CN107043773B - 一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段、重组载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段，其特征在于：其核苷酸如SEQ ID NO.1或2所示。本发明还公开了一种重组质粒，它是将pcDNA3.1(+)质粒中启动子CMV替换为CHEF‑alpha基因5’端的长度为1543bp序列，以及BGHPA替换为CHEF‑alpha基因3’端的长度为610bp序列，在启动子上游插入鸡溶菌酶MAR序列，筛选标记基因Neo替换为DHFR基因的重组质粒。本发明还公开了重组质粒的用途。本发明重组质粒携带外源基因转染哺乳细胞，外源基因的表达水平高，且外源基因的表达水平可以持续稳定高产，应用前景良好。

Description

一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段、重 组载体及其用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段、重组载体及其用途。

背景技术

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是生物制药中最常用的哺乳动物细胞，是外源真核基因的最佳表达系统之一，在生物制药中被广泛应用，目前已经上市和正在进行临床研究的基因工程药物中大约有60-70％为哺乳动物细胞表达产品，而CHO细胞表达产品占其中的绝大部分。与原核表达系统比较具有如下优点：外源蛋白容易在CHO细胞中合成并分泌到培养基中；重组蛋白的折叠与修饰、理化性质、生物学性质几乎与天然蛋白相同；能正确组装多亚基蛋白；能大规模高密度无血清培养。但是，与原核、酵母表达系统相比其表达量低难以大量制备一直是该表达系统的问题，特别是临床使用剂量达到数十至数百毫克级乃至克级水平的生物工程药物的应用，提高表达量就成了直关重要的问题。

启动子的强弱直接关系到外源基因在宿主细胞中的表达水平，为提高外源基因的转录效率，必须尽可能的选用高活性的启动子。目前在真核细胞中最常用的启动子为人的CMV启动子，它有比较广泛的宿主细胞，也是比较强的启动子。但是研究发现，该启动子内存在CpG岛容易导致沉默效应；仅在细胞周期的S期起作用，因此寻找比CMV更好的启动子是必要的。人们一直在寻找，高强度适应性广的启动子，Kalwy S用鼠的mCMV启动子在CHO-K1细胞中表达EGFP，是人的CMV启动子的3倍，但在表达抗体这样的蛋白时，表达能力却比较弱不如人的CMV启动子。Gershon TJ等通过人工设计合成了一个能够增加基因表达的核心启动子，体内外研究表明：它比CMV核心启动子显著性提高报告基因荧光素酶的表达水平，这就为寻找高活性启动子提供了另一种思路，有可能创造出自然界不存在的高强度的人工启动子。ProBioGen公司，克隆了细胞内广泛存在的启动子，强度比CMV强，非细胞周期依赖，能够对抗基因沉默，在细胞中稳定表达50代以上，很可能细胞内源性启动子更有利于重组蛋白基因的转录调控。

肽延伸因子在细胞整个周期中都处于高表达，不受细胞周期影响的看家基因，其基因座序列可能含有一些有利于基因表达的转录调控序列，与细胞的反式作用因子共同作用，促进基因的高表达。Running Deer和Allison等(Biotechnol Prog2004,20(3):880–889)报道了根据CHO细胞的EF1alpha非编码区序列构建的表达载体PDEF38包含EF1alpha基因的上游4.1Kb和4.2Kb的下游序列，与商业化的常用CMV启动子比较能够增加外源基因6-35倍的表达量，如果去掉下游的4.2Kb的调控序列导致表达水平降低4倍。但是在这篇文献中这个表达载体PDEF38并没有测试随着MTX浓度的增加外源基因也随之扩增，我们根据文献构建的含EF1alpha上下游调控序列的载体，在实验中发现增加MTX浓度外源基因的表达并没有增加，很可能在它的4Kb的调控序列中含有类似于绝缘子的序列，维持它的表达框类的基因不受周围环境影响，从而导致MTX浓度增加只能扩增DHFR基因及其下游序列，而其上游的EF1alpha调控序列及外源基因不扩增。Orlova和Kovnir等(BMC Biotechnology2014,14:56)报道了利用EF1alpha基因的上游4.1Kb和4.2Kb的下游序列在调控序列之间将目的外源基因通过IRES与DHFR基因连接形成一个双顺反子的表达载体，以EGFP作为目目的基因时在贴壁培养和悬浮培养时，通过一轮扩增EGFP的表达水平分别增加了8倍和4.5倍，说明以这种双顺反子的表达载体即能够获得高活性启动子特性又能够扩增，但是该文献没有验证其它目的基因的表达情况是否又能够获得如此良好的结果。有文献(Mcgrew JT.Vectorsand methods for recombinant protein expression,Uspatent No:6632637B1.)报道认为通过IRES连接的两个基因形成一个大的mRNA有可能减少mRNA的半衰期；也有可能形成不利于蛋白翻译的RNA二级结构；从而导致目的基因的表达降低。因此这种方法的在表达其它蛋白特别是高剂量的抗体类药物时是否能够获得很高的表达水平是否可行不得而知。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段、重组载体及其用途。

本发明提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。

本发明重组质粒，它是将pcDNA3.1(+)质粒中启动子CMV替换为CHEF-alpha基因5’端的长度为1543bp序列，以及BGHPA替换为CHEF-alpha基因3’端的长度为610bp序列的重组质粒。

