CN110042122A - 使用杂合chef1启动子的改善重组蛋白表达 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于高水平表达重组蛋白的表达载体和宿主细胞。所述表达载体包含中国仓鼠卵巢延长因子1‑α(CHEF1)转录调控DNA元件和巨细胞病毒(CMV)启动子和/或人腺病毒三联前导(AdTPL)序列。与以前描述的表达系统相比，本发明实现宿主细胞的增加蛋白表达和更好的产率。
Description
本申请含有呈计算机可读形式的序列表(文件名：44744A_seqListing.txt；大小：37,528字节；创建：2014年3月11日)作为公开内容的单独部分，所述内容以全文引用的方式并入本文。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年3月12日提交的美国临时专利申请序列号61/777,603的优先权的权益。所述优先权申请的公开内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明针对包含新颖启动子-增强子组合的表达载体，所述启动子-增强子组合增强异源蛋白表达并且在重组蛋白生产的领域中具有实际应用。
背景技术
通过转录、翻译、蛋白质折叠和/或分泌中的改善而增加的重组蛋白表达是基本优先的用于在细胞系发展期间优化产量。中国仓鼠卵巢延长因子1-α(CHEF1)表达系统已经被广泛使用以创建用于产生重组蛋白的临床细胞系。延长因子1-α(EF-1α)基因在大多数组织类型中高度表达，并且EF-1是人细胞中最丰富的蛋白质之一(Beck等，Molecular SystemsBiology 7：549；2011)。CHEF1表达载体实现在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中以及在非仓鼠细胞中的高水平重组蛋白表达。
CHEF1表达与生长相协调，使得滴定度增加由增加的体积产率来驱动。通常，蛋白表达在生长的指数期早期启动并且在静止期期间下降且衰退。蛋白表达和细胞生长之间的联系与天然EF-1α基因的调控是一致的，所述天然EF-1α基因被组成型表达以在核糖体蛋白复合物中发挥作用。EF-1α的表达已经被证明在转化的细胞(Sanders等，Nucleic AcidsResearch 20：5907；1992)和丝裂原刺激的细胞(Thomas和Thomas，Journal ofCellBiology 103：2137；1986)中增加，这与EF-1α在活跃生长细胞中的组成型表达是一致的。除了生长的细胞的转录控制，胰岛素生长因子通过mRNA 5′非翻译区(5′UTR)来调控EF-1α的翻译(Hammond和Bowman，Journal of Biological Chemistry 25：17785；1988；Proud和Denton，Biochemical Journal 328：329；1997)。通过在5′UTR中发现的多嘧啶系统(TOP)序列来实现这种翻译控制(Mariottini和Amaldi，Molecular and Cellular Biology 10：816；1990)。
CHEF1表达系统已经示出能够实现比采用其他常用启动子(例如，巨细胞病毒(CMV)、人EF-1α以及猿猴病毒40(SV40)启动子)的载体更高水平的蛋白表达(Running Deer和Allison，Biotechnology Progress 20：880；2004)。CMV启动子是用于重组蛋白表达最广泛使用的启动子之一。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系统使用鼠科或人CMV启动子(Kalwy，S.，″Towards stronger gene expression-a promoter′s tale，″第19届欧洲动物细胞技术(ESACT)学院会议，2005)。商业表达质粒pcDNATM3(Life Technologies Corp.，Carlsbad，CA)携带来源于之前描述的主要立即早期(IE)基因(GenBank Accession#K03104.1)的CMV启动子(Boshart等，Cell 1985；4：521)。另一个常用的CMV启动子来源于人CMV株AD 169(GenBank Accession#X17403.1)，也称为人疱疹病毒5。
含有CHEF1调控DNA的载体导致重组蛋白的改善的表达与来自CMV控制的质粒相比大多达280倍(Running Deer和Allison，2004)。使用CHEF1驱动载体已经在不同真核细胞系(包括非仓鼠细胞)中实现各种目标蛋白质(包括分泌和膜结合蛋白)的增加的表达。转染效率CHEF1与CMV载体之间是可比的，但是在用CHEF1载体转染的克隆中的表达水平通常一致地更高。
尽管CHEF1载体在驱动高水平表达重组蛋白中证明成功，但还存在开发改善的表达系统的持续需要。
发明内容
本公开提供一种用于高水平表达重组蛋白的表达载体。在各种方面中，表达载体包含CHEF1转录调控DNA元件和CMV启动子和/或人腺病毒三联前导(AdTPL)序列。
在各种方面中，根据本公开的表达载体包含5′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，5′CHEF1转录调控DNA包含SEQ ID NO：1。在各种实施方案中，5′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：1中的位置1与位置11,716之间的DNA。在各种方面中，5′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：1中的位置10,744与位置11,716之间的DNA。在各种实施方案中，5′CHEF1转录调控DNA包含SEQ ID NO：2。在各种实施方案中，5′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：2中的位置1与位置4057之间的DNA。
