por mL se midio por ELISA de Factor IX. La cantidad de Factor IX activo se midio por un ensayo de coagulacion APTT usando plasma deficiente en Factor IX como sustrato y Factor IX derivado de plasma como patron.

Tabla 1. Supertransfeccion de clones de celulas CHO que producen Factor IX con VKGC y VKOR

Clon

Tffulo (jg/mL) Actividad FIX (U/mL) Actividad espedfica (U/mg) FIX activo (jg/mL) % de FIX activo

1

1,560 0,15 97 0,549 35

2

1,283 0,10 76 0,356 28

3

0,469 0,09 198 0,338 72

4

1,628 0,09 56 0,331 20

5

2,205 0,09 41 0,331 15

6

0,604 0,09 144 0,316 52

7

1,274 0,09 68 0,316 25

8

0,811 0,09 105 0,309 38

5

10

15

20

25

30

35

Clon

Tftulo (pg/mL) Actividad FIX (U/mL) Actividad espedfica (U/mg) FIX activo (pg/mL) % de FIX activo

9

0,827 0,08 100 0,302 36

10

0,954 0,07 77 0,265 28

11

0,177 0,03 186 0,120 68

12

0,340 0,06 171 0,211 62

13

0,121 0,02 165 0,073 60

14

0,272 0,04 143 0,142 52

15

0,169 0,02 142 0,087 52

Como se ve en la Tabla 1, se analizaron los resultados de 15 clones individuales. El antigeno de Factor IX vario entre 0,12 y 2,2 pg/mL. El porcentaje de Factor IX activo oscilo entre 15 y 72%. Consecuentemente, la supertransfeccion de celulas que producen Factor IX con VKGC y VKOR aumenta significativamente el porcentaje de Factor IX activo que se produce por clones de celulas CHO espedficos.

Notar que mas antigeno se produce mientras la produccion se aumenta. Por ejemplo, para platos de 6 pocillos, se produce aproximadamente 25 veces mas de antigeno cuando se compara con platos de 96 pocillos. Consecuentemente, en platos de 6 pocillos los niveles de antigeno de Factor IX podnan esperarse que oscilen de 355 pg/ml.

Ejemplo 3. Produccion a gran escala de grandes cantidades de Factor IX recombinante biologicamente activo

Para demostrar que las celulas CHO que producen Factor IX supertransfectadas con VKGC y VKOR pueden producir grandes cantidades de Factor IX biologicamente activo, dos clones aislados independientemente se hicieron crecer en biorreactores y la cantidad y calidad del producto de Factor IX se evaluaron despues de purificar el material. Los biorreactores que contienen medio libre de suero se usaron para hacer crecer Clon 130 (biorreactor de 12 L) y Clon 44 (biorreactor de 10 L). Ambos de estos clones expresaron Factor IX humano, VKGC y VKOR. Los biorreactores se dejaron crecer durante 12 dfas sin cambio de medio. El fluido de cultivo tisular se separo de las celulas y el Factor IX se purifico por un conjunto estandar de columnas de cromatograffa, dando por resultado protema de Factor IX con mas del 90% de pureza.

Tabla 2. Produccion a gran escala de Factor IX recombinante biologicamente activo

Clon hecho crecer en biorreactor

Tftulo total (mg/L) % activo Tftulo activo (mg/L)

130

44 61 27

44

28 35 10

Como se presenta en la Tabla 2, grandes cantidades de antfgeno de Factor IX se produjeron en ambos biorreactores. El Clon 130 produjo 44 mg de Factor IX por L de medio de cultivo y el Clon 44 produjo 28 mg de Factor IX por L. Consistente con los datos presentados anteriormente, el % de Factor IX activo se vio que estaba entre 35 y 61%. Consecuentemente, las celulas CHO que producen Factor IX, cuando se supertransfectan con las enzimas de modificacion post-traduccional VKGC y VKOR, producen grandes cantidades de antfgeno de Factor IX que contiene una cantidad significativa de Factor IX biologicamente activo.

Ejemplo 4. Re-transfeccion con VKOR de clones que producen Factor IX, VKGC y VKOR

Para determinar si es posible producir Factor IX recombinante biologicamente activo en celulas CHO transfectadas, los dos clones, 130 y 44; que produjeron Factor IX despues de supertransfectarse con VKGC y VKOR, se volvieron a transfectar con VKOR. Los aislados individuales de Clones 130 y 44 se clonaron por dilucion ftmite y se volvieron a transfectar con el ADNc para VKOR. Los clones se hicieron crecer en platos de 6 pocillos y las celulas se dejaron crecer durante 9 dfas hasta que fueron confluentes. El antfgeno total de Factor IX (pg por mL) se midio por ELISA de Factor IX, y la actividad (U por mL) se determino por un ensayo de coagulacion APTT usando plasma deficiente en Factor IX.