其中，所述CHEF-alpha基因5’端的长度为1543bp序列如SEQ ID NO.3所示；所述CHEF-alpha基因3’端的长度为610bp序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述重组质粒在插入的CHEF-alpha基因5’端的长度为1543bp序列的5’端还插入有鸡溶菌酶的MAR基因。

其中，所述MAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述重组质粒中，Neo基因被DHFR基因、GS基因、Hygromycin基因、Blastcidin基因、Puromycin基因或者Zeocin基因替代。

其中，所述DHFR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了前述的重组质粒在制备表达外源基因的转基因细胞中的用途；优选地，所述外源基因是EGFP基因或者aldalimumab基因以及其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类等生物技术药物。

其中，所述细胞是哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞是CHO、BHK、HEK293、NS0、PERC6细胞。

本发明还提供了一种制备表达外源基因的转基因细胞的方法，步骤如下：

(1)取前述的重组质粒，连接外源基因，得携带有外源基因重组质粒；

(2)取携带有外源基因重组质粒，转染细胞，即可。

本发明采取截短的EF1alpha基因的上下游序列调控序列，尽可能小的减少其活性的损失，又不影响在MTX加压扩增时在细胞中的扩增，在其上游与鸡的溶菌酶MAR序列组合，能够克服位置效应及增加基因表达稳定性；以二氢叶酸还原酶基因(DHFR)为筛选扩增基因，在MTX加压的情况下能够将外源基因拷贝数扩增，从而进一步提高它的表达量增加表达的稳定性。

采用本发明重组质粒携带外源基因(如，EGFP基因或者aldalimumab基因)转染哺乳细胞(如，CHO细胞)，外源基因的表达水平稳定，且外源基因的表达水平高，是改进前质粒pcDNA3.1的7倍以上，采用本发明重组质粒容易筛选到外源基因高表达的细胞株，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更；以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1CHO的肽延伸因子1基因的转录调控序列及鸡溶菌酶MAR序列的克隆

图2pcDNA3.1EGFP和含CHO肽延伸因子1序列和的载体结构图

图3含筛选扩增基因DHFR的不同载体结构图

图4含DHFR筛选扩增基因及鸡溶菌酶MAR序列的载体表达EGFP在自然光照射下的图谱

图5表达aldalimumab的载体图及表达蛋白电泳图谱

具体实施方式

实施例1本发明重组载体的构建及其效果验证

一、构建方法

(一)CHO细胞EF-alpha1的转录调控序列及鸡溶菌酶MAR序列的克隆。

1、CHO细胞基因组DNA序列的提取

CHO细胞用D/F培养基10％血清培养至细胞方瓶长满，胰酶消化。按Transgen公司EasyPure Genomic DNA kit操作说明书提取CHO细胞基因组DNA。

2、CHO的肽延伸因子1的基因转录调控序列的克隆

根据Genbank的报告的序列设计如下引物:

CHEF1:5-ata acgcgt GCAGATCCGT CGAGCTCTCG GCCACCGAGC-3

CHEF2:5-ata gctagc ACACCTTAAA AAAAAAGTTC GAAGAATACC-3

CHEF3:5-ata tctaga AATATTACCC CTAACACCTG CCACCCCAGT C-3

CHEF4:5-ata tccgga AGCAAAGCCT GCCTCATATA TTAATATTCA C-3

用引物CHEF1和CHEF2扩增肽延伸因子1的1543bp的5，端调控序列，扩增产物含NheI和MluI酶切位点；包括启动子和内含子1的序列，采用Transgen公司的FastPfu Fly DNA Polymerase。扩增条件为95℃2min,95℃20sec,60℃20sec,72℃1min,30个循环，72℃延伸10min,扩增产物1％琼脂糖胶回收(图1a)。引物CHEF3和CHEF4扩增肽延伸因子1的610bp的3，端调控序列，扩增产物含XbaI和BspEI酶切位点。扩增条件为95℃2min,95℃20sec,60℃20sec,72℃0.5min,30个循环，72℃延伸10min,扩增产物1％琼脂糖胶回收(图1b)。胶回收产物与T载体连接。酶切和测序结果表明所获得的序列为正确序列。

3、鸡溶菌酶的MAR序列的克隆和报告基因EGFP载体的构建

从市场上卖鸡处取得鸡血(加入柠檬酸钠抗凝)，用白细胞分离液分离出白细胞。用Transgen公司的基因组提取试剂盒(BloodZol)提取基因组DNA。根据Genbank报道的鸡溶菌酶的MAR序列合成以下引物：

CHMAR1：5-ATA ggcgcgcc GAT CCG TAA TAC AAT TGT ACC AGG TTT TGG-3

CHMAR2：5-ATAttaattaa GAA AAC AAT ATA TTT CCA AAT GAA AAA AAA ATC TG-3

为了便于连接，上游引物的5^/端设计了酶切位点AscI，下游引物的5^/端设计了酶切位点PacI；采用Transgen公司的FastPfu Fly DNA Polymerase，扩增条件为95℃变性2min、94℃20sec、60℃20sec、72℃1.5min共30个循环，72℃延伸10min，4℃冷却，得到3000bp左右的PCR特异条带(图1c)。将得到的PCR产物与T载体连接，酶切及测序结果表明为鸡溶菌酶的MAR序列。