在各种方面中，根据本公开的表达载体还包含3′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，3′CHEF1转录调控DNA包含SEQ ID NO：3。在各种实施方案中，3′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：3中的位置1与位置4180之间的DNA。在各种方面中，3′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：3中的位置1与位置209之间的DNA。在各种实施方案中，3′CHEF1转录调控DNA包含约4.2千碱基。
在各种实施方案中，根据本公开的表达载体包含CHEF1转录调控DNA和CMV启动子。在各种实施方案中，表达载体包含CHEF1转录调控DNA和AdTPL序列。在各种方面中，表达载体包含CHEF1转录调控DNA、CMV启动子以及AdTPL序列。
在各种方面中，在根据本公开的表达载体中，CMV启动子和/或AdTPL序列被插入5′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，在包含有SEQ ID NO：1列出的DNA的表达载体中，SEQ ID NO：1中的位置1与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。在各种方面中，SEQ ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。在各种方面中，根据本公开的表达载体包含在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7列出的一个或多个多核苷酸。
在各种实施方案中，根据本公开的表达载体还包含选择性标记基因。在各种实施方案中，根据本公开的表达载体还包含编码目标蛋白质的多核苷酸，所述目标蛋白质可操作地连接至5′CHEF1转录调控DNA、3′CHEF1转录调控DNA、CMV启动子，和/或AdTPL序列。
本公开还提供用表达载体转化、转导或转染的宿主细胞，所述表达载体包含CHEF1转录调控DNA和CMV启动子和/或AdTPL序列。在各种方面中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在各种方面中，宿主细胞是仓鼠细胞，并且在各种实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在各种方面中，宿主细胞是非仓鼠哺乳动物细胞。在各种实施方案中，宿主细胞是人细胞。本公开的表达载体包含CHEF1转录调控DNA，所述CHEF1转录调控DNA与CMV启动子和/或AdTPL序列结合实现宿主细胞的蛋白表达能力的协同增加。
附图说明
图1示出包含5′CHEF1转录调控DNA和3′CHEF1转录调控DNA和CMV启动子的表达载体pDEF85的图谱。CMV启动子代替载体pDEF38中的5′CHEF1 DNA的1217个核苷酸(从位置2866至位置4083)以创建pDEF85。将GP1和MAb1报告基因克隆至XhoI-XbaI克隆位点内以制成表达载体pDEF85-GP1和pDEF85-MAb1。
图2示出包含5′CHEF1转录调控DNA和3′CHEF1转录调控DNA、CMV启动子以及AdTPL序列的表达载体pDEF86的图谱。CMV启动子和AdTPL序列代替载体pDEF38中的5′CHEF1 DNA的1217个核苷酸(从位置2866至位置4083)以创建pDEF86。将GP1和MAb1报告基因克隆至XhoI-XbaI克隆位点内以制成表达载体pDEF86-GP1和pDEF86-MAb1。
图3示出用载体pDEF38-GP1、pDEF85-GP1或pDEF86-GP1转染的CHO宿主细胞的活力。所述细胞在非选择性CD-CIM1加HT的培养基中恢复2-3天，并且重悬浮于缺乏HT的选择培养基中(传代数0)。如果细胞数量允许，细胞每2至3天传代。x-轴上提供传代数，并且y-轴上示出细胞活力百分比。
图4A～图4C示出用载体pDEF38-GP1、pDEF85-GP1或pDEF86-GP1转染的CHO宿主细胞的活力和产率。将复制转染池以12天分批补给生产模式运行，并且在第3、5和7天补给原料C，以及在第0、3、5和7天补给原料CB至CD-CIM1基础培养基中。在37℃下运行生产并且在第3天转移至34℃下。在第3、5、7、10和12天测量活细胞密度、活力百分比以及产率。图4A示出活细胞密度，其中x-轴上示出天数，并且y-轴上描绘以10e5个细胞每毫升测量的活细胞密度。图4B示出活力百分比，其中x-轴上示出天数，并且y-轴上描绘细胞活力百分比。图4C示出产率，其中x-轴上示出天数，并且y-轴上描绘以微克每毫升计的蛋白质滴定度。
图5示出用载体pDEF38-GP1、pDEF85-GP1或pDEF86-GP1转染的CHO宿主细胞的比产率。x-轴上示出以百万细胞每毫升乘以天数测量的综合细胞面积(ICA)，并且y-轴上描绘以微克每毫升测量的蛋白质滴定度。比产率值计算为在整个细胞培养期间平均每天每个细胞的微微克蛋白质。
图6示出用在BF1-补充培养基中生长的载体pDEF38-GP1、pDEF85-GP1或pDEF86-GP1转染的CHO宿主细胞的产率。将复制转染池以12天分批补给生产模式运行，并且在第4、6、8、10以及12天补给BF1至加入CB的CD-CIM1基础培养基中。在37℃下运行生产并且在第3天转移至34℃下。在第5、7、10和12天测量滴定度样品。x-轴上示出天数，并且y-轴上描绘以微克每毫升测量的蛋白质滴定度。
图7A～图7B示出用在BF1-补充培养基中生长的载体pDEF38-MAb1、pDEF85-MAb1或pDEF86-MAb1转染的CHO宿主细胞的生长和产率。将复制转染池以12天分批补给生产模式运行，并且在第4、6、8、10以及12天将BF1补给至加入CB的CD-CIM1基础培养基中。在37℃下运行生产并且在第5天转移至32.5℃下。在第7、10、12和14天测量抗体滴定度样品。图7A示出生长，其中x-轴示出天数，并且y-轴描绘以10e5个细胞每毫升测量的活细胞密度。图7B示出产率，其中x-轴上示出天数，并且y-轴上描绘以微克每毫升测量的蛋白质滴定度。
图8A～图8B示出用载体pDEF38-MAb1或pDEF85-MAb1转染的CHO宿主细胞的生长和产率。在用pDEF38或pDEF85转染后，将表达MAb1的十二个随机选择的克隆以12天分批补给生产模式运行，并且在第4、6、8、10以及12天将BF1补给至加入CB的CD-CIM1基础培养基中。在37℃下运行生产并且在第5天转移至32.5℃下。在第4、6、11、和13天测量活细胞密度和抗体滴定度。图8A示出每个克隆的生长，其中x-轴示出天数，并且y-轴描绘以10e5个细胞每毫升测量的活细胞密度。图8B示出每个克隆的产率，其中x-轴示出天数，并且y-轴描绘以微克每毫升测量的抗体滴定度。