Tabla 3. Re-transfeccion con VKOR de clones CHO que producen Factor IX, VKGC y VKOR

Clon

Tttulo F-IX (Ug/mL) Actividad de F-IX (U/mL) Actividad espedfica (U/mg) % activo

130-1

2,7 0,55 199 80%

130-2

2,6 0,48 186 74%

130-3

2,6 0,55 209 84%

130-4

1,3 0,23 172 69%

130-5

1,7 0,38 229 91%

130-6

1,1 0,16 145 58%

130-7

1,7 0,29 172 69%

130-8

2,0 0,46 229 92%

130-9

2,4 0,49 206 82%

130-10

1,9 0,42 222 89%

130-11

1,9 0,40 212 85%

130-12

2,1 0,50 237 95%

130-13

2,2 0,48 223 89%

130-14

2,4 0,63 265 106%

130-15

2,2 0,44 196 78%

130-16

1,4 0,31 214 86%

130-17

1,8 0,34 185 74%

130-18

1,5 0,27 176 70%

44-1

3,0 0,45 147 59%

44-2

0,9 0,22 235 94%

44-3

2,2 0,21 92 37%

44-4

1,3 0,26 210 84%

44-5

1,6 0,36 230 92%

44-6

1,1 0,22 194 78%

44-7

1,4 0,23 165 66%

44-8

0,9 0,15 163 65%

44-9

1,7 0,33 197 79%

44-10

1,6 0,25 156 62%

44-11

2,3 0,45 199 80%

44-12

1,4 0,34 240 96%

44-13

1,6 0,21 132 53%

44-14

1,9 0,26 136 55%

44-15

1,8 0,45 250 100%

44-16

2,1 0,42 194 77%

5

10

15

20

25

Los resultados en la Tabla 3 muestran que los subclones tanto del Clon 130 como del Clon 44 produjeron cantidades significativas de antigeno de Factor IX, que oscilan de 0,9 a 3,0 pg/mL. Ademas, como una consecuencia de la re- transfeccion con VKOR, ambos clones dieron al menos un subclon que produjo 100% del Factor IX como protema biologicamente activa, ademas de varios subclones con mas del 90% de Factor IX activo. Estos datos sugieren que la adecuada co-expresion de VKGC y VKOR pueden facilitar la produccion de Factor IX totalmente altamente activo o incluso totalmente activo en celulas CHO transfectadas con un ADNc de Factor IX tipo salvaje.

Ejemplo 5. Produccion a gran escala de Factor IX biologicamente activo en celulas disenadas geneticamente re- transfectadas con la enzima de modificacion post-traduccional VKOR

Este experimento se diseno para demostrar que las celulas CHO que producen Factor IX recombinante despues de la transfeccion con VKGC y VKOR y se vuelven a transfectar con VKOR pueden producir grandes cantidades de Factor IX a escala de produccion. Los aislados individuales de Clon 130 vueltos a transfectar con VKOR se hicieron crecer en matraces de agitacion de 1,5 L (para representar la produccion comercial) y se midieron el antfgeno de Factor IX y la actividad biologica. Los subclones individuales del clon 130 descritos en el Ejemplo 4 anterior (clon CHO transfectado con Factor IX, VKGC y VKOR y posteriormente vuelto a transfectar con VKOR) se aislaron por dilucion ftmite en platos de microtftulo de 6 pocillos y despues se sembraron en matraces agitadores de 1,5 L. La produccion de Factor IX en matraces agitadores de 1,5 L se conoce por reflejar las condiciones de produccion de biorreactores de 15 L y mas grandes (no se muestran datos). Las celulas se dejaron crecer en medio libre de suero durante 18 dfas, en cuyo punto se tomaron muestras y se evaluaron para antfgeno de Factor IX por ELISA de Factor IX y para actividad biologica por ensayo de coagulacion APTT usando plasma deficiente en Factor IX.

Tabla 4. Produccion de grandes cantidades de Factor IX activo en celulas CHO transfectadas con Factor IX, VKGC y VKOR, y vueltas a transfectar con VKOR

Clon

Matraz Tftulo total (mg/L) % activo Tftulo activo (mg/L)