(二)包含CHO肽延伸因子调控序列载体的制备

首先对pcDNA3.1(+)进行改造，在MluI酶切位点的上游引入酶切位点AscI和PacI。在改造后的pcDNA3.1(+)的EcoRV处连入EGFP报告基因(EGFP报告基因的序列为SEQ IDNO.13所示)，命名为pcDNA3.1EGFP，作为对照载体，用CHEF-alpha基因的5’端1543bp的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，简称5’端1.5kb)和3’端610bp的调控序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，简称3’端0.6kb)替换pcDNA3.1EGFP中的CMV启动子和BGHPA，命名为pcDNACHEF1506EGFP，载体结构图见图2。

(三)包含鸡溶菌酶MAR序列及DHFR筛选扩增基因与CHEF1506的组合

1鸡溶菌酶MAR序列与pcDNACHEF1506的组合及表达结果

将克隆到的鸡溶菌酶MAR序列用AscI和PacI酶切，连入经同样酶切的pcDNACHEF1506EGFP中(MAR序列是否在CHEF15的5’端)，命名为CHMARCHEF1506EGFP，载体结构图见图2。

将pcDNA3.1EGFP、pcDNACHEF1506EGFP、CHMARCHEF1506EGFP转染CHO-S细胞后用G418筛选阳性细胞用流式细胞仪测定EGFP表达强度，结果见表一。说明1543bp和610bp的CHEF-alpha调控序列比CMV启动子和BGHpolyA序列提高EGFP表达水平7倍；克服位置效应的鸡溶菌酶MAR序列能够进一步提高载体的表达强度，与未连接鸡溶菌酶MAR序列的pcDNACHEF1506EGFP载体比较其表达EGFP的强度提高了1.7倍，这个组合与最初的pcDNA3.1EGFP比较提高表达水平超过10倍，可以用作下一步构建基因扩增载体用。

表一 不同载体表达EGFP的荧光强度单位

由表一可以看出，与pcDNA3.1(+)载体相比，采用本发明两个特定的基因片段(其中，基因片段1为1543bp的CHEF-alpha基因的5’端序列+610bp的CHEF-alpha基因3’端调控序列，基因片段2为鸡溶菌酶MAR序列+1543bp的CHEF-alpha基因的5’端序列+610bp的CHEF-alpha基因3’端调控序列)，替代pcDNA3.1(+)载体中的CMV启动子和BGHPA后形成的重组pcDNA3.1(+)载体，目标基因的表达强度显著提高。

实验结果说明，本发明两个特定的基因片段(其中，基因片段1为1543bp的CHEF-alpha基因的5’端序列+610bp的CHEF-alpha基因3’端调控序列【二者之间含多克隆酶切位点】——SEQ ID NO.1，基因片段2为鸡溶菌酶MAR序列+1543bp的CHEF-alpha基因的5’端序列+610bp的CHEF-alpha基因3’端调控序列【三者之间含多克隆酶切位点】——SEQ IDNO.2)，可以有效提高目标基因的表达水平，其中，目标基因插入在“1543bp的CHEF-alpha基因的5’端序列”与“610bp的CHEF-alpha基因3’端调控序列”之间。

(四)含筛选扩增基因二氢叶酸还原酶(DHFR)的载体构建

用XmaI和BstBI酶切DHFR基因和改造后的pcDNA3.1(+)载体，用DHFR基因替换改造后的pcDNA3.1(+)中的Neo基因。所构建的载体命名为pcDNADHFR。

用CHEF-alpha基因的5’端1543bp和3’端610bp调控序列替换pcDNADHFR中的CMV启动子和BGHPA，命名为CHEF1506/DHFR。再将鸡溶菌酶MAR序列连入pcDNACHEF1506/DHFR中，命名为CHMARCHEF1506/DHFR。

含DHFR的三个载体用NheI、XhoI酶切后与经同样酶切的EGFP基因连接构建成功的载体分别命名为pcDNADHFREGFP、pcDNACHEF1506EGFP/DHFR、CHMARCHEF1506EGFP/DHFR(图3)。将这三个载体分别转染CHO-S细胞后用200nM MTX筛选，两周后阳性细胞克隆出现后，增加MTX浓度为1000nM，每4-5天换一次液，两周后阳性细胞长满后用流式细胞测定EGFP表达强度，结果见表二。

收集CHMARCHEF1506EGFP/DHFR阳性细胞离心后不需要蓝光照射在室内自然光照射下就能够见到整个细胞都是绿色的(图4)，而pcDNADHFREGFP、pcDNACHEF1506EGFP/DHFR在自然光照射下没有明显看见细胞显示出绿色，可见CHMARCHEF1506EGFP/DHFR载体能够高效率的表达外源基因，也能够通过MTX加压扩增外源基因的拷贝数进一步增强外源基因EGFP的表达强度。

表二 含DHFR的不同载体表达EGFP的荧光强度单位

由表二可以看出，与pcDNA3.1DHFR载体相比，采用本发明两个特定的基因片段(其中，基因片段1为1543bp的CHEF-alpha基因的5’端序列+610bp的CHEF-alpha基因3’端调控序列，基因片段2为鸡溶菌酶MAR序列+1543bp的CHEF-alpha基因的5’端序列+610bp的CHEF-alpha基因3’端调控序列)，替代pcDNA3.1(+)载体中的CMV启动子和BGHPA、并用DHFR基因序列替代Neo基因后形成的重组pcDNACHEF1506EGFP/DHFR和CHMARCHEF 1506EGFP/DHFR载体，目标基因的表达强度显著提高。