图9A～图9B示出用载体pDEF38-GP1或pDEF85-GP1转染的CHO宿主细胞的产率。在用pDEF38-GP1或pDEF85-GP1转染后，使用流式细胞术选择八个表达GP1的克隆并且以12天分批补给生产模式运行。在第4、6、8、10以及12天在加入CB的CD-CIM1基础培养基中将BF1补给所述克隆。在37℃下运行生产并且在第3天转移至32.5℃下。在第5、7、10、12和14天测量滴定度。图9A示出用CHEF1载体pDEF38-GP1转染的克隆的产率，其中x-轴示出天数，并且y-轴描绘以微克每毫升测量的蛋白质滴定度。图9B示出用CHEF1-CMV载体pDEF85-GP1转染的克隆的产率，其中x-轴示出天数，并且y-轴描绘以微克每毫升测量的蛋白质滴定度。
具体实施方式
本公开提供一种表达载体，其包含调控DNA元件的组合以用于实现与本领域已知载体相比的高水平的蛋白表达和改善的产率，本公开还提供用在此所述的表达载体转化的宿主细胞。本公开的表达载体包含与CMV启动子和/或AdTPL序列组合的CHEF1转录调控DNA。之前已经描述使用CHEF1转录调控DNA元件在表达载体中以实现高水平表达重组蛋白(美国专利第5,888,809号；Running Deer和Allison，2004)。对于许多不同的蛋白质和宿主细胞类型，来自CHEF1-驱动载体的蛋白表达已经示出明显高于来自CMV启动子控制的载体的蛋白表达，并且所述增加能够大于250倍(Running Deer和Allison，2004)。AdTPL序列是在晚期病毒mRNA上发现的200-核苷酸5′非编码序列，所述mRNA增强它们的翻译(Logan，PNAS81：3655；1984)。
考虑到使用CHEF1控制载体所获得的改善的蛋白表达，非CHEF1控制区(例如CMV启动子或AdTPL序列)至CHEF1表达载体的添加是违反直觉的。这种非CHEF1控制区的存在会破坏个别CHEF1转录调控元件的协同作用并且预计将不会与CHEF1调控DNA一致行动以产生改善的蛋白表达。然而，本公开的包含CHEF1转录调控DNA和CMV启动子和/或AdTPL序列的表达载体，与仅包含CHEF1控制区的载体相比，令人惊奇地产生了增加的蛋白表达。
如本文所用，以下定义可用于帮助熟练的技术人员理解本公开：
术语“表达载体”是指用于向宿主细胞转移编码信息的任何分子。在各种方面中，表达载体是核酸、质粒、粘粒、病毒或人工染色体。
术语“宿主细胞”是指已经通过携带目标基因的表达载体转化、转染或转导的细胞，所述目标基因随后通过所述细胞表达。在各种方面中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在各种方面中，宿主细胞是细菌细胞、原生生物细胞、真菌细胞、植物细胞，或动物细胞。所述术语还指亲本宿主细胞的后代，不管后代与父母在基因型或表型方面是否相同，只要存在目标基因。
术语“CMV启动子”是指本领域已知的CMV启动子序列。在各种方面中，CMV启动子是任何起源，所述起源包括鼠科(mCMV)或人(hCMV)。在各种方面中，hCMV起源于任何CMV株。在各种方面中，CMV株是AD169、Davis、Toledo或Towne。在本公开的各种实施方案中，CMV启动子含有在SEQ ID NO：4中列出的多核苷酸。
术语“AdTPL序列”是指本领域已知的存在于人腺病毒晚期病毒mRNA中的大约200个核苷酸，即5′非编码序列。在各种实施方案中，AdTPL序列含有在SEQ ID NO：5中列出的多核苷酸。
术语“CHEF1转录调控DNA”是指含有能够控制CHEF1基因转录的顺式调控元件的非编码序列，例如启动子区和元件，例如增强子、绝缘子(insulators)以及框架/基质附着区。
术语“5′CHEF1转录调控DNA”是指在自然界中位于中国仓鼠基因组的CHEF1基因起始密码子的5′端(即上游)的DNA。
术语“3′CHEF1转录调控DNA”是指在自然界中位于，中国仓鼠基因组的CHEF1基因起始密码子的3′端(即下游)的DNA。
术语“大约”和“约”是指在参考量的近范围内的量。关于多核苷酸，大约/约指定长度的序列是在所引述长度的5％以内。
在各种方面中，根据本公开的表达载体包含CHEF1转录调控DNA和CMV启动子和/或AdTPL序列。在各种方面中，CHEF1转录调控DNA包含5′CHEF1转录调控DNA和/或3′CHEF1转录调控DNA。
在各种实施方案中，5′CHEF1转录调控DNA包含在SEQ ID NO：1中列出的多核苷酸。本公开还提供与在SEQ ID NO：1中列出的多核苷酸至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的5′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，5′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：1的位置1与位置11，716之间的DNA，即，SEQ ID NO：1的一部分。本公开还提供与位于SEQ ID NO：1中的位置1与位置11，716之间的DNA至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的5′CHEF1转录调控DNA。在各种方面中，5′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：1中的位置10，744与位置11，716之间的DNA。本公开还提供与位于SEQ ID NO：1中的位置10，744与位置11，716之间的DNA至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的5′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，5′CHEF1转录调控DNA包含在SEQ ID NO：2中列出的多核苷酸。本公开还提供与在SEQ ID NO：2中列出的多核苷酸至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的5′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，5′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：2的位置1与位置4057之间的DNA，即，SEQ ID NO：2的一部分。本公开还提供与位于SEQ ID NO：2的位置1与位置4057之间的DNA至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的5′CHEF1转录调控DNA。