A 42,0 46,0 19,3

130

B 41,8 46,8 19,6

Promedio 41,9 ± 0,1 46,4 ± 0,4 19,4 ± 0,1

A 45,1 49,5 22,3

130-6

B 42,8 52,2 22,4

Promedio 43,9 ± 1,1 50,9 ± 1,3 22,3 ± 0,1

A 41,5 48,7 20,2

130-16

B 37,1 51,3 19,0

Promedio 39,3 ± 2,2 50,0 ± 1,3 19,6 ± 0,6

A 52,0 57,9 30,1

130-17

B 45,0 70,8 31,9

Promedio 48,5 ± 3,5 64,3 ± 6,4 31,0 ± 0,9

A 53,8 52,6 28,3

130-19

B 50,6 59,0 29,8

Promedio 52,2 ± 1,6 55,8 ± 3,2 29,1 ± 0,8

A 45,7 47,9 21,9

130-31

B 44,1 49,3 21,7

Promedio 44,9 ± 0,8 48,6 ± 10,7 21,8 ± 0,1

Los datos para el Clon 130 en sf mismo y para cinco subclones se presentan en la Tabla 4. Grandes cantidades de antfgeno de Factor IX se produjeron por todos los clones, oscilando de 39,3 a 52,2 mg de antfgeno de Factor IX por litro de fluido de cultivo. El porcentaje de Factor IX activo fue tambien bastante alto, oscilando de 46,4% a 64,3%. La cantidad de Factor IX biologicamente activo producido fue tambien sorprendentemente alto oscilando de 19,4 a 31,0

mg/L. Consecuentemente, en sistemas de matraz agitador, que reflejan la produccion de Factor IX en biorreactores a nivel comercial, pueden producirse grandes cantidades de antfgeno de Factor IX y Factor IX activo en celulas que se han transfectado con Factor IX, VKGC, VKOR y posteriormente se han vuelto a transfectar con VKOR.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir un producto de protema de Factor IX recombinante biologicamente activo, que comprende las etapas de:

   transfectar una celula CHO, con un gen que codifica el producto de protema de Factor IX unido de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hamster chino (CHEF-1), y al menos dos genes unidos de forma operable a al menos un promotor, o bien de forma simultanea o secuencial; y cosechar el producto de protema de Factor IX,

   por lo que la celula produce producto de protema de Factor IX biologicamente activo, como se mide con referencia al Factor IX estandar Mononine, en una cantidad de al menos 15 mg/L; y en donde los al menos dos genes comprenden un gen que codifica epoxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR), y un gen que codifica Y- glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC).
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde al menos uno de los genes se sobre-expresa.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 2, en donde el gen sobre-expresado se une de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hamster chino (CHEF1).
4. 4. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde al menos aproximadamente 75% de los residuos de acido glutamico en el dominio gla del producto de protema de Factor IX biologicamente activo estan gamma carboxilados.
5. 5. El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en donde al menos 50%, al menos 70% o al menos 80% de la protema de Factor IX es biologicamente activa.
6. 6. El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en donde la protema de Factor IX biologicamente activa se produce en una cantidad de al menos 20 mg/L.
7. 7. El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en donde la transfeccion es secuencial y en donde transfectar la celula de mairnfero comprende ademas:

   seleccionar celulas que expresan altos niveles del producto de protema de Factor IX, VKOR O VKGC; clonar las celulas seleccionadas; y amplificar las celulas clonadas.
8. 8. El metodo segun la reivindicacion 7, en donde la etapa de transfeccion con los al menos dos genes se realiza antes de la etapa de transfeccion con el gen que codifica la protema de Factor IX.
9. 9. El metodo segun la reivindicacion 7, en donde la etapa de transfeccion con el gen que codifica la protema de Factor IX se realiza antes de la etapa de transfeccion con los al menos dos genes.
10. 10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la celula CHO se selecciona para expresion de niveles endogenos de uno o mas factores de procesado antes de la transfeccion.
11. 11. Una celula CHO recombinante, que comprende un gen que codifica una protema de Factor IX unida de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hamster chino (CHEF-1) y al menos dos genes unidos de forma operable a al menos un promotor,

    en donde la celula produce protema FIX biologicamente activa en una cantidad de al menos 15 mg/L, como se mide con referencia al Factor IX estandar Mononine,

    en donde los al menos dos genes comprenden un gen que codifica epoxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR) y un gen que codifica Y-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC).
12. 12. La celula recombinante segun la reivindicacion 11, en donde al menos un gen se sobre-expresa.
13. 13. La celula recombinante segun la reivindicacion 12, en donde el producto genico sobre-expresado esta unido de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hamster chino (CHEF-1).
14. 14. Un metodo para producir un producto de protema de Factor IX recombinante biologicamente activo, que comprende las etapas de:

    (a) transfectar una celula CHO, con un gen que codifica la protema de Factor IX unida de forma operable a un promotor de factor de alargamiento 1-a de hamster chino (CHEF-1);

    (b) seleccionar celulas que expresan altos niveles del producto de protema de Factor IX;

    (c) transfectar las celulas seleccionadas con al menos dos genes, en donde los al menos dos genes comprenden un gen que codifica epoxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR), y un gen que codifica Y-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC);

    (d) repetir la etapa (b);

    5 (e) opcionalmente, repetir las etapas (a) y/o (c) seguido por (b);

    (f) clonar las celulas seleccionadas;

    (g) hacer crecer las celulas clonadas; y

    (h) cosechar el producto de protema de Factor IX a partir de las celulas clonadas en una cantidad de al menos 15 mg/L.