实施例2用本发明组合载体CHMARCHEF1506/DHFR表达外源蛋白

通过实施例1表明载体CHMARCHEF1506DHFR表达EGFP的荧光强度效果好，表明用CHO内源性的肽延伸因子1的基因5’和3’端调控序列和鸡溶菌酶MAR序列在CHO细胞中表达外源基因效果更好，进一步用外源基因aldalimumab来验证此载体的效果。

通过NheI和XhoI酶切位点在CHMARCHEF53/DHFR上，aldalimumab重链基因(aldalimumab重链基因的序列为SEQ ID NO.14所示)，构建成载体CHMARCHEFaldalimumabHC/DHFR(图5)；aldalimumab轻链基因(aldalimumab轻链基因的序列为SEQ ID NO.15所示)同样通过NheI和XhoI酶切位点连入经同样酶切的载体CHMARCHEF1506/EGFP，构建成功的载体命名为CHMARCHEF aldalimumabLC/Neo(图5)。

构建成功的载体用SalI线性化后，用脂质体Lipofectamine 2000转染CHO-S细胞，aldalimumab抗体轻重链共转染；用0.6mg/ml G418和200nM MTX筛选阳性细胞，当10-14天阳性克隆出现，增加MTX浓度至1000nM；2周后阳性细胞混合克隆活力达到95％左右时对其单克隆化，高表达单克隆进一步加压至2000nM MTX扩增外源基因，再亚克隆，所获得高表达细胞株扩大培养，用125ml摇瓶30ml培养体积，用葡萄糖补料，无血清培养基培养至细胞活力为50％左右收获培养上清，测定表达量获得5株表达量较高的细胞株(见表三)。

表三 组合载体表达单克隆抗体aldalimuan结果

实施例3本发明组合载体CHMARCHEF1506/DHFR表达外源蛋白的稳定性研究

将实施例2摇瓶中获得高表达的五株细胞，按3x10⁵/ml细胞密度接种，3-4天细胞长至200万/ml，再按3x10⁵/ml密度接种，在摇瓶中一直以这种方式传代培养50-60天。结果表明，所获得的高表达细胞株在传代培养60天左右表达aldalimumab的表达量没有发生明显变化，最终传代细胞在用葡萄糖作为补料的无血清培养基中培养14天，这五株细胞表达量分别1-1.3克/L左右，说明以这种方法构建的高表达载体在CHO细胞中表达外源蛋白能够达到稳定高产。

按照文献资料报道如果在生物反应器中优化培养条件，结合控制融氧和pH以及温度的变化，补料改用氨基酸、维生素矿物质和糖类，能够进一步提高细胞密度，延长培养时间，抗体类蛋白药物能够提高表达进一步提高，具体表达量可以达到2-3克/L。

综上，本发明重组质粒携带外源基因(如，EGFP基因或者aldalimumab基因)转染哺乳细胞(如，CHO细胞)，外源基因的表达水平稳定，且外源基因的表达水平高，是改进前质粒pcDNA3.1的7倍以上，采用本发明重组质粒容易筛选到外源基因高表达的细胞株，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川丰讯科技发展有限公司

<120> 一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段、重组载体及其用途

<130> GY456-17P1062

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2189

<212> DNA

<213> 有效提高目标基因表达水平的基因片段1

<400> 1

acgcgtgcag atccgtcgag ctctcggcca ccgagctgag cccttaggtt ctggggctgg 60

gaagggtccc taggattgtg cacctctccc gcgggggaca agcaggggat ggcggggctg 120

acgtcgggag gtggcctcca cgggaaggga cacccggatc tcgacacagc cttggcagtg 180

gagtcaggaa gggtaggaca gattctggac gccctcttgg ccagtcctca ccgccccacc 240

cccgatggag ccgagagtaa ttcatacaaa aggagggatc gccttcgccc ctgggaatcc 300

cagggaccgt cgctaaattc tggccggcct cccagcccgg aaccgctgtg cccgcccagc 360

gcggcgggag gagcctgcgc ctagggcgga tcgcgggtcg gcgggagagc acaagcccac 420

agtccccggc ggtgggggag gggcgcgctg agcgggggcc cgggagccag cgcggggcaa 480

actgggaaag tggtgtcgtg tgctggctcc gccctcttcc cgagggtggg ggagaacggt 540

ataaaagtgc ggtagtcgcg ttggacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gtcagaacgc 600

aggtgagtgg cgggtgtggc ctccgcgggc ccgggctccc tcctttgagc ggggtcggac 660

cgccgtgcgg gtgtcgtcgg ccgggcttct ctgcgagcgt tcccgccctg gatggcgggc 720

tgtgcgggag ggcgaggggg ggaggcctgg cggcggcccc ggagcctcgc ctcgtgtcgg 780

gcgtgaggcc tagcgtggct tccgccccgc cgcgtgccac cgcggccgcg ctttgctgtc 840

tgcccggctg ccctcgattg cctgcccgcg gcccgggcca acaaagggag ggcgtggagc 900

tggctggtag ggagccccgt agtccgcatg tcgggcaggg agagcggcag cagtcggggg 960

ggggaccggg cccgcccgtc ccgcagcaca tgtccgacgc cgcctggacg ggtagcggcc1020

tgtgtcctga taaggcggcc gggcggtggg ttttagatgc cgggttcagg tggccccggg1080

tcccggcccg gtctggccag taccccgtag tggcttagct ccgaggaggg cgagcccgcc1140

cgcccggcac cagttgcgtg cgcggaaaga tggccgctcc cgggccctgt agcaaggagc1200

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tctaatggcg ttggagtttg ctcacatttg gtgggtggag actgtagcca ggccagcctg1440