在各种方面中，根据本公开的表达载体还包含3′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，3′CHEF1转录调控DNA包含在SEQ ID NO：3中列出的多核苷酸。本公开还提供与在SEQ ID NO：3中列出的多核苷酸至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的3′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，3′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ IDNO：3的位置1与位置4180之间的DNA，即，SEQ ID NO：3的一部分。本公开还提供与位于SEQID NO：3中的位置1与位置4180之间的DNA至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的3′CHEF1转录调控DNA，即，SEQ ID NO：3的一部分。在各种方面中，3′CHEF1转录调控DNA包含位于SEQ ID NO：3中的位置1与位置209之间的DNA。本公开还提供与位于SEQ ID NO：3中的位置1与位置209之间的DNA至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的3′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，3′CHEF1转录调控DNA可以包含约4.2千碱基。
在各种实施方案中，根据本公开的表达载体包含CHEF1转录调控DNA元件和CMV启动子。在各种方面中，CMV启动子包括在SEQ ID NO：4中列出的多核苷酸。本公开还提供与在SEQ ID NO：4中列出的多核苷酸至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的CMV启动子。在各种方面中，所述表达载体包含5′CHEF1转录调控DNA和CMV启动子，并且不含在SEQ ID NO：6中列出的多核苷酸。本公开还提供与在SEQ ID NO：6中列出的多核苷酸至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的5′CHEF1转录调控DNA和CMV启动子。在各种实施方案中，表达载体包含CHEF1转录调控DNA和AdTPL序列。在各种方面中，AdTPL序列包含在SEQ ID NO：5中列出的多核苷酸。本公开还提供与在SEQ ID NO：5中列出的多核苷酸至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的AdTPL序列。在各种实施方案中，表达载体包含CHEF1转录调控DNA、CMV启动子以及AdTPL序列。在各种方面中，表达载体包含含有在SEQ ID NO：7中列出的多核苷酸的5′CHEF1转录调控DNA、CMV启动子以及AdTPL序列。本公开还提供与在SEQ ID NO：7中列出的多核苷酸至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％相同的5′CHEF1转录调控DNA、CMV启动子、以及AdTPL序列。
在各种实施方案中，CMV启动子和/或AdTPL序列被插入根据本公开的表达质粒的5′CHEF1转录调控DNA。在各种实施方案中，在包含有SEQ ID NO：1中列出的DNA的表达载体中，SEQ ID NO：1的位置1与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。在各种实施方案中，用CMV启动子和/或AdTPL序列代替近侧5′CHEF1启动子区。举例而言且并非限制，在各种方面中，用CMV启动子、AdTPL序列或CMV启动子和AdTPL序列缺失和代替SEQ ID NO：1的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基。
根据本公开的表达载体还包含编码目标蛋白质的多核苷酸。在各种方面中，多核苷酸可操作地连接至5′CHEF1转录调控DNA、3′CHEF1转录调控DNA、CMV启动子和/或AdTPL序列。表达载体可用于任何蛋白质并且旨在提供比单独CHEF1或CMV更高的蛋白表达。在各种方面中，表达载体还包含选择性标记基因以用于鉴定转化的细胞。合适的选择性标记基因的实例包括但不限于：新霉素磷酸转移酶(npt II)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、博来霉素(zeocin)、腐草霉素(phleomycin)、争光霉素抗性基因(ble)、庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、乙酰乳酸合酶突变形式(als)、溴苯腈腈水解酶、草胺膦乙酰基转移酶(bar)、烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(aro A)、肌肉特异性酪氨酸激酶受体分子(MuSK-R)、铜锌超氧化物岐化酶(sod1)、金属硫蛋白(cup1，MT1)、β-内酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(pac)、杀稻瘟菌素乙酰转移酶(bls)、杀稻瘟菌脱氨酶(bsr)、组氨醇脱氢酶(HDH)、N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(ade1)、精氨基琥珀酸裂解酶(arg4)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)、转化酶(suc2)、乳清酸核苷-5’-磷酸(OMP)脱羧酶(ura3)和前述标记蛋白中任一者的直系同源物。
本公开还提供用表达载体转化、转导或转染的宿主细胞，所述表达载体包含CHEF1转录调控DNA和CMV启动子和/或AdTPL序列。在各种方面中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在各种方面中，宿主细胞是仓鼠细胞。在各种方面中，仓鼠细胞是CHO细胞。在各种实施方案中，宿主细胞是非仓鼠哺乳动物细胞，并且在各种方面中，所述细胞是人细胞。
鉴于前文描述来设想的实施方案包括但不限于以下编号的实施方案：
1.一种表达载体，其包含中国仓鼠延长因子-1α(CHEF1)转录调控DNA和巨细胞病毒(CMV)启动子和/或腺病毒三联前导(AdTPL)序列。
2.实施方案1所述的表达载体，其中CHEF1转录调控DNA包含5′CHEF转录调控DNA。
3.实施方案2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含序列ID NO：1或与序列ID NO：1至少95％相同的多核苷酸。
4.实施方案2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含位于序列IDNO：1中的位置1与位置11,716之间的DNA，或与位于序列ID NO：1中的位置1与位置11,716之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
5.实施方案4所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含位于序列IDNO：1中的位置10,774与位置11,716之间的DNA，或与位于序列ID NO：1中的位置10,774与位置11,716之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
6.实施方案2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含序列ID NO：2或与序列ID NO：2至少95％相同的多核苷酸。
7.实施方案2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含位于序列IDNO：2中的位置1与位置4057之间的DNA，或与位于序列ID NO：2中的位置1与位置4057之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
8.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含3′CHEF1转录调控DNA。
9.实施方案8所述的表达载体，其中所述3′CHEF1转录调控DNA包含序列ID NO：3或与序列ID NO：3至少95％相同的多核苷酸。
10.实施方案8所述的表达载体，其中所述3′CHEF1转录调控DNA包含位于序列IDNO：3中的位置1与位置4180之间的DNA，或与位于序列ID NO：2中的位置1与位置4180之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
11.实施方案10所述的表达载体，其中所述3′CHEF1转录调控DNA包含位于序列IDNO：3中的位置1至位置209之间的DNA，或与位于序列ID NO：3中的位置1至位置209之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
12.实施方案8-11中任一项所述的表达载体，其中所述3′CHEF1转录调控DNA包含约4.2千碱基。
13.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其包含CMV启动子。
14.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其包含AdTPL序列。
15.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其包含CMV启动子和AdTPL序列。
16.实施方案2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含在序列ID NO：1中列出的DNA，其中序列ID NO：1中的位置1与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。
17.实施方案16所述的表达载体，其中位于序列ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。
18.实施方案17所述的表达载体，其中位于序列ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子。
19.实施方案17所述的表达载体，其中位于序列ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为AdTPL序列。
20.实施方案17所述的表达载体，其中位于序列ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和AdTPL序列。
21.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO：4或与序列IDNO：4至少95％相同的多核苷酸。
22.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO：5或与序列IDNO：5至少95％相同的多核苷酸。
23.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO：6或与序列IDNO：6至少95％相同的多核苷酸。
24.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO：7或与序列IDNO：7至少95％相同的多核苷酸。
25.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含选择性标记基因。
26.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含编码目标蛋白质的多核苷酸，所述目标蛋白质可操作地连接至5′CHEF1转录调控DNA、3′CHEF1转录调控DNA、CMV启动子和/或AdTPL序列。