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cctcgagtct agaaatatta cccctaacac ctgccacccc agtcttaatc agtggtggaa1620

gaacggtctc agaactgttt gtctcaattg gccatttaag tttaatagtg aaagactggt1680

taatgataac aatgcatcgg aaaaccttca ggaggaaagg agaatgtttt gtggaacatt1740

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<400> 2

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ttctttggaa atacactgac ttgattgaag tctcttgaag atagtaaaca gtacttacct1740

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cctcaccctc ttgtgtactg tattttgtaa tagaaaatat tttaaactgt gcatatgatt1920

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catttttatg aagattacca gcgctgctga ctttctaaac ataaggctgt attgtcttcc2160

tgtaccattg catttcctca ttcccaattt gcacaaggat gtctgggtaa actattcaag2220

aaatggcttt gaaatacagc atgggagctt gtctgagttg gaatgcagag ttgcactgca2280

aaatgtcagg aaatggatgt ctctcagaat gcccaactcc aaaggatttt atatgtgtat2340

atagtaagca gtttcctgat tccagcaggc caaagagtct gctgaatgtt gcgttgccgg2400

agacctgtat ttctcaacaa ggtaagatgg tatcctagca actgcggatt ttaatacatt2460

ttcagcagaa gtacttagtt aatctctacc tttagggatc gtttcatcat ttttagatgt2520

tatacttgaa atactgcata acttttagct ttcatgggtt cctttttttc agcctttagg2580

agactgttaa gcaatttgct gtccaacttt tgtgttggtc ttaaactgca atagtagttt2640

accttgtatt gaagaaataa agaccatttt tatattaaaa aatacttttg tctgtcttca2700

ttttgacttg tctgatatcc ttgcagtgct cattatgtca gttctgtcag atattcagac2760

atcaaaactt aacgtgagct cagtggagtt acagctgcgg ttttgatgct gttattattt2820

ctgaaactag aaatgatgtt gtcttcatct gctcatcaaa cacttcatgc agagtttaag2880

gctagtgaga aatgcataca tttattgata cttttttaaa gtcaactttt tatcagattt2940

ttttttcatt tggaaatata ttgttttcgg atccttaatt aaacgcgtgc agatccgtcg3000

agctctcggc caccgagctg agcccttagg ttctggggct gggaagggtc cctaggattg3060

tgcacctctc ccgcggggga caagcagggg atggcggggc tgacgtcggg aggtggcctc3120

cacgggaagg gacacccgga tctcgacaca gccttggcag tggagtcagg aagggtagga3180

cagattctgg acgccctctt ggccagtcct caccgcccca cccccgatgg agccgagagt3240

aattcataca aaaggaggga tcgccttcgc ccctgggaat cccagggacc gtcgctaaat3300

tctggccggc ctcccagccc ggaaccgctg tgcccgccca gcgcggcggg aggagcctgc3360

gcctagggcg gatcgcgggt cggcgggaga gcacaagccc acagtccccg gcggtggggg3420

aggggcgcgc tgagcggggg cccgggagcc agcgcggggc aaactgggaa agtggtgtcg3480

tgtgctggct ccgccctctt cccgagggtg ggggagaacg gtataaaagt gcggtagtcg3540

cgttggacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgtcagaac gcaggtgagt ggcgggtgtg3600

gcctccgcgg gcccgggctc cctcctttga gcggggtcgg accgccgtgc gggtgtcgtc3660

ggccgggctt ctctgcgagc gttcccgccc tggatggcgg gctgtgcggg agggcgaggg3720

ggggaggcct ggcggcggcc ccggagcctc gcctcgtgtc gggcgtgagg cctagcgtgg3780

cttccgcccc gccgcgtgcc accgcggccg cgctttgctg tctgcccggc tgccctcgat3840

tgcctgcccg cggcccgggc caacaaaggg agggcgtgga gctggctggt agggagcccc3900

gtagtccgca tgtcgggcag ggagagcggc agcagtcggg ggggggaccg ggcccgcccg3960

tcccgcagca catgtccgac gccgcctgga cgggtagcgg cctgtgtcct gataaggcgg4020

ccgggcggtg ggttttagat gccgggttca ggtggccccg ggtcccggcc cggtctggcc4080

agtaccccgt agtggcttag ctccgaggag ggcgagcccg cccgcccggc accagttgcg4140

tgcgcggaaa gatggccgct cccgggccct gtagcaagga gctcaaaatg gaggacgcgg4200

cagcccggcg gagcggggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaagagggcc ttgcccctcg4260

ccggccgctg cttcctgtga ccccgtggtg taccggccgc acttcagtca ccccgggcgc4320

tctttcggag caccgctggc ctccgctggg ggaggggatc tgtctaatgg cgttggagtt4380

tgctcacatt tggtgggtgg agactgtagc caggccagcc tggccatgga agtaattctt4440

ggaatttgcc cattttgagt ttggagcgaa gctgattgac aaagctgctt agccgttcaa4500

aggtattctt cgaacttttt ttttaaggtg tgctagcgat atcctcgagt ctagaaatat4560

tacccctaac acctgccacc ccagtcttaa tcagtggtgg aagaacggtc tcagaactgt4620

ttgtctcaat tggccattta agtttaatag tgaaagactg gttaatgata acaatgcatc4680

ggaaaacctt caggaggaaa ggagaatgtt ttgtggaaca tttttgtgtg tgtggcagtt4740

ttaagttatt agttttcaaa atcagtactt tttaatggaa acaacttgac caaaaatctg4800

tcacagaatt ttgagaccca ttaaaataca agtttaatga gaagtctgtc tctgttaatg4860

ctgaagtcat tactaagtgc ttagcttagc aaggtatgtg gatgcccatt tgtgttccaa4920

gggattggac tgttcatcag gacccagagc tgagtttcaa gggctcaaga gatggcttat4980

tacctgtggg tgtcttgaag gttctggttg ggacaaatta ggaatgtttt tggcagacat5040

ggtgactacc ttcatctggg tgagttcagt tgatttgtct tgagcctttg gggtttacac5100

aagtaaatga catcatacag ttagtgtatt gttagtgaat attaatatat gaggcaggct5160

ttgcttccgg a 5171

<210> 3

<211> 1543

<212> DNA

<213> CHEF-alpha基因的5'端1543bp的序列

<400> 3

gcagatccgt cgagctctcg gccaccgagc tgagccctta ggttctgggg ctgggaaggg 60

tccctaggat tgtgcacctc tcccgcgggg gacaagcagg ggatggcggg gctgacgtcg 120

ggaggtggcc tccacgggaa gggacacccg gatctcgaca cagccttggc agtggagtca 180

ggaagggtag gacagattct ggacgccctc ttggccagtc ctcaccgccc cacccccgat 240

ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcccctggga atcccaggga 300

ccgtcgctaa attctggccg gcctcccagc ccggaaccgc tgtgcccgcc cagcgcggcg 360

ggaggagcct gcgcctaggg cggatcgcgg gtcggcggga gagcacaagc ccacagtccc 420

cggcggtggg ggaggggcgc gctgagcggg ggcccgggag ccagcgcggg gcaaactggg 480

aaagtggtgt cgtgtgctgg ctccgccctc ttcccgaggg tgggggagaa cggtataaaa 540

gtgcggtagt cgcgttggac gttctttttc gcaacgggtt tgccgtcaga acgcaggtga 600

gtggcgggtg tggcctccgc gggcccgggc tccctccttt gagcggggtc ggaccgccgt 660

gcgggtgtcg tcggccgggc ttctctgcga gcgttcccgc cctggatggc gggctgtgcg 720

ggagggcgag ggggggaggc ctggcggcgg ccccggagcc tcgcctcgtg tcgggcgtga 780

ggcctagcgt ggcttccgcc ccgccgcgtg ccaccgcggc cgcgctttgc tgtctgcccg 840

gctgccctcg attgcctgcc cgcggcccgg gccaacaaag ggagggcgtg gagctggctg 900

gtagggagcc ccgtagtccg catgtcgggc agggagagcg gcagcagtcg ggggggggac 960

cgggcccgcc cgtcccgcag cacatgtccg acgccgcctg gacgggtagc ggcctgtgtc1020

ctgataaggc ggccgggcgg tgggttttag atgccgggtt caggtggccc cgggtcccgg1080

cccggtctgg ccagtacccc gtagtggctt agctccgagg agggcgagcc cgcccgcccg1140

gcaccagttg cgtgcgcgga aagatggccg ctcccgggcc ctgtagcaag gagctcaaaa1200

tggaggacgc ggcagcccgg cggagcgggg cgggtgagtc acccacacaa aggaagaggg1260

ccttgcccct cgccggccgc tgcttcctgt gaccccgtgg tgtaccggcc gcacttcagt1320

caccccgggc gctctttcgg agcaccgctg gcctccgctg ggggagggga tctgtctaat1380

ggcgttggag tttgctcaca tttggtgggt ggagactgta gccaggccag cctggccatg1440

gaagtaattc ttggaatttg cccattttga gtttggagcg aagctgattg acaaagctgc1500

ttagccgttc aaaggtattc ttcgaacttt ttttttaagg tgt 1543

<210> 4

<211> 610

<212> DNA

<213> CHEF-alpha基因的3'端610bp的调控序列

<400> 4

aatattaccc ctaacacctg ccaccccagt cttaatcagt ggtggaagaa cggtctcaga 60

actgtttgtc tcaattggcc atttaagttt aatagtgaaa gactggttaa tgataacaat 120

gcatcggaaa accttcagga ggaaaggaga atgttttgtg gaacattttt gtgtgtgtgg 180

cagttttaag ttattagttt tcaaaatcag tactttttaa tggaaacaac ttgaccaaaa 240

atctgtcaca gaattttgag acccattaaa atacaagttt aatgagaagt ctgtctctgt 300

taatgctgaa gtcattacta agtgcttagc ttagcaaggt atgtggatgc ccatttgtgt 360

tccaagggat tggactgttc atcaggaccc agagctgagt ttcaagggct caagagatgg 420

cttattacct gtgggtgtct tgaaggttct ggttgggaca aattaggaat gtttttggca 480

gacatggtga ctaccttcat ctgggtgagt tcagttgatt tgtcttgagc ctttggggtt 540

tacacaagta aatgacatca tacagttagt gtattgttag tgaatattaa tatatgaggc 600

aggctttgct 610

<210> 5

<211> 2960

<212> DNA

<213> MAR基因的核苷酸序列

<400> 5

gatccgtaat acaattgtac caggttttgg tttattacat gtgactgacg gcttcctgtg 60

cgtgctcagg aaacggcagt tgggcactgc actgcccggt gatggtgcca cggtggctcc 120

tgccgccttc tttgatattc actctgttgt atttcatctc ttcttgccga tgaaaggata 180

taacagtctg tgaggaaata cttggtattt cttctgatca gcgtttttat aagtaatgtt 240

gaatattgga taaggctgtg tgtcctttgt cttgggagac aaagcccaca gcaggtggtg 300