27.一种用前述实施方案中任一项所述的表达载体转化、转导或转染的宿主细胞。
28.实施方案27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
29.实施方案27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
30.实施方案29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是仓鼠细胞。
31.实施方案30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠细胞卵巢(CHO)细胞。
32.实施方案29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是非仓鼠哺乳动物细胞。
33.实施方案32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
根据本公开的一种表达质粒还描述于以下实施例中。所述实施例仅为阐述本发明，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
基因序列和表达载体——将编码CMV启动子(SEQ ID NO：4)和CMV-AdTPL启动子(SEQ ID NO：5)的DNA片段化学合成并且克隆至前述CHEF1表达载体pDEF38中(RunningDeer和Allison，2004)，从而创建称为pDEF85的CHEF1-CMV-启动子载体(图1)，以及称为pDEF86的CHEF1-CMV-AdTPL启动子载体(图2)。使用标准分子生物学技术来创建表达Fc-糖蛋白融合(GP1)和IgG1抗体(MAb1)的衍生载体(Maniatis等，J.Molecular Cloning：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory.545，1982)并且将所述载体称为pDEF38-GP1、pDEF85-GP1、pDEF86-GP1、pDEF38-MAb1、pDEF85-MAb1以及pDEF86-MAb1。
细胞系构建——通过标准电穿孔方法将pDEF38-GP1、pDEF85-GP1、pDEF86-GP1、pDEF38-MAb1、pDFF85-MAb1以及pDFF86-MAb1表达载体单独地转染至CHO DG44细胞中，在含有次黄嘌呤和胸苷(HT)的非选择培养基中生长两天，并且随后在缺乏HT的培养基中选择约两周。将所选择的细胞群体或转染池扩大并且分成生产模式培养物以评估产率，并且还同时地分成用于单个细胞克隆的培养物。
生产模式——按照标准生物制造工艺来运行小规模分批补给生产模式以评估培养物产率(滴定度)。将培养物以0.5百万细胞每毫升的种子密度接种到缺乏HT的化学限定培养基(CD-CIM1，CMC Biologies，Bothell，WA)的摇瓶中。将培养物在37℃下运行3至5天，并且随后转移至较低温度(30℃至34℃)下以减缓生长并且促进生产。用补充平衡的原料1(BF1，CMC Biologies)、高效原料C(原料C，Life Technologies，Grand Island，NY)或细胞加强(CB，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)补给培养物以延长培养物健康状态。在第3、5、7、10、12、14和16天收集用于滴定度和细胞密度的样品。所述研究在第12至16天结束。将收获的上清液过滤通过0.2微米的过滤器并且随后通过蛋白质A高效液相色谱法(HPLC)测定GP1或MAb1生产。
细胞系克隆——将选择的GP1-和MAb1-表达转染池稀释以接种单个细胞至96孔板的个别孔中。将所述板在接种多达两周之后进行成像，以鉴定来自单个细胞的单克隆细胞系。将含有单克隆集群的孔扩大，并且使用流式细胞术随机挑选或选择，以鉴定来自每个转染池的高度表达细胞。将细胞系扩大以便在悬浮培养物中生长，并且分成生产模式培养物以评估产率。
流式细胞术——用第2天的正常生长细胞执行荧光激活细胞分类术(FACS)分析，所述第2天的正常生长细胞被收获并且用荧光抗IgGl Fc抗体(RPE)染色以检测重组GP1和MAb1表达。
结果和讨论
使用标准DHFR选择方法使用表达载体pDEF38、pDEF85和pDEF86制成表达报告蛋白GP1或MAb1的稳定细胞系。不使用氨甲喋呤，在缺乏次黄嘌呤和胸苷(HT)的培养基中选择转染池。细胞活力在缺乏HT的培养基中下降，并且随后恢复为具有在群体中长出的DHFR载体的细胞。转染培养物最初下降至约10％至约30％活力，并且随后通过在第12天左右(第6代)获得大于90％的活力。与仅用CHEF1载体(pDEF38-GP1)转染的细胞相比，用CHEF1-CMV载体(pDEF85-GP1)或CHEF1-CMV-AdTPL载体(pDEF86-GP1)转染的细胞的生长对GP1表达构建体表现出类似的恢复，在恢复期之后具有一致的高活力(图3)。对于抗体表达细胞系获得类似的结果(数据未示出)。
将转染池直接设置成生产模式或进展成为单细胞克隆，并随后将克隆细胞系与生产模式比较。图4示出，分批补给摇瓶生产模式生长与GP1表达池是相似的(图4A)；然而，收获时的蛋白表达(滴定度)(通常在接种后12至16天)是显著不同的。第12天收获的用于CHEF1-CMV或CHEF1-CMV-AdTPL表达载体(pDEF85和pDEF86)的滴定度显著高于用于标准CHEF1载体(pDEF38)的滴定度(图4C)。由来自CHEF1-CMV或CHEF1-CMV-AdTPL载体的分批补给摇瓶的合并转染子产生的重组GP1蛋白质的量是标准CHEF1载体的约两倍。CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL池的生长稍早些到达顶峰，并且表现出活力更快速下降(图4B)。活力下降预期并不改善表达，反而可能是有害的。稍后实验表明，改善末梢活力增加了针对CHEF1-CMV培养物的滴定度。
如图5所见，在CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL载体情况下看到的滴定度的增加是比产率增加的结果。将比产率计算为在整个细胞培养期间平均每天每细胞的微微克蛋白质。在CHEF1-CMV(pDEF85)和CHEF1-CMV-AdTPL(pDEF86)构建体之间存在细微的表达差异，这表明AdTPL序列的添加与比产率相关的可能益处。图1示出以微微克每细胞每天(PCD)的比产率。使用CHEF1-CMV或CHEF1-CMV-AdTPL载体实现的比产率比CHEF1载体的比产率大两倍以上。