gttggggtgg tggcagctca gtgacaggag aggttttttt gcctgttttt tttgttgttt 360

ttttttttta agtaaggtgt tcttttttct tagtaaaatt tctactggac tgtatgtttt 420

gacaggtcag aaacatttct tcaaaagaag aaccttttgg aaactgtaca gcccttttct 480

ttcattccct ttttgctttc tgtgccaatg cctttggttc tgatttgcat tatggaaaac 540

gttgatcgga acttgaggtt tttatttata gtgtggcttg aaagcttgga tagctgttgt 600

tacatgagat accttattaa gtttaggcca gcttgatgct ttattttttt ccctttgaag 660

tagtgagcgt tctctggttt ttttcctttg aaactggcga ggcttagatt tttctaatgg 720

gattttttac ctgatgatct agttgcatac ccaaatgctt gtaaatgttt tcctagttaa 780

catgttgata acttcggatt tacatgttgt atatacttgt catctgtgtt tctagtaaaa 840

atatatggca tttatagaaa tacgtaattc ctgatttcct ttttttttta tctctatgct 900

ctgtgtgtac aggtcaaaca gacttcactc ctatttttat ttatagaatt ttatatgcag 960

tctgtcgttg gttcttgtgt tgtaaggata cagccttaaa tttcctagag cgatgctcag1020

taaggcgggt tgtcacatgg gttcaaatgt aaaacgggca cgtttggctg ctgccttccc1080

gagatccagg acactaaact gcttctgcac tgaggtataa atcgcttcag atcccaggga1140

agtgtagatc cacgtgcata ttcttaaaga agaatgaata ctttctaaaa tattttggca1200

taggaagcaa gctgcatgga tttgtttggg acttaaatta ttttggtaac ggagtgcata1260

ggttttaaac acagttgcag catgctaacg agtcacagca tttatgcaga agtgatgcct1320

gttgcagctg tttacggcac tgccttgcag tgagcgattt gcagataggg gtggggtgct1380

ttgtgtcgtg ttcccacacg ctgccacaca gccacctccc ggaacacatc tcacctgctg1440

ggtacttttc aaaccatctt agcagtagta gatgagttac tatgaaacag agaagttcct1500

cagttggata ttctcatggg atgtcttttt tcccatgttg ggcaaagtat gataaagcat1560

ctctatttgt aaattatgca cttgttagtt cctgaatcct ttctatagca ccacttattg1620

cagcaggtgt aggctctggt gtggcctgtg tctgtgcttc aatcttttaa gcttctttgg1680

aaatacactg acttgattga agtctcttga agatagtaaa cagtacttac ctttgatccc1740

aatgaaatcg agcatttcag ttgtaaaaga attccgccta ttcataccat gtaatgtaat1800

tttacacccc cagtgctgac actttggaat atattcaagt aatagacttt ggcctcaccc1860

tcttgtgtac tgtattttgt aatagaaaat attttaaact gtgcatatga ttattacatt1920

atgaaagaga cattctgctg atcttcaaat gtaagaaaat gaggagtgcg tgtgctttta1980

taaatacaag tgattgcaaa ttagtgcagg tgtccttaaa aaaaaaaaaa agtaatataa2040

aaaggaccag gtgttttaca agtgaaatac attcctattt ggtaaacagt tacattttta2100

tgaagattac cagcgctgct gactttctaa acataaggct gtattgtctt cctgtaccat2160

tgcatttcct cattcccaat ttgcacaagg atgtctgggt aaactattca agaaatggct2220

ttgaaataca gcatgggagc ttgtctgagt tggaatgcag agttgcactg caaaatgtca2280

ggaaatggat gtctctcaga atgcccaact ccaaaggatt ttatatgtgt atatagtaag2340

cagtttcctg attccagcag gccaaagagt ctgctgaatg ttgcgttgcc ggagacctgt2400

atttctcaac aaggtaagat ggtatcctag caactgcgga ttttaataca ttttcagcag2460

aagtacttag ttaatctcta cctttaggga tcgtttcatc atttttagat gttatacttg2520

aaatactgca taacttttag ctttcatggg ttcctttttt tcagccttta ggagactgtt2580

aagcaatttg ctgtccaact tttgtgttgg tcttaaactg caatagtagt ttaccttgta2640

ttgaagaaat aaagaccatt tttatattaa aaaatacttt tgtctgtctt cattttgact2700

tgtctgatat ccttgcagtg ctcattatgt cagttctgtc agatattcag acatcaaaac2760

ttaacgtgag ctcagtggag ttacagctgc ggttttgatg ctgttattat ttctgaaact2820

agaaatgatg ttgtcttcat ctgctcatca aacacttcat gcagagttta aggctagtga2880

gaaatgcata catttattga tactttttta aagtcaactt tttatcagat ttttttttca2940

tttggaaata tattgttttc 2960

<210> 6

<211> 564

<212> DNA

<213> DHFR基因的核苷酸序列

<400> 6

atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac 60

ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca 120

acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc 180

attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc 240

aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt 300

attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct 360

gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420

caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc 480

ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt 540

gaagtctacg agaagaaaga ctaa 564

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> CHEF1

<400> 7

ataacgcgtg cagatccgtc gagctctcgg ccaccgagc 39

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> CHEF2

<400> 8

atagctagca caccttaaaa aaaaagttcg aagaatacc 39

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> CHEF3

<400> 9

atatctagaa atattacccc taacacctgc caccccagtc 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> CHEF4