表1
使用不同的报告蛋白质和改变的分批补给生产条件来确认具有CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL的改善的表达。与补充有商业培养基(原料C)的细胞相比，在补充有CB的CD-CIM1基础培养基中生长的细胞证明类似的GP1产率曲线，所述CB在第4、6、8、10以及12天补给专有的BF1补充物。图6表明，CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL载体培养物在BF1过程中具有超过对照CHEF1载体的有所增加的GP1滴定度。
在BF1过程中还测试利用CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL载体的抗体(MAb1)生产。用与GP1池相同的方法建立MAb1转染池，并且一旦从选择中完全恢复，则该MAb1转染池进入分批补给摇瓶生产模式。如图7所示，CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL MAb1池产生比第12天后pDEF38对照物产生更高滴定度的抗体。与糖蛋白生产相比，在表达抗体的转染池中的产率曲线是新颖的，因为当细胞进入静止期时，抗体产率显著增加。当细胞培养物积极生长时，可以看到与CHEF1 MAb1池相比，用于CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL MAb1池的较低的初始滴定度(第7天)，随后当生长减缓并且在第10天后最终减缓时，CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL培养物的产率快速增加(图7B)。甚至随着活细胞密度减小(图7A)，14天时CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL池中的产率增加，然而产率在CHEF1池中开始减缓，尽管对于所有培养物来说，最终第14天的活力百分比是类似的(约80％存活，数据未示出)。
克隆培养物由表达GP1和MAb1两者的转染池发展。通过对限制性稀释板成像来鉴定单克隆细胞系，并且随后扩大成悬浮培养物。从每个pDEF38-MAb1和pDEF85-MAb1转染池中随机选择十二个MAb1克隆培养物，并且在分批补给摇瓶生产模式中运行。克隆CHEF1-启动子(pDEF38-MAb1)抗体生产与转染池曲线匹配，从而示出比在生长相期间的pDEF85-MAb1克隆更高的表达，并且随后当培养物进入静止期时，减缓生产(图8B)。来自CHEF1-CMV载体(pDEF85-MAb1)克隆的抗体产生显得与转染池十分类似，其中大部分抗体表达是在第6天后，在指数生长减缓并且细胞转变为静止期后出现(图8A)。
使用基于FACS的测定来选择表达GP1的克隆细胞系以检测在发展早期的GP1表达。通过FACS平均荧光来筛选来自每个pDEF38-GP1和pDEF85-GP1转染池的超过100个的克隆并且进行评级。基于来自每个组的FACS分析，前八名的GP1表达培养物进一步在使用CD-CIM1基础培养基和BF1原料的分批补给生产模式中进行检查(图9)。表2和表3示出的平均滴定度和比产率，表明来自CHEF1-CMV启动子(pDEF85-GP1)的表达显著高于来自单独CHEF1启动子(pDEF38-GP1)的表达，并且受比产率的增加所驱动。
表2
表3
如前面实施例证实，新颖CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL表达载体增加在稳定CHO细胞转染池中的糖蛋白和抗体两者的表达。与CHEF1-启动子池相比，来源于CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL池的稳定的克隆细胞系还示出改善的蛋白表达。在CHEF1-CMV和CHEF1-CMV-AdTPL克隆细胞系中的增加的表达是由与CHEF1-启动子相比较高的比产率所导致，这表明具有CMV启动子的组合CHEF1转录调控DNA增加细胞表达能力，并且不只是改善生长性能。来自CHEF1-CMV构建体的表达模式不同于单独CHEF1-启动子，其中最大表达稍后在在细胞生长的静止期期间出现，这表明通过CHEF1-CMV-启动子的调节不同于来自单独CHEF1的调节并且具备独特的重组蛋白生产特性。与单独CHEF1相比，来自CHEF1-CMV的蛋白质的延迟的时间性表达是组合的调控元件改变CHEF1生长-依赖性表达的证据，因此展示新的机制以控制CHEF1蛋白质产生。考虑到之前的发现，其中CHEF1启动子性能优于CMV启动子(Running Deer和Allison，2004)，由CHEF1和CMV的重组实现的高水平表达是意想不到的。结合观察到的表达中的时间偏移，获得增加的比产率是有利的，因为培养物补给条件可以针对生物制造过程中的二次生长以及生产进行优化。根据本公开的表达载体包含CHEF1转录调控DNA和CMV启动子和/或AdTPL序列，因此，为在重组蛋白表达系统中获得高滴定度和产率提供改善的选项。
根据本公开，在此公开和要求保护的所有组合物可在无需过度实验的情况下制得和实施。虽然本公开的组合物已依照具体实施方案进行了描述，但对本领域普通技术人员显而易见的是，可以不背离本公开的概念和范围来制得所述组合物。更具体来说，显而易见在化学上和生物学上均相关的某些多核苷酸可替代本文所述的多核苷酸，同时实现相同或相似结果。本领域技术人员显而易见的所有这种相似的替代物和修改都被认为是在所附权利要求书所界定的本发明的范围和概念之内。
本文通篇所引用的参考文献均在某种程度上特定地以引用的方式并入本文，使得所述参考文献对本文所陈述内容提供示例性程序或其他细节补充。
Claims (33)
1.一种表达载体，其包含中国仓鼠延长因子-1α(CHEF1)转录调控DNA和巨细胞病毒(CMV)启动子和/或腺病毒三联前导(AdTPL)序列。
2.如权利要求1所述的表达载体，其中所述CHEF1转录调控DNA包含5′CHEF转录调控DNA。
3.如权利要求2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含序列ID NO：1或与序列ID NO：1至少95％相同的多核苷酸。
4.如权利要求2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含位于序列ID NO：1中的位置1与位置11,716之间的DNA，或与位于序列ID NO：1中的位置1与位置11,716之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含位于序列ID NO：1中的位置10,774与位置11,716之间的DNA，或与位于序列ID NO：1中的位置10,774与位置11,716之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
6.如权利要求2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含序列ID NO：2或与序列ID NO：2至少95％相同的多核苷酸。
7.如权利要求2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含位于序列ID NO：2中的位置1与位置4057之间的DNA，或与位于序列ID NO：2中的位置1与位置4057之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
8.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含3′CHEF1转录调控DNA。
9.如权利要求8所述的表达载体，其中所述3′CHEF1转录调控DNA包含序列ID NO：3或与序列ID NO：3至少95％相同的多核苷酸。
10.如权利要求8所述的表达载体，其中所述3′CHEF1转录调控DNA包含位于序列ID NO：3中的位置1与位置4180之间的DNA，或与位于序列ID NO：2中的位置1与位置4180之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
11.如权利要求10所述的表达载体，其中所述3′CHEF1转录调控DNA包含位于序列IDNO：3中的位置1与位置209之间的DNA，或与位于序列ID NO：3中的位置1与位置209之间的DNA至少95％相同的多核苷酸。
12.如权利要求8-11中任一项所述的表达载体，其中所述3′CHEF1转录调控DNA包含约4.2千碱基。
13.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其包含CMV启动子。
14.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其包含AdTPL序列。
15.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其包含CMV启动子和AdTPL序列。
16.如权利要求2所述的表达载体，其中所述5′CHEF1转录调控DNA包含在序列ID NO：1中列出的DNA，其中序列ID NO：1中的位置1与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。
17.如权利要求16所述的表达载体，其中序列ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。
18.如权利要求17所述的表达载体，其中序列ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子。
19.如权利要求17所述的表达载体，其中序列ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为AdTPL序列。
20.如权利要求17所述的表达载体，其中序列ID NO：1中的位置10,512与位置11,716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和AdTPL序列。
21.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO：4或与序列ID NO：4至少95％相同的多核苷酸。
22.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO：5或与序列ID NO：5至少95％相同的多核苷酸。
23.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO：6或与序列ID NO：6至少95％相同的多核苷酸。
24.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO：7或与序列ID NO：7至少95％相同的多核苷酸。
25.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含选择性标记基因。
26.如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含编码目标蛋白质的多核苷酸，所述目标蛋白质可操作地连接至所述5′CHEF1转录调控DNA、所述3′CHEF1转录调控DNA、所述CMV启动子和/或所述AdTPL序列。
27.一种用如前述权利要求中任一项所述的表达载体转化、转导或转染的宿主细胞。
28.如权利要求27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
29.如权利要求27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
30.如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是仓鼠细胞。
31.如权利要求30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠细胞卵巢(CHO)细胞。
32.如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是非仓鼠哺乳动物细胞。
33.如权利要求32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
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