<400> 10

atatccggaa gcaaagcctg cctcatatat taatattcac 40

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> CHMAR1

<400> 11

ataggcgcgc cgatccgtaa tacaattgta ccaggttttg g 41

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> CHMAR2

<400> 12

atattaatta agaaaacaat atatttccaa atgaaaaaaa aatctg 46

<210> 13

<211> 720

<212> DNA

<213> EGFP报告基因

<400> 13

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 14

<211> 1404

<212> DNA

<213> aldalimumab重链基因的序列(含信号肽序列)

<400> 14

atgcctctcc tcctgctgct gcctctgctg tgggctggcg ctctggctga agtgcagctg 60

gtggaatctg gcggcggact ggtgcagcct ggcagaagcc tgagactgag ctgtgccgcc 120

agcggcttca ccttcgacga ctacgctatg cactgggtgc gacaggcccc tggcaaggga 180

ctggaatggg tgtccgccat cacctggaac agcggccaca tcgactacgc cgacagcgtg 240

gaaggcagat tcaccatcag cagagacaac gccaagaaca gcctgtacct gcagatgaac 300

tccctgagag ccgaggacac cgccgtgtac tactgcgcca aggtgtccta cctgagcacc 360

gccagcagcc tggattactg gggccaggga acactcgtga ccgtgtctag cgccagcacc 420

aagggcccta gcgtgttccc tctggcccct agcagcaagt ctaccagcgg cggaacagcc 480

gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcccg tgacagtgtc ctggaactct 540

ggcgccctga caagcggcgt gcacacattc cctgccgtgc tgcagtctag cggcctgtac 600

agcctgagca gcgtcgtgac tgtgcccagc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 660

aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 720

gacaagaccc acacctgtcc tccctgtcct gcccccgaac tgctgggagg cccttccgtg 780

ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gcagaacccc cgaagtgacc 840

tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 900

ggcgtggaag tgcacaacgc taagaccaag cctagagagg aacagtacaa cagcacctac 960

agagtggtgt ccgtgctgac agtgctgcat caggactggc tgaacggcaa agagtacaag1020

tgcaaagtgt ccaacaaggc cctgccagcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag1080

ggccagccca gggaacccca ggtgtacaca ctgcctccaa gcagggacga gctgaccaag1140

aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa1200

tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc1260

gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcagggc1320

aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc1380

ctgagcctga gccccggcaa atga 1404

<210> 15

<211> 693

<212> DNA

<213> aldalimumab轻链基因(含信号肽序列)

<400> 15

atgcctctcc tcctgctgct gcctctgctg tgggctggcg ccctggccga cattcagatg 60

acacagagcc ccagcagcct gagcgccagc gtgggagaca gagtgaccat cacctgtaga 120

gccagccagg gcatcagaaa ctacctggcc tggtatcagc agaagcccgg caaggccccc 180

aagctgctga tctacgccgc cagcacactg cagtctggcg tgccctctag attcagcggc 240

agcggctctg gcaccgactt caccctgacc atcagctccc tgcagccaga ggacgtggcc 300

acctactact gccagagata caacagggcc ccctacacct ttggccaggg caccaaggtg 360

gaaatcaaga gaaccgtggc cgctcccagc gtgttcatct tcccacctag cgacgagcag 420

ctgaagtccg gcacagcctc tgtcgtgtgc ctgctgaaca acttctaccc ccgcgaggcc 480

aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg cagagcggca acagccagga aagcgtgacc 540

gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc ctgtccagca ccctgacact gagcaaggcc 600

gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc gaagtgaccc accagggcct gagcagccct 660

gtgaccaaga gcttcaacag aggcgagtgc tga 693

Claims (9)

1.一种重组质粒，其特征在于：它是将pcDNA3.1(+)质粒中启动子CMV替换为CHEF-alpha基因5’端的长度为1543bp序列，以及BGHPA替换为CHEF-alpha基因3’端的长度为610bp序列的重组质粒；所述重组质粒在插入的CHEF-alpha基因5’端的长度为1543bp序列的5’端还插入有鸡溶菌酶的MAR基因；所述CHEF-alpha基因5’端的长度为1543bp序列如SEQID NO.3所示；所述CHEF-alpha基因3’端的长度为610bp序列如SEQ ID NO.4所示；所述MAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒中，Neo基因被DHFR基因、GS基因、Hygromycin基因、Blastcidin基因、Puromycin基因或者Zeocin基因替代。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述DHFR基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

4.权利要求1~3任意一项所述的重组质粒在制备表达外源基因的转基因细胞中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述外源基因是EGFP基因或者其它外源基因；所述其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类外源基因。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述单克隆抗体类外源基因是aldalimumab基因。

7.根据权利要求4~6任意一项所述的用途，其特征在于：所述细胞是哺乳动物细胞.

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述哺乳动物细胞是CHO、BHK、HEK293、NS0、PERC6细胞。

9.一种制备表达外源基因的转基因细胞的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）取权利要求1~3任意一项所述的重组质粒，连接外源基因，得携带有外源基因重组质粒；

（2）取携带有外源基因重组质粒，转染细胞，即可。